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Biochemistry

एस 100 ए 12 की अभिव्यक्ति, शुद्धि और रोगाणुरोधी गतिविधि

Published: May 13, 2017 doi: 10.3791/55557
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 1,4
1Department of Life and Physical Sciences, Fisk University, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs, 3Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University Medical School, 4Department of Biochemistry, Vanderbilt University

Summary

यहां, हम S100A12 (कैलगनुलिन सी) को व्यक्त और शुद्ध करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हम मानव रोगज़न एच। पाइलोरी के खिलाफ इसकी रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

कैल्ग्रेन्युलिन प्रोटीन जन्मजात प्रतिरक्षा के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं और कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के ईएफ-हाथ परिवार के एस -100 वर्ग के सदस्य हैं। कुछ एस 100 प्रोटीन में उच्च आत्मीयता के साथ संक्रमण धातुओं को बाँधने की क्षमता होती है और उन्हें "पोषण प्रतिरक्षा" कहा जाता है जो प्रक्रिया में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों पर हमला करने से प्रभावी रूप से अलग हो जाते हैं। एस -100 ए 12 (एन-रेजेस) जस्ता और तांबा दोनों को बांधता है और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे कि मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होता है। हम अपनी सक्रिय, मेटल बाइंडिंग कॉन्फ़िगरेशन में S100A12 की अभिव्यक्ति, संवर्धन और शुद्धि के लिए एक परिष्कृत विधि की रिपोर्ट करते हैं। जीवाणु वृद्धि और व्यवहार्यता विश्लेषण में इस प्रोटीन का उपयोग बताता है कि एस -1 ए 1 ए 12 में जीवाणु रोगजन, हेलिकोबैक्टर पाइलोरी के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि है। रोगाणुरोधी गतिविधि S100A12 की जस्ता बाध्यकारी गतिविधि पर आधारित होती है, जो पोषक तत्व जस्ता को chelates करती है, जिससे एच। पाइलोरी भूख से पीड़ित होती है जिसके लिए विकास की जस्ता की आवश्यकता होती है और पीroliferation।

Introduction

एस 1100 प्रोटीन, कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के ईएफ-हाथ परिवार का एक वर्ग है, जिसमें कार्य 1 के विविध सरणी हैं। वे एक ऊतक और सेल विशिष्ट तरीके से व्यक्त होते हैं, और सेलुलर फ़ंक्शंस 2 , 3 के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को विनियमित करते हैं। कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के लिए अद्वितीय, एस 100 प्रोटीन दोनों इंट्रासेल्युलर और बाह्य कार्य 4 , 5 प्रदर्शित करता है। सेल के भीतर, सीए 2+ बाध्यकारी एक गठनात्मक परिवर्तन लाती है जो एक हाइड्रोफोबिक सतह को उजागर करती है जो विशेष रूप से प्रोटीन बंधन साझेदारों को लक्षित करती है यह इंट्रासेल्युलर तंत्र महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं जैसे सेल प्रसार, भेदभाव और ऊर्जा चयापचय को नियंत्रित करता है। बाह्य वातावरण में, एस 100 प्रोटीन दो फ़ंक्शंस प्रदर्शित करता है 7 । एक में, वे क्षति से जुड़े अणु पैटर्न (डीएएमपी) प्रोटीन के रूप में काम करते हैं और एक प्रो-इन्फलम शुरू करते हैंपैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स 8 , 9 के साथ बातचीत के माध्यम से अंधविश्वास प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इसके अतिरिक्त, S100 प्रोटीन वर्ग सेक्जेस्टर ट्रांजिशन मेटल्स के कई सदस्य, एक समारोह जो माइक्रोबियल रोगजनकों को प्रोटीन में प्रोटीन करते हैं, जो पोषण उन्मुक्ति 10 , 11 कहते हैं ।

