Summary
ويدخل هذا المخطوط وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. استخدام القوة المغناطيسية وخرز الصلب ومجموعة من خلال ثقب، شكلت ميكروويلس عدة مئات في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم.
Abstract
ثقافة كروي أداة مفيدة لفهم سلوك الخلوية حيث أنه يوفر في فيفو--مثل البيئة ثلاثية الأبعاد. مختلف أساليب الإنتاج كروي مثل الأسطح غير لاصقة وقوارير غزل وقطرات معلقة وميكروويلس قد استخدمت في دراسات التفاعل خلية إلى خلية، وتنشيط جهاز المناعة، المخدرات الفرز، تنبع تمايز الخلية، وجيل أورجانويد. من بين هذه الأساليب، اكتسبت ميكروويلس مع هندسة مقعرة ثلاثي الأبعاد اهتمام العلماء والمهندسين، ونظرا لمزاياها من جيل كروي موحدة الحجم والسهولة التي يمكن أن تكون ردود الماغنيسيوم الفردية رصد. على الرغم من أن قد اقترحت طرق فعالة من حيث التكلفة مثل استخدام الأغشية المرنة والطباعة الحجرية الجليد، هذه التقنيات تحمل العيوب الخطيرة مثل صعوبة في السيطرة على أحجام نمط، تحقيق نسب عالية، وإنتاج مساحات أكبر من ميكروويلس. للتغلب على هذه المشاكل، فإننا نقترح وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. هذا الأسلوب يستخدم صفيف من خلال ثقب 30 × 30، عدة مئات ميكرومتر-أمر الصلب الخرز، والقوة المغناطيسية اختﻻق ميكروويلس 900 في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم. لإثبات انطباق لدينا طريقة للتطبيقات البيولوجية الخلية، استزراع الخلايا الجذعية الدهنية لمدة 3 أيام، وأنتجت بنجاح الماغنيسيوم استخدام برنامجنا ميكروويل. وبالإضافة إلى ذلك، نحن إجراء محاكاة ماجنيتوستاتيك للتحقيق في هذه الآلية، حيث استخدمت القوة المغناطيسية لفخ الخرز الصلب من خلال الثقوب. ونحن نعتقد أنه يمكن تطبيق طريقة تصنيع ميكروويل المقترحة للعديد من الدراسات الخلوية على أساس كروي مثل فحص المخدرات وتجديد الأنسجة، وتمايز الخلايا الجذعية وسرطان خبيث.
Introduction
الخلايا التي نمت في شكل كروي أكثر مشابهة للنسيج الحقيقي في الجسم من ثقافة المستوية ثنائية الأبعاد1. ونظرا لهذه الميزة، قد اعتمدت استخدام الماغنيسيوم لتحسين دراسة تفاعل الخلية للخلية2،3، التنشيط المناعي4، المخدرات الفحص5و6من التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت مؤخرا إلى أورجانويدس (قرب الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة)، والتي مفيدة جداً لدراسة التنمية والأمراض البشرية7الماغنيسيوم دمج أنواع متعددة من الخلايا. وقد استخدمت عدة أساليب لإنتاج الماغنيسيوم. أبسط طريقة ينطوي على استخدام سطح غير لاصق، بتجميع الخلايا مع بعضها البعض والماغنيسيوم النموذج. ويمكن علاج طبق بيتري مع ألبومين المصل البقري أو بلورونيك F-127 أو بوليمر مسعور (مثل بولي 2-هيدروكسييثل ميثاكريلات) لجعل سطح غير لاصق8، 9. الأسلوب قارورة زر الزيادة والنقصان وسيلة أخرى معروفة لإنتاج كميات كبيرة من الماغنيسيوم10،11. في هذا الأسلوب، تشغل الخلايا في تعليق إثارة للحيلولة دون أن تصبح يعلق على الركازة. بدلاً من ذلك، العائمة الخلايا المجمعة الماغنيسيوم النموذج. كل أسلوب سطحي غير لاصقة وغزل قارورة أسلوب يمكن أن تنتج كميات كبيرة من الماغنيسيوم. ومع ذلك، فتخضع لقيود بما في ذلك صعوبات في التحكم في حجم كروي، فضلا عن التتبع ورصد كل كروي. كعلاج لهذه المشاكل، وأسلوب الإنتاج كروي آخر، إلا وهي إسقاط معلقة أسلوب يمكن العاملين12. وهذا ينطوي على إيداع قطرات تعليق خلية على الجزء السفلي غطاء صحن الثقافة. وعادة ما تكون من 15 إلى 30 ميليلتر في حجم هذه القطرات وتحتوي على ما يقرب من 300 إلى 3000 الخلايا13. عندما هو مقلوب الغطاء، القطرات تجري في مكان التوتر السطحي. ويركز بيئة الجاذبية الصغرى في كل قطره الخلايا، ثم تشكل الماغنيسيوم واحد في واجهة الهواء السائل حرة. فوائد معلقة أسلوب الإسقاط أن يوفر توزيع المساحة التي تسيطر عليها جيدا، في حين أنه من السهل تتبع ورصد كل كروي، مقارنة بالأساليب قارورة المياه السطحية وغزل غير لاصقة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتكبد عيب واحد في هذا الإنتاج الضخمة من الماغنيسيوم وعملية الإنتاج ذاتها مفرطة من حزب العمل المكثف.
