Summary
Aquí, se presenta un método para expresar y purificar S100A12 (calgranulina C). Se describe un protocolo para medir su actividad antimicrobiana contra el patógeno humano H. pylori .
Abstract
Las proteínas de la calgranulina son mediadores importantes de la inmunidad innata y son miembros de la clase S100 de la familia EF de proteínas de unión al calcio. Algunas proteínas S100 tienen la capacidad de unirse a los metales de transición con alta afinidad y efectivamente secuestrarlos lejos de patógenos microbianos invasores en un proceso que se denomina "inmunidad nutricional". S100A12 (EN-RAGE) se une tanto al zinc como al cobre y es muy abundante en las células inmunes innatas, como los macrófagos y los neutrófilos. Presentamos un método refinado para la expresión, enriquecimiento y purificación de S100A12 en su configuración activa de unión a metal. La utilización de esta proteína en el crecimiento bacteriano y análisis de viabilidad revela que S100A12 tiene actividad antimicrobiana contra el patógeno bacteriano , Helicobacter pylori . La actividad antimicrobiana se basa en la actividad de unión a zinc de S100A12, que quelates nutrientes de zinc, por lo tanto hambrientos H. pylori que requiere zinc para el crecimiento y pRoliferation.
Introduction
Las proteínas S100 son una clase de la familia EF-mano de proteínas vinculantes de calcio con una amplia gama de funciones [ 1] . Se expresan de una manera específica de tejidos y células, y regulan un amplio espectro de funciones celulares 2 , 3 . Únicas a las proteínas de unión al calcio, las proteínas S100 exhiben funciones intracelulares y extracelulares 4 , 5 . Dentro de la célula, Ca 2 + vinculante induce un cambio conformacional que expone una superficie hidrófoba que se dirige específicamente a los socios de unión a proteínas [ 6] . Este mecanismo intracelular regula importantes procesos como la proliferación celular, la diferenciación y el metabolismo energético. En el medio extracelular, S100 proteínas presentan dos funciones [ 7] . En uno, actúan como patrón molecular asociado al daño (DAMP) e inician una inflamación pro-inflamatoriaRespuesta inmune a través de la interacción con el patrón de reconocimiento de los receptores [ 8 , 9] . Además, varios miembros de la clase de proteína S100 secuestran metales de transición, una función que sirve para matar de hambre a los patógenos microbianos en un proceso denominado inmunidad nutricional 10 , 11 .
El S100A12 (también conocido como calgranulina C y EN-RAGE) está altamente expresado en macrófagos y neutrófilos y ha sido identificado como un biomarcador potencial para enfermedades inflamatorias 12 , 13 . Además de fijar calcio en sus sitios EF-Hand, S100A12 tiene dos sitios de unión de metal de transición de alta afinidad situados en extremos opuestos de la interfaz 14 , 15 de dímero. Cada sitio de unión está compuesto por tres residuos de histidina y un residuo de ácido aspártico y puede quelar zinc o cobre <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Recientemente, se informó de que S100A12 dependientes de cinc hambre es importante en la regulación Helicobacter pylori crecimiento y la actividad de los factores de virulencia pro-inflamatoria [ 18] .
H. pylori infecta el estómago de aproximadamente la mitad de la población humana del mundo; Por lo que sin duda uno de los más exitosos patógenos bacterianos [ 19] . La infección con H. pylori puede conducir a resultados significativos de la enfermedad gástrica incluyendo gastritis, úlcera péptica y duodenal, linfoma linfoide asociado con mucosa (MALT) y adenocarcinoma gástrico invasivo (cáncer de estómago). El cáncer de estómago es la principal causa de muerte asociada al cáncer no cardiaco en el mundo, y el factor de riesgo asociado más grande para el cáncer de estómago es la infección por H. pylori .
