Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR-spektroskopi som ett kraftfullt verktyg för snabb utvärdering av lipidprofilen av fiskolja kosttillskott

Published: May 1, 2017 doi: 10.3791/55547
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Food Science and Technology, The Ohio State University, 2Foods for Health Discovery Theme, The Ohio State University

Summary

Här, var hög upplösning 1 H och 13 C kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi används som ett snabbt och tillförlitligt verktyg för kvantitativ och kvalitativ analys av inkapslade fiskolja tillskott.

Abstract

Den västra dieten är dålig i n -3 fettsyror, därför konsumtionen av fiskolja tillskott rekommenderas för att öka intaget av dessa viktiga näringsämnen. Målet med detta arbete är att visa den kvalitativa och kvantitativa analysen av inkapslade fiskolja tillskott med användning hög upplösning 1 H och 13 C-NMR-spektroskopi med användning av två olika NMR-instrument; en 500 MHz och en 850 MHz-instrument. Både proton (1 H) och kol (13 C) NMR-spektra kan användas för kvantitativ bestämning av de stora beståndsdelarna i fiskolja tillskott. Kvantifiering av lipiderna i kosttillskott fiskolja uppnås genom integrering av de lämpliga NMR-signaler i den relevanta 1D spektra. Resultat som erhållits av ett H och 13 C-NMR är i god överensstämmelse med varandra, trots skillnaden i upplösning och känslighet mellan de två kärnor och de två instrumenten. 1 H NMR erbjudandesa mer snabb analys jämfört med 13 C-NMR, som det spektrum kan registreras på mindre än en minut, i motsats till 13 C-NMR-analys, som varar från 10 minuter till en timme. Den 13 C NMR-spektrum, men är mycket mer informativa. Den kan ge kvantitativa data för ett större antal individuella fettsyror och kan användas för bestämning av positions fördelningen av fettsyror på glycerolhuvudkedjan. Båda kärnor kan ge kvantitativ information på bara ett experiment utan behov renings eller separationssteg. Styrkan hos magnetfältet påverkar mestadels 1 H-NMR-spektra på grund av dess lägre upplösning i förhållande till 13 C-NMR, dock ännu lägre kostnads NMR instrument effektivt kan appliceras som en standardmetod av laboratorierna livsmedelsindustri och kvalitetskontroll.

Introduction

Konsumtionen av n -3 fettsyror i dieten har visat sig vara fördelaktigt mot flera tillstånd, såsom hjärtsjukdomar 1, 2, 3, inflammatoriska sjukdomar 4 och diabetes 5. Den västra dieten är lågt i n -3-fettsyror och därmed konsumtionen av fiskolja tillskott rekommenderas för att förbättra n -6 / n -3 balans i konsumentens näring 1. Trots den senaste tidens ökning av fiskolja tillägg konsumtion, frågor kvarstår om säkerheten, äkthet, och kvaliteten på några av dessa produkter. Den snabba och noggranna analysen av sammansättningen av fiskolja tillskott är viktigt att korrekt bedöma kvaliteten på dessa kommersiella produkter och garantera konsumenternas säkerhet.

De vanligaste metoderna för bedömning av fiskolja tilläggs är gaskromatografi (GC) och infraröd spektroskopi (IR). Även om dessa är mycket känsliga metoder, de lider av flera nackdelar 6. GC-analys är tidskrävande (4-8 h), eftersom separation och derivatisering av individuella föreningar behövs 7 och lipidoxidation kan inträffa under analysen 8, 9. Medan IR-spektroskopi kan vara kvantitativa, är en prognosmodell som krävs för att konstrueras med användning av partiell minsta kvadratregression (PLSR), även om det finns undantag där IR-band kan hänföras till en enda förening 10. PLSR kräver analys av ett stort antal prover, vilket ökar tiden för analysen 11. Av denna anledning finns det ett ökande intresse för utveckling av nya analytiska metoder som möjliggör noggrann och snabb analys av ett stort antal fiskoljeprover. Organisationer såsom Office av kosttillskott (ODS) vid National Institutes of Health (NIH) och Food and Drug Administration (FDA) har samarbetat med Association of Official Analytical Chemists (AOAC) för att utveckla dessa nya metoder 12, 13.

En av de mest lovande analysmetoder för screening och utvärdering av flerkomponents matriser, såsom kosttillskott, är kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi 14, 15. NMR-spektroskopi har flera fördelar: det är ett icke-förstörande och kvantitativ teknik, det kräver minimal eller ingen provberedning, och den kännetecknas av utmärkt noggrannhet och reproducerbarhet. Dessutom är NMR-spektroskopi en miljövänlig metod eftersom det använder endast små mängder lösningsmedel. Den huvudsakliga nackdelen med NMR-spektroskopi är dess relativt låg känslighet jämfört med andra analytical metoder har emellertid den senaste tekniska framstegen inom instrumentering såsom starkare magnetfält, kryogena prober med olika diametrar, avancerad databehandling och mångsidiga pulssekvenser och tekniker ökade känsligheten upp till nM-området. Medan NMR instrumentering är höga kostnader, lång livslängd NMR spektrometrar och de många tillämpningar av NMR sänka kostnaden för analysen i det långa loppet. Denna detaljerade video protokollet är avsett att hjälpa nya utövare inom området undvika fallgropar som är förknippade med ett H och 13 C-NMR-spektroskopisk analys av kosttillskott fiskolja.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. NMR Provberedning

Obs: Varning, kontakta alla relevanta material säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Deutererad kloroform (CDCI3) som används i provberedningen är giftigt. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder när du utför provberedning inklusive användningen av ett dragskåp och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock, full längd byxor, sluten tå skor).

  1. Framställning av ett H och 13 C-prover
    1. Extrahera 120 | il (~ 110 mg) av fiskolja från ett diet kapsel med användning av en spruta och placera den i en 4 ml glasflaska. Notera vikten av fiskolja.
    2. provupplösning
      1. Upplös ungefär 120 mikroliter av fiskolja i 500 mikroliter av CDCI3 innehållande 0,01% av tetrametylsilan (TMS) som används som en referens för ett H och 13 C kemiska skift.
        OBS: TMS är användningend endast för kemiskt skift kalibrering (se stegnummer 2.2.1.2.7 och 2.2.2.2.7), inte för kvantifiering (se stegnummer 2.2.1.3 och 2.2.2.3) syften.
      2. Bered en 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) stamlösning, om kvantifiering uttryckt i mg / g önskas, genom upplösning av cirka 220 mg BHT och 15 mg krom (III) acetylacetonat (Cr ( acac) 3) i 20 ml av CDCI3 innehållande 0,01% av TMS. Använda 500 | il av stamlösningen för att lösa upp 100 mg (± 10 mg) av fiskolja.
    3. Efter upplösning av oljan (detta tar ett par sekunder), överföra all lösning direkt i en hög kvalitet 5-mm NMR-rör och fäst ett lock. Analysera proverna inom 24 timmar efter beredning av proverna.

2. NMR Instrument beredning

Anmärkning: Varning, akta att närvaron av starka magnetfält som produceras av NMR-instrument kan påverka medicinska anordningar och implmyror såsom pacemakers och kirurgiska proteser, såväl som elektroniska artiklar såsom kreditkort, klockor, etc. Ytterligare försiktighet krävs när analysen utförs med användning av icke-skärmande magneter. Två NMR-instrument användes för förvärv av ett H och 13 C-NMR-spektra; en spektrometer som arbetade vid 850,23 MHz och 213,81 MHz för ett H och 13 C-kärnor, respektive, utrustad med en trippelresonans helium kyld invers (TCI) 5 mm sond och en spektrometer som arbetade vid 500,20 MHz och 125,77 MHz för ett H och 13 C kärnor, respektive, utrustad med ett brett band observerades (BBO) kväve-kyld 5 mm sond. Alla experiment utfördes vid 25 ± 0,1 ° C och spektra bearbetades genom en standard NMR-data analys förvärv och bearbetning mjukvarupaket (se Material List).