مجموعة ميكروويل من شقة لوحة مع العديد من الآبار الصغيرة الحجم، وكل منها يبلغ قطرها يتراوح من 100 إلى 1000 ميكرومتر. مبدأ الإنتاج كروي عند استخدام ميكروويلس شبيه بطريقة سطحية غير لاصقة. وتشمل فوائد حقيقة أن توفر ميكروويلس المسافات بين ميكروويلس لفصل الخلايا أو الماغنيسيوم، مثل أن يكون من السهل التحكم في حجم كروي، حين أيضا يجعل من السهل لرصد كل واحد كروي. مع عدد كبير من ميكروويلس، من الممكن أيضا إنتاج كروي الفائق. ميزة أخرى من ميكروويلس هو الخيار لآبار شكل من أشكال مختلفة (مسدس الأضلاع، أسطواني، البزموت المنشورية) تبعاً لأغراض تجريبية فريدة من نوعها المستخدمين. عموما، إلا أن شكل ثلاثي الأبعاد (3D) مقعرة (أو نصف كروية) تعتبر الأكثر مناسبة لإنتاج الماغنيسيوم واحدة موحدة الحجم. ولذلك، فائدة ميكروويلس مقعرة أبلغ العديد من دراسات البيولوجيا الخلية مثل تلك دراسة كارديوميوسيتي التفريق بين14من الخلايا الجذعية الجنينية، إفراز الأنسولين من خلية جزيرة مجموعات15، النشاط الأنزيمي من خلايا الكبد16، ومقاومة المخدرات الورم الماغنيسيوم17.
ولسوء الحظ، تلفيق ميكروويلس غالباً ما يتطلب وجود مرافق ميكروباتيرنينج المتخصصة؛ الأساليب التقليدية المستندة إلى الطباعة التصويرية تتطلب التعرض، وإنشاء مرافق بينما رد الفعل الأساليب المستندة إلى النقش بايون بحاجة إلى معدات البلازما وأيون-شعاع. هذه المعدات مكلفة، جنبا إلى جنب مع عملية تصنيع معقدة، يعرض حاجز عال لدخول لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى ميكروتيتشنولوجي. للتغلب على هذه المشاكل، طرق أخرى فعالة من حيث التكلفة مثل الجليد الطباعة الحجرية18 (باستخدام قطرات الماء المجمدة) وقد اقترحت طريقة غشاء مرن14 (باستخدام غشاء والركيزة من خلال ثقب وفراغ). ومع ذلك، تحمل هذه الأساليب أيضا عيوب خطيرة مثل كونها صعبة التحكم في أحجام نمط وتحقيق نسب عالية وإنتاج ميكروويلس مساحة أكبر.
