リアルタイム血行動態モニタリングを用いたマウスの肝梗塞モデルによる制御不能出血性ショック

Summary

外傷患者の死亡原因の重要な原因である制御不能な出血は、マウスモデルにおける標準的な肝臓裂傷を用いてモデル化することができる。このモデルは一貫した失血、生存率をもたらし、止血剤の試験を可能にする。この記事では、この貴重なモデルを実行するためのステップバイステップのプロセスを提供します。

Abstract

制御不能な出血は、外傷患者の予防可能な死亡の重要な原因である。我々は、一貫した失血、血行動態の変化、および生存をもたらす肝臓の裂傷を介した制御されない出血のマウスモデルを開発した。

マウスは肝臓の左中葉の標準化切除を受ける。彼らは機械的介入なしに出血することができます。止血剤は、治験責任医師の興味に応じて、治療前または救済療法として投与することができる。出血時に、左大腿動脈ラインを介したリアルタイムの血行動態モニタリングが行われる。次いで、マウスを屠殺し、失血を定量し、さらなる分析のために血液を採取し、臓器を傷害の分析のために採取する。実験的な設計は、複数の動物の同時試験を可能にすることが記載されている。

制御不能な出血のモデルとしての肝臓出血が存在する主にラットおよびブタのモデルにおける文献。これらのモデルの中には、血行力学的モニタリングを利用するものや失血量を定量化するものの、一貫性がないモデルもあります。現在のモデルは、コントロールされていない出血の病態生理学的機序をさらに調べるために、トランスジェニック系統およびハイスループット機構を用いる利点を提供する、ネズミモデルにおける失血のリアルタイム血行動態モニタリングの定量化を組み込んでいる。

Introduction

外傷は、世界中の若者の死と障害の主要な原因です。 ¹制御されない出血は、重傷を負った外傷患者の間でも死亡原因の主要な原因のままである。出血性外傷患者の管理は、外科的出血の制御、および蘇生および失われた血液の置換の2つである。

出血性ショックの動物モデルは、外傷研究の基礎であり、病態生理学の評価および外傷性/出血性ショックの治療に使用することができる。動物モデルにおけるショックは、制御された出血および制御されない出血の2つの方法によって広く達成することができる。 ^5、6制御された出血は、一定量の血液を除去することによって、または一定の血圧（一定圧力）を達成するために血液を除去することによって行われる。一方、seモデルは、出血性ショックのメカニズムおよび免疫変化における評価に有用であり、止血剤の試験には適用できず、外傷後の出血の臨床シナリオを模倣しない。この程度まで、我々は、マウスモデルにおける止血変化および凝固促進剤を試験することができる制御されない出血のモデルを開発しようとした。肝臓は、肝臓への二重血液供給のために部分的に制御されない出血のための魅力的な選択肢であり、鈍的および侵襲的外傷の両方において最も傷ついた腹内側臓器の1つである。高い臨床的関連性を考慮すると、肝臓は、制御されない出血のモデルとして、最も一般的にはラットおよびブタモデルで利用されているが、最近霊長類においても同様に利用されている。 ^{7,8,9,10,11,12} 13,14

コントロールされていない肝出血のラットおよびブタモデルは、蘇生術および血行力学的モニタリングを検討する上で貴重であるが、コスト、利用動物数、および分析に利用できる重要なトランスジェニック系統の欠如など、様々な理由によりネズミモデルよりもあまり有利ではない特定の細胞および分子シグナル伝達現在のマウスモデルは、標準化された肝臓裂傷、失血定量化、血行力学的モニタリング、および生存分析を行う能力を含む既存の肝出血モデルとの重要な類似点を共有する。多くの既存のモデルは、これらの側面のいくつかを取り入れているだけであるが、本発明者らのモデルは生理学的バリエーションの多くを測定するために開発された同時に複数のマウスに繁殖する。同様に、マウスモデルの開発は、高度な分子技術を用いたコスト効率のよいハイスループットモデルの潜在的可能性を伴って、蘇生を超えた研究および制御されない出血のより大きな病態生理学的機構への扉を開く。

