Summary
Hierbij werd een hoge resolutie 1H en 13C kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie gebruikt als een snel en betrouwbaar middel voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van ingekapselde visolie supplementen.
Abstract
De westerse dieet is slecht in n -3 vetzuren, dus de consumptie van visolie supplementen wordt aanbevolen om de inname van deze essentiële voedingsstoffen te verhogen. Het doel van deze werkzaamheden is de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van ingekapselde visoliesupplementen aantonen met behulp van hoge resolutie 1H en 13C NMR spectroscopie NMR gebruikmaking van twee verschillende instrumenten; een 500 MHz en een 850 MHz instrument. Zowel proton (1H) en koolstof (13C) NMR-spectra kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van de hoofdbestanddelen van visoliesupplementen. Kwantificering van de lipiden in visoliesupplementen wordt verkregen door integratie van de geschikte NMR-signalen in het betrokken 1D spectra. Resultaten verkregen met 1H en 13C NMR komen goed overeen met elkaar, ondanks het verschil in resolutie en gevoeligheid tussen de twee kernen en de twee instrumenten. 1H NMR biedensa snellere analyse vergeleken met 13C NMR, omdat het spectrum kan worden opgenomen in minder dan 1 minuut, in tegenstelling tot 13C NMR-analyse, die duurt 10 minuten tot een uur. Het 13C NMR spectrum echter veel meer informatief. Het kan kwantitatieve gegevens voor een groter aantal individuele vetzuren en kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de positie verdeling van vetzuren op de glycerol hoofdketen. Beide kernen kan kwantitatieve informatie in slechts een experiment zonder de noodzaak van zuivering of scheiding stappen. De sterkte van het magneetveld voornamelijk invloed op de 1H NMR spectra vanwege de lagere resolutie bij 13 C NMR echter ook goedkopere NMR instrumenten efficiënt worden toegepast als standaardmethode door de voedingsindustrie en kwaliteitscontrolelaboratoria.
Introduction
De consumptie van n -3-vetzuren in het dieet gebleken gunstig tegen verschillende omstandigheden zoals hartstoornissen 1, 2, 3, 4 ontstekingsziekten en diabetes 5. De Westerse dieet is in n -3 vetzuren slecht beschouwd en daarmee de consumptie van visolie supplementen wordt aanbevolen om de n te verbeteren -6 / n -3 balans in de voeding van de consument 1. Ondanks de recente stijging van visolie supplement consumptie, vragen blijven over de veiligheid, authenticiteit en kwaliteit van sommige van deze producten. De snelle en nauwkeurige analyse van de samenstelling van visolie supplementen is essentieel voor de kwaliteit van deze commerciële producten goed te kunnen beoordelen en te zorgen voor de veiligheid van de consument.
De meest voorkomende methoden voor de beoordeling van visolie supplements zijn gaschromatografie (GC) en infraroodspectroscopie (IR). Hoewel deze zijn zeer gevoelige methoden, ze lijden aan verschillende nadelen 6. GC-analyse is tijdrovend (4-8 h), omdat scheiding en derivatisering verschillende verbindingen vereist 7 en lipide oxidatie kan optreden tijdens de analyse 8, 9. Terwijl IR spectroscopie kwantitatief kan worden, wordt een voorspellingsmodel moeten worden geconstrueerd met gebruikmaking partiële kleinste kwadraten regressie (PLSR), hoewel er uitzonderingen waarbij Infraroodbanden kan worden toegeschreven aan een enkele verbinding 10. PLSR vereist de analyse van een groot aantal monsters, die het tijdstip van de analyse 11 toeneemt. Om deze reden is er een toenemende belangstelling voor de ontwikkeling van nieuwe analytische methoden die nauwkeurige en snelle analyse van een groot aantal van visolie monsters mogelijk te maken. Organisaties zoals de Office van voedingssupplementen (ODS) aan de National Institutes of Health (NIH) en de Food and Drug Administration (FDA) hebben samengewerkt met de Association of Official Analytical Chemists (AOAC) om deze nieuwe methoden 12, 13 te ontwikkelen.
Een van de meest veelbelovende analysemethoden voor het screenen en evalueren van meerdere componenten matrices, zoals voedingssupplementen, is kernspinresonantie (NMR) spectroscopie 14, 15. NMR spectroscopie heeft een aantal voordelen: het is een niet-destructieve en kwantitatieve techniek vereist minimale tot geen monstervoorbereiding en wordt gekenmerkt door uitstekende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Bovendien NMR spectroscopie is een milieuvriendelijke methode omdat het gebruik maakt van slechts kleine hoeveelheden oplosmiddelen. Het belangrijkste nadeel van NMR-spectroscopie is de relatief lage gevoeligheid in vergelijking met andere analytical methoden zijn echter recente technologische vooruitgang in instrumentatie zoals sterkere magneetvelden, cryogene probes met verschillende diameters, geavanceerde gegevensverwerking en veelzijdige pulssequenties en technieken de gevoeligheid verhoogd tot het nM traject. Terwijl NMR instrumentatie is hoge kosten, de lange levensduur van NMR spectrometers en de vele toepassingen van NMR lager de kosten van de analyse op de lange termijn. Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld om nieuwe mensen in het veld voorkomen valkuilen geassocieerd met 1H en 13C NMR spectroscopische analyse van visoliesupplementen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NMR Monstervoorbereiding
Let op: Let op, raadpleeg dan eerst alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Gedeutereerd chloroform (CDCI3) gebruikt monsterbereiding giftig. Gelieve gebruik maken van alle passende veiligheidsmaatregelen in acht bij het uitvoeren van monstervoorbereiding inclusief het gebruik van een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen).
- Bereiding van 1H en 13C samples
- Extract 120 pl (-110 mg) visolie van een voedingssupplement capsule met behulp van een spuit en plaats deze in een 4 ml glazen flesje. Registreer het gewicht van de visolie.
- monster oplossen
- Los ongeveer 120 pl visolie in 500 pl CDCl3 die 0,01% tetramethylsilaan (TMS) dat wordt gebruikt als referentie voor de 1H en 13C chemische verschuivingen.
OPMERKING: TMS is gebruikd alleen voor chemische verschuiving kalibratie (zie stap nummers 2.2.1.2.7 en 2.2.2.2.7), niet voor de kwantificering (zie stap nummers 2.2.1.3 en 2.2.2.3) doeleinden. - Bereid een 2,6-di-tert-butyl-4-methylfenol (BHT) voorraadoplossing, indien kwantificering uitgedrukt in mg / g gewenst, door het oplossen van ongeveer 220 mg BHT en 15 mg van chroom (III) acetylacetonaat (Cr ( acac) 3) in 20 ml CDCl3 die 0,01% van TMS. Met 500 ul van de voorraadoplossing tot 100 mg (± 10 mg) visolie lossen.
- Los ongeveer 120 pl visolie in 500 pl CDCl3 die 0,01% tetramethylsilaan (TMS) dat wordt gebruikt als referentie voor de 1H en 13C chemische verschuivingen.
- Na oplossen van de olie (dit duurt enkele seconden), dragen alle oplossing direct in een hoogwaardige 5 mm NMR-buis en voeg een dop. Analyseer de monsters binnen 24 uur na bereiding van de monsters.
2. Instrument voorbereiding NMR
Opmerking: Voorzichtig, voorzichtig zijn dat de aanwezigheid van sterke magnetische velden afkomstig van NMR instrumenten kunnen beïnvloeden medische hulpmiddelen en implmieren zoals pacemakers en chirurgische prothesen, en elektronische apparatuur zoals creditcards, horloges, etc. Extra voorzichtigheid vereist bij de analyse wordt uitgevoerd met behulp van niet-afschermende magneten. Twee NMR instrumenten gebruikt voor het verwerven van 1H en 13C NMR spectra; een spectrometer die werkt bij 850,23 MHz en 213,81 MHz voor 1H en 13C kernen, die zijn uitgerust met een triple resonantie heliumgekoelde inverse (TCI) 5 mm probe en een spectrometer die werkt bij 500,20 MHz en 125,77 MHz voor 1H en 13C kernen respectievelijk uitgerust met een brede band waargenomen (BBO) stikstof gekoelde sonde 5 mm. Alle experimenten werden uitgevoerd bij 25 ± 0,1 ° C en de spectra werden verwerkt door een standaard NMR-gegevensanalyse acquisitie en verwerkingssoftware (zie Materialen List).
- Voorbereiding van het verwerven van de NMR-spectra
Noot: 1H en 13C NMR spectrakan derhalve worden verkregen zonder het monster uit het instrument.- Plaats de NMR buis in een spinner turbine (zie Materialen List).