للتغلب على المسائل المذكورة أعلاه، نقترح أسلوب اختﻻق رواية ميكروويل مقعرة استخدام ركيزة من خلال ثقب وخرز الصلب ومجموعة مغناطيس. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن اختﻻق مئات ميكروويلس كروية مقعرة بالاستفادة من إليه الخرز المعدني التأمين الذاتي ساعدت القوة المغناطيسية (الشكل 1). عملية تصنيع ينطوي على استخدام مرافق قليلة جداً معقدة ومكلفة ولا تتطلب الكثير من المهارات المتقدمة. على هذا النحو، يمكن بسهولة إجراء الأشخاص المهرة حتى هذا الأسلوب تلفيق. وللتدليل على الطريقة المقترحة، كانت مثقف الإنسان الدهنية-المستمدة من الخلايا الجذعية في ميكروويلس مقعرة لإنتاج الماغنيسيوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد صفيف من خلال ثقب الألومنيوم لوحة والمغناطيس الصفيف
- إعداد اثنين 50 x 50 مم (أو أكبر) صفائح الألومنيوم. وكان سمك كل لوحة 300 ميكرون هو نصف قطر حبة.
- تشكيل مجموعة من خلال ثقب 30 × 30 في واحدة من لوحات الألومنيوم باستخدام حفارة دوارة استخدام الحاسب الآلي مع قليلاً حفر الصغرى ميكرومتر Φ550 مع 30 ملم/s معدل الهبوط و 8000 دورة في الدقيقة لسرعة الدوران. وكان المسافة بين كل ثقب (مركز إلى مركز) 1 ملم (الشكل 1a و 2a الشكل، وأنا).
- وتشكل مجموعة 30 × 30 ميكرون Φ750 من خلال الثقوب على لوحة الألومنيوم الأخرى، باستخدام نفس الإجراء كالموضحة في 1.2 (الشكل 1a و 2a الشكل، ثانيا).
- إرفاق لوحات اثنين بعضها البعض باستخدام شريط لزجة وتشكل Φ3 مم محاذاة الثقوب في كل من الزوايا الأربع من صفائح الألومنيوم على حد سواء.
- نقع ألواح الألومنيوم في حمض الكبريتيك 15% ح 12 لتنظيف هذه الأسطح. نظراً لأن طبقة رقيقة من أكسيد الألومنيوم على سطح الألومنيوم تجعل من مقاومة للتآكل، حفرة قطرها وسمك اللوح لا تتغير بهذه المعالجة الحمضية.
- وتشكل مجموعة 30 × 30 من 1 × 1 × 1 مم نيوديميوم المغناطيس (مع قوة مغنطيسية 0.363 ن). ضمان أن كل المغناطيس الأقطاب المتقابلة لجارتها. لمنع كسر أو نثر الصفيف المغناطيس، إرفاق لوحة ألومنيوم 30 x 30 ملم إلى الجزء السفلي من الصفيف المغناطيس باستخدام الشريط على الوجهين (الشكل 2a، ثالثا واقحم في الشكل 2).
2-حبة العملية الملائمة
- محاذاة والمكدس لوحات الألومنيوم اثنين (أعلى اللوحة: لوحة 750 حفرة ميكرومتر، أسفل لوحة: لوحة 550 حفرة ميكرومتر) استخدام الثقوب إعداد المحاذاة في الأركان الأربعة لكل لوحة (الشكل 1b).
- تأمين لوحات اثنين معا عن طريق إدراج مسامير M3 في محاذاة الثقوب، ومن ثم تأمين البراغي مع المكسرات (الشكل 1b).
- المكدس الجمعية لوحة الألومنيوم في الصفيف المغناطيس استعداد (الشكل 1bو 2bو 2 (ج)). قم بمحاذاة صفيف المغناطيس ومجموعة من خلال الثقوب في لوحة الألومنيوم أثناء عملية التراص. ثم استخدم شريط مثبت لتحديد موقف الصفيف المغناطيس.
- لوحة مكان عددا كافياً من الصلب مم SUJ2 Φ600 الخرز على الجمعية لوحة والتلاعب بالخرز استخدام اﻷكريليك (أو غير المعدنية) مثل أن يصبح محاصرين في وقت واحد في كل حفرة (الشكل 1 ج ود 1و 1e) بينما حبة إزالة الخرز الزائدة التي لا تقدموا في الثقوب.
- بعناية إزالة اللوحة العلوية لتجنب تشتت غير المرغوب فيها والتفكك من الخرز المحاصرين (الشكل 1f).
3-تصنيع ميكروويل مقعرة
- نقل القالب ميكروويل مقعرة، أنتجت في خطوات 2.1 2.5، أعلاه، إلى طبق بيتري.
- مزيج مركب بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، وعامل المعالجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة19 مع مونومر PDMS: علاج عامل نسبة 10:1.