H. pylori persiste en el nicho gástrico a pesar de un robuSt respuesta inmune al patógeno, lo que subraya la necesidad de una mejor comprensión de los mecanismos inmunes de control de esta infección bacteriana [ 20 , 21 , 22 , 23] . La inflamación asociada a H. pylori se caracteriza por una profunda infiltración de células polimorfonucleares, o neutrófilos, que depositan un repertorio de proteínas antimicrobianas, incluyendo S100A12, en el sitio de infección 18 , 24 , 25 . En un esfuerzo por entender el complejo diálogo entre el huésped y el patógeno, buscamos refinar la técnica para purificar S100A12 y usarla para estudiar el efecto antimicrobiano que ejerce sobre este patógeno relevante desde el punto de vista médico. El protocolo siguiente describe una técnica mejorada para la purificación de S100A12 en su estado biológicamente activo; Capaz de unir metales nutrientes con alto affiniY la quelación de los microorganismos invasores. Además, los métodos a continuación destacan la utilidad de esta proteína como un reactivo crítico para estudiar el mecanismo por el cual las moléculas antimicrobianas innatas restringen el crecimiento de patógenos bacterianos.
Las proteínas de la familia S100A han ganado reconocimiento como un importante grupo de moléculas del sistema inmune innatas que participan en la señalización inmunológica así como en la defensa del huésped 27 . El más bien estudiado de estos es calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina es una proteína asociada a los neutrófilos que forma un heterodímero de las subunidades S100A8 y S100A9 que se une a los metales de transición en la interfaz dímero [ 31] . Se ha demostrado que la calprotectina posee dos sitios de unión de metal: el sitio 1 puede unirse a Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ , y el sitio 2 puede Se unen Zn ^ { 2+} 31 , 32 . Numerosos informes han demostrado que la calprotectina tiene actividades antimicrobianas contra diversos patógenos, incluyendo Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli y H. pylori , y que los efectos inhibidores se deben a la actividad de quelación del metal de calprotectina 25 , 28 , 29 .
Trabajos previos demostraron que la calprotectina ejerce numerosas actividades sobre H. pylori, incluyendo la alteración de la estructura de los lípidos A en la membrana externa, reprimiendo el sistema de secreción cag- Tipo IV (que es un factor de virulencia proinflamatorio mayor en H. pylori ), induciendo la formación de biofilm y reprimiendo Crecimiento y viabilidad de H. pylori de una manera dependiente de la dosisClass = "xref"> 25 , 33 . Además, los ensayos genéticos y bioquímicos revelaron que la actividad antibacteriana de la calprotectina contra H. pylori se derivaba en gran medida de su capacidad para unirse al nutriente de zinc [ 25] . H. pylori requiere zinc, como se determinó mediante investigaciones previas que utilizaron un medio químicamente definido para determinar los requerimientos de micronutrientes para que este patógeno crezca y prolifere 34 . Además, la calprotectina era muy abundante dentro de los tejidos infectados por H. pylori , y asociada con infiltrados neutrófilos, lo que indica que el huésped puede emplear calprotectina como una estrategia antimicrobiana durante la infección y la posterior inflamación 25 , 35 .
La evidencia reciente de las técnicas de detección de la proteómica imparcial sugiere que bajo condiciones donde las especies reactivas del oxígeno son abundantes, calprotecEl estaño experimenta modificaciones postraduccionales que alteran el sitio de unión de hexa-histidina, inhibiendo así la actividad de unión a metal de la proteína 36 . Como tal, la hipótesis de que otras proteínas de la familia S100A entre el amplio repertorio de estas moléculas podrían actuar potencialmente como metal-quelantes auxiliares. Se seleccionó S100A12 para su posterior estudio debido a que no se identificó en la pantalla antes mencionada para modificación post-traduccional, tiene la capacidad de unir zinc y es muy abundante en tejidos humanos derivados de H. pylori .