- Plaats de spinner en de buis bovenop een gegradeerde dieptemeter en druk de bovenkant van de buis totdat de onderzijde van de bodem van de meter raakt.
- Plaats NMR monster in een open plek van de SampleCase. Noteer het slotnummer het monster geplaatst.
- Bij de inhoud van de NMR belasting terug naar de besturingscomputer en soort 'sx #', waarbij # het slot in de SampleCase houden van uw monster.
- Wacht op het deuterium signaal van CDCl3 op het vergrendelvenster scherm. Als dit niet automatisch verschijnt, type "lockdisp". Zodra het deuterium signaal zichtbaar, type "lock" op de opdrachtregel en selecteer "CDCI3" uit de lijst van het oplosmiddel om het monster te vergrendelen met de CDCl3 deuterium resonantie.
LET OP: Deuterium signal mogelijk niet uit als de vorige gebruiker een ander oplosmiddel gebruikt. Gebruiker moet wachten op de indicator dat het monster naar beneden, dan vergrendelen. - Type "bsmsdisp" in de opdrachtregel om spinnen te verzekeren is niet actief. Als de "SPIN" knop groen is, klikt u erop om spinnen te deactiveren.
- Typ de "nieuwe" opdracht om een nieuwe dataset te maken. Voer een naam voor de set in het tabblad "Naam" en het experiment nummer in de tab "EXPNO" data. Gebruik nummer "1" in het tabblad "PROCNO". In het tabblad "Experiment", klik op "Select" en kies de "PROTON" parameter bestand. Schrijf de titel van het experiment in het tabblad "TITLE". Klik op "OK".
- Type "getprosol" in de opdracht om het standaardparameters voor de NMR sonde en oplosmiddel te verkrijgen.
- Herhaal stap 2.1.7 voor13C, optie "C13IG" pulssequentie de tab "Experiment" voor 1D 13C inverse gated ontkoppeld experiment.
- Type "getprosol" in de opdracht om het standaardparameters voor de NMR sonde en oplosmiddel te verkrijgen.
- Typ het commando "Atma" naar automatische afstemming en aanpassing van de sonde uit te voeren voor zowel koolstof en proton kernen.
- Voer een eendimensionale gradiënt vulplaten een sterk homogeen magnetisch veld te bereiken en aldus een optimale lijnvorm voor de NMR signalen.
- Gebruik de standaard procedure voor de automatische 1D shimming, simpelweg door het sequentieel uitvoeren van de commando "qu topshim 1dfast ss", "Qu topshim tuneb ss," en "qu topshim rapport" op de opdrachtregel.
- parameter optimalisatie
- 90 ° puls kalibratie
- Maak een nieuwe dataset voor 1 H (zie stap 2.1.7 en 2.1.8).
- Typ het commando "paropt" op de opdrachtregel om de automatisering programma te starten voor het kalibreren van de 90 ° pulse. Kies pulsduur, p1, als parameter worden gewijzigd.
- Met "2" ps de beginwaarde van p1 voert "2" pS stappen en voer "16" experimenten.
- Maak een nieuwe dataset voor 13 C (zie stap 2.1.9) en herhaal het proces voor 13C kernen (zie stap 2.2.1.2 en 2.2.1.3).
- T1 meting gemeten door nulmethode 16 voor 1H
OPMERKING: De nulmethode gebruikt inversieherstelpuls sequentie die bestaat uit een 180 ° puls gevolg van een vertraging (tau), ontspanning mogelijk langs de z-as en een uiteindelijke 90 ° puls, die de waarneembare dwarse magnetisatie creëert.- Maak een nieuwe dataset voor 1 H (zie stap 2.1.7 en 2.1.8).
- Type "pulprog t1ir1d" naar de pulssequentie te veranderen om de inversie-recovery-experiment.
- Typ de volgende opdrachten op de command lijn om de spectrale breedte in ppm, het midden van de RF-zender, het aantal aftastingen het aantal dummy scans en het aantal datapunten "sw 8", "o1p 3.8", "ns 2", "ds 2" en "td 64K".
- Type "p1 (value)" en voer het duurwaarden 90 ° puls bepaald door de puls kalibreren (zie stap 2.2.1) en type "p2 (value)" om de 180 ° puls (de duurwaarde de 180 ° puls 90 ° pulsduur maal twee).
- Stel de recycle vertraging een zeer hoge waarde, bijvoorbeeld 10 s typt "d1 10".
- Stel tau op een korte waarde, bijvoorbeeld 10 ms, typt "d7 10ms" in de commandoregel.
- Stel de ontvangerversterking (RG) op een geschikte waarde met de opdracht "RGA" voor automatische berekening van RG.
- Voer een spectrum door het intikken van het commando "zg".
- Uitvoeren Fourier-transformatie door te typen "EFP"in de command line.
- Voer automatische fasecorrectie door het intikken van het commando "apk" in de opdrachtregel. Als er extra fase aanpassingen nodig zijn om een verdere verbetering van het spectrum, klik op het tabblad "Process", klik op het icoon "Stel fase" om de fasecorrectie in te schakelen.
- Met de nulde orde (0) en de eerste orde (1) fasecorrectie iconen slepen met de muis totdat alle signalen negatief opname modus. Breng en sla de fasecorrectie waarden door te klikken op de "Return and Save" knop om de fasecorrectie te verlaten.
- Verhoging van de tau tot alle pieken ofwel positief of nul gebracht door stap 2.2.2.6-2.2.2.9. De T1 te bepalen, eenvoudigweg verdelen de tau-waarde waarbij de piek wordt nul gemaakt met ln2.
- T1 meting gemeten door nulmethode 16 voor13C
- Maak een nieuwe dataset voor 13 C (zie stap 2.1.9)
- Type "pulprog t1irpg" naar de pulssequentie te veranderen om de inversie-recovery experiment koolstof kernen.
- De volgende opdrachten op de opdrachtregel om de spectrale breedte in ppm, het midden van de RF-zender, het aantal scans, het aantal dummy scans en het aantal gegevenspunten: "sw 200", "o1p 98" , "ns 8", "ds 2" en "td 64K".
- Type "p1 (value)" en voer het duurwaarden 90 ° puls bepaald door de puls kalibreren (zie stap 2.2.1) en type "p2 (value)" om de 180 ° puls (de duurwaarde is 90 ° pulsduur vermenigvuldigd met twee).
- Stel de recycle vertraging een zeer hoge waarde, zoals 100 s typt "d1 100".
- Set tau op een korte waarde, bijvoorbeeld 100 ms typt "d7 100ms" in de commandoregel.
- Stel de ontvaner waarderingsverschil (RW) op de juiste waarde met de opdracht "RGA" voor automatische berekening van RG.
- Voer een spectrum door het intikken van het commando "zg".
- Uitvoeren Fourier-transformatie door te typen "EFP" in de opdrachtregel.
- Voer Automatische fasecorrectie door het intikken van het commando "apk" in de opdrachtregel. Als extra faseinstellingen nodig om het spectrum te verbeteren, op het pictogram "Stel fase" en de fasecorrectie iconen voor nulde orde (0) en de eerste-orde fase (1) correctie.
- Terwijl u op het nulde orde en eerste orde fasecorrectie iconen, sleep de muis tot alle signalen negatief opname modus. Breng en sla de fasecorrectie waarden door te klikken op de "Return and Save" knop om de fasecorrectie te verlaten.
- Verhoging van de tau tot alle pieken ofwel positief of nul gebracht door stap 2.2.3.6-2.2.3.9. om te bepalende T1 waarde eenvoudigweg verdelen de tau-waarde waarbij de piek wordt nul gemaakt met ln2.
- 90 ° puls kalibratie
- Ééndimensionale (1D) NMR spectra
- 1H-NMR spectra
- Verwerving van de NMR-gegevens
- Naar het 1H gegevensreeks in stap 2.1.7 en gebruik de standaard "pulse-acquire" pulssequentie "zg", door te typen "pulprog zg" in de commandoregel.
- De volgende opdrachten op de opdrachtregel om de spectrale breedte in ppm, het midden van de RF-zender, het aantal scans, het aantal dummy scans, het aantal gegevenspunten en de pulsduur van 90 ° pulshoek : "sw 8", "o1p 3.8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" en "p1 (zoals bepaald door impuls kalibratie)" (zie stap 2.2.1).
OPMERKING: 32K datapunten kunnen worden gebruikt voor de 500 MHz instrument. - Stel een relaxatiedelay van 7 vanwege de 500 MHz instrument of 9 en de 850 MHz-instrument typen "d1 7s" of "d1 9s", respectievelijk in de commandoregel.