  1. Förberedelse för att förvärva den NMR-spektra
    Beakta: ett H och 13 C-NMR-spektrakan förvärvas följaktligen utan att avlägsna provet från instrumentet.
    1. Infoga NMR-röret in i en spinnare turbin (se Material List).
    2. Placera spinnaren och röret på toppen av en graderad djupmätare och tryck försiktigt toppen av röret till dess att dess nedre del vidrör botten av mätaren.
    3. Placera NMR prov i en öppen plats i SampleCase. Notera luckenumret provet placeras i.
    4. För att ladda provet i NMR, återgå till kontrolldatorn och typ "sx #, där # är spåret i SampleCase hålla ditt prov.
    5. Vänta tills deuterium signalen från CDC 3 visas på låset fönsterfilm. Om det inte visas automatiskt, typ "lockdisp". Så snart som deuterium signalen är synlig, typ "lås" på kommandoraden och välj "CDC! 3" från lösningsmedlet: s lista för att låsa provet med användning av CDCI3 deuterium resonans.
      OBS! Deuterium signal kan utebli om föregående användare använde ett annat lösningsmedel. Användare bör vänta på indikatorn att provet är nere, då låsa.
    6. Skriv "bsmsdisp" på kommandoraden för att säkerställa spinning är inte aktiv. Om "SPIN" -knappen är grön, klicka på den för att avaktivera spinning.
    7. Skriv "nya" för att skapa en ny datauppsättning. Ange ett namn för datauppsättningen i "NAME" -fliken och experimentet nummer i "EXPNO" -fliken. Använd nummer "1" i "PROCNO" -fliken. I "Experiment" -fliken, klicka på "Välj" och välj "PROTON" parameterfil. Skriv titeln på experimentet i "titel" -fliken. Klicka på "OK".
    8. Skriv "getprosol" på kommandoraden för att få standardparametrar för den aktuella NMR-sond och lösningsmedel.
    9. Upprepa steg 2.1.7 för 13 C, välja "C13IG" pulssekvens i "Experiment" fliken för 1D 13 C invers grerad frikopplat experimentet.
    10. Skriv "getprosol" på kommandoraden för att få standardparametrar för den aktuella NMR-sond och lösningsmedel.
    11. Skriv kommandot "atma" för att utföra automatisk inställning och matchning av sonden för både kol och protonkärnor.
    12. Utföra endimensionell gradient mellanlägg för att uppnå en i hög grad homogent magnetfält, och därmed optimal linjeform för NMR-signalerna.
      1. Använd standard automatiska förfarandet för 1D mellanlägg, helt enkelt genom att sekventiellt exekvera kommandon "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss" och "qu topshim rapport" på kommandoraden.
  2. parameter optimering
    1. 90 ° puls kalibrering
      1. Skapa en ny uppsättning data för ett H (se steg 2.1.7 och 2.1.8).
      2. Skriv kommandot "paropt" på kommandoraden för att starta automation program för kalibrering av 90 ° pulse. Välj pulsvaraktighet, p1, som den parameter som skall modifieras.
      3. Börjar med "2" ^ s som det initiala värdet av p1, ange "2" ^ s inkrement och utför "16" experiment.
      4. Skapa en ny datauppsättning för 13 C (se steg 2.1.9) och upprepa processen för 13 C-kärnor (se steg 2.2.1.2 och 2.2.1.3).
    2. T en mätning mätt med nollmetod 16 för en H
      OBS: null metoden använder inversionsåterhämtningspulssekvensen, som består av en 180 ° puls följer genom en fördröjning (tau), för att tillåta relaxa längs z-axeln och en slutlig 90 ° puls som skapar det observer transversell magnetisering.
      1. Skapa en ny uppsättning data för ett H (se steg 2.1.7 och 2.1.8).
      2. Skriv "pulprog t1ir1d" för att ändra pulssekvensen till inversions-recovery experimentet.
      3. Skriv följande kommandon på command linje för att ställa in den spektrala bredden i ppm, i mitten av RF-sändaren, antalet avsökningar antalet blind avsökningar och antalet datapunkter "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2", "ds 2" och "td 64K".
      4. Typ "p1 (värde)" och ange varaktighetsvärdena för 90 ° puls såsom bestäms av puls kalibreringen (se steg 2.2.1) och skriv "p2 (värde)" för 180 ° puls (varaktighet värde för de 180 ° puls är den 90 ° pulslängd multiplicerat med två).
      5. Ställa återföringsfördröjningen till ett mycket stort värde, såsom 10 s genom att skriva "d1 10".
      6. Inställd tau till ett kort värde, såsom 10 ms, genom att skriva "d7 10ms" på kommandoraden.
      7. Ställ in mottagarens förstärkning (RG) till ett lämpligt värde med kommandot "RGA" för automatisk beräkning av RG.
      8. Kör ett spektrum genom att skriva kommandot "ZG".
      9. Utför Fourier-transformation genom att skriva "EFP"på kommandoraden.
      10. Utför automatisk korrigering fas genom att skriva kommandot "APK" i kommandoraden. Om ytterligare justeringar fas krävs för att ytterligare förbättra spektrum, klicka på "Process fliken" klicka på ikonen "Justera Phase" att gå in i fas korrigeringsläget.
        1. Använda nollte ordningens (0) och av första ordningen (1) fas korrigerings ikoner genom att dra musen tills alla signalerna är i negativ absorption läge. Tillämpa och spara fas korrigeringsvärdena genom att klicka på "Return och spara" -knappen för att avsluta faskorrigeringen läge.
      11. Öka tau tills alla toppar är antingen positiv eller nollas genom att upprepa stegen 2.2.2.6-2.2.2.9. För att bestämma värdet på T 1, helt enkelt dela tau värdet där toppen nollas med ln2.
    3. T en mätning mätt med nollmetod 16 för 13 C
      1. Skapa en ny datauppsättning för 13 C (se steg 2.1.9)
      2. Typ "pulprog t1irpg" för att ändra pulssekvensen till inversionsåtervinning Experiment för kol kärnor.
      3. Skriv följande kommandon på kommandoraden för att ställa in den spektrala bredden i ppm, i mitten av RF-sändaren, antalet avsökningar, antalet dummy avsökningar och antalet datapunkter: "sw 200", "o1p 98" , "ns 8", "ds 2" och "td 64K".
      4. Typ "p1 (värde)" och ange varaktighetsvärdena för 90 ° puls såsom bestäms av puls kalibreringen (se steg 2.2.1) och typ "p2 (värde)" för 180 ° pulsen (varaktighet värdet är 90 ° pulslängd multiplicerat med två).
      5. Ställa återföringsfördröjningen till ett mycket stort värde, såsom 100 s genom att skriva "d1 100".
      6. Set tau till ett kort värde, såsom 100 ms genom att skriva "d7 100ms" på kommandoraden.
      7. Ställ mottagareer förstärkning (RG) till ett lämpligt värde med hjälp av kommandot "RGA" för automatisk beräkning av RG.
      8. Kör ett spektrum genom att skriva kommandot "ZG".
      9. Utför Fourier-transformation genom att skriva "EFP" i kommandoraden.
      10. Utför automatisk korrigering fas genom att skriva kommandot "APK" i kommandoraden. Om ytterligare fasjusteringar krävs för att ytterligare förbättra spektrumet, klicka på "Justera Fas" -ikonen och faskorrigeringen ikoner för ordningen noll (0) och första ordningens fas (1) korrigering.
        1. Samtidigt klicka på de nollte ordningens och första ordningens fas-korrigerings ikoner, dra musen tills alla signalerna är i negativ absorption läge. Tillämpa och spara fas korrigeringsvärdena genom att klicka på "Return och spara" -knappen för att avsluta faskorrigeringen läge.
      11. Öka tau tills alla toppar är antingen positiv eller nollas genom att upprepa stegen 2.2.3.6-2.2.3.9. Att bestämmavärde T 1, helt enkelt dela tau värdet där toppen nollas med ln2.
  3. Endimensionella (1D) NMR-spektra
    1. 1 H-NMR-spektra
      1. Förvärv av NMR-data
        1. Gå till en H-datauppsättningen skapade i steg 2.1.7 och använda standard "puls-förvärv" pulssekvens, "zg", genom att skriva "pulprog zg" på kommandoraden.
        2. Skriv följande kommandon på kommandoraden för att ställa in den spektrala bredden i ppm, i mitten av RF-sändaren, antalet avsökningar, antalet blind avsökningar, antalet datapunkter och pulsvaraktigheten för en 90 ° pulsvinkel : "sw 8", "o1p 3,8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" och "p1 (bestämda genom puls kalibrering)" (se steg 2.2.1).
          OBS: 32K datapunkter kan användas för 500 MHz-instrument.
        3. Ställa in en relaxationsfördröjning av 7 s för 500 MHz-instrument eller 9 s för 850 MHz-instrument genom att skriva "d1 7s" eller "d1 9s", respektive, på kommandoraden.
        4. Ställ in mottagarens förstärkning (RG) till ett lämpligt värde med kommandot "RGA" för automatisk beräkning av RG.
        5. Typ "digmod baseopt" att förvärva ett spektrum med förbättrad baslinjen.
        6. Starta förvärv genom att skriva puls förvärva kommandot "ZG" i kommandoraden.