Nuestro trabajo indica que S100A12 puede inhibir el crecimiento y la viabilidad de H. pylori de una manera dependiente de la dosis en la cepa G27 de H. pylori , y que la actividad antimicrobiana de esta proteína puede ser revertida por la adición de exceso de nutrientes de zinc. Este trabajo complementa nuestro trabajo anterior indicando S100A12 ejerció actividad antimicrobiana contra PMSS1 y 7.13 cepas de H. pylori , lo que demuestra su amplia actividad antibacteriana contra numerosos aislamientos clínicos y adaptado a laboratorio cepas de H. pylori [ 18] . En conjunto, estos resultados confirman la importancia de S100A12 como un mecanismo para controlar el crecimiento bacteriano y la proliferación a través de la inmunidad nutricional. Futuros estudios de esta importante interacción huésped-bacteriana podrían incluir explotar la actividad de S100A12 para reducir la carga bacteriana en los tejidos del huésped o determinar la contribución de esta proteína a la señalización inmune en el contexto de la infección por H. pylori .
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Protocol
1. Expresión de S100A12
- Transformar células BL21 DE3 competentes con un plásmido pGEMEX-S100a12 usando un protocolo de choque térmico estándar 18 . Añadir 1 a 5 μL de plásmido a 50 μL de bacterias en un tubo de microcentrífuga sobre hielo. Incubar durante 20 min.
- Caliente las células a 42 ° C durante 30 s.
- Incubar las células en hielo durante 2 min.
- Agregue 500 μl de medio SOC a las células. Incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm en un agitador orbital durante 1 h.
- Placa 150 μL de la reacción de transformación en medio LB-agar (suplementado con 100 μg / ml de ampicilina). Incubar durante 12-16 h a 37 ° C.
- Escoja una colonia. Inocular 2 mL de LB (suplementado con 100 μg / mL de ampicilina).
- Incubar durante 4-6 h a 37 ° C en un agitador orbital (300 rpm). El OD 600 debe leer entre 1-3 unidades de absorbancia.
- Añadir 500 μl de cultivo inicial a 50 ml de ZYM-5052 autoinduCtion 26 suplementado con 100 μg / ml de ampicilina. Para obtener la mejor aireación y máxima expresión, utilice un matraz erlenmeyer de 250 ml. Agitar (300 rpm) durante 24 h, a 37ºC.
- Transferir la suspensión bacteriana a un tubo de centrífuga. Se peletean las células por centrifugación (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C.
- Decantar el medio, registrar la muestra y almacenar la pasta celular a -80 ° C. La muestra es estable durante años.
2. Purificación de S100A12 usando cromatografía de baja presión
- Resuspender las células en 30 ml de Tris 20 mM, pH 8,0.
- Sonicar la suspensión en hielo para lisar las células. Utilice ~ 20 W de salida, 5 s on y 5 s off ciclo durante 5 min.
- Transfiera la solución a tubos de centrifugación de alta velocidad. Aclarar el lisado celular por centrifugación, 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Decantar el sobrenadante y transferir a un vaso de precipitados de polipropileno limpio de 100 ml. Enfriar la solución colocando el vaso en hielo. Añade una agitaciónR y añadir lentamente 11,20 g de sulfato de amonio. Dejar que la solución se agite sobre hielo durante 1 h adicional. Esto creará una solución al 60% de sulfato de amonio y precipitará la mayoría de las proteínas endógenas de E. coli . S100A12 permanecerá soluble.
- Centrifugar la solución a 4 ° C, 20.000 xg durante 20 minutos para sedimentar la proteína precipitada.
- Decantar el sobrenadante y transferir al tubo de diálisis (MWCO 3.500 kDa). Dializar contra 1 l de Tris 20 mM, pH 8,0 a 4 ° C. Cambie el tampón de diálisis dos veces. Permita 4 h entre cambios.
- La cromatografía de intercambio aniónico
- Realizar la cromatografía en un sistema de baja presión. El caudal típico es de 1 ml / min.