- Stel de ontvangerversterking (RG) op een geschikte waarde met de opdracht "RGA" voor automatische berekening van RG.
- Typ "digmod baseopt" naar een spectrum met verbeterde basislijn te verwerven.
- Start de overname door het intikken van de puls-verwerven opdracht "zg" in de opdrachtregel.
- Verwerken van de NMR-gegevens
- Typ "si 64K" in de command line naar nul-vulling toe te passen en de grootte van de echte spectrum aan 64K.
- Stel de lijn verbreding parameter 0,3 Hz typt "0,3 lb" in de commandoregel een weegfunctie (exponentieel verval) toegepast met een lijn verbreding factor 0,3 Hz voorafgaand aan Fouriertransformatie.
- Uitvoeren Fourier-transformatie door te typen "EFP" in de opdrachtlijn.
- Voer Automatische fasecorrectie door het intikken van het commando "apk" in de opdrachtregel. Als extra faseinstellingen nodig verdere verbetering van de spectrum op de "tab Process," klik op het icoon "Stel fase" en de fasecorrectie iconen voor nulde orde (0) en de eerste orde (1) fasecorrectie .
- Terwijl u op het nulde orde en eerste orde fasecorrectie iconen, sleep de muis totdat alle signalen positieve absorptie modus. Breng en sla de fasecorrectie waarden door te klikken op de "Return and Save" knop om de fasecorrectie te verlaten.
- Breng een polynoom van de vierde orde functie basislijn correctie op de integratie openen door het commando "abs n".
LET OP: Dit zorgt voor een vlakke spectrale basislijn met een minimum intensiteit. - Chemische verschuivingen in ppm vanaf TMS (δ = 0). Klik op de kalibratie ( "Calib. Axis ') icoon, en plaats de cursor met de rode lijn op de top van de TMS NMR-signaal (piek die het dichtst bij 0). Klik met de linkermuisknop en type in '0'.
- NMR gegevensanalyse
- Integreer het spectrale gebied van δ 1,1 tot ó 0,6 en de pieken bij δ 4,98, δ 5,05 en δ 5,81 via het pictogram "geïntegreerd" (onder de tab "Process") en de opgelichte icoon ( "new regio definiëren"). Links klikken en slepen door de integralen.
OPMERKING: Als er behoefte is om zich te concentreren op een regio, klikt u op het icoontje hoogtepunt om te deactiveren en de linker muisknop en sleep de muis om in te zoomen op de regio. Om de drempel intensiteit aan te passen, gebruikt u de middelste muisknop indien nodig. Klik op het icoon hoogtepunt opnieuw om de integratie-functie actief te maken, ga dan naar de volgende piek.- Normaliseren van de som van de bovenstaande integralen tot 100 door rechts te klikken op de integrale waarde die verschijnens onder het signaal en selecteer "normaliseren som van integralen". Voer de waarde "100" in het vak en klik op de "Return en Save" om de integratie te verlaten.
- Bij gebruik van BHT als interne standaard integreren piek bij δ 6,98 en stel de integraal gelijk aan de millimol BHT per 0,5 mL van de voorraadoplossing.
- Integreer de belangrijke pieken (zie stap 2.3.1.3.1) uitstrekt 10 Hz vanaf elke zijde van de piek, indien mogelijk.
- Verder met 13C-NMR-spectra en -verwerking te voeren op een soortgelijke wijze.
- Integreer het spectrale gebied van δ 1,1 tot ó 0,6 en de pieken bij δ 4,98, δ 5,05 en δ 5,81 via het pictogram "geïntegreerd" (onder de tab "Process") en de opgelichte icoon ( "new regio definiëren"). Links klikken en slepen door de integralen.
- Verwerving van de NMR-gegevens
- 13C-NMR spectra
- Verwerving van de NMR-gegevens
- Naar het 13C gegevensset en gebruik de inverse gated ontkoppelde pulssequentie "ZGig" typt "pulprog ZGig" in de commandoregel.
OPMERKING: Om een carbon experiment met de standaard breedband decou draaienPLED pulssequentie type "pulprog zgpg" in de commandoregel. - De volgende opdrachten op de opdrachtregel om de spectrale breedte in ppm, het midden van de RF-zender, het aantal scans, het aantal dummy scans, het aantal gegevenspunten en de pulsduur van 90 ° pulshoek : "sw 200", "o1p 95", "16 ns" "ds 2", "td 64K" en "p1 (zoals bepaald door impuls kalibratie)" (zie stap 2.2.1.4).
- Stel een relaxatiedelay van 35 s voor 500 MHz instrument of 45 s voor 850 MHz instrument typen "d1 35s" of "d1 45s", respectievelijk in de commandoregel. Bij gebruik van BHT zou relaxatiedelay 50 s in de 500 MHz instrument 60 en de 850 MHz instrument.
- Stel de ontvangerversterking (RG) op een geschikte waarde met de opdracht "RGA" voor automatische berekening van RG.
- Typ "digmod baseopt" in de opdrachtregel om een spectrum te verwerven wet verbeterde baseline.
- Start de overname door het intikken van de puls-verwerven opdracht "zg" in de opdrachtregel.
- Naar het 13C gegevensset en gebruik de inverse gated ontkoppelde pulssequentie "ZGig" typt "pulprog ZGig" in de commandoregel.
- Verwerken van de NMR-gegevens
- Typ "si 64K" in de command line naar nul-vulling toe te passen en de grootte van de echte spectrum aan 64K.
- Stel de lijn verbreding parameter 1,0 Hz typt "lb 1.0" in de commandoregel een weegfunctie (exponentieel verval) toegepast met een lijn verbreding van 1,0 Hz voorafgaand aan Fouriertransformatie.
- Uitvoeren Fourier-transformatie door te typen "EFP" in de opdrachtregel.
- Voer Automatische fasecorrectie door het intikken van het commando "apk" in de opdrachtregel. Als extra faseinstellingen nodig verdere verbetering van de spectrum op de "tab Process," klik op het icoon "Stel fase" en de fasecorrectie iconen voor nulde orde (0) en de eerste-orde fase (1) correctie .
- Breng een polynoom van de vierde orde functie basislijn correctie op de integratie openen door het commando "abs n" in de commandoregel.
- Chemische verschuivingen in ppm vanaf TMS (δ = 0). Klik op de kalibratie ( "Calib. Axis") icoon, en plaats de cursor met de rode lijn op de top van het NMR-signaal te worden verwezen. Klik met de linkermuisknop en typ in "0".
- Verwerving van de NMR-gegevens
- NMR gegevensanalyse
- Integreer het spectrale gebied van 175 tot δ ó 171 met het pictogram "geïntegreerd" (onder de tab "Process") en de opgelichte icoon ( "new regio definiëren"). Links klikken en slepen door de integralen.
OPMERKING: Als er behoefte is om zich te concentreren op een regio, klikt u op het icoontje hoogtepunt om te deactiveren en de linker muisknop en sleep de muis om in te zoomen op de regio. Klik op het icoon hoogtepunt opnieuw om de integratie-functie actief te maken, ga dan naar de volgende piek.- Stel de integrale tot 100 door het doen van een klik met de rechtermuisknop op de integrale waarde die onder het signaal verschijnt en selecteer "Calibrate Huidige Integral". Voer de waarde "100" in het vak en klik op de "Return en opslaan" om de integratie te verlaten.
- Bij gebruik van BHT als interne standaard integreren piek bij δ 151,45 en stel de integraal gelijk is aande millimol BHT per 0,5 mL van de voorraadoplossing.
- Integreer de belangrijke pieken uitstrekken 5Hz vanaf elke zijde van de piek (zie stap 2.3.2.3.1).
- Integreer het spectrale gebied van 175 tot δ ó 171 met het pictogram "geïntegreerd" (onder de tab "Process") en de opgelichte icoon ( "new regio definiëren"). Links klikken en slepen door de integralen.