      2. Bearbetning av NMR-data
        1. Skriv "si 64K" i kommandoraden för att tillämpa noll fyllning och ställa in storleken på den verkliga spektrum till 64K.
        2. Ställa in linjebreddning parametern till 0,3 Hz genom att skriva "lb 0,3" på kommandoraden för att applicera en viktningsfunktion (exponentiell avklingning) med en linje bredda faktor på 0,3 Hz före Fourier-transform.
        3. Utför Fourier-transformation genom att skriva "EFP" i kommandotlinje.
        4. Utför automatisk korrigering fas genom att skriva kommandot "APK" i kommandoraden. Om ytterligare fasjusteringar krävs för att ytterligare förbättra spektrumet, klicka på "Process fliken" och sedan klicka på "Justera Fas" -ikonen och faskorrigeringen ikoner för ordningen noll (0) och av första ordningen (1) faskorrigering .
          1. Samtidigt klicka på de nollte ordningens och första ordningens fas-korrigerings ikoner, dra musen tills alla signalerna är i positiv absorption läge. Tillämpa och spara fas korrigeringsvärdena genom att klicka på "Return och spara" -knappen för att avsluta faskorrigeringen läge.
        5. Applicera ett polynom av fjärde ordningen funktion för bas-linjekorrigering vid integrering genom att skriva kommandot "abs n".
          OBS: Detta säkerställer en platt spektral baslinje med ett minimum intensitet.
        6. Rapport kemiska skift i ppm från TMS (δ = 0). Klicka på kalibrering ( "Calib. Axär ") ikon, och placera markören med den röda linjen på toppen av TMS NMR-signalen (topp närmast 0). Vänster klicka och skriv in '0'.
      3. NMR analys av data
        1. Integrera den spektrala regionen från δ 1,1 till ö 0,6 samt topparna vid δ 4,98, δ 5,05 och δ 5,81 med hjälp av "integrera" -ikonen (under "Process" -fliken) och höjdpunkten ( "Definiera ny region") ikon. Vänsterklicka och dra genom integral.
          OBS: Om det finns behov av att fokusera på en region, klicka på ikonen markera att avaktivera och vänsterklicka och dra musen för att zooma in på området. För att ställa in tröskeln intensitet, använd musens mittenknapp om det behövs. Klicka på ikonen markera igen för att göra integrationsfunktionen aktiv, sedan gå vidare till nästa topp.
          1. Normalisera summan av ovanstående integraler till 100 genom att högerklicka på integralvärdet som visass under signal och välj "Normalisera summan av integral". Mata in värdet "100" i rutan och klicka på "Return och spara" för att avsluta integrationen läget.
        2. Vid användning av BHT som en inre standard, integrera toppen vid δ 6,98 och ställ integralen lika med det antal millimol BHT per 0,5 ml av förrådslösningen.
        3. Integrera topparna av intresse (se steg 2.3.1.3.1) som sträcker sig 10 Hz från vardera sidan av toppen, när det är möjligt.
        4. Fortsätta att utföra 13 C-NMR-spektra förvärv och bearbetning på ett liknande sätt.
    2. 13 C-NMR-spektra
      1. Förvärv av NMR-data
        1. Gå till 13 C-datauppsättning och använda den inversa gated frikopplade pulssekvens, "ZGig" genom att skriva "pulprog ZGig" på kommandoraden.
          OBS: Om du vill köra ett kol experiment med standardbredbands decouPLED pulssekvens, typ "pulprog zgpg" på kommandoraden.
        2. Skriv följande kommandon på kommandoraden för att ställa in den spektrala bredden i ppm, i mitten av RF-sändaren, antalet avsökningar, antalet blind avsökningar, antalet datapunkter och pulsvaraktigheten för en 90 ° pulsvinkel : "sw 200", "o1p 95", "ns 16" "ds 2", "td 64K" och "p1 (bestämda genom puls kalibrering)" (se steg 2.2.1.4).
        3. Ställa in en relaxationsfördröjning av 35 s för 500 MHz-instrument eller 45 s för 850 MHz-instrument genom att skriva "d1 35s" eller "d1 45s", respektive, på kommandoraden. Vid användning av BHT, bör avkoppling fördröjning vara 50 s i 500 MHz-instrument och 60 s i 850 MHz-instrument.
        4. Ställ in mottagarens förstärkning (RG) till ett lämpligt värde med kommandot "RGA" för automatisk beräkning av RG.
        5. Typ "digmod baseopt" på kommandoraden att förvärva ett spektrum wed förbättrad baslinjen.
        6. Starta förvärv genom att skriva puls förvärva kommandot "ZG" i kommandoraden.
      2. Bearbetning av NMR-data
        1. Skriv "si 64K" i kommandoraden för att tillämpa noll fyllning och ställa in storleken på den verkliga spektrum till 64K.
        2. Ställa in linjebreddning parametern till 1,0 Hz genom att skriva "lb 1,0" på kommandoraden för att applicera en viktningsfunktion (exponentiell avklingning) med en linje bredda faktor på 1,0 Hz före Fourier-transform.
        3. Utför Fourier-transformation genom att skriva "EFP" i kommandoraden.
        4. Utför automatisk korrigering fas genom att skriva kommandot "APK" i kommandoraden. Om ytterligare fasjusteringar krävs för att ytterligare förbättra spektrumet, klicka på "Process fliken" och sedan klicka på "Justera Fas" -ikonen och faskorrigeringen ikoner för ordningen noll (0) och första ordningens fas (1) korrigering .
            OBS: För kol-spektra registrerades på Larmor-frekvensen för 214 MHz (850 MHz-instrument) korrigering av de beroende fel frekvens (första ordningen) kan vara utmanande och tidskrävande för mindre erfarna användare på grund av de stora off-resonans effekterna av 90 ° puls.
        5. Applicera ett polynom av fjärde ordningen funktion för bas-linjekorrigering vid integrering genom att skriva kommandot "abs n" på kommandoraden.
        6. Rapport kemiska skift i ppm från TMS (δ = 0). Klicka på kalibrering ( "Calib. Axis") ikonen och placera markören med den röda linjen på toppen av NMR-signalen som ska refereras. Vänsterklicka och skriv in "0".
      3. NMR analys av data
        1. Integrera den spektrala regionen från δ 175 till ö 171 med ikonen "integrera" (under "Process" -fliken) och höjdpunkten ( "Definiera ny region") ikon. Vänsterklicka och dra genom integral.
          OBS: Om det finns behov av att fokusera på en region, klicka på ikonen markera att avaktivera och vänsterklicka och dra musen för att zooma in på området. Klicka på ikonen markera igen för att göra integrationsfunktionen aktiv, sedan gå vidare till nästa topp.
          1. Ställ en integrerad del av 100 genom att göra en högerklicka på integralvärdet som visas under signalen och välj "Kalibrera Current Integral". Mata in värdet "100" i rutan och klicka på "Return och spara" för att avsluta integrationen läget.
        2. Vid användning av BHT som en inre standard, integrera toppen vid δ 151,45 och ställ integralen lika meddet antal millimol BHT per 0,5 ml av förrådslösningen.
        3. Integrera topparna av intresse som sträcker sig 5 Hz från vardera sidan av toppen (se steg 2.3.2.3.1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett H och 13 C NMR-spektra uppsamlades för kommersiellt tillgängliga kosttillskott fiskolja med användning av två NMR-instrument; en 850 MHz och en 500 MHz-spektrometer. Dessa spektra kan användas för kvantitativ bestämning av komponenter i fiskolja, såsom dokosahexaensyra (DHA) och eikosapentaensyra (EPA), liksom andra föreningar, såsom n -1 acylkedjor och näringsmässigt viktigt index såsom n -6 / n -3 förhållande. Kvantifieringen kan utföras även utan användning av en inre standard, men de kvantitativa resultaten skall uttryckas som relativa molära procenttal. När data måste uttryckas i absoluta värden (mg / g), är en intern standard som krävs. De resultat som erhölls med NMR är mycket reproducerbara med relativa standardavvikelser (RSD) som sträcker sig från 0,3% till 2% för 13 C-NMR-analys och från 0,5% till 2,5% för en H-NMR-analys, beroende på t han lipid. Den något högre RSD för en H NMR observeras ofta eftersom protonspektra tenderar att vara överfulla, vilket påverkar noggrannheten i analysen, särskilt för resonanser som har en lägre signalbrusförhållande (S / N). En mycket god överensstämmelse fanns mellan 850 MHz och 500 MHz-instrument med rsds varierande från 1% till 4%. Relativt höga rsds (upp till 8%) observerades vid jämförelse av resultat som erhållits av ett H och 13 C, särskilt för föreningar som visas i lägre koncentrationer, såsom n -1 acylkedjor. NMR-spektroskopi har tidigare validerat som ett verktyg för lipidanalys, inklusive fastställandet av vissa fiskoljekomponenter. Resultaten visade att det är i god överensstämmelse med traditionella metoder, såsom GC 17, 18.