S100A12 (जिसे कैलगनुलिन सी और एन-रेज के नाम से भी जाना जाता है) मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल में अत्यधिक व्यक्त किया गया है और इसे भड़काऊ बीमारियों के लिए संभावित जैवमार्कर के रूप में पहचाना गया है 12 , 13 । अपने ईएफ-हाथ साइटों पर कैल्शियम बंधन के अलावा, एस 100 ए 12 में डिमर अंतरफलक 14 , 15 के विपरीत छोर पर स्थित दो उच्च संबंध संक्रमण धातु बंधन वाली साइटें हैं। प्रत्येक बाध्यकारी साइट में तीन हिस्टडीन अवशेषों और एक एस्पैक्टिक एसिड अवशेष शामिल होते हैं और जस्ता या तांबे की चोंच कर सकते हैं <Sup वर्ग = "xref"> 16 , 17 हाल ही में, हमने बताया कि हीलिकोबैक्टर पाइलोरी वृद्धि को नियंत्रित करने और प्रो-भड़काऊ विषमता कारकों की गतिविधि 18 को नियंत्रित करने के लिए S100A12- आश्रित जस्ता भुखमरी महत्वपूर्ण है।

एच। पाइलोरी दुनिया की आबादी के आधे हिस्से के पेट को संक्रमित करता है; यह यकीनन सबसे सफल बैक्टीरियल रोगजनकों में से एक 19 एच। पाइलोरी के साथ संक्रमण, गैस्ट्रिटिस, पेप्टिक और डुओडानल अल्सर, श्लेष्मल सम्मिलित लिम्फोइड टिशू (एमएएलटी) लिंफोमा, और इनवेसिव गैस्ट्रिक एडोनोकैरिनोमा (पेट कैंसर) सहित महत्वपूर्ण गैस्ट्रिक बीमारी के परिणाम पैदा कर सकता है। पेट कैंसर दुनिया में गैर-कार्डिया कैंसर से जुड़े मौत का प्रमुख कारण है, और पेट कैंसर के लिए सबसे बड़ा जुड़ा जोखिम वाला पहलू एच। पाइलोरी के साथ संक्रमण है।

एच। पाइलोरी एक रोबू के बावजूद गैस्ट्रिक आला में मौजूद हैजीवाणु संक्रमण के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया , जीवाणु संक्रमण 20 , 21 , 22 , 23 को नियंत्रित करने के प्रतिरक्षा तंत्र की बेहतर समझ की आवश्यकता को रेखांकित करना। एच। पाइलोरी- सहसंबंधित सूजन पॉलिमोरफोन्यूक्लियर कोशिकाओं, या न्युट्रोफिल के गहन घुसपैठ की विशेषता है, जो 18 18 , 24 , 25 को संक्रमण के स्थल पर एस 100 ए 12 समेत रोगाणुरोधी प्रोटीन के एक प्रदर्शन की सूची प्रस्तुत करते हैं। मेजबान और रोगजनन के बीच जटिल बातचीत को समझने के प्रयास में, हमने तकनीक को परिशोधित करने के लिए S100A12 को शुद्ध करने की कोशिश की और रोगाणुरोधी प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इसे इस्तेमाल करने के लिए इसका उपयोग इस चिकित्सकीय रूप से संबंधित रोगज़नक़ पर किया। प्रोटोकॉल नीचे अपने जैविक रूप से सक्रिय राज्य में S100A12 शुद्धि के लिए एक बेहतर तकनीक की रूपरेखा; उच्च एफिनी के साथ पोषक तत्वों की बाइंडिंग करने में सक्षमटी और उन्हें सूक्ष्मजीवों पर हमला करने से दूर चित्ती। इसके अलावा, नीचे की विधियां इस प्रोटीन की उपयोगिता को एक महत्वपूर्ण अभिकर्मक के रूप में उजागर करती हैं जो तंत्र का अध्ययन करती हैं जिसके द्वारा सहज रोगाणुरोधी अणु बैक्टीरियल रोगजनकों के विकास को प्रतिबंधित करते हैं।