- 1H-NMR spectra
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1H en 13C NMR spectra werden verzameld voor in de handel verkrijgbaar visoliesupplementen behulp van twee NMR instrumenten; Een 850 MHz en 500 MHz spectrometer. Deze spectra kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van bestanddelen van de visolie, zoals docosahexaeenzuur (DHA) en eicosapentaeenzuur (EPA), en andere verbindingen zoals n -1 acylketens en uit voedingsoogpunt belangrijke index zoals n -6 / n -3-verhouding. De kwantificering kan worden uitgevoerd zelfs zonder het gebruik van een interne standaard, echter de kwantitatieve resultaten worden uitgedrukt als relatieve molaire percentages. Wanneer de gegevens moeten worden uitgedrukt in absolute waarden (mg / g), wordt een interne standaard vereist. De verkregen NMR-resultaten zeer reproduceerbaar relatieve standaarddeviatie (RSD) varieert van 0,3% tot 2% van 13C NMR-analyse en 0,5% tot 2,5% 1H NMR-analyse, afhankelijk t hij lipide. De iets hogere RSD voor 1H NMR vaak waargenomen omdat proton spectra vaak overvol zijn, wat de nauwkeurigheid van de analyse beïnvloedt, met name voor resonanties die een lagere signaal-ruisverhouding (S / N) hebben. Een zeer goede overeenkomst werd gevonden tussen de 850 MHz en 500 MHz instrument met RSD variërend van 1% tot 4%. Relatief hoge RSD (tot 8%) werden waargenomen bij vergelijking van de resultaten verkregen met 1H en 13C, in het bijzonder aan verbindingen die in lagere concentraties zoals n -1 acylketens weergegeven. NMR-spectroscopie is eerder gevalideerd als instrument voor lipide analyse, het bepalen van een aantal visolie componenten. De resultaten toonden aan dat het in goede overeenstemming met de traditionele methoden, zoals GC 17, 18.
1H NMR analyse
"xfig"> Figuur 1 vergelijkt het 1H NMR-spectra verkregen op (A) een 850 MHz en (B) een 500 MHz instrument. Het 850 MHz spectrum wordt gekenmerkt door hogere resolutie, maar de hoofdcomponenten van visolie zoals DHA, EPA en n -6 / n -3 verhouding kan ook worden bepaald uit het 500 MHz spectrum. Het 1H-NMR-signalen van visolie vetzuren die kunnen worden gebruikt voor kwantificering doeleinden zijn weergegeven in tabel 1, terwijl de volledige NMR toewijzing van het 1H NMR spectrum van visolie elders 19 worden gevonden.
1H NMR gaf betrouwbare gegevens voor de kwantificering van de totale hoeveelheid n -3, -6 n, DHA, transvetzuren, n -1 acylketens, en verzadigde vetzuren (SFA). Voor het 1H NMR-analyse wordt het gebruik van geschikte verhoudingen nodig omdat de meeste jarenignals behoren tot groepen protonen die op de verschillende vetzuren en lipiden. Daarom, in de meeste gevallen de concentratie van vetzuren in visolie kan alleen worden bepaald door een combinatie van verschillende 1H NMR signalen, opgenomen in de juiste verhoudingen. Bovendien zijn deze vergelijkingen bevatten rekenkundige coëfficiënten dat het verschillend aantal protonen behorende bij elke groep normaliseren. Als een interne standaard wordt gebruikt de volgende vergelijking worden overwogen: C = I / I IS x n / N x A x MW / m (1), waarin C de concentratie van de analyt in mg / g visolie, I is de integraal van een resonantie die uniek is toegewezen aan het lipide van belang, i is het gebied van een protonsignaal die uniek behoort tot de interne standaard, N het aantal protonen van de functionele groep die wordt geanalyseerd,N is het aantal protonen van de interne standaard die gebruikt worden voor de analyse, A de millimol interne standaard MW is het molecuulgewicht van het vetzuur (uitgedrukt in methylesters), en m de hoeveelheid visolie uitgedrukt in g.
Voorbeeld 1, DHA: De hoeveelheid DHA wordt bepaald door de vergelijking C DHA = ¾ I DHA / S, waarin ik DHA is de integraal van het signaal bij δ 2,39 die behoort tot de H α en H β protonen van DHA en S is de som van integralen van de methylprotonen van SFA, n -6, -9 n, n -3, transvetzuren plus de integralen van de pieken van n -1 acylketens bij δ 4,98, 5,05 en δ δ 5,81. De geïntegreerde I DHA is normaseerd door vermenigvuldiging met 3/4 omdat deze overeenkomt met vier protonen, terwijl de integrale S overeenkomt met drie protonen. 1H NMR is niet in staat te geven informaties positionele verdeling van de vetzuren op de glycerol hoofdketen en kan dus alleen worden gebruikt voor de kwantificering van de totale hoeveelheid vetzuren. Het 1H NMR-analyse van een ingekapselde visolie supplement bleek dat deze uit 10,5% DHA. De concentratie van DHA in hetzelfde monster gebruikt BHT bleek 105,23 mg / g. Deze waarden zijn zeer dicht bij de waarde die voor 13C NMR (zie voorbeeld 2 voor 13C analyse).
Voorbeeld 2 n -1 acylketens: De concentratie van n -1 acylketens wordt gegeven door de relatie C n-1 = 3 I n-1 / S, waarbij I n-1 is de integraal van het signaal bij δ 5,818. Dezecorrespondeert met één proton en moet dus worden genormaliseerd door drie vermenigvuldigd. Bij gebruik BHT, n -1 acylketens worden bepaald door de vergelijking C n-1 = 2 I n-1 / I BHT. De resultaten kunnen niet worden uitgedrukt in mg / g vanwege de MW n -1 acylketens onbekend.
Voorbeeld 3, -6 n / n -3 ratio: Deze belangrijke index kan worden berekend uit de verhouding van de genormaliseerde intensiteiten van de resonantie bij δ 2,77, wat overeenkomt met het bis-allylische protonen n -6 acylketens (twee protonen) via triplet bij δ 0,97 behorende tot n -3 vetzuren en correspondeert met drie protonen. De relatie is C n-6 / n-3 C = 3/2 IA / IB, waarin IA en IB zijn de integralen van de signalenbij δ 2,77 en δ 0,97 resp. n -6 vetzuren worden bepaald uit de relatie C n-6 = 3 / 2I n-6 / S, waarbij I n-6 is integraal van de bis-allylische protonen bij δ 2,77.
Voorbeeld 4, transvetzuren: kan Transvetzuren worden berekend uit de vergelijking C = trans trans I / S, waarin I trans is de integraal van het signaal bij δ 0,91. De onderhavige monster bevatte 3,07% transvetzuren, zoals bepaald met behulp van 1H NMR 850 MHz instrument. Hetzelfde monster in een 500 MHz instrument geanalyseerd bleek 3,03% transvetzuren bevatten.
Voorbeeld 5, verzadigde vetzuren (SFA): De concentratie van SFA kan worden Calculated van de vergelijking C = SFA S - C n-3 - Cn-6 - Cn-9 - Cn-1 - C trans-. n -9 vetzuren (voornamelijk oliezuur) kan worden gekwantificeerd volgens de vergelijking Cn-9 = (3/4 Q - 3/2 I n-6) / S, waarin Q de integraal van de allylische protonen van n en n -6 -9 bij δ 2,01. De hoeveelheid SFA in een commercieel verkrijgbare visolie monster bleek 36,1% te zijn. Hetzelfde monster geanalyseerd met 13C NMR bleek 33,8% SFA bevatten. SFA vormen een groep diverse FA (bijvoorbeeld stearinezuur en palmitinezuur) met verschillend molecuulgewicht en dus de concentratie als visolie niet kan worden uitgedrukt in mg / g.
Voorbeeld 6 totale sterolen: De totale hoeveelheid sterolen (vrij en veresterd) kan worden bepaald door de signal van de methylprotonen bij koolstof 18 die bij δ 0,68 weergegeven, gebruik van de vergelijking C = I ste / S. De molverhouding van totale sterolen in de handel verkrijgbare visolie monster bleek 0,32% te zijn. BHT kan ook worden gebruikt voor het bepalen van de absolute concentratie van sterolen. De belangrijkste sterolen visolie cholesterol en vitamine D (of zijn precursor 7-dehydrocholesterol) en zijn vaak toegevoegd in de supplementen. Deze verbindingen hebben een zeer vergelijkbare MW. Daarom kunnen de resultaten worden uitgedrukt in mg / g en worden berekend volgens de vergelijking C = 2/3 STE I / I IS A x STE MW / m, waarbij MW STE is de moleculaire massa (386) van cholesterol, die vormt meeste sterolverbinding fractie visolie 20. De hoeveelheid sterolen in hetzelfde monster gebruikt BHT 3,8 mg / g visolie. De afzonderlijke bepaling van cholesterol (δ (δ 0,678) haalbaar op 850 MHz instrument na het aanbrengen van een vensterfunctie voor resolutieverbetering.