1 H NMR Analysis

"xfig"> Figur 1 jämför en H NMR-spektra förvärvas på (A) en 850 MHz och (B) ett 500 MHz-instrument. 850 MHz-spektrumet kännetecknas av högre upplösning, men de viktigaste komponenterna i fiskolja, inklusive DHA, EPA, och n -6 / n -3-förhållandet kan även bestämmas från 500 MHz spektrum. De 1 H-NMR signaler av fiskolja-fettsyror som kan användas för kvantifiering ändamål visas i tabell 1, medan kan hittas den fullständiga NMR tilldelning av ett H-NMR-spektrum av fiskolja på andra ställen 19.

1 H NMR gav tillförlitliga uppgifter för kvantifiering av den totala mängden av n -3, n -6, DHA, transfettsyror, n -1 acylkedjor, och mättade fettsyror (SFA). För ett H-NMR-analys, krävs användningen av lämpliga relationer eftersom de flesta av de signals tillhör grupper av protoner som är gemensamma för olika fettsyror och lipider. Av den anledningen, i de flesta fall koncentrationen av fettsyror i fiskolja kan bestämmas endast genom kombination av olika 1 H NMR-signaler, som införlivas i de lämpliga förhållandena. Dessutom är dessa ekvationer innehåller aritmetiska koefficienter som normaliserar den olika antal protoner som associeras med varje grupp. När en intern standard används följande ekvation bör beaktas: C = I / I IS * N IS / N x A x MW / m (1), där C är koncentrationen av analyten i mg / g av fiskolja, jag är integralen av en resonans som är unikt tillskrivas till lipiden av intresse, jag IS är det område av en protonsignal som hör unikt till den interna standarden, är N antalet protoner i den funktionella gruppen som analyseras,N IS är antalet protoner för den interna standard som används för analysen, A är det antal millimol inre standard, är MW molekylvikten av fettsyran (uttryckt i metylestrar), och m är den mängd fiskolja uttryckt i gram.

Exempel 1, DHA: Andelen DHA bestäms av ekvationen C DHA = ¾ I DHA / S, där jag DHA är integralen av signalen vid δ 2,39 som hör till de H a och H P protoner av DHA, och S är summan av integralerna för metylprotoner av SFA, n -6, n -9, n -3, transfettsyror plus integralerna för topparna i n -1 acylkedjor på δ 4,98, ö 5,05 och δ 5,81. Den integrerade I DHA är normanyttjas genom att multiplicera med 3/4, eftersom det motsvarar fyra protoner, medan integral S motsvarar tre protoner. 1 H-NMR inte är kapabel att ge information om positions fördelning av fettsyror på glycerolhuvudkedjan och kan sålunda endast användas för kvantifiering av den totala mängden fettsyror. Den 1 H-NMR-analys av en inkapslad fiskolja komplettera visade att den består av 10,5% av DHA. Koncentrationen av DHA i samma prov med användning av BHT befanns vara 105,23 mg / g. Dessa värden är mycket nära de värden som erhölls med 13 C-NMR (se exempel 2 för 13 C-analys).

Exempel 2, n -1 acylkedjor: Koncentrationen av n -1 acylkedjor ges av förhållandet C n-1 = 3 I n-1 / S, där I n-1 är integralen av signalen vid δ 5,818. Dettasignal motsvarar en proton och sålunda måste normaliseras genom multiplikation med tre. Vid användning av BHT, n -1 acylkedjorna bestäms av ekvationen C n-1 = 2 I n-1 / I BHT. Resultaten kan inte uttryckas i mg / g, eftersom MW n -1 acylkedjorna är okänd.

Exempel 3, n -6 / n -3 förhållande: Denna viktiga index kan beräknas från förhållandet mellan de normaliserade intensiteterna resonansen vid δ 2,77, vilket motsvarar bis-allyliska protoner i n -6 acylkedjor (två protoner) över triplett vid δ 0,97 som hör till n -3 fettsyror och motsvarar tre protoner. Relationen är Cn-6 / C n-3 = 3/2 I A / I B, där jag A och I B är integralerna för signalernavid δ 2,77 och δ 0,97, respektive. n -6 fettsyror bestäms från förhållandet C n-6 = 3 / 2I n-6 / S, där I n-6 är i ett stycke av de bis-allyliska protoner vid δ 2,77.

Exempel 4, transfettsyror: kan Transfettsyror beräknas från ekvationen C trans = I trans / S, där jag träns är integralen av signalen vid δ 0,91. Föreliggande provet innehöll 3,07% av transfettsyror, såsom bestämts genom en H NMR med användning av 850 MHz-instrument. Samma prov analyserades i ett 500 MHz-instrument visade sig innehålla 3,03% av transfettsyror.

Exempel 5, mättade fettsyror (SFA): Koncentrationen av SFA kan vara calculrerad från ekvationen C SFA = S - C n-3 - C n-6 - C n-9 - C n-1 - C träns. n -9 fettsyror (huvudsakligen oljesyra) kan kvantifieras i enlighet med ekvationen C n-9 = (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, där Q är integralen av de allyliska protoner i n -6 och n -9 vid δ 2,01. Mängden SFA i en kommersiellt tillgänglig provfiskolja befanns vara 36,1%. Samma prov analyseras med 13 C-NMR visade sig innehålla 33,8% SFA. SFA representera en grupp av olika FA (t.ex. stearinsyra och palmitinsyra) med olika MW och därmed deras koncentration om fiskolja inte kan uttryckas i mg / g.

Exempel 6, totala steroler: Mängden av totala steroler (fri och förestrad) kan bestämmas genom den signal av metyl- protoner vid kol 18 som uppträder vid δ 0,68, med användning av ekvationen C = I ste / S. Molförhållandet av totala steroler i ett kommersiellt tillgängligt prov fiskolja befanns vara 0,32%. BHT kan också användas för bestämning av den absoluta koncentrationen av steroler. De huvudsakliga steroler i fiskolja är kolesterol och vitamin D (eller dess prekursor 7-dehydrokolesterol) och tillsätts ofta i tillskott. Dessa föreningar har en mycket liknande MW. Därför kan resultaten uttryckas i mg / g och beräknas enligt ekvationen C = 2/3 I STE / I är ett × MW STE / m, där MW STE är den molekylmassa (386) av kolesterol, som utgör den majoriteten av sterolisk fraktionen i fiskolja 20. Mängden steroler i samma prov med användning av BHT var 3,8 mg / g av fiskolja. Individuell bestämning av kolesterol (δ (δ 0,678) är genomförbart på ett 850 MHz-instrument efter appliceringen av en fönsterfunktion för upplösningsförbättring.