- إزالة الغاز المخلوط PDMS باستخدام مجففة ومضخة فراغ لإزالة أي فقاعات محاصرين في خليط PDMS.
- صب خليط PDMS العفن ميكروويل مقعرة والغاز دي مرة أخرى باستخدام نفس الإجراء كالموضحة في 3.3 (الشكل 1f).
- خبز خليط PDMS على هوتبلت عند 80 درجة مئوية ح 2 تشكل جزءا لا يتجزأ من حبة الركازة PDMS (الشكل 1 ز).
- إزالة الركيزة PDMS شُفي من العفن (الشكل 1 ز). في عملية إزالة، ورذاذ الميثانول باستخدام زجاجة الغسيل لفصل الركيزة PDMS من العفن.
- باستخدام Φ15 مم × 2 مم المغناطيس، إزالة الخرز الصلب المحاصرين من الركازة PDMS (ح الشكل 1). لهذه العملية، ويمكن استخدام أي مغناطيس قوي بما فيه الكفاية لاستخراج الخرز من الركازة PDMS.
4-ثقافة كروي
- قص الركيزة PDMS مقعرة منقوشة ميكروويل باستخدام Φ14 مم خزعة لكمه لتركيبها في لوحة 24-جيدا في هذه الدراسة.
- تعقيم الركيزة PDMS مم Φ14 الناجمة عن ذلك في معقم اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية و 15 رطل/بوصة مربعة.
- ضع الركيزة PDMS معقمة في 24 لوحة جيدا.
- معطف الركيزة PDMS كامل مع حل pluronic F-127 4% (w/v) بين عشية وضحاها لمنع المرفقات الخلية إلى السطح ميكروويل. أثناء عملية الطلاء، وإزالة أي فقاعات الهواء أكمنة في ميكروويلس مقعرة بيبيتينج أو باستخدام منظف الموجات فوق الصوتية.
- مسح الحل F-127 ثلاث مرات باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- البذور 1 مل من محلول الخلية المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة دولبيكو) (والذي يحتوي على 2 × 106 خلايا) على الركازة PDMS. لاحظ أنه لا يمكن تغيير كثافة البذر وفقا لحجم كروي الهدف و/أو نوع الخلية الهدف. وهنا استخدمت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC).
- نضح 1 مل المتوسطة باستخدام ماصة 1000 ميليلتر لإزالة أي الخلايا الزائدة التي لا حوصروا في ميكروويلس (الشكل 3).
- احتضان الخلايا عند 36.5 درجة مئوية، رطوبة > 95%، و 5% CO2 حالة. وفي حالة الخزفية المستخدمة في هذه الدراسة، تجميع الخلايا إلى كروي في ح 48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت ملفقة من العفن محدب ونمط ميكروويل بنجاح قبل اتباع الخطوات 2.1 إلى 3.7. (الشكل 4). الخرز الصلب التجاري حوصروا في الصفيف من خلال ثقب 30 × 30. وعقدت الخرز محكم دون أي ثغرات بين الخرز وفي المقابلة عن طريق الثقوب (الشكل 4 أ). هو مقعر شكل ميكروويل مقعرة ملفقة نصف كروية، قطرها 600 ميكرون، وهو نفسه من حبة الصلب (الشكل 4 باء). شريحة من ميكروويل مقعرة (الشكل 4 ج) يبين أن كانت المسافة من ميكروويل المجاورة 1 ملم (من مركز إلى مركز)، والذي كان نفسه من خلال الثقوب. الركيزة مقعرة مم ميكروويل Φ14، التي تم وضعها في لوحة جيدا 24، الواردة ميكروويلس ما يزيد على 120 (د الرقم 4).
تم استزراع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية في ميكروويلس مقعرة. نحن المصنف 2 × 106 خلايا في الصفيف مقعرة ميكروويل مم Φ14. بعد 24 ساعة، وقد دمج الخلايا في الماغنيسيوم، كما هو مبين في الشكل 4. وكان متوسط قطر الماغنيسيوم تشكلت في لدينا مجموعة ميكروويل 185.68 ± 22.82 ميكرومتر (اليوم 1، الشكل 5a، ج 5). في يوم 3، الخلايا قد تصبح أكثر مجمعة، مع متوسط قطرها الماغنيسيوم السقوط إلى 147.00 ± 17.11 ميكرومتر (الشكل 5b، 5 د).