13C NMR-analyse
Figuur 2 toont de 13C NMR-spectra verkregen op (A) een 850 MHz en (B) een 500 MHz instrument in het carbonylkoolstofatoom gebied. De twee spectra zijn zeer vergelijkbaar en kan dezelfde hoeveelheid informatie. Het 13C NMR spectrum kan met succes worden gebruikt voor de analyse van extra vetzuren zoals stearidonzuur (SDA) en eicosatetraeenzuur (ETA) zuren, zijn echter meer aftastingen nodig monsters waarin deze zuren in lagere concentraties. 13C spectra worden gekenmerkt door een hoge resolutie door het grote spectrale breedte en de toepassing van breedband ontkoppeling, waarbijelimineert het effect van scalaire koppeling en produceert singlets. Om deze reden is er beperkte overlapping, zelfs bij gebruik van een 500 MHz instrument.
Het 13C NMR-spectrum is veel informatiever vergelijking met het 1H NMR-spectrum en kan vollediger kwantitatieve gegevens omdat er minder overlappende signaal wordt waargenomen (figuren 1 en 2). De meest bruikbare spectrale gebied van het 13C spectrum is het carbonylkoolstofatoom regio omdat het kwantitatieve informatie over een groot aantal vetzuren en hun positie distributie op het glycerol skelet 19, 21, 22. De methylgroep gebied van δ 14,5 tot 13,5 ó kunnen worden gebruikt voor de snelle bepaling van de totale hoeveelheid n -3, -6 n, n -9 en verzadigde vetzurenvetzuren (SFA), en transvetzuren. In de 500 MHz NMR-spectrometer, een gedeeltelijke overlapping van de n en n -6 -9 verzadigde vetzuren (SFA). De toepassing van een venster functie voor resolutie enhancement kan dit probleem op te lossen, hoewel de 850 MHz-instrument nog steeds een meer betrouwbare optie wordt beschouwd. De alkenische gebied van het koolstofspectrum kan worden gebruikt voor de totale hoeveelheid n -3 en n -1 acylketens en voor bepaling van de individuele vetzuren zoals DHA, EPA, Arachidonzuur (AA), linoleenzuur (Ln) n -3 en oliezuur (OL) (zie tabel 2). 13C NMR kan ook worden toegepast voor het karakteriseren van visolie uit andere bronnen, zoals supplementen rijk aan ethylesters (EE) met de koolstofsignalen bij δ 14,31 (methyl) en δ 60,20 (methyleen).
Voor koolstofanalyse kunnen vetzuren zijn determined door de integraal van de geschikte alifatische, alkenische en carbonylsignalen de totale integraal van alle acylketens verdelen volgens de algemene relatie C = I / S (2), waarin C de concentratie van de analyt in mol (% ) I is de integraal van een resonantie die uniek is toegewezen aan het lipide van belang en s de totale integraal van het signaal (B) de totale vetgehalte van het monster voorstelt. De totale integrale Z van acylketens kan worden bepaald door integratie van het gebied vanaf 175 tot δ ó 171 en wordt ingesteld op 100.
Kwantificering van vetzuren in mg / g visolie wordt uitgevoerd met een interne standaard op basis van de volgende vergelijking: C = I / I IS x A x MW / m (3), waarin C de concentratie van de analyt in mg / gvisolie, I is de integraal van een resonantie die uniek is toegewezen aan het lipide van belang, I is het gebied van een koolstofsignaal die uniek behoort tot de interne standaard, A de millimol interne standaard MW is het molecuulgewicht gewicht van de verbinding van belang (vetzuren uitgedrukt in methylesters), en m de hoeveelheid visolie g. De 13C-NMR-signalen van visolie vetzuren die kunnen worden gebruikt voor kwantificering doeleinden zijn weergegeven in Tabel 2, terwijl de volledige NMR toewijzing van de 13C NMR-spectrum elders 19 worden gevonden.
Voorbeeld 1 EPA in sn-2 positie: De hoeveelheid (%) van EPO op de sn-2 positie wordt berekend door de integraal van het signaal bij δ 172,56 delen door S. De hoeveelheid EPA op de sn-2 positie in een commercially verkrijgbaar monster bleek 3,4% te zijn met behulp van de 850 MHz-instrument. Met dezelfde spectrometer en BHT als interne standaard, de hoeveelheid EPA op de sn-2 positie uitgedrukt in mg / g visolie 29,73 mg / g. Hetzelfde monster in een 500 MHz instrument geanalyseerd bleek 3,6% of 31,39 mg / g EPA bevatten op de sn-2 positie. Soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen bij de berekening van de relatieve moleculaire verhoudingen van EPA in sn-2 met een volledig ontkoppelde spectrum. Dit komt omdat de carbonyl koolstof van EPA wordt beïnvloed door protonontkoppeling dezelfde verwaarlozen mate als de andere carbonylkoolstofatomen, die als referentie. Echter grote afwijkingen waargenomen bij gebruik van BHT, omdat de koolstof BHT bij δ 151,45, die wordt gebruikt voor het kwantificeren, wordt een andere NOE verbetering ten opzichte van de carbonylgroep koolstofatomen van vetzuren. Daarom moet de volledige ontkoppeling spectrum worden vermeden bij het gebruik van interne standaarden of integrerende carbons met verschillende veelvouden.
Voorbeeld 2 totale hoeveelheid DHA: De totale hoeveelheid (%) DHA wordt eenvoudig berekend door de hoeveelheid DHA in sn -1,3 en sn-2 positie zoals bepaald door de NMR signalen bij δ δ 172,48 en 172,08 resp. Hetzelfde monster geanalyseerd met 1H NMR (zie voorbeeld 1 van 1H analyse) bleek 10,3% DHA bevatten volgens 13C-NMR-analyse. De hoeveelheid DHA kan ook mg / g tot expressie worden gebracht door toepassing van een interne standaard en vergelijking 3. De totale hoeveelheid DHA werd 103,25 mg / g.
Voorbeeld 3, totale SDA: is de totale hoeveelheid (%) van SDA verkregen door de integralen van de signalen bij δ δ 172,99 en 172,60 die tot de carbonylkoolstof van SDA op positie sn -1,3 ensn-2, respectievelijk dan de som van S delen. De geanalyseerde monster bleek 3,93% SDA of 34,54 mg / g bevatten.
Voorbeeld 4, n -3 Ln: Ln n -3 (%) kan worden bepaald door de integraal van het signaal bij δ 131,85 delen de integrale S. De molaire verhouding n -3 Ln in het geanalyseerde monster visolie 0,7%. De absolute concentratie gebruikt BHT werd berekend als 5,5 mg / g.
Voorbeeld 5, transvetzuren: De molaire verhouding van trans-vetzuren wordt bepaald door de integraal van het signaal bij δ 13,80 S. De analyse van hetzelfde monster die werd geanalyseerd met 1H-NMR en bleek 3,07% trans FA te zijn, werd ook geanalyseerd met 13C-NMR en trans vetzuurgehalte bleek 3,42% te zijn. THij 13C NMR analyse van hetzelfde monster op een 500 MHz instrument toonde een gehalte aan transvetzuren 3,64%. De hoeveelheid trans FA in mmol / g visolie kan worden bepaald met BHT als inwendige standaard en de vergelijking C = I / I IS x A / m, maar resultaten niet worden uitgedrukt in mg / g, omdat de piek bij δ 13,80 overeen met verschillende transvetzuren, vooral trans DHA en EPA trans, verschillende MW.
Voorbeeld 6 EE: De concentratie van EE in een visolie monster wordt berekend door de integraal van het spectraalgebied verdelen van δ 60,50 tot ó 60,00, hetgeen overeenkomt met de methyleenkoolstoffen van het energieverbruik tijdens verschillende vetzuren, S. De analyse van een EE visolie steekproef toonde aan dat het bestond uit 100% EE. Opgemerkt wordt dat bij EE monsters, EPA can hetzij worden berekend door de carbonyl piek bij 173,60 δ of de methyleengroep EE koolstof bij δ 60,20, terwijl DHA kan worden berekend met behulp van het signaal bij δ 60,31 en / of het signaal bij δ 173,09.
Een overzicht van de kenmerkende signalen die kunnen worden gebruikt voor kwantificatie toepassingen met 13C en 1H-NMR-analyse zijn te vinden in de tabellen 1 en 2, respectievelijk, terwijl een gedetailleerde beschrijving van de vergelijkingen die kunnen worden gebruikt voor deze analyse vindt 19 elders.
NMR kunnen bovendien worden toegepast voor de beoordeling van de oxidatietoestand van visoliesupplementen. Figuur 3 vergelijkt het 1H NMR-spectra van een visolie monster onder twee oxidatieomstandigheden; blootstelling aan verwarmen en blootstelling aan ultraviolet (UV)licht. Vetverbranding is een ingewikkeld proces en de samenstelling van oxidatieproducten hangt van de oxidatie. De belangrijkste oxidatieproducten zijn hydroperoxiden (δ 8,0-8,8), geconjugeerde diënen hydroperoxiden (δ 5,4-6,7) en aldehyden (δ 9.0- 10).