13 C NMR Analysis

Figur 2 illustrerar den 13 C-NMR-spektra förvärvas på (A) en 850 MHz och (B) ett 500 MHz-instrument i karbonylkolet området. De två spektra är mycket lika och kan ge samma mängd information. Den 13 C NMR-spektrum kan med framgång användas för analys av ytterligare fettsyror såsom stearidonsyra (SDA) och eikosatetraensyra (ETA) syror, är emellertid mera avsökningar som krävs för prover i vilka dessa syror är i lägre koncentrationer. Den 13 C-spektra kännetecknas av hög upplösning på grund av den stora spektral bredd och tillämpningen av bredbands frikoppling, vilketeliminerar effekten av skalär koppling och producerar singletter. Av denna anledning finns det begränsad överlappning även när man använder en 500 MHz instrument.

Den 13 C NMR-spektrum är mycket mer informativ jämfört med ett H-NMR-spektrum och kan ge mer omfattande kvantitativa data eftersom mindre signal överlappning observeras (figurerna 1 och 2). Den mest användbara spektralområdet av 13 C-spektrumet är karbonylkolet regionen eftersom det ger kvantitativ information för ett stort antal fettsyror såväl som för deras läges distribution på glycerolskelettet 19, 21, 22. Metylgruppen området från δ 14,5 till ö 13,5 kan användas för snabb bestämning av den totala mängden av n -3, n -6, n -9 och mättade fettssyror (SFA), såväl som transfettsyror. Emellertid, i 500 MHz NMR-spektrometer, det finns en partiell överlappning av de n -6 och n -9 mättade fettsyror (SFA). Tillämpningen av en fönsterfunktion för upplösningsförbättring kan lösa detta problem, även om 850 MHz instrument anses fortfarande en mer tillförlitlig alternativ. Den olefiniska regionen av kol spektrumet kan användas för den totala mängden av n -3 och n -1 acylkedjorna såväl som för bestämning av enskilda fettsyror såsom DHA, EPA, Arakidonsyra (AA), linolensyra (Ln) n -3, och oljesyra (OL) (se tabell 2). 13 C-NMR kan tillämpas även för karakteriseringen av fiskolja från andra källor, såsom kosttillskott rika på etylestrar (EE) med användning av de kolsignaler vid δ 14,31 (metyl) och δ 60,20 (metylen).

Med avseende på kol-analys, kan fettsyror vara DeTermINED genom division av integralen av de lämpliga alifatiska, olefiniska och karbonylsignaler med den totala integralen av alla acylkedjor, enligt det allmänna förhållandet C = I / S (2), där C är koncentrationen av analyten i mol (% ), i är integralen av en resonans som är unikt tillskrivas till lipiden av intresse, och S är den totala integralen av signalen (s) som representerar det totala fettinnehållet i provet. Den totala integralen S från acylkedjor kan bestämmas genom integrering av regionen från δ 175 till ö 171 och är satt till 100.

Kvantifiering av fettsyror i mg / g av fiskolja utförs med användning av en intern standard på basis av följande förhållande: C = I / I IS x A x MW / m (3), där C är koncentrationen av analyten i mg / gav fiskolja, är I integralen av en resonans som är unikt tillskrivas till lipiden av intresse, i är är det område av en kol-signal som hör unikt till den interna standarden, A är det antal millimol intern standard, MW är molekyl vikten av föreningen av intresse (för fettsyror uttryckta i metylestrar) och m är den mängd fiskolja i g. De 13 C-NMR-signaler av fiskolja-fettsyror som kan användas för kvantifiering ändamål visas i tabell 2, medan återfinns den fullständiga NMR tilldelning av 13 C NMR-spektrum på andra ställen 19.

Exempel 1, EPA vid sn-2-positionen: Den mängd (%) av EPA på sn -2 position beräknas genom att dividera integralen hos signalen vid δ 172,56 genom S. Mängden av EPA vid sn-2-positionen i en commercially tillgängligt prov befanns vara 3,4% med användning av 850 MHz-instrument. Med användning av samma spektrometer och BHT som en inre standard, mängden av EPA vid sn-2-positionen uttryckt i mg / g av fiskolja är 29,73 mg / g. Samma prov analyserades i ett 500 MHz-instrument befanns innehålla 3,6% eller 31,39 mg / g av EPA i sn-2-positionen. Liknande resultat kan erhållas då man beräknar de relativa molekyl förhållandena av EPA vid sn -2 användning av en fullständigt frikopplat spektrum. Detta beror på karbonylkolet i EPA påverkas av protonavkoppling till samma försumbar grad som de andra karbonylkol, som används som referens. Emellertid är stora avvikelser observeras vid användning av BHT, eftersom kolet i BHT vid δ 151,45, som används för kvantifiering, ta emot en annan NOE förbättring jämfört med de karbonylkol av fettsyror. Av den anledningen bör helt frikopplade spektrum undvikas vid användning av interna standarder eller integrera carbons med olika multipliciteter.

Exempel 2, total mängd av DHA: Den totala mängden (%) av DHA är helt enkelt beräknas genom att addera de mängder av DHA i sn -1,3 och sn-2-positionen såsom bestämts genom NMR-signaler vid δ 172,48 och δ 172,08, respektive. Samma prov analyserades med ett H-NMR (se exempel 1 av en H-analys) visade sig innehålla 10,3% DHA enligt 13 C-NMR-analys. Mängden DHA kan också uttryckas i mg / g med användning av en intern standard och ekvation 3. Den totala mängden av DHA var 103,25 mg / g.

Exempel 3, totala mängden av SDA: är den totala mängden (%) av SDA bestäms genom att addera integralerna för signalerna vid δ 172,99 och δ 172,60 vilka hör till de karbonylkol av SDA på positionen sn -1,3 ochsn -2, respektive, sedan dividera summan med S. Det analyserade provet befanns innehålla 3,93% SDA eller 34,54 mg / g.

Exempel 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) kan bestämmas genom att dividera integralen hos signalen vid δ 131,85 med integralen S. Det molära förhållandet av n -3 Ln i det analyserade oljeprovet fisk var 0,7%. Den absoluta koncentrationen med användning av BHT beräknades som 5,5 mg / g.

Exempel 5, transfettsyror: Molförhållandet av trans-fettsyror bestäms genom att dividera integralen hos signalen vid δ 13,80 med S. Analysen av samma prov som analyserades med en H NMR och befanns vara 3,07% av trans FA, analyserades också med 13 C-NMR och dess trans-fettsyrahalt befanns vara 3,42%. Than 13 C NMR-analys av samma prov på en 500 MHz-instrument visade en halt 3,64% av transfettsyror. Mängden av trans FA i mmol / g av fiskolja kan bestämmas med användning BHT som inre standard och ekvationen C = I / I IS x A / m, men resultaten kan inte uttryckas i mg / g, eftersom toppen vid δ 13,80 motsvarar olika transfettsyror, huvudsakligen träns DHA och trans EPA, med olika MW.

Exempel 6, EE: Koncentrationen av EE i ett oljeprov fisk beräknas genom att dividera integralen av den spektrala området från δ 60,50 till ö 60,00, som motsvarar de metylenkol av EE av olika fettsyror, med S. Analysen av ett oljeprov EE fish visade att den bestod av 100% EE. Det bör noteras att i EE prover, EPA can beräknas antingen av karbonyl topp vid δ 173,60 eller av den metylen EE kol vid δ 60,20, medan DHA kan beräknas med användning av signalen vid δ 60,31 och / eller signalen vid δ 173,09.