एस -181 ए-परिवार प्रोटीन ने सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के अणुओं के एक महत्वपूर्ण समूह के रूप में प्रशंसा प्राप्त की है जो प्रतिरक्षा संकेतन के साथ-साथ मेजबान रक्षा 27 में भाग लेते हैं। इनमें से सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया गया कैल्प्रोटेक्टिन (एमआरपी -8 / 14, कैलग्रानुलिन ए / बी, एसए -1 एए 8 / ए 9) 28 , 29 , 30 है । कैल्प्रोटेक्टिन एक न्युट्रोफिल-संबंधित प्रोटीन है जो एस 100 ए 8 और एस 100 ए 9 सबुनेट्स के एक हेरोर्टरिमर बनाता है जो डायमर इंटरफेस 31 में संक्रमण धातुओं को बांधता है। कैलप्रोटेक्टिन को दो धातु बंधन स्थल रखने के लिए दिखाया गया है: साइट 1 को Zn 2+ , Mn 2+ , या Fe 2+ , और साइट 2 बाइंड कर सकते हैं बाध्य Zn 2 + 31 , 32 कई रिपोर्टों ने यह साबित किया है कि कैल्प्रोटेक्टिन में स्टैफिलोकोकस ऑरियस , कैंडिडा अल्बिकी , एसिनेटोबैक्टर बुमनेय , क्लेबिसिला न्यूमोनिया , एसेरचीशिया कोली और एच। पाइलोरी सहित विभिन्न रोगजनकों के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधियां होती हैं , और यह कि अवरोधक प्रभाव कैल्प्रोटेक्टिन 25 , 28 की धातु के केलेशन गतिविधि के कारण हैं , 2 9

पिछला कार्य का प्रदर्शन किया गया है, यह दर्शाता है कि कैल्शोप्रक्टिन एच। पाइलोरी पर कई गतिविधियों का इस्तेमाल करता है जिसमें बाहरी झिल्ली में लिपिड ए संरचना को बदलना शामिल है, कैग- टाईप IV स्राक्रिशन सिस्टम (जो एच। पाइलोरी के भीतर एक प्रमुख प्रिमफ्लमाट्री वायरलेंस कारक है) को दमन कर रहा है, बायोफिल्म गठन को उत्प्रेरित करना, और दमन एच। एक खुराक पर निर्भर तरीके से पाइलोरी वृद्धि और व्यवहार्यताClass = "xref"> 25 , 33 इसके अलावा, आनुवंशिक और जैव रासायनिक आभूषणों ने एच। पाइलोरी के खिलाफ कैल्प्रोटेक्टिन की जीवाणुरोधी गतिविधि का पता लगाया था जो पौष्टिक पोषक तत्वों की जस्ता 25 बाइंड करने की क्षमता से काफी हद तक उत्पन्न हुआ था। एच। पाइलोरी को जस्ता की आवश्यकता होती है, जैसा कि पिछले शोध द्वारा निर्धारित किया गया था, जो इस रोगज़नक़ा को विकसित करने और 34 पैदा करने के लिए सूक्ष्म पोषक तत्वों की आवश्यकता का पता लगाने के लिए एक रासायनिक परिभाषित माध्यम का उपयोग करता था। इसके अतिरिक्त, एच। पाइलोरी- कीटाणुओं के ऊतकों के भीतर कैल्प्रोटेक्टिन अत्यधिक प्रचुर मात्रा में था, और न्युट्रोफिलिक घुसपैठ के साथ जुड़े, यह संकेत करता है कि हो सकता है कि संक्रमण के दौरान मेजबान कैल्क्ट्रोक्टिन को एक रोगाणुरोधी रणनीति के रूप में इस्तेमाल कर सकता है और बाद में सूजन 25 , 35 ।

निष्पक्ष प्रोटिओमिक्स स्क्रीनिंग तकनीकों के हालिया साक्ष्य से पता चलता है कि ऐसी स्थिति में जहां प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां भरपूर मात्रा में होती हैं, कैल्प्रोटेकटिन पोस्ट-ट्रांसजेलेशन सुधारों से गुजरती हैं जो हेक्सा-हिस्टीडाइन बाध्यकारी साइट को बदलती हैं, जिससे प्रोटीन 36 की धातु बाध्यकारी गतिविधि को बाधित किया जा सकता है। जैसे, हम इस परिकल्पना करते हैं कि इन अणुओं के विस्तृत प्रदर्शनों के बीच अन्य एस -181 ए-परिवार प्रोटीन संभवतः सहायक धातु-चेललेटर्स के रूप में काम कर सकते हैं। हमने आगे के अध्ययन के लिए एस 100 ए 12 का चयन किया क्योंकि इसे पोस्ट-ट्रांसलेशन के संशोधन के लिए पहले की स्क्रीन में नहीं पहचाना गया था, इसमें जस्ता बाँधने की क्षमता है, और एच। पाइलोरी- इंटेक्टेड व्यक्तियों से उत्पन्न मानव टिश्यू में यह अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है।