Figuur 1. Het 1H NMR-analyse. 850,23 (A) en 500,20 MHz (B) 1H-NMR spectrum van een visolie supplement CDCl3 oplossing. De NMR-signalen van EPA en DHA die kunnen worden gebruikt voor het bepalen getoond. De piek bij δ 0,97 kan worden gebruikt voor het bepalen van de totale hoeveelheid n -3 vetzuren. De envelop bij δ 1,39-1,20 bijgesneden, zoals passend is voor de methyleenprotonen van vetketens en kan niet worden gebruikt voor identificatie of kwantificatie doeleinden. Het 1H NMR-spectrum wordt gekenmerkt door een smallere spectrale breedte (SW) in vergelijking met de 13C-NMR-spectrum en derhalve door lagere spectrale resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. 13C NMR-analyse. 213,81 (A) en 125,77 MHz (B) 13C-NMR spectrum van een visolie supplement CDCl3 oplossing in het carbonylkoolstofatoom regio. De NMR-signalen van EPA en DHA op sn -1,3 en sn-2 positie getoond. Deze signalen kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van EPA en DHA. Hoewel de spectra opgenomen bij 213,81 MHz worden gekenmerkt door een hogere resolutie en gevoeligheid, kan de 125,77 MHz spectra worden gebruikt voor het bepalen van de belangrijkste verbindingen. De toepassing van ontkoppeling in de 13C NMR-experiment elimineert het effect van scalaire koppeling tussen de koolstof en waterstofkernen en dus de signalen verschijnen als singlets waardoor de analyse eenvoudiger in vergelijking met het 1H NMR spectrum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Visolie oxidatie. Het 1H NMR spectrum van geoxideerde visolie afhankelijk van de oxidatieomstandigheden. De resonanties toegeschreven aan hydroperoxiden (δ 8,0-8,8), conjugated diënen hydroperoxiden (δ 5,4-6,7) en aldehyden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| δ ppm | Proton | samenstelling |
| 0,677 | CH3 (18) | cholesterol |
| 0,678 | CH3 (18) | 7-dehydrocholesterol |
| 0.88 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,27 Hz | n -9, SFA acylketens |
| 0,883 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,08 Hz | n -6 acylketens |
| 0,911 | CH 2 CH 3 (t), J ω, 1, ω2 = 7,65 Hz | Trans acylketens |
| 0,973 | CH 2 CH 3 (t), J ω1, ω2 = 7,63 Hz | n -3 acylketens |
| 1.25 | CH 2 CH 3 (t), J = 7,20 Hz | ethylesters |
| 1.697 | OCOCH2CH 2 (t), JH α, Η β = Hz | EPA acylketen |
| 2,391 | OCOCH 2 CH2 (t) | DHA acylketen |
| 2.772 | CH = CHCH2CH = CH | n -6 acylketens |
| 2.81 | CH = CHCH2CH = CH | n -3 acylketens |
| 3.593 | 3'a-CH2 OCO | Glycerol 1-MAG |
| 3.722 | 3'a, 3217 b-CH2 OCO (br) | Glycerol 1,2-DAG |
| 4,073 | 2'-CHOH (br) | Glycerol 1,3-DAG |
| 4.121 | CH 2 CH 3 multiplet | ethylesters |
| 4.173 | 1'b, 3'b-CH2 OCO (dd) | Glycerol 1,3-DAG |
| 4.238 | 1'a-CH2 OCO (dd) | Glycerol 1,2-DAG |
| 4,329 | 1'B-CH2 OCO (dd) | Glycerol 1,2-DAG |
| 4.989 | -CH = CH2 cis (dd) | n -1 acylketens |
| 5,052 | -CH = CH2 trans (dd) | n -1 acylketens |
| 5.082 | 2'-CHOCO | Glycerol 1,2-DAG |
| 5,268 | 2'; -CHOCO | Glycerol van TAG |
| 5.436 | CH = CHCH2CH = CH2 | n -1 acylketens |
| 5,818 | -CH = CH2 | n -1 acylketens |
Tabel 1: De opdracht van het 1H NMR spectrum. De 1H-NMR chemische verschuivingen van visolie vetzuren signalen die kunnen worden gebruikt voor kwantificatie doeleinden CDCl3 oplossing worden gepresenteerd. De chemische verschuivingen worden gemeten in ppm en informatie over de chemische omgeving van de kernen.
| δ ppm | Koolstof |
| 173,24 | C1 SFA (sn -1,3) |
| 172,21 | C1 OL, LO (sn -1,3) |
| C1 ETA (sn -1,3) | |
| 173,13 | C1 DPA (sn -1,3) |
| 173,03 | C1 SDA (sn -1,3) |
| 172,97 | C1 EPA (sn -1,3) |
| 172,73 | C1 ETA (sn-2) |
| 172.69 | C1 DPA (sn-2) |
| 172.61 | C1 SDA (sn-2) |
| 172,56 | C1 EPA (sn-2) |
| 172,48 | C1 DHA (sn -1,3) |
| 172,08 | C1 DHA (sn-2) |
| 136,8 | Cω1, n -1 |
| 131,85 | Cω3 LN |
| 130,37 | C15 AA |
| 130,11 | C9 LN |
| 130.06 | C13 LO |
| 129,54 | C5 DHA sn-2 |
| 129.47 | C5 DHA sn -1,3 |
| 128,94 | C5 EPA |
| 128,76 | C6 EPA |
| 128,45 | C17 n -3 |
| 127,71 | n -3 |
| 127,53 | C4 DHA sn-2 |
| 127,5 | C4 DHA sn -1,3 |
| 126,86 | Cω4, alle n -3 |
| 114.71 | Cω2, n -1 |
| 60.08 | DHA ethylesters |
| 59.96 | EPA, ethylesters |
| 59,95-59,85 | Andere FA, ethylesters |
| 33.48 | C2 EPA sn-2 |
| 33.32 | C2 EPA sn -1,3 |
| 31.44 | C3 n -1 |
| 27.05 | Allylische n -6 |
| 26.49 | C4 EPA sn -1,3 |
| 26.47 | C4 EPA sn-2 |
| 24.6 | C3 EPA |
| 24.48 | C3 SDA sn -1,3 |
| 24.44 | C3 SDA sn-2 |
| 14.27 | Cω1, alle n -3 |
| 14.13 | Cω1, SFA |
| 14.11 | Cω1, OL |
| 14.07 | Cω1, LO |
| 13.8 | Cω1, trans FA |
Tabel 2: De opdracht van het 13C NMR spectrum. De 13C-NMR chemische verschuivingen van visolie vetzuren signalen die kunnen worden gebruikt voor kwantificering purpmonosacchariden in CDCl3 oplossing worden gepresenteerd.
Bijkomende Figuur S1: Vergelijking tussen de 13C NMR-spectra verkregen met de standaard breedband ontkoppeling (A) en de inverse gated ontkoppeling (B) pulssequenties. De spectra werden geregistreerd voor hetzelfde monster met hetzelfde aantal scans, verwerkt met dezelfde procesparameters en worden getoond met dezelfde schaalfactor. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wijzigingen en strategieën voor het oplossen
Spectral kwaliteit. De lijnbreedte van het NMR-signaal en derhalve de resolutie van het NMR-spectrum is sterk afhankelijk van vulplaten, die een werkwijze voor het optimaliseren van de homogeniteit van het magneetveld. Voor routinematige analyse 1D shimming is voldoende en een 3D-shimming is niet vereist, aangezien zij worden uitgevoerd door personeel NMR regelmatig. Indien dit niet het geval is, moet een 3D shimming worden voorafgaand aan analyse met een monster dat 0,6 ml H2O: D 2 O (90:10). Om een betere en snellere shimming bereiken, moet het monster worden gecentreerd in de excitatie / detectie gebied van de radiofrequentie (RF) spoel, met de gesorteerde dieptemeter, voordat deze zich in de magneetboring. Een andere factor die van invloed is vulplaten spinnen het monster bij een spinsnelheid van 10-20 Hz. Hoewel spinnen het monster in deze spinsnelheid verbetert de radiale wiggen (X, Y, XY, XZ, YZ, X2 Y2, etc.) wordt in het algemeen niet aanbevolen om het uiterlijk van draaiende zijbanden van de eerste of hogere orde voorkomen. Wanneer echter aan instrumenten die werken in Larmor frequenties hoger dan 400 MHz, spinnen wordt aanbevolen voor 1D NMR-experimenten.