Protocol

マウスは、12時間の明暗サイクルを有する特異的な病原体のない状態で、ピッツバーグ大学（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）および米国国立衛生研究所（NIH; Bethesda、MD、USA）動物ケアガイドラインに従って収容され、標準の飼料と水。すべての動物実験は、ピッツバーグ大学の動物研究およびケア委員会によって定められたガイドラインに従って承認され、実施された。

1.手術野および機器の設定

1. 手順の前に、すべての外科用器具、縫合糸、ガーゼ、綿棒アプリケータ、チューブ、およびチューブコネクタを滅菌する。
   1. オートクレーブ内で外科器具、縫合糸、ガーゼ、およびコットンチップアプリケータを滅菌する。エチレンオキシドでチューブとコネクターを滅菌します。
2. 手術野
   1. 水循環式ヒートパッドをオンにして37℃に設定します。外科医を置くその上に青色の青色のパッドを、次いで外科用青色のパッドの上に無菌のドレープを付ける。
   2. すべての滅菌器具を滅菌ドレープ上に開きます。滅菌手袋を使用して、この工程中の滅菌を防ぐ。
   3. 70％エタノールでステンレス製のボールを満たし、脇に置いてください。これは動物間の器具の清掃に使用されます。
   4. マイクロビーズ滅菌器をオンにし、150℃に加熱します。これは動物間の器具の清掃にも使用されます。 5匹以上のマウスで手術を行う場合は、器具を新しい無菌セットに交換してください。
3. トランスデューサのセットアップ
   1. 滅菌トランスデューサ、PE-50チューブ、2本の23Gニードル、オス - オスのルアー、3方向ストップコックを接続します。 ⁶
   2. トランスデューサを製造元の指示に従って較正してゼロにします。

2.肝切開手術

1. 麻酔の誘導と位置決め
2. ペントバルビタールナトリウムを70mg / kgの用量で腹腔内に注射する。麻酔は5-10分の間に有効でなければならない。つま先で麻酔深度を評価する。マウスがつま先のつまみに反応する場合、追加の時間または麻酔が必要です。処置中に追加の麻酔が必要な場合は、ペントバルビタールナトリウムを補充してください。過量を避けるために、0.05 mLよりも多い量のサプリメントを与えないでください。
3. マウスが完全に麻酔下になった後、マウスを手術用ボード上に仰向けに置く。マウスの4肢すべてをテープでボードに固定します。
4. 剃刀で腹部と両脇の下を剃る。
5. ベタディンで滅菌ガーゼを浸し、手術のために腹部および両側鼠径部に適用する。生存実験のために、腹部および鼠径部にベタジンを、次いでエタノールで合計3回の準備サイクルを準備する。
6. 直腸温度プローブを挿入して、手順全体を通してコア温度を監視する。 Cを保つ鉱石の温度は35〜37℃である。

大腿動脈および静脈カニューレ挿入

1. 静脈カテーテルの設定には、PE-10チュービング、30G針、およびIVバッグからの乳酸加リンゲル液を含む三方活栓を充填する。
2. 動脈カテーテルの設定：PE-10チュービングと30G針にヘパリン処理生理食塩水（1,000Uヘパリンの1:10希釈液）を充填する。凝固を防ぐにはヘパリン食塩水が必要です。
3. 解剖顕微鏡の下にマウスを置く。
4. 外科用アイリスはさみを使用して鼠径部の筋肉を4〜5mm縦切開する。デュモン鉗子を使用して、内転筋に接続された脂肪組織をつかみ、横に引っ張って大腿骨バンドルのきれいな暴露を行う。脂肪組織を切開しないでください。これにより血管損傷が起こります。
5. 慎重に、デュモン鉗子で動脈および静脈から神経を摘出する。神経に隣接して脂肪パッドがあります。 1つのDumont forcepでこれを取得するd横方向に引っ張る。これは動脈から神経を引き離し、解剖のための平面を作り出す。他のデュモンのforcepは、神経と動脈との間の結合組織を鈍的に切開する。
   1. 解剖のこの部分の間に神経をつかまえないでください。
6. 大動脈周囲の3つの6-0の絹の縫合糸をループし、大腿部に近位の静脈を離す。
   1. 最も近位に縫合糸1を置き、緩いままにする。
   2. 最も遠位に縫合糸2を置き、すぐに結ぶ。
   3. 縫合糸1と2の間に縫合糸3を置き、緩くしておきます。
7. 血管の腹面に動脈切開を行う。血管の切断を避けるために動脈切開術を行うには、微小血管はさみの使用を推奨します。
8. 3方向カテーテルを動脈に挿入します。カテーテルを所定の位置に固定するために、直ちに縫合糸1および2を締めてください。
9. 三方向カテーテルをトランスデューサに接続し、ベースラインの血圧データを収集します。
10. 反対側の鼠径部にステップ2.2.4〜2.2.6を繰り返します。動脈と同様の方法で大腿静脈にカニューレを挿入する。血管の腹面に静脈切開を行い、続いてカテーテルを挿入する。このカテーテルは、流体投与または薬物投与に利用することができる。