الشكل 1 : التخطيطي لعملية تصنيع. (أ) جعل Φ550 30 × 30 و 750 ميكرون من خلال ثقب الصفيف في صفائح الألومنيوم استخدام حفارة باستخدام الحاسب الآلي. (ب) التوفيق بين الاثنين من خلال لوحات باستخدام محاذاة الثقوب. وفي وقت لاحق، كانت مكدسة لوحات المنحازة في الصفيف المغناطيس. (ج) كمية كافية من الخرز الصلب على اللوحات البذر. (د) إلغاء استخدام صفيحة اﻷكريليك إلى اعتراض الخرز في الصفيف من خلال ثقب الخرز. (ﻫ) الخرز حوصروا في الصفيف من خلال ثقب. (و (تمت إزالة الصفيحة العلوية (صفيف من خلال ثقب Φ750-ميكرومتر) وكان سكب أونكوريد PDMS الخليط في القالب. (ز) بعد أن كان خبز في PDMS في 80 ˚C ح 2، كان صهر PDMS علاجه. (ح) PDMS شُفي يمسك الخرز الصلب. تتم إزالة الخرز ثم استخدام مغنطيس نيوديميوم (Φ15 ملم بسماكة 2 ملم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : عملية تلفيق. (أ) إعداد اثنين من خلال ثقب لوحات والمغناطيس الصفيف. ط) لوحة الألومنيوم بعد 750 ميكرون من خلال ثقب الصفيف. الثاني) لوحة الألومنيوم بعد 550 ميكرون من خلال ثقب الصفيف. ثالثا) 30 × 30 مجموعة من 1 مم × 1 مم × 1 مم المغناطيس. (ب) أعلى عرض لوحات مكدسة وتمت محاذاته. (ج) أسفل عرض لوحات مكدسة والانحياز والمغناطيس الصفيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إزالة الخلايا المفرط بانحسار غضروف. التي تطمح المتوسطة، كان سببه التوتر السطحي واجهة الهواء السائل، ثم ألغت التوتر السطحي الخلايا المفرط على سطح الركازة ميكروويل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : العفن محدب ومجموعة ميكروويل ملفقة. (أ) المحاصرين الخرز في لوحة الألومنيوم من خلال ثقب الصفيف. بمثابة الخرز المحاصرين العفن اختﻻق ميكروويلس مقعرة. وكان حجم حبة 600 ميكرون. شريط مقياس من 1 مم-(ب) ووزارة شؤون المرأة (ج) صور ميكروويلس ملفقة. كل ميكروويل ملفقة بشكل نصف كروي، 600 ميكرون في القطر. (د) مم Φ14 ميكروويل الصفيف في لوحة 24-جيدا. يحتوي الصفيف على ما يزيد على 120 ميكروويلس مقعرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الثقافة الماغنيسيوم في صفيف مقعرة ميكروويل. كان المصنف مع 2 x 106 الخزفية الصفيف ميكروويل Φ14 ملم ومثقف لمدة 3 أيام. (أ) مثقف الماغنيسيوم في يوم 1؛ وبدأ الماغنيسيوم شكل الخلايا. هو شريط مقياس 2-(ب) الماغنيسيوم المستزرعة في اليوم 3؛ الماغنيسيوم شكلت تنظيماً أكثر أحكاما، بينما انخفض متوسط قطرها من 185.68 ميكرومتر 22.82 ± 1 يوم إلى 147.00 ميكرومتر 17.11 ± 3 يوم. شريط مقياس التكبير (ج) صور 2 مم. كروي في يوم 1. شريط مقياس 500 ميكرومتر. (د) تكبير صور كروي في اليوم 3. شريط مقياس هو 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : نتيجة المحاكاة لناقلات لكثافة التدفق المغناطيسي- تم حساب كثافة تدفق مغناطيسي في الصفيف المغناطيس باستخدام الوحدة النمطية ماجنيتوستاتيك. وتبين نتيجة المحاكاة كثافة التدفق المغناطيسي أقوى في مركز كل المغناطيس، تسبب الخرز حبيسة في المركز من