Resolutie, betreffende de gevoeligheid, worden beïnvloed door de ontvangerversterking (rg) waarde. Lage waarden van de ontvangerversterking vermindering van de gevoeligheid, terwijl hogere waarden dan passend oorzaak overloop van de analoog-digitaalomzetter (ADC). ADC overloop leidt tot symmetrische lijnvormen en de signalen kan niet worden gebruikt voor kwantitatieve doeleinden, omdat de eerste punten van het vrije inductieverval (FID) verloren gaan. In de meeste gevallen is het commando "RGA" berekent een geschikte rg waarde. Echter, in sommige gevallen, de rg berekend door de software hoger is dan de ideale waarde en er een vervorming in de Lorentz vorm van het NMR-signaal. Ineen dergelijk geval moet de gebruiker handmatig een kleinere rg waarde typen "rg (value)" in de commandoregel. Een typische RG waarde voor de monsters die geanalyseerd dit protocol 8.
Vaak, als cryogeen gebruik van gekoelde NMR probe met een hoge kwaliteit (Q-factor), een grote vertraging (dode tijd)> 200US tussen de laatste puls en de detectieperiode vereist artefacten te vermijden, zoals een bult rond de frequentie van de zender en rollen in de basislijn van het spectrum. Een dergelijke langdurige vertraging veroorzaakt een grote negatieve eerste orde fasefout, die ook een basislijn rollen en grote dips kan brengen rond de basis van de sterke signalen. In deze gevallen kan een z gerestaureerde spin-echo-pulssequentie gebruikt om NMR-spectra zijn aanzienlijk hogere basislijn produceren, hoewel een kleine gevoeligheid reductie kan optreden 23.
Fosfolipiden. Naast de analyse van visoliemonsters die rijk zijn aan triglyceriden en ethylesters, kan NMR worden gebruikt voor de analyse van oliemonsters vis rijk aan fosfolipiden (PL). Echter, is speciale aandacht nodig voor dergelijke monsters omdat PL aggregaten vormen, die een significante vermindering van de spectrale resolutie en gevoeligheid. Voor de analyse van deze monsters, een oplosmiddelmengsel van gedeutereerd chloroform: methanol (CDCI3: CD3 OD) in een verhouding van 70:30 is vereist voor het verkrijgen spectra van hoge kwaliteit.
Interne standaard. BHT werd gekozen als interne standaard in dit onderzoek omdat het een zeer symmetrisch molecuul met eenvoudige 1H en 13C NMR spectra en geen van de pieken overlap met visolie bestanddelen. BHT is een signaal in het 1H NMR spectrum, dat verschijnt als een singlet bij δ 6,97 en aangesloten twee equivalente aromatische protonen (para - positie ten opzichte van de OH-groep) en een signaal bijδ 151,45 in het 13C NMR-spectrum dat behoort tot de aromatische quaternaire koolstofatoom dat de -OH-groep. Beide signalen geen overlap met een van de bestanddelen van visolie en kan dus worden gebruikt voor kwantificatie doeleinden. Andere verbindingen zoals 1,2,4,5-tetrachloor-3-nitrobenzeen (TCNB) of ethyleenchloride kan ook worden gebruikt als alternatieve interne standaarden, maar ze worden gekenmerkt door langere T1 waarden.
Beperkingen van de Techniek
De kwantificering van de verschillende vetzuren en lipiden in visoliesupplementen wordt verkregen door integratie van de geschikte diagnostische NMR-signalen in de spectra 1D. Dergelijke signalen moet behoren slechts in specfieke component en mag geen interferentie met signalen van andere verbindingen. Dit kan een probleem voor 1H-NMR-analyse omdat het 1H NMR-spectrum wordt gekenmerkt door lage resolutie als gevolg van de korte afstand van cheMICAL verschuivingen. Bovendien is de aanwezigheid van scalaire koppeling (J) produceert multipletten en maakt de analyse ingewikkelder. Bijvoorbeeld kan ethylesters (EE) worden gekwantificeerd met gebruikmaking van 1H- NMR door de karakteristieke triplet (J = 7,20 Hz) van de methylgroep op δ 1,25 en het multiplet bij δ 4,12, die behoort tot de methyleenprotonen van de estergroep. Wanneer echter NMR instrumenten die in Larmor frequenties hoger dan 850 MHz, de analyse van EE met gebruikmaking van 1H- NMR moet worden vermeden vanwege de gedeeltelijke overlapping van de piek bij δ 4.12 met de piek bij δ 4,14 van TG en de overlapping van het signaal bij δ 1,25 met breed signaal van de alifatische methyleen protonen bij δ 1,23-1,35. Grote afwijkingen werden ook waargenomen tussen 1H en 13C analyses van EPO in sommige monsters, 13C NMR dichter bij het gemerkte preparaat door tHij fabrikant. Dit komt waarschijnlijk door de overlapping van het signaal bij δ 1,69, die wordt gebruikt voor EPO analyse met signalen van andere verbindingen die bij sommige soorten visoliesupplementen weergegeven. Extra fouten in kwantificering kunnen voordoen bij het gebruik van een interne standaard door de onzekere zuiverheid van de interne standaard en van fouten in het gewicht.
De analyse van de samenstelling kan in relatieve molaire concentraties uitgedrukt worden zonder gebruik van een interne standaard. Als resultaat moet worden uitgedrukt in absolute concentraties, bijvoorbeeld als milligram van vetzuur per gram olie (mg / g), wordt het gebruik van een interne standaard vereist. Echter, wanneer het NMR-signaal van interesse tot meerdere verbindingen met verschillende molecuulgewichten, kunnen de resultaten niet worden uitgedrukt als mg / g, zelfs bij gebruik van een interne standaard. Bovendien, het gebruik van interne standaard verhoogt meestal de duur van de analyse omdat de meest voorkomende inwendige s NORMEN, zoals BHT, zijn kleine moleculen hoog moleculaire symmetrie, hetgeen resulteert in langere relaxatietijden. Aangezien de herhalingstijd (vertraging tussen pulsen + acquisitietijd) is ingesteld volgens de langste relaxatietijd T1 in het monster, zal het gebruik van een interne standaard de duur van de experimenten toenemen langere vertraging tussen pulsen vereist. Dit is een bijzonder belangrijke factor voor 13C NMR-analyse vanwege de uitzonderlijk lange T1 relaxatietijd koolstof kernen. De toevoeging van een paramagnetische verbinding zoals Cr (acac) 3 efficiënt verminderen T1 relaxatietijd. De aanbevolen concentratie van Cr (acac) 3 0,75 mg / mL oplossing. Hogere concentraties van Cr (acac) 3 kan worden beschouwd voor verdere vermindering van T1 echter voorzichtigheid vereist om dalingen in de S / N te vermijden vanwege de lijnverbreding.
ntent "> Hoewel de 13C NMR wordt gekenmerkt door een veel hogere spectrale resolutie in vergelijking met 1H de gevoeligheid van de 13C NMR-experiment significant lager door de lage natuurlijke abundantie (1,1%) en de lage gyromagnetische verhouding (67,26 10 6 rad s-1 T-1) 13C kernen. Daarnaast lange T1 relaxatietijden 13C verlenging van de duur van de analyse. Dit kan een probleem zijn wanneer de beschikbare olie voor analyse beperkt, omdat een verhoogde scans worden gebruikt om een redelijke signaal-ruisverhouding.Beperkingen van de gevoeligheid en de resolutie van de NMR-spectra voorkomen dat de analyse van vele kleine verbindingen visolie die kunnen worden geanalyseerd met andere technieken zoals GC. Bijvoorbeeld 1 Η NMR kan niet individuele sterolen en vetzuren (zoals palmitinezuur en stearinezuur), terwijl 13C scheidenniet in staat om verbindingen die in visolie in zeer lage concentraties worden weergegeven zoals dodecaanzuur en myristinezuur, die overlappen met de signalen van verzadigde vetzuren te bepalen op δ δ 173,24 en 172,82. Hoewel het verhogen van de hoeveelheid monster die wordt geanalyseerd maakt analyse van een aantal kleinere verbindingen haalbaar is voorzichtigheid geboden bij zeer geconcentreerde monsters, vanwege de toegenomen viscositeit. Zeer viskeuze oplossingen die meer dan 150 mg olie moet worden vermeden omdat er een afname van S / N vanwege de lijnverbreding veroorzaakt door de verminderde spin-spin T2-relaxatietijden. Bovendien zijn langere vertraging tussen pulsen vereist vanwege de langere T1 en er zijn verschillende problemen in vulplaten en daarmee de resolutie.