हमारा काम यह दर्शाता है कि एस -1 ए 1 ए 12 एच। पाइलोरी के जी 27 तनाव में खुराक पर निर्भर तरीके से एच। पाइलोरी विकास और व्यवहार्यता को रोक सकता है, और इस प्रोटीन की एंटीबायोटिक गतिविधि अतिरिक्त पोषक जस्ता के अलावा द्वारा उलट कर सकती है। यह काम हमारे पिछले कार्य को दर्शाता है कि एसएमए 100 ए 12 ने पीएमएसएस 1 और 7.1 के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि पेश की हैएच। पाइलोरी के 3 उपभेदों, एच । पाइलोरी 18 के कई नैदानिक ​​आइसोलेट्स और प्रयोगशाला-अनुप्रयुक्त उपभेदों के विरुद्ध इसकी व्यापक जीवाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन। साथ में, ये परिणाम पोषण उन्मुक्ति के माध्यम से जीवाणु वृद्धि और प्रसार को नियंत्रित करने के लिए एक तंत्र के रूप में एस 100 ए 12 के महत्व की पुष्टि करते हैं। इस महत्वपूर्ण होस्ट-बैक्टीरियल इंटरैक्शन के भविष्य के अध्ययन में एस -100 ए 12 की गतिविधि का शोषण करने के लिए मेजबान के ऊतकों में बैक्टीरियल बोझ को कम किया जा सकता है या एच। पाइलोरी संक्रमण के संदर्भ में प्रतिरक्षा संकेतन के लिए इस प्रोटीन का योगदान निर्धारित किया जा सकता है।

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Protocol

1. एस 100 ए 12 की अभिव्यक्ति

  1. एक मानक गर्मी झटका प्रोटोकॉल 18 का उपयोग करके एक पीजीएमएक्स-एस 100 ए 12 प्लाज्मिड युक्त सक्षम बीएल 21 डीई 3 कोशिकाओं को ट्रांसफ़ॉर्म करना। बर्फ पर एक microcentrifuge ट्यूब में 50 μL बैक्टीरिया को प्लाज्मिड के 1 से 5 μL जोड़ें। 20 मिनट के लिए सेते
  2. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं में गर्मी का झटका
  3. 2 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं
  4. सेल के 500 μL सोशल मीडिया जोड़ें। 1 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. एलबी-अगर मध्यम (100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन से पूरक) पर परिवर्तन की प्रतिक्रिया के प्लेट 150 μL। 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए सेते हैं
  6. एक कॉलोनी चुनें 2 एमएल एलबी (100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक) टीका डालना
  7. एक कक्षीय प्रकार के बरतन (300 आरपीएम) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए सेते हैं। आयुध डिपो 600 को 1-3 अवशोषण इकाइयों के बीच पढ़ना चाहिए।
  8. 500 μL स्टार्टर कल्चर को जेएमएम-5052 ऑटो इंडू के 50 एमएल में जोड़ेंकैप्शन मीडिया 26 में 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन का पूरक रखा गया है। सर्वश्रेष्ठ वातन और अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए, 250 एमएल का चकराचिल एर्लेनमेयर फ्लास्क का उपयोग करें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेक (300 आरपीएम)
  9. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में बैक्टीरिया के निलंबन को स्थानांतरित करें। सेंटीफ्यूगेशन (4000 xg, 10 मिनट) 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की गोली
  10. -80 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया, टेस्ट नमूना, और सेल पेस्ट स्टोर करें साल के लिए नमूना स्थिर है

2. कम दबाव क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करना S100A12 के शोधन