خلال الثقوب حيث أصبحت ثابتة بشكل أمن. شريط مقياس 2 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : توزيع المجال المغناطيسي للمغناطيس الصفيف. كل المغناطيس من الأقطاب المتقابلة لجارتها. الحقل المغناطيسي الأفقية المهيمنة في مجال التفاعل بين المغناطيس المجاورة، بينما المجال المغناطيسي العمودي الأقوى في مركز كل مغناطيس. هذه القوات اتجاهي دليل حبة لمركز المغناطيس. (أ) المجال المغناطيسي للمغناطيس الصفيف. (ب (ناقل للمجال المغناطيسي كما يحدده ماجنيتوستاتيك المحاكاة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 : الحد من استخدام المغناطيس كبيرة واحدة ومن حجم حبة. (أ) خلافا لحالة استخدام صفيف مغناطيسات صغيرة، عند أحد يستخدم مغنطيس كبير، كلها تقريبا من الخرز تميل إلى الانتقال إلى الحافة أو مركز للمغناطيس حيث يتكون المجال المغناطيسي عالي الكثافة. علاوة على ذلك، ترتبط الخرز لتشكيل شكل سلسلة. شريط مقياس صورة 10 ملم-(ب) وزارة شؤون المرأة مرتبط ميكروويل التي كانت مختلقة باستخدام الخرز مكم Φ800 مع 1 مم × 1 مم × 1 مم المغناطيس الصفيف. استخدام حبة كبيرة جداً في الحجم بالنسبة لحجم المغناطيس إنشاء ثقب صغير في الجدار الفاصل بين ميكروويلس المجاورة. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 9 : أهمية اختيار حجم وسمك وثقب الصفيحة العلوية المناسبة في عملية محاصرة حبة. (أ) إذا كان أعلى لوحة سميكة جداً، سوف تحدث فخ مزدوج. (ب) على العكس من ذلك، إذا كانت اللوحة العلوية رقيقة جداً، هناك ميل الخرز تؤتي ثمارها. (ج) إذا كان الحجم من خلال الثقب أكبر من قطر حبة، قد يحدث التفكك على حد سواء من ضعف فخ وحبه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان التحدي الرئيسي الذي يواجه هذا الأسلوب تلفيق تحديد آمنة من الخرز في الصفيف من خلال ثقب في لوحة الألومنيوم. لحل هذا التحدي، استخدمت القوة المغناطيسية في شكل مصفوفة المغناطيس 30 × 30 لإصلاح الخرز بشكل أمن، كما هو مبين في أرقام 6 و 7. كثافة التدفق المغناطيسي في الصفيف المغناطيس، التي تضم الأقطاب المتقابلة، الأقوى في مركز كل سطح المغناطيس. لقوام القوة المغناطيسية يعتمد على كثافة التدفق، والخرز اهتدت إلى مركز السطح العلوي لكل مغناطيس حيث احتجزوا في الموقف. إذا تم استخدام مغناطيس واحدة كبيرة الحجم (5 سم × 5 سم × 1 سم)، والخرز، وبخاصة تلك التي تقع في أقصى خارج الثقوب، تميل إلى جذبها إلى أعلى كثافة المجال المغناطيسي التي تم إنشاؤها عند الحافة المغناطيس. مشكلة أخرى مع استخدام مغناطيس كبير هو أن الخرز العصا معا تلقائياً لإنشاء سلاسل حبة صغيرة (الشكل 8 أ).
دور الصفيحة العلوية (750 ميكرون ثقب) كان لخدمة الهندسة الحفرة إلى اعتراض الخرز. نتيجة لهذا الهيكل حفرة، فمن الممكن الصفر الخرز مع صفيحة اكريليك لإنشاء عدد كبير من صفائف حبة المحاصرين في وقت واحد (بروتوكول 2.4 و الشكل 1 ج ود 1). إذا لم تكن تستخدم الصفيحة العلوية، كل حبة يجب إدراجه يدوياً في القاعدة (550 ميكرون هول) في وقت واحد.