En komplett lista över de diagnostiska signaler som kan användas för kvantifiering ändamål med 13 C och ett H-NMR-analys kan hittas i tabellerna 1 och 2, respektive, medan kan hittas en detaljerad beskrivning av de ekvationer som kan användas för denna analys någon annanstans 19.

NMR kan dessutom användas för att bedöma oxidation status kosttillskott fiskolja. Figur 3 jämför ett H-NMR-spektra för ett oljeprov fiskar enligt två oxidationsbetingelser; exponering för upphettning och exponering för ultraviolett (UV)ljus. Lipidoxidation är en komplicerad process, och sammansättningen av oxidationsprodukter beror på villkoren för oxidation. De viktigaste oxidationsprodukterna är hydroperoxider (ö 8,0-8,8), konjugerade diener hydroperoxider (δ 5.4-6.7), och aldehyder (ö 9.0- 10).

Figur 1
Figur 1. Den 1 H NMR-analys. 850,23 (A) och 500,20 MHz (B) en H-NMR-spektrum av en fiskolja tillägg i CDCI3-lösning. NMR-signalerna hos EPA och DHA, som kan användas för deras bestämningen visas. Toppen vid δ 0,97 kan användas för bestämning av den totala mängden av n -3 fettsyror. Ramanslagen vid δ 1,39-1,20 beskärs, eftersom den tillhör metylenprotonerna av alla fettkedjas och kan inte användas för några identifiering eller mätning ändamål. Den 1 H NMR-spektrum kännetecknas av en smalare spektralbredd (SW) jämfört med 13 C NMR-spektrum och sålunda med lägre spektral upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Den 13 C-NMR-analys. 213,81 (A) och 125,77 MHz (B) 13 C-NMR-spektrum av ett kosttillskott med fiskolja i CDCI3-lösning i karbonylkolet regionen. NMR-signaler av EPA och DHA på sn -1,3 och sn-2-positionen visas. Dessa signaler kan användas för kvantitativ bestämning av EPA och DHA. Även om spectra registrerades vid 213,81 MHz kännetecknas av en högre upplösning och känslighet, kan 125,77 MHz-spektra också användas för bestämning av de stora föreningarna. Tillämpningen av frikoppling i 13 C-NMR experiment eliminerar effekten av skalär koppling mellan kol- och väte kärnor och sålunda signalerna visas som singletter gör analysen enklare jämfört med ett H-NMR-spektrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 3
Figur 3. Fiskolja oxidation. Den 1 H-NMR-spektrum av oxiderad fiskolja beror på oxidationsbetingelser. Resonanser tillskrivs hydroperoxider (ö 8,0-8,8), conjugated diener hydroperoxider (δ 5.4-6.7), och aldehyder är visade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

δ ppm Proton Förening
0,677 CH 3 (18) Kolesterol
0,678 CH 3 (18) 7-dehydrokolesterol
0,88 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,27 Hz n -9, SFA acylkedjor
0,883 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,08 Hz n -6 acylkedjor
0,911 CH 2 CH 3 (t), J ω; 1, ω2 = 7,65 Hz Trans acylkedjor
0,973 CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,63 Hz n -3 acylkedjor
1,25 CH 2 CH 3 (t), J = 7,20 Hz etylestrar
1,697 OCOCH2CH 2 (t), J H α, Η β = Hz EPA acylkedjan
2,391 OCOCH 2 CH 2 (t) DHA acylkedjan
2,772 CH = CHCH 2 CH = CH n -6 acylkedjor
2,81 CH = CHCH 2 CH = CH n -3 acylkedjor
3,593 3'a-CH 2 OCO Glycerol av en-MAG
3,722 3'a, 3217; b-CH 2 OCO (br) Glycerol 1,2-DAG
4,073 2'-CHOH (br) Glycerol av 1,3-DAG
4,121 CH 2 CH 3 multiplett etylestrar
4,173 1'b, 3'b-CH 2 OCO (dd) Glycerol av 1,3-DAG
4,238 1'a-CH 2 OCO (dd) Glycerol 1,2-DAG
4,329 1'b-CH 2 OCO (dd) Glycerol 1,2-DAG
4,989 -CH = CH 2 cis (dd) n -1 acylkedjor
5,052 -CH = CH 2 trans (dd) n -1 acylkedjor
5,082 2'-CHOCO Glycerol 1,2-DAG
5,268 2'; -CHOCO Glycerol av TAG
5,436 CH = CHCH 2 CH = CH 2 n -1 acylkedjor
5,818 -CH = CH 2 n -1 acylkedjor

Tabell 1: Tilldelningen av ett H-NMR-spektrum. De 1 H-NMR kemiska skift av fiskolja-fettsyra-signaler som kan användas för kvantifiering ändamål i CDCl 3-lösning presenteras. De kemiska förskjutningarna mättes i ppm och ger information om den kemiska miljön av kärnorna.

δ ppm Kol
173,24 C1 SFA (sn -1,3)
172,21 C1 OL, LO (sn -1,3)
C1 ETA (sn -1,3)
173,13 C1 DPA (sn -1,3)
173,03 C1 SDA (sn -1,3)
172,97 C1 EPA (sn -1,3)
172,73 C1 ETA (sn -2)
172,69 C1 DPA (sn -2)
172,61 C1 SDA (sn -2)
172,56 C1 EPA (sn -2)
172,48 C1 DHA (sn -1,3)
172,08 C1 DHA (sn -2)
136,8 Cω1, n -1
131,85 Cω3 LN
130,37 C15 AA
130,11 C9 LN
130,06 C13 LO
129,54 C5 DHA sn -2
129,47 C5 DHA sn -1,3
128,94 C5 EPA
128,76 C6 EPA
128,45 C17 n -3
127,71 n -3
127,53 C4 DHA sn -2
127,5 C4 DHA sn -1,3
126,86 Cω4, alla n -3
114,71 Cω2, n -1
60,08 DHA, Etylestrar
59,96 EPA, Etylestrar
59,95-59,85 Andra FA, Etylestrar
33,48 C2 EPA sn -2
33,32 C2 EPA sn -1,3
31,44 C3 n -1
27,05 Allylisk n -6
26,49 C4 EPA sn -1,3
26,47 C4 EPA sn -2
24,6 C3 EPA
24,48 C3 SDA sn -1,3
24,44 C3 SDA sn -2
14,27 Cω1, alla n -3
14,13 Cω1, SFA
14,11 Cω1, OL
14,07 Cω1, LO
13,8 Cω1, trans FA

Tabell 2: Tilldelningen av 13 C-NMR-spektrum. De 13 C-NMR-kemiska skift av fiskolja-fettsyra-signaler som kan användas för kvantifiering purpoperativsystemmiljöer i CDCl 3-lösning presenteras.

Supplementär Figur S1: Jämförelse mellan den 13 C-NMR-spektra förvärvas med användning av standard bredband frikoppling (A) och den inversa gated frikoppling (B) pulssekvenser. De spektra registrerades för samma prov med samma antal avsökningar, bearbetas med samma parametrar bearbetning och visas med samma skalfaktor. Klicka här för att ladda denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ändringar och strategier för felsökning

Spectral kvalitet. Linjebredden av NMR-signalen och således upplösningen av NMR-spektrum är mycket beroende av mellanlägg, vilket är ett förfarande för optimering av homogeniteten hos det magnetiska fältet. För rutinanalys, är 1D mellanlägg tillräcklig och en 3D-mellanlägg krävs inte, med tanke på att det utförs av NMR personal på en regelbunden basis. Om detta inte är fallet, måste en 3D kompensations utföras före analys med användning av ett prov innehållande 0,6 ml H 2 O: D 2 O (90:10). För att uppnå en bättre och snabbare mellanlägg, behöver det prov som skall centreras i exciterings / detekteringsområdet av radiofrekvent (RF) spole, med hjälp av graderad djupmätare, innan den placeras i magnetöppningen. En annan faktor som påverkar mellanlägg är spinning av provet vid en spinnhastighet av 10-20 Hz. Även om spinning av provet vid denna spinnhastighet förbättrar de radiella mellanläggen (X, Y, XY, XZ, YZ, X 2 Y 2, etc), är det i allmänhet inte rekommenderas för att undvika uppkomsten av spinnsidoband hos den första eller högre ordning. Emellertid, när man arbetar på instrument som är verksamma i Larmor frekvenser som är lägre än 400 MHz, är spinn rekommenderas för 1D NMR-experiment.

