Okontrollerad hemoragisk shock modellerad via leverlackering i möss med realtidshemodynamisk övervakning

Summary

Okontrollerad blödning, en viktig orsak till dödlighet bland traumapatienter, kan modelleras med en standard leverlaceration i en murinmodell. Denna modell resulterar i konsekvent blodförlust, överlevnad och möjliggör testning av hemostatiska medel. Denna artikel ger steg för steg processen för att utföra denna värdefulla modell.

Abstract

Okontrollerad blödning är en viktig orsak till förebyggande dödsfall bland traumapatienter. Vi har utvecklat en murin modell av okontrollerad blödning via en leverlaceration som resulterar i konsekvent blodförlust, hemodynamiska förändringar och överlevnad.

Möss genomgår en standardiserad resektion av leverns vänstra mittklob. De får blöda utan mekanisk ingrepp. Hemostatiska medel kan ges som förbehandling eller räddningsbehandling beroende på undersökarens intresse. Under blödningstiden utförs realtidshemodynamisk övervakning via en vänster femoral arteriell linje. Mössen offras sedan, blodförlust kvantifieras, blod samlas in för vidare analys och organ skördas för analys av skada. Experimentell design beskrivs för att möjliggöra samtidig testning av flera djur.

Leverblödning som modell för okontrollerad blödning finns iN litteraturen, främst i rått- och svinmodeller. Några av dessa modeller använder hemodynamisk övervakning eller kvantifierar blodförlust men saknar konsistens. Den nuvarande modellen innehåller kvantifiering av blodförlust, hemodynamisk övervakning i realtid i en murinmodell som erbjuder fördelen att använda transgena linjer och en hög genomströmningsmekanism för att ytterligare undersöka de patofysiologiska mekanismerna vid okontrollerad blödning.

Introduction

Trauma är den främsta orsaken till dödsfall och handikapp bland ungdomar över hela världen. ¹ Okontrollerad blödning är fortfarande en ledande orsak till dödlighet bland allvarligt skadade traumapatienter. ² Hantering av hemorrhagande traumapatienter är dubbelt: kontroll av kirurgisk blödning och återupplivning och ersättning av förlorat blod.

Djurmodeller av hemorragisk chock har varit hörnstenen i traumavetenskap och kan användas vid utvärderingen av patofysiologin och behandling av traumatisk / hemorragisk chock. ^{3 , 4} Shock i djurmodeller kan uppnås i stort sett genom två metoder: kontrollerad blödning och okontrollerad blödning. ^{5 , 6} Kontrollerad blödning utförs genom avlägsnande av en fast volym blod eller genom blodavlägsnande för att uppnå ett visst blodtryck (fast tryck). MedanSe-modeller är användbara vid utvärderingen av mekanismerna och immunförändringar i hemorragisk chock, de är inte tillämpliga på test av hemostatiska medel och efterliknar inte det kliniska scenariot av blödning efter trauma. I denna grad försökte vi utveckla en modell av okontrollerad blödning som skulle göra det möjligt för oss att testa hemostatiska förändringar och prokoaguleringsmedel i en murinmodell. Levern är ett attraktivt alternativ för okontrollerad blödning delvis på grund av den dubbla blodtillförseln till levern och det är ett av de vanligaste skadade intrabdominala organen i både trubbigt och penetrerande trauma. Med tanke på den höga kliniska relevansen har levern använts som en modell för okontrollerad blödning, oftast hos råtta och svinmodeller, men också nyligen i primater. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} 13 ^{, 14}

Rått- och svinmodellerna av okontrollerad leverblödning, samtidigt som de är värdefulla när man tittar på återupplivningspraxis och hemodynamisk övervakning, är mindre fördelaktiga än en murinmodell av olika skäl, såsom kostnad, antal använda djur och viktigare de relativa bristande transgena linjerna som är tillgängliga för analys Av specifik cellulär och molekylär signalering. Den föreliggande murinmodellen delar viktiga likheter med befintliga leverblödningsmodeller, inklusive standardiserad leverlaceration, kvantitativ blodförlust, hemodynamisk övervakning och förmågan att utföra överlevnadsanalys. Många existerande modeller innehåller bara några av dessa aspekter medan vår modell utvecklades för att mäta många av de fysiologiska variablernaBles samtidigt och i flera möss. Utveckling av en murinmodell öppnar också dörren till undersökningar utöver återupplivning och till större patofysiologimekanismer vid okontrollerad blödning med potentialen i en kostnadseffektiv, hög genomströmningsmodell med användning av avancerade molekylära tekniker.