肝臓裂傷

1. 0.5mLのPBS、3つの吸収三角、およびマウス1匹の計量ボートを含むチューブを予め計量する。
2. 腹側の中線開腹を切開部から開始し、尾側に広げて肝臓を完全に露出させる。
3. 右の腹壁に対して腹部に吸収三角形を挿入します。左側を繰り返します。
   1. 肝臓が裂傷された後、詰め止めの止血効果を避けるために、吸収三角形が肝臓から離れていることを確認してください。
4. 慎重に肝臓の左中葉をつかみ、外科用アイリスはさみで葉の75％を裂く。ライカレートを置くdセグメントをPBSを含むチューブに入れた。
5. ステープルアプリケータでステープルで腹壁を閉めます。皮膚と筋肉を一緒につかみ、ステープルを発射する。肝臓の裂傷後、可能な限り迅速に腹部外の失血を避けるようにしてください。生存実験では、腹部は2つの層で閉じられている。筋肉のための実行可能な吸収性縫合糸に続いて皮膚のための非吸収性縫合糸の走行層が続くことにより、適切な閉鎖が提供される。
6. 30分より長い生存時間のマウスでは、大腿カテーテルを除去し、動脈および静脈をステップ2.2.6の縫合糸3で結ぶ。次に、前のステップで説明したように、両側の鼠径部を2つの層で閉じる。
7. 出血のための特定の時間（30分〜72時間）の後、ステープルを取り除く。吸収三角形を取り除き、対応する事前に計量した計量ボートに入れます。追加の吸収三角形を使用して、吸収されていない血液を吸収してください。

術後ケア

1. 30分で外科用ボード上で屠殺し、絶え間ない監視下で、完全麻酔下で犠牲になるまでマウスを放置する。マウスは、心臓穿刺と吸入イソフルランの過剰摂取の組み合わせで安楽死させる。
2. より長い生存時間ポイントのマウスを、水循環式加熱パッドの上にある回収ケージに置く。回復中にマウスを絶えず監視し、胸骨臥位を維持する意識を回復するまで無人で放置しないでください。麻酔から回復した後にのみ、他のマウスと一緒にケージ空間にマウスを戻します。
3. 麻酔から覚醒し、犠牲の時まで12時間ごとに皮下注射により術後鎮痛を0.1mg / kgブプレネックスで投与する。
4. マウスが食物と水に自由にアクセスできるようにする。術後の正常なケージ。
5. 生存マウスの屠殺時に、吸入イソフルランで麻酔を行う。麻酔下になったら、右心臓の心臓穿刺により血液が採取され、上記のように失血が記録され、最後に安楽死がイソフルランの過剰投与により保証される。

Representative Results

肝臓の裂傷モデルは、マウスにおいて再現性のある一貫した失血をもたらす。 図1Aは、0.02gの標準偏差で得ることができる裂傷肝臓の一貫した重量を示す。このような刻み目のある肝臓重量の一貫性は、マウスと異なる蘇生プロトコールのような異なる実験設定においてモデルを再現する能力を可能にする。同様に、0.01gの標準誤差を有する刻んだ肝臓の再現性のある重さは、動物モデルでは得られないことが多い制御されない出血に対してより標準的なモデルを提供する。