Upplösning, såväl som känslighet, påverkas av mottagarens förstärkning (rg) värde. Låga värden på mottagarens förstärkning minskar känsligheten, medan värden högre än lämplig orsak överflöde av analog-till-digitalomvandlare (ADC). ADC överströmningsresulterar i osymmetrisk linje-former och de signaler kan inte användas för kvantitativa syften eftersom de första punkterna i fri induction decay (FID) kan gå förlorad. I de flesta fall kommandot "RGA" beräknar ett lämpligt rg värde. Men i vissa fall är rg värdet beräknas av programvaran högre än det ideala värdet och det finns en distorsion i Lorentz formen av NMR-signalen. Isådant fall användaren bör manuellt mata en mindre rg värde genom att skriva "rg (värde)" på kommandoraden. Ett typiskt RG värde för de prover som analyserats med detta protokoll är åtta.

Ofta, när man använder kryogeniskt kyld NMR sonder med ett högt kvalitets-faktor (Q-faktor), en stor fördröjning (dödtid)> 200US mellan den sista pulsen och detekteringsperioden krävs för att undvika artefakter såsom en puckel runt frekvens sändarens och en rullande i spektrumet baslinje. Orsakar emellertid en så lång fördröjning en stor negativ första ordningens fasfel, som också kan införa en baslinje valsning och stora nedgångar runt basen av de starka signaler. I dessa fall kan en z-restaurerad spinneko pulssekvens användas för att producera NMR-spektra med avsevärt förbättrade baslinjer, även om en liten känslighetsreduktion kan förekomma 23.

Fosfolipider. Utöver analysen av fiskoljaprover rika på triglycerider och etylestrar, kan NMR användas för analys av fiskoljeprover rika på fosfolipider (PL). Dock särskild omsorg krävs för sådana prover eftersom PLS bildar aggregat, som kan orsaka en betydande minskning av den spektrala upplösning och känslighet. För analys av dessa prover, en lösningsmedelsblandning av deutererad kloroform: metanol (CDC! 3: CD 3 OD) i ett förhållande av 70:30 krävs för att erhålla spektra av hög kvalitet.

Intern standard. BHT valdes som en intern standard i denna studie, därför att den är en mycket symmetrisk molekyl med enkel ett H och 13 C-NMR-spektra och ingen av dess toppar överlappar med de för fiskoljebeståndsdelar. BHT har en signal i ett H-NMR-spektrum, som visas som en singlett vid δ 6,97 och tillhör de två ekvivalenta aromatiska protoner (para - position i förhållande till OH-gruppen) och en signal vidδ 151,45 i 13 C NMR-spektrum som hör till den aromatiska kvaternära kolet som bär gruppen -OH. Båda dessa signaler har ingen överlappning med någon av beståndsdelarna i fiskolja, och därmed kan användas för kvantifiering ändamål. Andra föreningar såsom 1,2,4,5-tetraklor-3-nitrobensen (TCNB) eller etylenklorid kan också användas som alternativa interna standarder, emellertid kännetecknas de av längre T 1-värden.

Begränsningar av tekniken

Kvantifiering av olika fettsyror och lipider i fiskolja tillskott uppnås genom integration av de lämpliga diagnostiska NMR-signaler i 1D-spektra. Sådana signaler bör tillhöra endast till en specifik provkomponent och måste ha någon interferens med signaler från andra föreningar. Detta kan vara ett problem för en H-NMR-analys, eftersom en H-NMR-spektrum kännetecknas av låg upplösning på grund av den korta räckvidden av cheMICAL skift. Dessutom, närvaron av skalär koppling (J) ger multipletter och gör analysen mer komplicerad. Till exempel, kan etylestrar (EE) kvantifieras med hjälp av ett H-NMR av den karakteristiska triplett (J = 7,20 Hz) av metylgruppen vid δ 1,25 och multiplett vid δ 4,12, som tillhör de metylenprotoner i estergruppen. Emellertid, vid användning av NMR-instrument som är verksamma i Larmor frekvenser som är lägre än 850 MHz, analysen av EE använder ett H NMR bör undvikas på grund av den partiella överlappningen av toppen vid δ 4,12 med toppen vid δ 4,14 av TGs, och överlappningen av signalen vid δ 1,25 med bred signal av de alifatiska metylenprotonerna vid δ 1,23-1,35. Stora avvikelser observerades också mellan ett H och 13 C-analys av EPA i vissa prover, var 13 C-NMR närmare till den märkta sammansättningen tillhandahålls av than tillverkaren. Detta är förmodligen på grund av överlappningen av signalen vid δ 1,69, som används för EPA-analys, med signaler av andra föreningar som förekommer i vissa typer av fiskolja tillskott. Ytterligare fel i kvantifieringar kan uppstå vid användning av en intern standard på grund av att det osäkra renhet av den interna standarden och från fel vid vägning.

Sammansättningsanalys kan uttryckas i relativa molära koncentrationer utan användning av en inre standard. Om resultat måste uttryckas i absoluta koncentrationer, exempelvis som milligram fettsyra per gram olja (mg / g), krävs användningen av en intern standard. Emellertid, i de fall där NMR-signalen av intresse hör till flera föreningar med olika molekylvikter, kan resultaten inte uttryckas som mg / g även vid användning av en inre standard. Dessutom ökar användningen av inre standard vanligtvis längden av analysen, eftersom den vanligaste interna s STANDARDER, såsom BHT, är små molekyler med hög molekyl symmetri, vilket resulterar i långa relaxationstider. Eftersom repetitionstiden (fördröjning mellan pulser + förvärvs tid) ställs in enligt den längsta relaxationstiden T 1 i provet, kommer användningen av en intern standard öka varaktigheten av de experiment som längre fördröjningar mellan pulser erfordras. Detta är en särskilt viktig faktor för 13 C-NMR-analys på grund av den exceptionellt långa T en relaxationstid av kol- kärnor. Tillsats av en paramagnetisk förening, såsom Cr (acac) 3 kan effektivt minska T en relaxationstiden. Den rekommenderade koncentrationen av Cr (acac) 3 är 0,75 mg / ml lösning. Högre koncentrationer av Cr (acac) 3 kan övervägas för ytterligare minskning av T 1, dock krävs försiktighet för att undvika minskningar i S / N-på grund av linjebreddning.

ntent "> Även om 13 C-NMR kännetecknas av en mycket högre spektral upplösning jämfört med en H, är känsligheten hos 13 C-NMR experiment signifikant lägre på grund av den låga naturliga förekomsten (1,1%) och den låga gyromagnetiska förhållandet (67,26 10 6 rad s -1 T -1) av 13 C kärnor. Dessutom är de långa T 1 relaxationstider av 13 C öka längden av analysen. Detta kan vara ett problem när den tillgängliga oljan för analys är begränsad, eftersom en ökad antalet avsökningar bör användas för att uppnå en rimlig signal-brusförhållande.

Begränsningar i känslighet och upplösning av NMR-spektra förhindra analys av många mindre föreningar i fiskolja som kan analyseras med andra tekniker såsom GC. Till exempel, är oförmögen att separera individuella steroler eller fettsyror (t ex palmitin- och stearin) medan 13 C 1 Η NMRinte är i stånd att bestämma föreningar som visas i mycket låg koncentration i fiskolja, såsom dodekansyra och myristinsyra, som överlappar med signalerna från alla mättade fettsyror i δ 173,24 och δ 172,82. Även om att öka mängden av provet som analyseras gör analysen av några mindre föreningar genomförbara krävs försiktighet för mycket koncentrerade prover, på grund av deras ökade viskositet. Mycket viskösa lösningar som innehåller mer än 150 mg olja bör undvikas eftersom det finns en minskning i S / N på grund av linjebreddning som orsakas av de reducerade spinn-spinn-T 2 relaxationstider. Dessutom är längre fördröjningar mellan pulser som krävs på grund av den längre T 1 och det finns flera frågor i mellanlägg och därmed i upplösning.