  1. 30 एमएल 20 एमएम ट्रिस, पीएच 8.0 में रेसपेंड सेल
  2. कोशिकाओं को तुच्छ करने के लिए बर्फ पर निलंबन की ध्वनि दें 5 मिनट के लिए ~ 20 डब्ल्यू आउटपुट, 5 एस पर और 5 सेकंड के चक्र का उपयोग करें
  3. हाई स्पीड अपकेंद्रित्र ट्यूबों के समाधान को स्थानांतरित करें। सेंटीफ्यूगेशन द्वारा सेल लिसेडेट, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 xg का स्पष्टीकरण दें
  4. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 100 एमएल पॉलीप्रोपीलीन बीकर के लिए स्थानांतरण करें। बर्फ पर बीकर रखकर समाधान शांत करें एक हलचल बा जोड़ेंआर और धीरे धीरे अमोनियम सल्फेट के 11.20 ग्राम जोड़ें। समाधान को एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए बर्फ पर हल करने की अनुमति दें। यह अमोनियम सल्फेट का 60% समाधान बनायेगा और ई। कोलाई के अंतर्जात प्रोटीन का सबसे अधिक त्वरण करेगा। S100A12 घुलनशील रहेगा
  5. 4 डिग्री सेल्सियस, 20,000 XG के समाधान के लिए 20 मिनट के लिए उपजी प्रोटीन गोली में अपकेंद्रित्र
  6. सतह पर तैरनेवाला decant और डायलिसिस टयूबिंग (MWCO 3,500 केडीए) के लिए स्थानांतरण। 1 एल 20 एमएम ट्राइस के खिलाफ डायलवाईज, पीएच 8.0 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस डायलिसिस बफर दो बार बदलें परिवर्तनों के बीच 4 घंटे की अनुमति दें
  7. आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी
    1. कम दबाव प्रणाली पर क्रोमैटोग्राफी करें विशिष्ट प्रवाह दर 1 एमएल / मिनट है
    2. 5 एमएल Sepharose स्तंभ 10 एमएल 20 मिमी Tris, पीएच 8.0 के साथ समतल बनाना।
    3. नमूना पंप (प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा) का उपयोग करके ~ 40 एमएल का S100A12 समाधान लोड करें।
    4. 10 एमएल 20 एमएम ट्राइस के साथ स्तंभ धो लें, पीएच 8
    5. 0-30% ढाल के साथ कॉलम का विकास करें (बूएफ बी 20 मिमी त्रि, पीएच 8.0, 1 एम नाओकल) 1 9 कॉलम वॉल्यूम (सीवी, 95 एमएल) से अधिक है 5 एमएल अंश ले लीजिए
    6. प्रत्येक अंश का एक 10 μL विभाज्य लो और कूमेसी धुंधला होकर एमईएस एसडीएस पृष्ठ का उपयोग करने का विश्लेषण करें। 30 मिनट के लिए लगातार वोल्टेज (20 वी / सेमी) का उपयोग कर जेल भागो
    7. S100A12 वाले पूल के अंश S100A12 एक denaturing जेल पर ~ 10 केडीए प्रोटीन पर चलता है
    8. एक ultrafiltration डिवाइस (एमएमसीओ 10 केडीए) का उपयोग कर 5 एमएल के लिए अंश केंद्रित करें। ~ 8 मिनट के लिए 3,000 xg पर अपकेंद्रित्र शीर्ष अंश को लें
  8. आकार अपवर्जन वर्णलेखन
    1. 1 सीवी (120 एमएल) के साथ 20 एमएम ट्रिस पीएच 8, 100 एमएम नाएलएल के साथ S75 कॉलम समतल बनाना।
    2. केंद्रित S100A12 अंशों (आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी से) के 5 एमएल इंजेक्षन करें।
    3. 120 एमएल से अधिक 1 एमएल / एम की प्रवाह दर पर कॉलम का विकास करें। 5 एमएल अंश ले लीजिए
    4. प्रत्येक अंश के 10 μL विभाज्य लो और क्यूमसाई धुंधला हो जाने के साथ एसडीएस पृष्ठ का उपयोग करने का विश्लेषण करें। प्रोटीन पहचान का प्रयोग करके प्रमाणित करेंपश्चिमी धब्बा या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मोज़ेक सबिनिट 10,575.0 की गणित की आणविक द्रव्यमान, 10575.4 दा मापा गया)।
  9. पूल के अंश
    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रोटीन ए 280 के अवशोषण को मापें। एसईसी बफर को रिक्त स्थान के रूप में प्रयोग करें। एस 100 ए 12 होमोडीमर के लिए गणना विलुप्त होने के गुणांक 5960 एम -1 सेमी -1 है ।
      नोट: विशिष्ट पैदावार 35-45 मिलीग्राम S100A12 प्रति 50 एमएल संस्कृति के हैं।
    2. विभाज्य S100A12 में 1.5 एमएल माइक्रोसॉसिटिव्यू ट्यूब (1 मिलीग्राम / ट्यूब) में, तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. रोगाणुरोधी गतिविधि घेराबंदी