- Equilibrar una columna de Sepharose de 5 ml con 10 ml de Tris 20 mM, pH 8,0.
- Cargue los ~ 40 ml de S100A12 solución utilizando la bomba de muestra (recoger el flujo a través).
- Lavar la columna con 10 ml de Tris 20 mM, pH 8.
- Desarrollar la columna con un gradiente 0-30% (BuFfer B es Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 1 M) sobre 19 volúmenes de columna (CV, 95 ml). Recoger fracciones de 5 ml.
- Tomar una alícuota de 10 μL de cada fracción y analizar utilizando MES SDS PAGE con tinción Coomassie. Ejecutar el gel usando un voltaje constante (20 V / cm) durante 30 min.
- Las fracciones de la piscina que contienen S100A12. S100A12 corre a ~ 10 kDa de proteína sobre un gel desnaturalizante.
- Se concentran las fracciones a 5 ml usando un dispositivo de ultrafiltración (MWCO 10 kDa). Centrifugar a 3.000 xg durante ~ 8 min. Tome la fracción superior.
- La cromatografía de exclusión de tamaño
- Equilibrar la columna S75 con 1 CV (120 ml) de Tris 20 mM pH 8, NaCl 100 mM.
- Inyectar <5 ml de fracciones S100A12 concentradas (de la cromatografía de intercambio iónico).
- Desarrollar la columna a un caudal de 1 mL / m sobre 120 mL. Recoger fracciones de 5 ml.
- Tomar una alícuota de 10 μL de cada fracción y analizar utilizando SDS PAGE con tinción Coomassie. Validar la identidad de proteínas utilizandoWestern blot o espectrometría de masas (masa molecular calculada de la subunidad monomérica 10.575,0 Da, medida 10575,4 Da).
- Fracciones de piscina
- Medir la absorbancia de la proteína A 280 usando un espectrofotómetro. Utilice el búfer SEC como un espacio en blanco. El coeficiente de extinción calculado para el homodímero S100A12 es 5960 M -1 cm -1 .
NOTA: Los rendimientos típicos son 35-45 mg de S100A12 por 50 mL de cultivo. - Alícuota S100A12 en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 mg / tubo), congelación rápida en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80 ° C.
- Medir la absorbancia de la proteína A 280 usando un espectrofotómetro. Utilice el búfer SEC como un espacio en blanco. El coeficiente de extinción calculado para el homodímero S100A12 es 5960 M -1 cm -1 .
3. Ensayos de actividad antimicrobiana
- Rallar la cepa G27 de H. pylori sobre placas de agar de soja trípticas suplementadas con sangre de oveja al 5% (placas de agar sangre). Crecer 2-3 días a 37 ° C en aire ambiente suplementado con 5% de dióxido de carbono.
- Inocular H. pylori en caldo Brucella suplementado con 1x colesterol. Cultura sobreAgitación nocturna (250 rpm) a 37 ° C en aire ambiente suplementado con 5% de dióxido de carbono.
- Diluir H. pylori 1:10 en 50% de caldo de Brucella, 50% de tampón de calprotectina más 1x colesterol y cultivar en medio solo o suplementado con 100 μM de cloruro de zinc más 0, 100 o 1.000 μg / ml de S100A12 purificado. Cultura agitando durante la noche (250 rpm) a 37 ° C en aire ambiente suplementado con 5% de dióxido de carbono.
- Al día siguiente, realizar diluciones en serie y placa sobre placas de agar sangre. Dejar crecer las colonias bacterianas durante 2-3 días a 37 ° C en aire ambiente suplementado con dióxido de carbono al 5%. Enumerar las unidades formadoras de colonias para calcular el crecimiento bacteriano en presencia o ausencia de S100A12 y / o zinc exógeno.