القيود المفروضة على أسلوبنا تشمل الحاجة إلى حفارة باستخدام الحاسب الآلي الذي هو أغلى جهاز يستخدم في الأسلوب. يتم تسعير هذه الأجهزة باستخدام الحاسب الآلي من حوالي 3000 دولار. ومع ذلك، هذا لا يزال أرخص من مرافق الطباعة الحجرية الناعمة التقليدية. آخر القيد الأصيل أسلوبنا هو الحاجة إلى مغناطيس صغير، والفجوة بين ميكروويلس تعتمد على حجم المغناطيس، الذي كان 1 مم في المظاهرة المذكورة في هذه الورقة. فإنه سيكون من الصعب لتقليل هذه الفجوة أكثر بكثير منذ مغناطيسات أصغر من 500 ميكرون ليست متاحة بسهولة. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا الحد الأقصى لحجم حبة محدودة. وقد ممغنط الخرز المحاصرين بالمغناطيس. إذا كانت الفجوة بين الخرز المغناطيسي ضيقة للغاية، أعلى من بعض ميكروويلس كانت متصلة بواسطة ثقوب كما هو موضح في الشكل 8باحتمال الالتصاق معا. ولذلك، عندما تستخدم 1 مم × 1 مم × 1 مم المغناطيس، الخرز التي يبلغ قطرها 700 ميكرون أو أكثر لا ينصح
بالمقارنة مع أساليب تصنيع أخرى مثل غشاء مرن14والجليد الطباعة الحجرية18 ورد الفعل العميق أيون النقش20، هذا الأسلوب تلفيق لا تتطلب مرافق الطباعة الحجرية الخاصة، يسمح الموقف ميكروويل لتكون السيطرة عليها بسهولة، ويمكن أن تنتج شكل موحد ميكروويل مقعرة. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترحت النقش الرطب21PDMS و الطباعة الحجرية الرمادي22والمؤخر موزع الطباعة الحجرية الخفيفة23 لإنتاج الهندسات مقعرة. بيد أن النقش الرطب من PDMS يتطلب بنية مستطيلة أولاً جعل ميكروويل مقعرة وجولة، وليست مناسبة لجعل ميكروويل مفتوحة. أسلوب الطباعة الحجرية اللون الرمادي على الاستفادة من استخدام مرافق الطباعة الحجرية الموجودة في الصورة، ولكن الحاجة إلى مرافق يسعر عالية وقناع الصور اللون الرمادي وضع غير مؤات. موزع المؤخر الضوء الطباعة الحجرية وكان أسلوب الإبلاغ عنها مؤخرا آخر مفيدة اختﻻق ميكروويلس مقعرة بنسب مختلفة، ولكن فقط بدقة منخفضة الكثافة نمط.
أن الخطوة الحاسمة في تصنيع ميكروويل مقعرة هو اختيار سمك وحجم من خلال ثقب الصفيحة العلوية (الخطوة 1، 1 و 1-3). إذا كانت اللوحة من خلال ثقب سميكة جداً، يمكن المحاصرين الخرز متعددة في كل من خلال ثقب (الشكل 9 ألف)؛ إذا كانت ضعيفة جداً، لن ثابتة في الخطوة 2، 4 الخرز وهكذا خلع من خلال الثقوب (9b الشكل). في حالة أكبر من خلال ثقب، يمكن أن تحدث فخ متعددة والتفكك (ج الشكل 9).
كمبدأ توجيهي لتحديد حجم المغناطيس وسمك اللوح من خلال ثقب، من المستحسن أن حجم المغناطيس وسمك "اللوحة من خلال ثقب" يكون استناداً إلى حجم حبة. يجب أن يكون حجم المغناطيس أكبر من قطر حبة، ولا ينبغي أن يتجاوز سمك اللوح من خلال ثقب قطره حبة. ومع ذلك، نظراً لاختيار المغناطيس وسمك اللوح التجريبية، التحسين أكثر تفصيلاً ودراسات بارامتريه ستدرج في الدراسات المستقبلية.
وتشمل الأهداف المستقبلية لدينا أسلوب تصنيع الخلايا الجذعية المتخصصة مثل ميكروويلس للمحاكاة البيولوجية في المختبر بصيلات الشعر24، ميكروويلس مخصصة ل جيل أورجانويد25، ومصفوفات متنوعة من ميكروويلس مختلفة الحجم لدراسة اعتماد الخلايا السرطانية والخلايا المناعية على حجم كروي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل (2014R1A1A2057527 جبهة الخلاص الوطني وجبهة الخلاص الوطني-2016R1D1A1B03934418).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
| Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
| Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
| Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
- Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
- Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
- Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
- Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
- Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
- Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
- Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
- Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
- Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
- Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
- Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
- Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
- Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
- Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
- Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
- Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
- Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
- Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).