  1. स्ट्रीक एच। पाइलोरी 5% भेड़ रक्त (रक्त अगर प्लेट) के पूरक के साथ ट्रिपेटिक सोया एगर प्लेटों पर जी -27 के लिए तनाव। 2-3 दिनों में 37 डिग्री सेल्सियस बढ़ो 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ पूरक कमरे के हवा में।
  2. 1x कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक ब्रुसेला शोरबा में एच । संस्कृति से अधिकरात्रि मिलाप (250 आरपीएम) 37 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के हवा में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ पूरक।
  3. एच। पाइलोरी 1:10 में 50% ब्रुसेला शोरबा, 50% कैल्क्ट्रोटैक्टिन बफर प्लस 1x कोलेस्ट्रॉल और संस्कृति को अकेले मध्यम या 100 माइक्रोन जस्ता क्लोराइड प्लस 0, 100 या 1000 माइक्रोग्राम / एमएल शुद्ध एसएएनए 100 ए 12 के साथ पूरक। संस्कृति में रात भर मिलाकर (250 आरपीएम) 37 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के हवा में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ पूरक।
  4. अगले दिन, रक्त एगर प्लेटों पर धारावाहिक dilutions और प्लेट प्रदर्शन। बैक्टीरियल कॉलोनियों को 2-3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के हवा में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ बढ़ने की अनुमति दें। एस 100 ए 12 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में बैक्टीरिया वृद्धि की गणना करने के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां और / या एक्सोजेनेस जस्ता का विवरण दीजिए।

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Representative Results

S100A12 अभिव्यक्ति और शुद्धि

बैक्टीरिया की संस्कृति के 50 एमएल से ~ तीन मिलीग्राम शुद्धिकरण ~ 40 मिलीग्राम पुनः संयोजक S100A12 का उत्पादन किया गया। पहला कदम अंतर्जात ई। कोलाई प्रोटीन का अमोनियम सल्फेट था। इस कदम के बाद आयनों-विनिमय क्रोमैटोग्राफी ( चित्रा 1 ए ) का पालन किया गया। प्रोटीन को सीओडीएस-पेज द्वारा ट्रैक किया गया है जिसमें कॉमॉसी बिलियेट ब्लू ( चित्रा 1 बी ) के साथ दाग किया गया है। शुद्धिकरण प्रक्रिया के अंतिम चरण में एसएक्सएएएए 12 वाले आकार के अंशों को शामिल करने के लिए आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी शामिल है जो आणविक भार और आकार ( चित्रा 2 ए ) द्वारा प्रोटीन को अलग करती है। S100A12 एक होमोडीमर है (उपूतन प्रति 92 अमीनो एसिड) और लगभग 21 केडीए का कुल आणविक भार है। आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी से एकत्र किए गए अंश एसडीएस पृष्ठ द्वारा विश्लेषण किए गए थे और कॉमॉसी स्टिंयिंग ( चित्रा 2 बी

एस 100 ए 12 जस्ता केलेशन गतिविधि के माध्यम से जीवाणु वृद्धि को दबाना

एस 100 ए 12 की रोगाणुरोधी गतिविधि की जांच करने के लिए, बैक्टीरियल व्यवहार्यता विश्लेषण को मात्रात्मक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति तकनीक ( चित्रा 3 ) के माध्यम से किया गया था। बैक्टीरिया कोशिकाओं की गणना से पता चलता है कि 100 ग्राम / एमएल के एस 100 ए 12 के संपर्क में पोषक तत्व जस्ता के एक बाहरी स्रोत की उपस्थिति या अनुपस्थिति में बैक्टीरियल व्यवहार्यता को काफी नुकसान नहीं होता है, जो कि S100A12 के बिना नियंत्रण (पी> 0.05, एक ही रास्ता एनोवा) के बावजूद नहीं है। हालांकि, मध्यम अकेले में 1000 μg / mL के S100A12 के संपर्क में अकेले मध्यम (पी = 0.0193, छात्र का टेस्ट, पी> 0.05 एक रास्ता एनोवा) की तुलना में जीवाणु व्यवहार्यता में 69 गुना कमी में परिणाम होता है; परिणामस्वरूप पोषक तत्व जस्ता (पी = 0.023, छात्र का टी टेस्ट) के बहिर्जात स्रोत के अलावा द्वारा उलट किया गया था। ये परिणाम डीS100A12 की रोगाणुरोधी गतिविधि को नियंत्रित करना इसकी जस्ता सिकुड़न गतिविधि पर निर्भर है।