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Representative Results
S100A12 expresión y purificación
Una purificación en tres etapas produjo ~ 40 mg de S100A12 recombinante a partir de 50 ml de cultivo bacteriano. El primer paso fue una precipitación con sulfato de amonio de proteínas endógenas de E. coli . Este paso fue seguido por cromatografía de intercambio aniónico ( Figura 1A ). La proteína es rastreada por una SDS-PAGE teñida con Coomassie Brilliant Blue ( Figura 1B ). El último paso del procedimiento de purificación implicó el agrupamiento de fracciones que contenían S100A12 para cromatografía de exclusión de tamaño que separa las proteínas por peso molecular y forma ( Figura 2A ). S100A12 es un homodímero (92 aminoácidos por subunidad) y tiene un peso molecular total de aproximadamente 21 kDa. Las fracciones recogidas de cromatografía de exclusión de tamaño se analizaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con Coomassie ( Figura 2B
S100A12 reprime el crecimiento bacteriano a través de la actividad de quelación de zinc
Para investigar la actividad antimicrobiana de S100A12, se realizaron análisis de viabilidad bacteriana mediante técnicas de cultivo microbiológico cuantitativo ( Figura 3 ). La enumeración de células bacterianas revela que la exposición a 100 μg / ml de S100A12 en presencia o ausencia de una fuente exógena de zinc nutriente no inhibe significativamente la viabilidad bacteriana en comparación con los controles sin S100A12 añadido (P> 0,05, One way ANOVA). Sin embargo, la exposición a 1000 μg / ml de S100A12 en medio solo resulta en una disminución de 69 veces en la viabilidad bacteriana en comparación con el medio solo (P = 0,0193, t de Student, P> 0,05 One Way ANOVA); Un resultado que se invirtió mediante la adición de una fuente exógena de zinc nutriente (P = 0,023, Student t Test). Estos resultadosMostrar la actividad antimicrobiana de S100A12 depende de su actividad de secuestro de zinc.
Figura 1: Lisis celular y purificación de S100A12 mediante cromatografía de intercambio aniónico . (A) Cromatograma de purificación por intercambio iónico. Traza de absorbancia UV a 280 nm mostrada en azul, gradiente de sal representado en rosa, fracciones recogidas marcadas en rojo. ( B ) gel SDS PAGE de etapas de purificación. Carriles: 1) patrón de peso molecular 2) fracción de lisado soluble 3) precipitado de sulfato de amonio 4) sulfonato de amonio sobrenadante 5-14) fracciones de cromatografía Q 6-15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados de cromatografía de exclusión de tamaño de la purificación de S100A12. (A) Cromatograma de resultados de exclusión de tamaño. Traza de absorbancia UV a 280 nm mostrada en azul, fracciones recogidas marcadas en rojo. ( B ) gel SDS PAGE de cromatografía de exclusión de tamaño. Carriles: 1) marcador de peso molecular 2) carga de muestra 3-15) fracciones 10-21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de cultivo cuantitativo de la viabilidad bacteriana en respuesta a la exposición a la quelación de cinc dependiente de S100A12. Las bacterias se expusieron a 0, 100 ó 100 μg / ml de S100A12 en medio solo (barras grises), o medio suplementado con 100 μM de cloruro de cinc(Barras negras). La exposición a 1.000 μg / ml en ausencia de una fuente exógena de zinc nutriente da lugar a una inhibición significativa de la viabilidad bacteriana (* P <0.05, prueba t de Student en comparación con medio + zinc). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se presenta un protocolo eficaz tanto para la expresión como para la purificación de S100A12 humano. El sistema de expresión de E. coli es la herramienta más común usada para la producción de proteínas recombinantes, particularmente cuando se requieren cantidades de mg para estudios bioquímicos y biofísicos. Una mejora clave del procedimiento descrito aquí es el uso de medios de autoinducción 26 que aumenta el rendimiento de proteína purificada por un factor de casi treinta en comparación con la expresión con medios de caldo Luria estándar 18 . Además, los medios de autoinducción simplifican en gran medida el flujo de trabajo de expresión de proteínas. Usando medios de crecimiento convencionales, los cultivos deben monitorearse continuamente de manera que se pueda a~nadir un agente inductor durante la fase de crecimiento exponencial. No es necesario supervisar los tiempos de duplicación cuando se usa un medio de autoinducción. Se permite que los cultivos crezcan hasta la saturación. Durante las etapas iniciales de crecimiento con autoinduciónEn los medios de comunicación, E. coli utiliza la glucosa como una fuente de carbono. Una vez que la glucosa se agota, las bacterias cambiar a la lactosa como fuente de carbono que induce la expresión de proteínas [ 26] . La composición de los medios de autoinducción se ajusta exquisitamente para permitir el crecimiento de cultivos de alta densidad y, por lo tanto, la expresión aumentada de la proteína recombinante. En nuestra experiencia con S100A12, los medios de inducción automática aumentan en gran medida la cantidad de proteína expresada, sin embargo, advertimos que esto puede ser dependiente de proteínas y debe ser verificado experimentalmente.