Alle verbindingen in visolie met NMR geanalyseerd gelijktijdig worden gekwantificeerd in een momentopname zonder enige scheiding of zuiveringsstappen. De NMR eenANALYSE snel is als het 1H spectrum worden opgenomen in minder dan een minuut, terwijl de 13C NMR overname duurt 10 min. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat er een paar factoren die van invloed zijn op de data-acquisitie tijd. Specifiek voor 13C-NMR, van 10 min looptijd kan alleen worden bereikt zonder het gebruik van interne standaarden en met gebruik van cryogeen gekoelde probes, waarbij de RF spoel en de voorversterker worden gekoeld en dus de thermische ruis wordt geminimaliseerd. Een 10-15 voudige verhoging van de experimentele tijd moet worden verwacht voor 13C-NMR-analyse bij kamertemperatuur (conventioneel) probes gebruikt.
Betekenis ten aanzien van bestaande methoden
NMR spectroscopie bleek een krachtig instrument voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de samenstelling van visolie supplementen, en vanwege de rapidness heeft het potentieel om te worden toegepast voor de high throughput screening van een groot nu mber van visolie monsters. NMR spectroscopie is per definitie een kwantitatieve methode omdat het signaalgebied is recht evenredig met het aantal kernen dat het signaal veroorzaken. Terwijl acuut giftige stoffen moeten NMR monsters te bereiden, deze werkwijze is milieuvriendelijk omdat dergelijke kleine hoeveelheden van deze stoffen (bijv CDCl3) worden gebruikt in tegenstelling tot andere werkwijzen die grote hoeveelheden oplosmiddel vereist om monsters te elueren. Daarnaast NMR heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere analytische werkwijzen. Kalibratie met standaarden wordt vereist voor de analyse en een minimale monstervoorbereiding zonder scheidings- en zuiveringsstappen wordt gewoonlijk aangenomen, dat maakt een zeer snelle NMR analyse-instrument. Bovendien 13C NMR is de best beschikbare methode voor het bepalen van de positie verdeling van verschillende vetzuren op de glycerol skelet. Terwijl de enzymatische hydrolyse is gebruikt als een alternatief is niet altijd betrouwbaar= "xref"> 24. Dit is van specifiek belang, omdat er een aanzienlijk belang in het bestuderen van de regiospecificiteit van de verschillende vetzuren in voedingsmiddelen, zoals gebleken is dat dit invloed heeft op hun functie in de menselijke voeding 25, 26.
toekomstige toepassingen
Ondanks de overeenkomst tussen de NMR-analyse en het etiket van de producten, evenals het feit dat er een aantal studies die aantonen tussen GC en NMR, zijn wij van mening dat er meer strenge en uitgebreide intra-laboratorium studies zijn nodig om de overeenkomst tussen NMR en traditionele onderzoeken methodes voor de analyse van visolie bestanddelen onder toepassing van een groter aantal monsters, visolie producten van verschillende oorsprong en gecertificeerde standaardoplossingen.
Een andere belangrijke toekomstige toepassing van NMR in visolie analyse het bepalen van de oxidatieproducten zijn. Naast het vaststellenvan de hoofdcomponenten in visolie, verschillende primaire en secundaire oxidatieproducten in visolie, zoals aldehyden en peroxiden aanwezig. 1H NMR kan eventueel worden toegepast voor de beoordeling van de oxidatietoestand van visoliesupplementen in verschillende oxidatieomstandigheden, zie figuur 3. De grootste uitdaging in deze analyse de NMR opdracht en de identificatie van individuele oxidatieproducten zijn. Vooruitgang in gevoeligheid van de NMR hardware ook de identificatie van individuele sterolen met 13C-NMR. NMR-spectroscopie kan worden toegepast voor de analyse van visweefsel als geheel ook zonder extractie met hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR.
Kritische stappen in het Protocol
Twee van de meest kritische stappen die de nauwkeurigheid van kwantitatieve NMR spectra beïnvloeden omvatten de keuze van een 90 ° puls en het gebruik van een vertraging tussen puGrote ondernemingen ≥ 5 x T1. De pulshoek is evenredig met pulsbreedte die een gekalibreerde NMR parameter die afhangt van de instrumentatie en het monster. Een 90 ° puls is essentieel voor de volledige omzetting van longitudinale (z) de magnetisatie waarneembare dwarse (xy) magnetisatie. Het is belangrijk op te merken dat voordat puls kalibratie, de NMR gesondeerd moet goed worden afgestemd en op elkaar afgestemd. Dit zal de overdracht van de HF-vermogen aan het monster optimaliseren en zodoende maximale S / N en een effectieve ontkoppeling. De sonde tuning wordt meestal beïnvloed door de diëlektrische constante van het monster, dus als er verschillen in de concentratie van monsters, herhaalt het afstemmingsproces voor elk. De 1D 13C NMR experiment omvat zowel 13C en 1H-kanalen, zodat automatisch afstemmen en aanpassing is noodzakelijk voor beide kernen.
Een vertraging tussen pulsen langer dan 5 × T1 zorgt totale recovery van de netto magnetisatie naar de oorspronkelijke waarde. Als alle resonanties in het spectrum niet volledig ontspannen voor elke puls wordt het signaal gedeeltelijk onderdrukt en leidt tot onnauwkeurigheden bij de integratie. T1 waarde is een belangrijke factor die de duur van het experiment beïnvloedt en is afhankelijk van de magnetische veldsterkte en de viscositeit van het monster. Gezien het feit dat de viscositeit tussen de monsters is gelijkaardig, moet T1 relaxatietijden worden bepaald voor elk instrument alleen in het begin van de analyse sessie.
Een ander belangrijk kenmerk van de visolie analyse met 13C-NMR is de selectie van de geschikte impulsreeks. De meest betrouwbare methode voor de kwantitatieve 13C-analyse is de inverse gated ontkoppeling experiment, waar breedband protonontkoppeling enkel gedurende acquisitie wordt toegepast en er is dus geen polarisatieoverdracht van 1 uur tot 13C via nucleair Overhauser effect (NOE). Hoewel de volledige ontkoppeling NMR experiment kan worden gebruikt voor kwantitatieve doeleinden, voorzichtigheid vereist bij het gebruik van dit experiment, omdat er verschillende NOE factoren tussen koolstofatomen met verschillende veelvouden en dus integraal vergelijking tussen methyl, methyleen, methaan en carbonylkoolstof moeten worden vermeden. Ondanks dit, wanneer slechts koolstoffen van soortgelijke veelheid en chemische milieu beschouwd worden in de analyse, de volledige ontkoppeling methode is betrouwbaar. Een voorbeeld hiervan is carbonylkoolstofatomen van vetzuren waarvan is bepaald dat deze geen significante verschillen in de NOE groeifactoren na ontkoppeling 27 hebben. Daarnaast voor koolstoffen dragen protonen, de volledig ontkoppelde experiment levert hogere gevoeligheid vanwege de NOE bijdragen aan de NMR-signaalintensiteit. Een vergelijking van spectra verkregen met de twee pulsreeksen is getoond in figuur S1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Foods for Health Discovery thema aan de Ohio State University en het Department of Food Science and Technology aan de Ohio State University. De auteurs willen graag de NMR faciliteit aan de Ohio State University en de NMR faciliteit aan de Penn State University bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avance III 850 NMR instrument | Bruker | ||
| Avance III 500 NMR instrument | Bruker | ||
| TCI 5 mm probe | Bruker | Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N) | |
| BBO prodigy 5 mm probe | Bruker | Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P) | |
| Spinner turbin | Bruker | NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place | |
| Topspin 3.5 | Bruker | ||
| deuterated chloroform | Sigma-Aldrich | 865-49-6 | 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS |
| 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol | Sigma-Aldrich | 128-37-0 | purity >99% |
| Fish oil samples | |||
| NMR tubes | New Era | NE-RG5-7 | 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube |
| BSMS | Bruker | Bruker Systems Management System; control system device |
References
- Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56 (8), 365-379 (2002).
- Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58 (5), 880-885 (1981).
- Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96 (11), 1521-1529 (2005).
- Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38 (8), 1107-1114 (1995).
- Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
- Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
- Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
- Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
- Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
- Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2 (2), 62-68 (2014).
- Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104 (6), 942-950 (2004).
- Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
- Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83 (1), 67-72 (2013).
- Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5 (6), 400-411 (2013).
- Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. , Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
- Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
- Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41 (8), 1247-1253 (1993).
- Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7 (12), 5226-5238 (2015).
- Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80 (10), 993-996 (2003).
- Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44 (12), 2406-2427 (2003).
- Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
- Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
- Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116 (3), 272-281 (2014).
- Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22 (1), 3-17 (2009).
- Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
- Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).