आकृति 1
चित्रा 1: आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा सेल विश्लेषण और S100A12 शुद्धि । ( ए ) आयन एक्सचेंज शुद्धि के क्रोमैटोग्राम। 280 एनएम पर नीले, नमक ढाल में दिखाए गए यूवी शोष के ट्रेस, गुलाबी रंग में दिखाया गया, एकत्रित लाल रंग में चिह्नित चिन्ह। ( बी ) शुद्धि चरण के एसडीएस पृष्ठ जेल लेन: 1) आणविक वजन मानक 2) घुलनशील lysate अंश 3) अमोनियम सल्फेट गोली 4) अमोनियम सल्फेट सतह पर तैरनेवाला 5-14) क्यू क्रोमैटोग्राफी अंश 6-15। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2 चित्रा 2: S100A12 शुद्धि के आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी परिणाम। ( ए ) आकार बहिष्करण परिणामों के क्रोमैटोग्राम 280 एनएम पर यूवी शोषक का ट्रेस लाल रंग में एकत्रित नीले, एकत्रित अंश ( बी ) आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के एसडीएस पेज जेल लेन: 1) अणु वजन मार्कर 2) नमूना लोड 3-15) अंश 10-21 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: मात्रात्मक संस्कृति S100A12- निर्भर जस्ता केलेशन के संपर्क में प्रतिक्रिया में बैक्टीरियल व्यवहार्यता का विश्लेषण करती है। जीवाणु अकेले मध्यम (ग्रे बार) में 0, 100 या 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एस 100 ए 12 तक पहुंच गए थे, या 100 माइक्रोन जस्ता क्लोराइड से युक्त माध्यम(काली सलाखों)। जीवाणु व्यवहार्यता (* पी <0.05, मध्यम + जस्ता हालत की तुलना में छात्र की टी परीक्षा) के महत्वपूर्ण अवरोध में पोषक तत्व जस्ता परिणाम के एक बाहरी स्रोत की अनुपस्थिति में 1,000 माइक्रोग्राम / एमएल का एक्सपोजर। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

मानव S100A12 के अभिव्यक्ति और शुद्धि दोनों के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। ई। कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली, पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला सबसे सामान्य उपकरण है, खासकर जब एमओजी मात्रा जैव रासायनिक और बायोफिजिकल अध्ययनों के लिए आवश्यक होती है। यहां वर्णित प्रक्रिया की एक प्रमुख वृद्धि ऑटो-प्रेरण मीडिया 26 का उपयोग है जो मानक लुरी-ब्रॉथ मीडिया 18 के साथ अभिव्यक्ति की तुलना में लगभग तीस के एक कारक द्वारा शुद्ध प्रोटीन की उपज बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, ऑटो-प्रेरण मीडिया प्रोटीन-अभिव्यक्ति वर्कफ़्लो को सरल बनाता है। परंपरागत विकास मीडिया का उपयोग करना, संस्कृतियों को निरंतर निगरानी की जानी चाहिए ताकि घातीय वृद्धि के चरण में एक प्रेरित एजेंट जोड़ा जा सके। स्वत: प्रेरण मीडिया का उपयोग करते समय दोहरीकरण समय की निगरानी करने की कोई आवश्यकता नहीं है। संस्कृतियों को संतृप्ति के लिए विकसित करने की अनुमति है ऑटो-इंडक्टी के साथ विकास की प्रारंभिक अवधियों के दौरानमीडिया पर, ई। कोली एक कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज का उपयोग करता है। एक बार ग्लूकोज समाप्त हो जाने पर, बैक्टीरिया एक कार्बन स्रोत के रूप में लैक्टोज को स्विच करते हैं जो कि प्रोटीन एक्सप्रेशन 26 लाती है। ऑटो-प्रेरण मीडिया की संरचना उत्कृष्टता उच्च घनत्व संस्कृतियों के विकास की अनुमति देने के लिए और इसलिए पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। S100A12 के साथ हमारे अनुभव में, ऑटो-प्रेरण मीडिया बहुत अधिक व्यक्त प्रोटीन की मात्रा को बढ़ाता है, हालांकि हम यह सावधानी बरतते हैं कि यह प्रोटीन निर्भर हो सकता है और प्रयोगात्मक रूप से सत्यापित होना चाहिए।