S100A12 se expresa en la fracción citoplásmica de E. coli lo que sugiere que es soluble y bien plegado. El primer paso de la purificación implica la adición de un alto porcentaje de sulfato de amonio que precipita muchas de las proteínas endógenas de E. coli . Este paso aprovecha la alta estabilidad y solubilidad de la familia de proteínas S100. S100A12 es moderadamente ácido (pI 5,81). De este modo, S100A12 se purifica adicionalmente con una fuerte resina de intercambio aniónico. La última etapa del proceso de purificación es una columna de cromatografía de exclusión de tamaño que asegura que S100A12 sea monodisperso y dimérico. Esta etapa del protocolo es crucial ya que se ha demostrado que S100A12 forma oligómeros solubles 15 y se desconoce qué efecto puede tener la oligomerización sobre su actividad antimicrobiana. Como los miembros de la clase S100 comparten una alta secuencia y homología estructural, sus propiedades físicas son similares 27 . Por lo tanto, este método de purificación de S100A12 puede aplicarse ampliamente a todas las proteínas S100 que se expresan en la fracción soluble de E. coli.
Trabajos previos han demostrado que las proteínas S100, como la calprotectina, tienen actividad antimicrobiana contra patógenos bacterianos como H. pylori, y que esta actividad depende de la actividad de unión al cinc 25 . El agente antimicrobianoLa actividad de S100A12 es también dependiente del zinc, pero la inhibición del crecimiento demostrada en ensayos de crecimiento bacteriano revela que se requiere significativamente más S100A12 para inhibir el crecimiento en comparación con otras proteínas de la familia S100 tales como la calprotectina. Por lo tanto, es crítico utilizar concentraciones más altas de S100A12 que la calprotectina para lograr fenotipos similares (inhibición del crecimiento o alteraciones en la virulencia). Aplicaciones futuras de este protocolo podría aplicarse para determinar los cambios globales en la expresión génica bacteriana, metabolómica, o alteraciones proteómicas en respuesta a la retención de metal impuesto por S100A12.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Asuntos de Veteranos Premio de Desarrollo de Carrera 1IK2BX001701, CTSA premio UL1TR000445 del Centro Nacional para el Avance Translational Sciences, la Fundación Nacional de Ciencias Premio Números 1547757 y 1400969, y el NIH concesión GM05551. Su contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no necesariamente representan puntos de vista oficiales del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Translacionales o los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S100A12 Expression | |||
| Expression cells | |||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 | |
| Autoinduction medium components | |||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 | |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 | |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 | |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 | |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 | |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 | |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 | |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 | |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 | |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 | |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 | |
| Selection agent | |||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 | |
| S100A12 Purification | |||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 | |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 | |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 | |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE | |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 | |
| H. pylori Culture | |||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 | |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 | |
| Cholesterol (250x) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
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