モデルにおける異なる治療プロトコールの出血効果の検証を図1Bに示す 。マウスをヘパリン（失血の陽性対照としての66単位）または抗線維素溶解性のトラネキサム酸（TXA）（ネガティブコントロール）、およびネズミ尾静脈出血アッセイで以前に試験された有効な止血ナノ粒子を含む。これらの結果は、このモデルが出血の設定における止血効果または抗凝固効果を評価するために使用される能力を実証する。

制御されない出血は、しばしばモニタリングすることが重要な血行動態障害を伴う。 図2において、肝臓裂傷後の個々のマウスの平均動脈血圧（MAP）は、裂傷が行われた後にMAPの急激で再現性のある低下が行われ、出血性ショック状態をもたらすことを実証している。これは、様々な蘇生または介入措置の血行動態効果を可能にし、様々な実験条件を取り巻く生理学への重要な洞察を可能にするので重要である。肝臓の裂傷後に有意な血行力学的効果があるが、我々は、モデルはこの時点で56％の生存率で72時間まで評価されているので（ 図3 ）、生存効果を評価するためにモデルを使用することができる。

図1：肝梗塞の検証。 （ A ）横断肝臓の代表的な体重。平均肝臓重量は0.26gであり、標準偏差は0.02gであり、平均誤差は0.01gであった。これらの結果は、我々の75％の裂傷の視覚的評価で得られる一貫性を実証している。 （ B ）ヘパリン、トラネキサム酸、および以前に検証された止血ナノ粒子による前処理後のグラム単位の血液損失平均失血量はそれぞれ1.6,0.60および0.65gであった。これらの結果は、薬物の止血効果または抗凝固効果を試験するためのこのモデルの有用性を実証している。

図2：肝梗塞後の平均動脈血圧。個々のマウスのグラフィカルな追跡は、偽手術または肝臓裂傷のいずれかを受けた20分を超える動脈血の追跡を意味する。 肝臓の裂傷に続いて、偽手術したマウスには存在しないマウスの平均動脈血圧（MAP）の特徴的かつ急峻な低下が起こる。

図3：肝梗塞後のカプラン - マイヤー生存曲線。処置なしで肝臓の裂傷を受けたマウスの72時間の生存率は56％であることが判明した。

Discussion

ここに記載されているマウス肝臓裂傷モデルは、制御されない出血の信頼できる一貫したモデルを提供する。このモデルは簡単に実行できますが、細心の注意を払う必要のある重要なステップがあります。このモデルの最も技術的に困難な部分は、血行動態モニタリングおよび流体/薬物投与のための大腿血管のカニューレ挿入である。神経の切開および動脈切開/静脈切開の際には注意が必要である。特に生存モデルのために、神経損傷および可能な麻痺を回避するために、血管の切開中に神経に触れないことが重要である。動脈切開および静脈切開術は血管の繊細な取り扱いを必要とする。血管の偶発的な切断を防ぐために微小血管はさみを使用することを推奨します。

肝臓の裂傷は技術的に挑戦的ではないが、再現性のある一貫した出血を確実にするためには、モデルの部分において一貫性を保つことが重要であるハツカネズミ。我々のモデルは、蘇生においてプロ止血剤を試験することを目的として開発されたものであり、したがって、重要な配置上の考慮事項は、梱包または機械的な止血効果を避けるために吸収三角形が裂傷部位から離れて配置されることを保証することを含む。手術のこの部分の間に意図しない怪我や出血を防ぐために、肝臓の他の臓器や他の葉の不必要な操作を避けてください。腹部外の失血を避けるために、腹部は熱傷後すぐに閉鎖されるべきである。

マウスは、手順の至るところで綿密に監視されるべきであるが、最も重要なことに、 図2で実証されたように顕著な血行力学的変化を経験した場合に裂傷が行われた後である。これらの重要な血行力学的変化を経験したことは、MAPが30mmを超えて10mmHgを下回るとマウスが生き残る可能性が低いことであり、この場合にマウスを犠牲にすることを推奨しますurs。流体または薬物がその止血効果について試験される場合、マウスは裂傷領域を迅速に凝固させる傾向があるので、裂傷直後に投与を推奨する。痛み管理の使用は、ここに記載されているよりも長い観察時間点を実行することに関心がある場合には不可欠です。同様に、後肢は、大腿血管の結紮後に虚血の徴候についてモニターされるべきである。これらの外科的処置の豊富な経験のために、我々の研究室におけるこの合併症の発生率は、試験したすべての動物の1％未満である。 ^4,6

このモデルは、制御されない出血の側面を含む多くの重要な制限を有する。失血の点でマウスで一貫した出血が見られるが、一部のマウスは異なる反応を示し、裂傷後すぐに死亡する。モデルのもう一つの限界は肝臓の裂傷の大きさです。私たちのデータは狭い標準エラーを示していますが異なる個体によって行われる場合、切除された肝臓の重さにおいて、切除サイズのより大きな変動の可能性があり、したがって出血が確実に存在する。さらに、微小血管切開およびカニューレ挿入の学習曲線は技術的に困難であり、我々は、経験則から50匹の動物の学習曲線を推定し、記載されているように肝臓裂傷の再現性について10匹のマウスの推定学習曲線を推定する。我々の経験から、72時間で56％の生存率が期待できる。生存分析のためにモデルを実行するときは、麻酔からの回復と適切な疼痛管理に注意を払うことが重要です。現在のモデルでは、肝臓の裂傷に先立って、補給液や薬物蘇生をマウスに与えていません。モデルの生存部分における苦痛の徴候について動物を注意深く監視し、痛みを適切に治療すべきであることに注意することが重要である。ペントバルビタールは私たちの麻酔薬です私たちが関心を持っていた時点では選択肢が多かったが、他の麻酔の選択が可能であり、結果に影響を与える可能性がある。マウスを自由に食べたり飲んだりすることができるように、痛みのコントロールは重要です。制御されないと、出血や関心のある治療の範囲外で変動する可能性があります。このモデルはまた、他のモデル、例えば軟部組織損傷、偽骨折、または多耳外傷モデルと組み合わせることができる。同様に、このモデルは、静脈内投与と比較して局所止血剤の効果を研究するために容易に適合させることができる。このモデルの複数の代替変更は可能ですが、未テストのままです。このモデルの動物は年齢と体重に合わせていましたが、異なる体重の動物を利用し、肝臓の裂傷の大きさを体重に基づいて選択することが可能です。関心の終点に応じて肝臓を傷つけたくない研究者にとって、脾臓の裂傷による同様の結果が期待される。同様の非制御他の動物7,8,9,10,11,12では、現在のモデルに対する潜在的な代替的な改変を提供する、先導された出血モデルが使用されている。最後に、裂傷の大きさは失血を最大にするために増加させることができるが、これは死亡率を実質的に増加させ、拡張モデルによる主要な肝静脈の損傷はより高い程度の変動性を有することを見出した。

肝臓は、以前の制御されていないモデルで使用されてきた。しかし、これらのモデルの大部分はラットモデルで行った。マウスにおける制御されていない肝臓裂傷モデルの開発により、研究者は豊富な遺伝子組み換え品種を利用することができます。ネズミモデルの他の利点としては、ハイスループット試験、費用対効果、および取り扱いの容易さを実行する能力が挙げられる。我々のモデルは、血行力学的モニタリング、失血量の定量化、および死亡率の評価を可能にする。これまでの研究では、評価のこれらの側面の1つだけが含まれることが多い。このモデルを複数のマウスで同時に実行することで、高いスループットを実現するだけでなく、モデルのばらつきを抑えることができます。

結論として、本明細書では、マウスモデルにおける標準的な肝臓裂傷を利用した、制御不能な出血の再現可能なモデルを提示する。我々のモデルは、出血または外傷の設定で新しい止血薬を評価するのに理想的であり、失血の短期評価に利用でき、または生存効果を評価するために実施することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8 mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4 x 4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30 G needle	can be purchased through any global vendor
23 G needle	can be purchased through any global vendor
10 cc syringe	can be purchased through any global vendor
50 cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1 cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3" x 8"	VWR	24008
sterilization pouch 5" x 10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7 mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1,000 7 mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4 oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2 cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18 x 26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3