एस 100 ए 12 को ई। कोलाई के cytoplasmic अंश में व्यक्त किया गया है जो बताता है कि यह घुलनशील और अच्छी तरह से जोड़ है। शुद्धि के पहले चरण में शामिल है अमोनियम सल्फेट का एक उच्च प्रतिशत जो अंतर्जात ई। कोलाई प्रोटीन के कई उपजी है। इस चरण में प्रोटीन के एस 100 परिवार की उच्च स्थिरता और विलेयता होती है। S100A12 मध्यम अम्लीय है (पीआई 5.81)। इस प्रकार S100A12 एक मजबूत आयन विनिमय विनिमय राल के साथ शुद्ध है। शुद्धि प्रक्रिया का अंतिम चरण एक आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ है जो यह सुनिश्चित करता है कि S100A12 मोनोडिसप्रेस और डिमरिक है। प्रोटोकॉल का यह चरण महत्वपूर्ण है क्योंकि S100A12 को घुलनशील ओलिगोमर्स 15 के रूप में दिखाया गया है और यह अज्ञात है कि oligomerization को इसके रोगाणुरोधी गतिविधि पर क्या असर पड़ सकता है। चूंकि एस 100 वर्ग के शेयरों में उच्च अनुक्रम और स्ट्रक्चरल समरूपता है, उनके भौतिक गुण समान 27 हैं । इसलिए, एस 100 ए 12 के शुद्धि के इस विधि को मोटे तौर पर सभी एस 100 प्रोटीनों पर लागू किया जा सकता है जो ई। कोली के घुलनशील अंश में व्यक्त किए जाते हैं ।

पिछला काम ने यह साबित किया है कि एसएफ़टीएफ़ प्रोटीन, जैसे कैल्क्ट्रोक्टिन, में एच। पाइलोरी जैसे बैक्टीरियल रोगजनकों के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि है , और यह गतिविधि जस्ता बाध्यकारी गतिविधि 25 पर निर्भर है। एंटीमिक्रोबS100A12 की ial गतिविधि भी जस्ता निर्भर है, लेकिन जीवाणु विकास के निष्कर्षों में दिखाया गया विकास अवरोध से पता चलता है कि एसएफ़एएएएएए 12 को अन्य एस 100-परिवार प्रोटीन जैसे कि कैल्प्रोटेक्टिन की तुलना में विकास को रोकना आवश्यक है। इस प्रकार, इसी तरह की फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए सीएएमएएएए 12 की तुलना में एसएएनएए 12 की उच्च सांद्रता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है (वृहदता में वृद्धि अवरोध या परिवर्तन)। S100A12 द्वारा लगाए गए धातु जब्ती के जवाब में जीवाणु जीन अभिव्यक्ति, चयापचय, या प्रोटिओमिक परिवर्तन में वैश्विक परिवर्तन निर्धारित करने के लिए इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों को लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

इस शोध के लिए वयोवृद्ध मामलों के कैरियर विकास पुरस्कार 1IK2BX001701, सीटीएसए पुरस्कार UL1TR000445 विभाग ने नेशनल सेंटर फॉर एडवांस ट्रांसजनल साइंसेज, नेशनल साइंस फाउंडेशन अवार्ड नम्बर 1547757 और 1400969 और एनआईएच ग्रान GM05551 द्वारा समर्थित किया गया। इसकी सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि नेशनल सेंटर फॉर अग्रिम ट्रांसजनल साइंसेज या नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व न करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

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References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).

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जैव रसायन अंक 123, पोषण उन्मुक्ति एस 100 ए 12 कैलगनुलिन सी जस्ता
एस 100 ए 12 की अभिव्यक्ति, शुद्धि और रोगाणुरोधी गतिविधि
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Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

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