Protocol

Möss hölls i enlighet med University of Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) och National Institutes of Health (NIH; Bethesda, MD, USA) djurhållningsriktlinjer vid specifika patogenfria förhållanden med 12 h ljust mörka cykler och fri tillgång till Standardmatning och vatten. Alla djurförsök godkändes och genomfördes i enlighet med riktlinjerna från Animal Research and Care Committee vid University of Pittsburgh.

1. Kirurgisk fält och instrumentinställning

1. Sterilisera alla kirurgiska instrument, sutur, gasbind, bomullsspetsapplikatorer, slangar och slanganslutningar före proceduren.
   1. Sterilisera kirurgiska instrument, sutur, gasbind och bomullsspetsapplikatorer i en autoklav. Sterilisera slangar och slanganslutningar med etylenoxid.
2. Kirurgiskt fält
   1. Slå på en vattencirkulerande värmepanna och ställ in till 37 ° C. Placera en surgiCal blue pad ovanpå den och sedan en steril drapera ovanpå den kirurgiska blåkudden.
   2. Öppna alla steriliserade instrument på den sterila draperingen. Använd sterila handskar för att undvika att bryta steriliteten under detta steg.
   3. Fyll en rostfritt stålskål med 70% etanol och lägg åt sidan. Detta kommer att användas för att rengöra instrument mellan djur.
   4. Slå på mikrobead sterilisatorn och låt värme till 150 ° C. Detta kommer också att användas för att rengöra instrument mellan djur. Om du utför operation på mer än 5 möss, var noga med att byta instrument till en ny steril uppsättning.
3. Transducer Set-up
   1. Anslut en steril givare, PE-50-rör, två 23G nålar och hanehane Luer och en trevägs stoppkrok. ⁶
   2. Kalibrera och noll givaren per tillverkarens instruktioner.

2. Kirurgisk procedur för leverlackering

1. Narkosinduktion och positionering
2. Injicera natriumpentobarbital intraperitonealt vid en dos av 70 mg / kg. Anestesi bör träda i kraft mellan 5-10 minuter; Bedöma djupet av anestesi med en tånklämma. Om musen har svar på tånklämman behövs ytterligare tid eller anestesi. Om ytterligare anestesi behövs under proceduren, komplettera natriumpentobarbital. Ge inte tillskott i större kvantiteter än 0,05 ml för att förhindra överdosering.
3. När musen är helt under anestesi, placera musen i ryggen på en kirurgisk bräda. Säkra alla fyra lemmar av musen till brädet med tejp.
4. Raka buken och bilaterala geler med en rakhyvel.
5. Blöt steril gasbind med betadin och applicera på buken och bilaterala geléer för operation. För överlevnadsexperiment, förbered magen och ljummen med betadin följt av etanol för totalt tre prep-cykler.
6. Sätt i en rektaltemperaturprobe för att övervaka kärntemperaturen under hela proceduren. Förvara cMalm temperatur mellan 35-37 ° C.

Femoralartär och venös kanylering

1. För venös kateteruppställning: fyll i PE-10-rör, en 30 G-nål och en trevägsstopp med Lactated Ringer-lösning från en IV-väska.
2. För arteriell kateteruppställning: fyll i PE-10-rör och 30G-nål med hepariniserad saltlösning (1:10 utspädning av 1000 U heparin). Heparin-saltlösning krävs för att förhindra koagulering.
3. Placera musen under ett dissekeringsmikroskop.
4. Gör ett 4-5 mm longitudinellt snitt över ljumsklemuskeln med hjälp av kirurgisk iris sax. Med hjälp av Dumont tångar ta tag i fettvävnaden ansluten till adduktormuskeln och dra åt sidan för en ren exponering av femoralbunten. Dissekera inte genom fettvävnaden eftersom detta leder till kärlsjukdom.
5. Avlägsna noggrant nerven bort från artären och venen med Dumont-tången. Det finns en fet kudde intill nerven. Ta det här med en Dumont Forcep anD dra i sidled; Detta drar nerven bort från artären som skapar ett plan för dissektion. Med andra Dumont-forcep dissekerar du bindväven mellan nerven och artären.
   1. Ta inte nerverna under denna del av dissektionen.
6. Loop tre 6-0 silke suturer runt artären och venen proximal till profunda femoris ta av.
   1. Placera sutur 1 mest proximalt och lämna lös.
   2. Placera sutur 2 mest distalt och knyta omedelbart.
   3. Placera sutur 3 mellan Suture 1 och 2 och lämna lös.
7. Gör en arteriotomi på kärlens ventrala yta. Användning av mikrovaskulär sax rekommenderas för att göra arteriotomi för att undvika transektion av kärlet.
8. Sätt in trevägskatetern i artären. Avsluta genast sutur 1 och 2 för att fästa katetern på plats.
9. Anslut trevägskatetern till transducern och samla in baslinjens blodtrycksdata.
10. Upprepa steg 2.2.4 - 2.2.6 på motsatta ljumsken. Kannulera lårbenen på ett liknande sätt som artären. Utför en venotomi på kärlens ventrala yta följt av kateterinsättning. Denna kateter kan användas för fluid eller läkemedelsadministration.

Leverlackering

1. Förväg ett vägrör innehållande 0,5 ml PBS, tre absorptions trianglar och en väga båt per mus.
2. Gör en ventral mittlinje laparotomy snitt som börjar vid xiphoid processen och förlänger caudalt för att tillåta leverans helt.
3. Sätt in en absorptionstriangel i buken mot höger bukvägg. Upprepa på vänster sida.
   1. Se till att absorptionstriangeln är borta från levern för att undvika en packande hemostatisk effekt efter att levern är lacerat.
4. Ta försiktigt i vänster mitten av levern och lera 75% av löken med kirurgisk iris sax. Placera lasernD-segmentet i ett rör innehållande PBS.
5. Stäng bukväggen med häftklamrar via en häftapplikator. Ta tag i huden och musklerna och elda häftklamret. Gör så snabbt som möjligt efter leverkärningen för att undvika blodförlust utanför buken. I överlevnadsexperiment stängs buken i två lager. En löpbar absorberbar sutur för muskeln följd av ett löpande skikt av icke absorberbar sutur för huden ger adekvat tillslutning.
6. För möss som är för överlevnadstidpunkter som är längre än 30 minuter ska lårkatetrarna avlägsnas, artären och venen binds med sutur 3 från steg 2.2.6. Bilaterala geler stängs sedan i två skikt såsom beskrivits i föregående steg.
7. Efter en bestämd tid av intresse för blödning (30 min upp till 72 h), ta bort häftklamrarna. Ta bort absorptions trianglarna och sätt i motsvarande förvägda väga båtar. Använd extra absorptions trianglar för att suga upp något oabsorberat blod.

Postoperativ vård

1. Lämna möss som ska offras efter 30 minuter på kirurgisk styrelse och under konstant övervakning och under fullbedövning fram till offretstidpunkten. Möss euthaniseras med en kombination av hjärtpunktur och en överdos av isofluran inandas.
2. Placera möss som för längre överlevnadstid punkter i en återhämtningsbur ovanpå en vattencirkulerande värmepanna. Ständigt övervaka mössen under återhämtning och lämna inte obevakad tills de återfår medvetandet för att upprätthålla sternal recumbency. Återvänd musen till att bara rymma med andra möss när den har återhämtat sig från anestesi.
3. Administrera postoperativ analgesi med 0,1 mg / kg buprenx via subkutan injektion, en gång vaken från anestesi och var 12: e timme efter tills offret uppnåtts.
4. Tillåt möss fri tillgång till mat och vatten efter att de har returnerats till derasNormala burar postoperativt.
5. Vid tiden för offret för överlevnadsmöss uppnås anestesi med inandad isofluran. En gång under anestesi samlas blod genom en hjärtkardiell punktur i hjärtat, blodförlust registreras som beskrivet ovan och slutligen är eutanasi försäkrad med en överdos av isofluran.

Representative Results

Leverlacerationsmodellen resulterar i reproducerbar och konsekvent blodförlust hos möss. Figur 1A visar den konsekventa vikten av lacererad lever som kan erhållas med en standardavvikelse av endast 0,02 g. Denna konsistens i lacererad levervikt möjliggör förmågan att reproducera modellen mellan möss och i olika experimentella inställningar såsom olika återupplivande protokoll. Den reproducerbara vikten hos den lacererade leveren med ett standardfel på endast 0,01 g ger också en mer standardmodell för okontrollerad blödning som ofta är svår att få i djurmodeller.

Validering av blödningseffekterna av olika behandlingsprotokoll i modellen visas i Figur IB . Mössen förbehandlades med heparin (66 enheter, som en positiv kontroll för blodförlust) eller den anti-fibrinolytiska tranexaminsyran (TXA) (som enNegativ kontroll) och en validerad pro-hemostatisk nanopartikel som tidigare testats i murina svansvinsblödningsanalyser. ¹⁵ Dessa resultat visar förmågan hos denna modell att användas för att bedöma de hemostatiska eller antikoagulerande effekterna vid blödningstillfället.

Okontrollerad blödning åtföljs ofta av hemodynamiska försvagningar som är viktiga för övervakning. I Figur 2 visar det genomsnittliga arteriella blodtrycket (MAP) hos enskilda möss efter leverlaceration att utfällbar och reproducerbar droppe i MAP efter lacerationen utförs vilket resulterar i ett hemorragiskt chocktillstånd. Detta är viktigt eftersom det möjliggör de hemodynamiska effekterna av olika återupplivande eller interventionsåtgärder och möjliggör en viktig inblick i fysiologin kring olika experimentella förhållanden. Medan det finns signifikanta hemodynamiska effekter efter leverlacerationen har vi funnit tHat modellen kan användas för att utvärdera överlevnadseffekter, eftersom modellen har utvärderats ut till 72 timmar med en överlevnad på 56% vid denna tidpunkt ( figur 3 ).

Figur 1: Lever Laceration Validation. ( A ) Representativa vikter av den transekterade leveren. Den genomsnittliga levervikten var 0,26 g med en standardavvikelse på 0,02 g och ett standardfel av medelvärdet av 0,01 g. Dessa resultat visar konsistensen som kan erhållas med visuell uppskattning av vår 75% laceration. ( B ) Blodförlust i gram efter förbehandling med heparin, tranexaminsyra och en tidigare validerad hemostatisk nanopartikel. Medelblodförlust var respektive 1,6, 0,60 och 0,65 g. Dessa resultat bekräftar nyttan av denna modell för att testa de hemostatiska eller antikoagulerande effekterna av ett läkemedel.

Figur 2: Medelvärt blodtryck efter leverlackering. Grafiska spår av enskilda möss innebär arteriella blodspårningar över 20 minuter som antingen genomgåde en skamoperation eller leverlaceration. Leverlacerationen följs av en karakteristisk och utfälld droppe i det genomsnittliga arteriella blodtrycket (MAP) hos mössen som saknas i skamopererade möss.

Figur 3: Kaplan-Meier Survival Curve efter Liver Laceration. 72 h överlevnaden hos möss som genomgick leverkärningen utan någon behandling visade sig vara 56%.

Discussion

Den här beskrivna murina leverlacerationsmodellen ger en pålitlig, konsekvent modell för okontrollerad blödning. Denna modell är enkel att utföra, men det finns viktiga steg som kräver noggrann övervägning. Den mest tekniskt utmanande delen av modellen är kanylering av femorala kärl för hemodynamisk övervakning och administrering av vätska / läkemedel. Försiktighet måste vidtas under dissektion av nerven och arteriotomi / venotomi. Det är viktigt att inte röra nerverna vid dissektion av kärlen för att undvika resulterande nervskador och möjlig förlamning, särskilt för överlevnadsmodeller. Arteriotomi och venotomi kräver ömtålig hantering av kärlet. Vi föreslår användning av mikrovaskulär sax för att förhindra oavsiktlig transektion av kärlet.

Medan leverlacerationen är mindre tekniskt utmanande är det viktigt att vara konsekvent i delen av modellen för att säkerställa reproducerbar och konsekvent blödning imusen. Vår modell utvecklades med avsikt att prova pro hemostatiska medel vid återupplivning och därför innefattar ett viktigt placeringshänsyn att absorptionstrianglarna placeras bort från lacerationsstället för att undvika packning eller mekanisk hemostatisk effekt. Undvik onödig manipulation av andra organ och andra leverlober för att förhindra oavsiktlig skada eller blödning under denna del av operationen. Magen bör snabbt stängas efter lacerationen för att undvika blodförlust utanför buken.

Mössen bör övervakas noggrant under hela proceduren, men viktigast efter att lacerationen utförts med tanke på de signifikanta hemodynamiska förändringar som de upplever som vi visade i Figur 2 . Vår erfarenhet av dessa signifikanta hemodynamiska förändringar är att musen osannolikt kommer att överleva om deras MAP sjunker under 10mmHg i> 30 s och vi rekommenderar att offret av musen där det här inträffarurs. Om en vätska eller ett läkemedel ska testas för dess hemostatiska effekter rekommenderar vi administrationen snart efter lacerationen, eftersom mössna tenderar att klota det lacererade området snabbt. Användning av smärtlindring är väsentlig om du är intresserad av att utföra längre observationstidpunkter än vad som beskrivs här. Dessutom bör bakbenen övervakas för tecken på ischemi efter ligering av femorala kärl. På grund av den omfattande erfarenheten av dessa kirurgiska ingrepp är incidensen av denna komplikation i vårt laboratorium mindre än 1% av alla testade djur. ^{4 , 6}

Denna modell har ett antal viktiga begränsningar, inklusive aspekten av okontrollerad blödning. Medan vi ser konsekvent blödning hos möss när det gäller blodförlust svarar vissa möss annorlunda och kommer att dö snabbt efter lacerationen. En annan begränsning i modellen är storleken på leverlacerationen. Medan våra data visar en smal standard erroR i vikten av den resekterade leveren, när den utförs av olika individer, finns möjligheten för större variation i resektionsstorleken och därför finns blödning säkerligen. Dessutom kan inlärningskurvan för den mikrovaskulära dissektionen och kanyleringen vara tekniskt utmanande och vi uppskattar en inlärningskurva på 50 djur från vår erfarenhet, med en uppskattad inlärningskurva på 10 möss för reproducerbarhet av leverlacerationen som beskrivits. Från vår erfarenhet kan en överlevnad på 56% vid 72 h förväntas. När man utför modellen för överlevnadsanalys är nära uppmärksamhet vid återhämtning från anestesi och korrekt smärthantering avgörande. I vår nuvarande modell har vi inte utfört någon kompletterande vätske- eller läkemedelsåtergivning till mössen bortom vad de får före leverlaceration. Det är viktigt att notera att djur ska övervakas noggrant för tecken på nöd i överlevnadsdelen av modellen och behandlas lämpligt för smärta. Pentobarbital är vår anestesTic av val för de tidpunkter vi var intresserade av men andra val av anestesi är möjliga och kan påverka resultatet. Smärta kontroll är viktigt att övervaka så att mössen kan fritt äta och dricka, vilket om det inte kontrolleras kan leda till variationer utanför blödningen och behandling av intresse. Denna modell låter sig också kombineras med andra modeller, såsom en mjukvävnadsskada, pseudofraktur eller en polytrauma-modell. Dessutom kan denna modell enkelt anpassas för att studera effekterna av topiska hemostatiska medel jämfört med intravenös. Flera alternativa modifieringar av denna modell är möjliga men förblir otestade. Även om djur i denna modell matchades för ålder och vikt, är det möjligt att djur med olika vikter kan utnyttjas och storleken på leverlacerationen valda baserat på vikt. Liknande resultat kan förväntas från miltlaceration för utredare som kanske inte vill skada levern beroende på intressepunkten. Liknande okontrolLedande blödningsmodeller har använts i andra djur ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12, vilket ger} potentiella alternativa modifieringar av föreliggande modell. Slutligen kan lacerationsstorleken ökas för att maximera blodförlusten, men vi har funnit att detta väsentligt ökar dödligheten och att skador på huvudvägarna med utökade modeller har en högre grad av variation.

Levern har använts i tidigare okontrollerade modeller; De flesta av dessa modeller utfördes emellertid i en råttmodell. Vår utveckling av en okontrollerad leverlacerationsmodell hos möss gör det möjligt för utredare att dra fördel av den rikedom av genetiskt modifierade raser. Andra fördelar med murine modeller inkluderar förmågan att genomföra hög genomströmningstestning, kostnadseffektivitet och enkel hantering.Vår modell möjliggör hemodynamisk övervakning, kvantifiering av blodförlust och utvärdering av mortalitet, vilket tidigare studier ofta bara inkluderar en av dessa aspekter av utvärdering. Vi kan utföra denna modell på flera möss samtidigt som det inte bara tillåter hög genomströmning utan minskad variation i modellen.

Sammanfattningsvis presenterar vi här en reproducerbar modell för okontrollerad blödning med användning av en standard leverlaceration i en murinmodell. Vår modell är idealisk för att utvärdera nya hemostatiska droger vid blödning eller trauma och kan användas vid en korttidsbedömning av blodförlust eller utförs för att utvärdera överlevnadseffekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8 mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4 x 4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30 G needle	can be purchased through any global vendor
23 G needle	can be purchased through any global vendor
10 cc syringe	can be purchased through any global vendor
50 cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1 cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3" x 8"	VWR	24008
sterilization pouch 5" x 10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7 mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1,000 7 mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4 oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2 cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18 x 26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3