Alla föreningarna som analyseras i fiskolja med NMR kan kvantifieras samtidigt i en ögonblicksbild utan att använda några separations- eller reningssteg. NMR-enALYS är snabb som en H-spektrumet kan registreras på mindre än en minut, under det att 13 C-NMR förvärvet varar 10 min. Det bör dock noteras att det finns några faktorer som påverkar datainsamlingstiden. Specifikt för 13 C-NMR, kan endast uppnås den 10 minuters körtid utan användning av interna standarder, och med användning av kryogeniskt kylda prober, i vilka RF-spolen och förförstärkaren kyls och därmed det termiska brus minimeras. En 10-15-faldig ökning i den experimentella tid bör förväntas för 13 C-NMR-analys, när rumstemperaturen (konventionella) prober används.

Betydelse med hänsyn till befintliga metoder

NMR-spektroskopi visade sig vara ett kraftfullt verktyg för kvalitativ och kvantitativ bestämning av sammansättningen av fiskolja kompletterar, och på grund av dess rapidness har den potential som skall tillämpas för högkapacitetsscreening av ett stort nu mber av fiskoljeprover. NMR-spektroskopi är per definition en kvantitativ metod eftersom signalen området är direkt proportionell mot antalet kärnor som orsakar signalen. Medan akut toxiska kemikalier är skyldiga att upprätta NMR-prover, är denna metod miljövänlig eftersom sådana små mängder av denna kemikalier (t.ex. CDCI3) används i motsats till andra metoder som kräver stora mängder lösningsmedel för att eluera proverna. Dessutom har NMR flera fördelar jämfört med andra analytiska metoder. Ingen kalibrering med standarder krävs före analysen, och en minimal provberedning utan några separations- och reningssteg är vanligtvis antagits, vilket gör NMR ett mycket snabbt analytiskt verktyg. Dessutom är 13 C-NMR bästa tillgängliga metod för bestämning av positions fördelning av olika fettsyror på glycerolskelettet. Medan den enzymatiska hydrolys har använts som ett alternativ är inte alltid tillförlitliga= "xref"> 24. Detta är av särskild betydelse eftersom det finns en betydande intresse av att studera regiospecificitet av olika fettsyror i livsmedel, eftersom det har visat sig att detta påverkar deras funktion i människans kost 25, 26.

framtida tillämpningar

Trots avtalet mellan NMR-analys och produkternas etikett, liksom det faktum att det finns vissa studier som visar överenskommelse mellan GC och NMR, tror vi att mer rigorösa och omfattande inom laboratoriestudier krävs för att undersöka avtalet mellan NMR och traditionell metoder för analys av fiskoljebeståndsdelar med användning av ett större antal prover, fiskoljeprodukter av olika ursprung, och certifierade standardlösningar.

En annan viktig framtida tillämpningen av NMR i fiskoljeanalys kommer att vara fastställandet av oxidationsprodukter. Utöver bestämnav de stora föreningarna i fiskolja, flera primära och sekundära oxidationsprodukter i fiskolja, såsom aldehyder och peroxider, är närvarande. 1 H-NMR kan potentiellt tillämpas för utvärdering av oxidationen status i tillskott fiskolja, under olika oxidationsförhållanden, såsom visas i fig 3. Den största utmaningen i denna analys kommer att vara NMR uppdrag och identifiera enskilda oxidationsprodukter. Framsteg inom känsligheten av NMR hårdvara kommer också att möjliggöra identifiering av individuella steroler med användning av 13 C-NMR. NMR-spektroskopi kan även tillämpas för analys av fisk vävnad som helhet även utan någon extraktion genom användning av högupplöst magiska Angle Spinning (HR-MAS) NMR.

Kritiska steg i protokollet

Två av de mest kritiska stegen som påverkar noggrannheten hos kvantitativa NMR-spektra inbegriper valet av en 90 ° -puls och användningen av en fördröjning mellan puLSES ≥ 5 x T 1. Pulsvinkeln är proportionell mot pulsbredd som är en kalibrerad NMR parameter som beror på instrumentering och provet. En 90 ° puls är nödvändig för fullständig omvandling av längsgående (z) magnetisering till den observerbara tvärgående (xy) magnetisering. Det är viktigt att notera att innan puls kalibrering, NMR sonde behov vara väl avstämd och matchas. Detta kommer att optimera överföringen av RF-effekten till provet och sålunda maximera S / N och säkerställa effektiv frikoppling. Sonden tuning är mest påverkad av den dielektriska konstanten för provet, så om det finns skillnader i koncentration mellan prover, upprepa avstämningsprocess för var och en. 1D 13 C-NMR experiment involverar både 13 C och 1 H-kanalerna så automatisk inställning och matchning är nödvändig för båda kärnor.

En fördröjning mellan pulser längre än 5 x T 1 säkerställer den fullständiga recovery av netto magnetiseringen till sitt initialvärde. Om alla resonanser i spektrumet inte helt har avslappnad före varje puls signalen delvis undertryckta och detta leder till felaktigheter i integrationen. Ett värde T är en kritisk faktor som påverkar längden av experimentet och det beror på den magnetiska fältstyrkan samt viskositeten hos provet. Givet att viskositeten mellan proverna är liknande, bör T en relaxationstider bestämmas för varje instrument endast i början av analyssessionen.

Ett annat viktigt särdrag hos oljeanalys fisk med 13 C-NMR är urvalet av den lämpliga pulssekvensen. Den mest tillförlitliga metoden för kvantitativ 13 C-analys är den inversa gated avkopplingsexperiment, där bredbandsprotonavkoppling tillämpas endast under förvärvsperioden och således finns det ingen polarisering överföring från en H till 13C via den nukleära Overhauser-effekten (NOE). Men medan den fullständigt frikopplat NMR experiment kan användas för kvantitativa syften, krävs försiktighet vid användning av detta experiment eftersom det finns olika NOE faktorer bland kol med olika multipliciteter och därför integrerad jämförelse mellan metyl-, metylen-, metan och karbonylkol måste undvikas. Trots detta, när endast kol av liknande multiplicitet och kemiska miljön anses i analysen, är det fullständigt frikopplade metoden tillförlitliga. Ett exempel på detta är karbonylkol av fettsyror som har befunnits ha några signifikanta skillnader i NOE-faktorerna efter frikoppling 27. Dessutom, för kolatomer som bär protoner tillhandahåller fullständigt frikopplade experimentet högre känslighet på grund av de NOE bidrag på NMR-signalintensitet. En jämförelse mellan spektra förvärvas med de två pulssekvenser visas i figur S1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av livsmedel för hälsa Discovery tema på Ohio State University och institutionen för livsmedelsvetenskap och teknik vid Ohio State University. Författarna vill tacka NMR anläggning vid Ohio State University och NMR anläggning vid Penn State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56 (8), 365-379 (2002).
  2. Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58 (5), 880-885 (1981).
  3. Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96 (11), 1521-1529 (2005).
  4. Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38 (8), 1107-1114 (1995).
  5. Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
  6. Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
  7. Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
  8. Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
  9. Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
  10. Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
  11. Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2 (2), 62-68 (2014).
  12. Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104 (6), 942-950 (2004).
  13. Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
  14. Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83 (1), 67-72 (2013).
  15. Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5 (6), 400-411 (2013).
  16. Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. , Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
  17. Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
  18. Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41 (8), 1247-1253 (1993).
  19. Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7 (12), 5226-5238 (2015).
  20. Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80 (10), 993-996 (2003).
  21. Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44 (12), 2406-2427 (2003).
  22. Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
  23. Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
  24. Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116 (3), 272-281 (2014).
  25. Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22 (1), 3-17 (2009).
  26. Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
  27. Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).

Tags

Kemi fiskolja NMR-spektroskopi omega-3 EPA DHA fettsyror kosttillskott
NMR-spektroskopi som ett kraftfullt verktyg för snabb utvärdering av lipidprofilen av fiskolja kosttillskott
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR… More

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter