Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

doi: 10.3791/55557 Published: May 13, 2017

Summary

هنا، نقدم طريقة للتعبير عن وتنقية S100A12 (كالغرانولين C). نحن تصف بروتوكول لقياس نشاطها المضادة للميكروبات ضد الممرض البشري H. بيلوري .

Abstract

بروتينات كالغرانولين هي وسطاء مهمين من الحصانة الفطرية وهي أعضاء في فئة S100 من الأسرة إف اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم. بعض البروتينات S100 لديها القدرة على ربط المعادن الانتقالية مع تقارب عالية وعزلها بشكل فعال بعيدا عن غزو مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى "الحصانة الغذائية". S100A12 (إن-ريج) يربط كلا من الزنك والنحاس وفيرة للغاية في الخلايا المناعية الفطرية مثل الضامة والعدلات. نحن تقرير طريقة المكرر للتعبير، تخصيب وتنقية S100A12 في نشط، تكوين ملزم المعادن. استخدام هذا البروتين في نمو البكتيريا والتحليلات البقاء على قيد الحياة يكشف أن S100A12 له نشاط مضاد للميكروبات ضد الممرض البكتيرية ، هيليكوباكتر بيلوري . ويستند النشاط المضاد للميكروبات على النشاط ملزم الزنك من S100A12، الذي يخلط الزنك المغذي، وبالتالي تجويع H. بيلوري الذي يتطلب الزنك للنمو و proliferation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بروتينات S100 هي فئة من الأسرة EF- اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم مع مجموعة متنوعة من الوظائف 1 . يتم التعبير عنها بطريقة الأنسجة والخلية محددة، وتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية 2 ، 3 . فريدة من نوعها لبروتينات الكالسيوم ملزمة، بروتينات S100 المعرض على حد سواء وظائف داخل الخلية وخارج الخلية 4 ، 5 . داخل الخلية، كا 2 + ملزمة يؤدي إلى تغيير كونفورماتيونال الذي يعرض سطح مسعور الذي يستهدف على وجه التحديد البروتين شركاء ملزم 6 . هذه الآلية داخل الخلايا ينظم العمليات الهامة مثل تكاثر الخلايا، والتمايز والتمثيل الغذائي للطاقة. في الوسط خارج الخلية، بروتينات S100 تظهر وظيفتين 7 . في واحدة، أنها بمثابة الضرر المرتبطة الجزيئية نمط (دامب) البروتينات والشروع في المؤيدة للالتهاباتأتوري الاستجابة المناعية من خلال التفاعل مع مستقبلات التعرف على نمط 8 ، 9 . بالإضافة إلى ذلك، العديد من أعضاء فئة البروتين S100 عزل انتقال المعادن، وهي وظيفة التي تعمل على تجويع مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى الحصانة الغذائية 10 ، 11 .

S100A12 (المعروف أيضا باسم كالغرانولين C و EN- ريج) وأعرب للغاية في الضامة والعدلات وتم التعرف على أنها العلامات البيولوجية المحتملة للأمراض الالتهابات 12 ، 13 . بالإضافة إلى الكالسيوم ملزمة في مواقع EF- اليد، S100A12 اثنين من تقارب عالية الانتقال المعادن مواقع ملزمة تقع على طرفي نقيض من واجهة ديمر 14 ، 15 . ويتكون كل موقع ملزم من ثلاثة مخلفات الحامض الاميني وبقايا حمض الأسبارتيك واحد ويمكن أن تشيلت الزنك أو النحاس <سوب كلاس = "كريف"> 16 ، 17 . في الآونة الأخيرة، أبلغنا أن المجاعة الزنك تعتمد على S100A12 مهم في تنظيم هيليكوباكتر بيلوري النمو ونشاط عوامل الفوعة المؤيدة للالتهابات 18 .

H. بيلوري يصيب المعدة من حوالي نصف سكان العالم في العالم. مما يجعلها واحدة من أنجح الممرضات البكتيرية 19 . العدوى مع H. بيلوري يمكن أن يؤدي إلى نتائج مرض المعدة كبيرة بما في ذلك التهاب المعدة والقرحة الهضمية الاثني عشر، الغشاء المخاطي المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (مالت) سرطان الغدد الليمفاوية، وغدية المعدة الغازية (سرطان المعدة). سرطان المعدة هو السبب الرئيسي للوفيات غير المرتبطة بالسرطان غير القلب في العالم، وأكبر عامل خطر واحد المرتبطة بسرطان المعدة هو العدوى مع H. بيلوري .

H. بيلوري يستمر في مكانة المعدة على الرغم من روبواستجابة المناعة المناعية للممرض، مما يؤكد الحاجة إلى فهم أفضل للآليات المناعية للسيطرة على هذه العدوى البكتيرية 20 ، 21 ، 22 ، 23 . يتميز بيلوري- التهاب مترافق مع تسلل عميق من الخلايا النوى متعددة النوى، أو العدلات، التي تودع ذخيرة من البروتينات المضادة للميكروبات، بما في ذلك S100A12، في موقع العدوى 18 ، 24 ، 25 . في محاولة لفهم الحوار المعقدة بين المضيف والممرض، سعينا إلى صقل تقنية لتنقية S100A12 واستخدامها لدراسة مضادات الميكروبات تؤثر عليه يمارس على هذا الممرض ذات الصلة طبيا. بروتوكول أدناه الخطوط العريضة تقنية محسنة لتنقية S100A12 في حالتها النشطة بيولوجيا. قادرة على ملزمة المعادن المغذية مع أفيني عاليةتي وخالب لهم بعيدا عن غزو الكائنات الحية الدقيقة. وعلاوة على ذلك، الأساليب أدناه تسليط الضوء على فائدة هذا البروتين كاشف حاسم لدراسة الآلية التي الجزيئات المضادة للميكروبات الفطرية تقيد نمو مسببات الأمراض البكتيرية.

وقد اكتسبت البروتينات S100A الأسرة التقدير كمجموعة هامة من جزيئات نظام المناعة الفطرية التي تشارك في إشارة المناعة وكذلك الدفاع المضيف 27 . الأكثر دراستها جيدا هي كالبروتكتين (مرب-8/14، كالغرانولين A / B، S100A8 / A9) 28 ، 29 ، 30 . كالبروتكتين هو البروتين المرتبط العدلات التي تشكل هيتيروديمر من S100A8 و S100A9 الوحدات الفرعية التي تربط الانتقال المعادن في واجهة ديمر 31 . وقد تبين أن كالبروتكتين تمتلك اثنين من المواقع الملزمة المعدنية: الموقع 1 يمكن ربط زن 2+ ، من 2+ ، أو الحديد 2+ ، والموقع 2 يمكن ربط زن 2+ 31 ، 32 . وقد أظهرت العديد من التقارير أن الكالبروتكتين لديها أنشطة مضادات الميكروبات ضد مسببات الأمراض المتنوعة بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية ، المبيضات البيض ، أسينتوباكتر بوماني ، كليبسيلا الرئوية ، الإشريكية القولونية ، والبكتيريا الحلزونية ، وأن الآثار المثبطة هي نتيجة لأنشطة خالب المعادن من كالبروتكتين 25 ، 28 ، 29 .

العمل السابق أظهرت كالبروتكتين تمارس العديد من الأنشطة على H. بيلوري بما في ذلك تغيير الدهون في هيكل في الغشاء الخارجي، وقمع كاج-نوع الرابع إفراز النظام (وهو عامل فوعة بروينفلاماتوري كبير داخل H. بيلوري )، وتحفيز تشكيل بيوفيلم، وقمع H. بيلوري النمو والصلاحية بطريقة تعتمد على الجرعةكلاس = "كريف"> 25 ، 33 . وعلاوة على ذلك، كشفت الفحوصات الجينية والكيمياء الحيوية النشاط المضاد للبكتيريا من الكالبروتكتين ضد H. بيلوري كان مستمدا إلى حد كبير من قدرته على ربط الزنك المغذيات 25 . يتطلب البوابية الزنك، كما تم تحديده من قبل البحوث السابقة التي تستخدم وسيلة محددة كيميائيا للتأكد من متطلبات المغذيات الدقيقة لهذا الممرض في النمو وتكاثر 34 . بالإضافة إلى ذلك، كان الكالبروتكتين وفيرة للغاية داخل الأنسجة الحلزونية الملوية البوابية ، ويرتبط مع تسلل العدلات، مشيرا إلى المضيف قد يكون توظيف الكالبروتكتين كاستراتيجية مضادات الميكروبات خلال العدوى والالتهاب اللاحق 25 ، 35 .

تشير الأدلة الحديثة من تقنيات التحري البروتيني غير منحازة أنه في ظل ظروف حيث الأكسجين التفاعلية الأنواع وفيرة، كالبروتيكالقصدير يخضع التعديلات بعد متعدية التي تغير سداسي الهستيدين ملزم الموقع، وبالتالي تثبيط نشاط ملزم المعادن من البروتين 36 . على هذا النحو، افترضنا أن بروتينات أخرى S100A الأسرة بين ذخيرة واسعة من هذه الجزيئات يمكن أن تكون بمثابة المعادن المساعدة-تشيلاتورس. اخترنا S100A12 لمزيد من الدراسة لأنه لم يتم تحديدها في الشاشة المذكورة أعلاه لتعديل ما بعد متعدية، لديها القدرة على ربط الزنك، وأنها وفيرة للغاية في الأنسجة البشرية المستمدة من H. بيلوري- المصابين بالعدوى.

عملنا يشير إلى أن S100A12 يمكن أن تمنع نمو البوابية وبقاء بطريقة تعتمد على الجرعة في سلالة G27 من H. بيلوري ، وأن النشاط المضاد للميكروبات من هذا البروتين يمكن عكسها عن طريق إضافة الزنك المغذيات الزائدة. هذا العمل يكمل عملنا السابق مشيرا إلى S100A12 النشاط المضاد للميكروبات ضد PMSS1 و 7.13 سلالات من الملوية البوابية ، مما يدل على نشاطها المضاد للبكتيريا واسعة ضد العديد من العزلات السريرية والسلالات المختبرية تكييفها من H. بيلوري 18 . معا، هذه النتائج تؤكد أهمية S100A12 كآلية للسيطرة على نمو البكتيريا وانتشارها عن طريق الحصانة الغذائية. الدراسات المستقبلية لهذا التفاعل المضيف البكتيرية الهامة يمكن أن تشمل استغلال نشاط S100A12 للحد من العبء البكتيرية داخل أنسجة المضيف، أو تحديد مساهمة هذا البروتين في الإشارات المناعية في سياق عدوى الملوية البوابية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. التعبير عن S100A12

  1. تحويل الخلايا المختصة BL21 DE3 مع البلازميد بجيمكس-S100a12 باستخدام معيار صدمة الحرارة بروتوكول 18 . إضافة 1 إلى 5 ميكرولتر من البلازميد إلى 50 ميكرولتر من البكتيريا في أنبوب ميكروسنتريفوج على الجليد. احتضان لمدة 20 دقيقة.
  2. صدمة الحرارة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  3. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام سوك إلى الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة على شاكر المداري لمدة 1 ساعة.
  5. لوحة 150 ميكرولتر من رد فعل التحول على لب-أجار المتوسطة (تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين). احتضان لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. اختيار مستعمرة واحدة. تطعيم 2 مل من لب (تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين).
  7. احتضان لمدة 4-6 ح عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري (300 دورة في الدقيقة). أود 600 يجب قراءة بين 1-3 وحدات الامتصاصية.
  8. إضافة 500 ميكرولتر من ثقافة بداية إلى 50 مل من زيم-5052 أوتويندووسائل الإعلام كتيون 26 تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. للحصول على أفضل التهوية والتعبير الأقصى، استخدم قارورة إرلنماير محشوة بحجم 250 مل. اهتز (300 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة، عند 37 درجة مئوية.
  9. نقل تعليق البكتيرية إلى أنبوب الطرد المركزي. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (4000 x ج، 10 دقيقة) في 4 درجات مئوية.
  10. صب وسائل الإعلام، تسجيل عينة، وتخزين لصق الخلية في -80 درجة مئوية. عينة مستقرة لسنوات.

2. تنقية S100A12 باستخدام الضغط المنخفض اللوني

  1. ريسوسبيند الخلايا في 30 مل من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0.
  2. يصوتن التعليق على الجليد إلى ليز الخلايا. استخدام ~ 20 واط الإخراج، 5 ثانية على و 5 ثانية دورة قبالة لمدة 5 دقائق.
  3. نقل الحل إلى أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة. توضيح الخلية المحللة بواسطة الطرد المركزي، 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. صب طاف ونقل إلى 100 مل كوب البولي بروبلين نظيفة. تبريد الحل عن طريق وضع الكأس على الجليد. إضافة ضجةr وإضافة ببطء 11.20 غرام من كبريتات الأمونيوم. السماح للحل لإثارة على الجليد لمدة 1 ساعة إضافية. وهذا سيخلق حل 60٪ من كبريتات الأمونيوم ويعجل معظم البروتينات E. القولونية الذاتية. S100A12 ستبقى قابلة للذوبان.
  5. أجهزة الطرد المركزي الحل في 4 درجات مئوية، 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة إلى بيليه البروتين عجلت.
  6. صب طاف ونقل إلى أنابيب غسيل الكلى (موكو 3،500 كيلو دالتون). دياليز ضد 1 لتر من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 في 4 درجات مئوية. تغيير عازلة غسيل الكلى مرتين. اترك 4 ساعات بين التغييرات.
  7. كروماتوجرافيا التبادل أنيون
    1. أداء اللوني على نظام الضغط المنخفض. معدل التدفق النموذجي هو 1 مل / دقيقة.
    2. موازنة 5 مل سيفاروس العمود مع 10 مل من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0.
    3. تحميل ~ 40 مل من حل S100A12 باستخدام مضخة عينة (جمع تدفق من خلال).
    4. غسل العمود مع 10 مل من 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.
    5. تطوير العمود مع التدرج 0-30٪ (بوفر B هو 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 M كلوريد الصوديوم) أكثر من 19 مجلدات العمود (كف، 95 مل). جمع 5 مل الكسور.
    6. خذ قسامة 10 ميكرولتر من كل جزء وتحليل باستخدام ميس سدز بادج مع تلطيخ كوماسي. تشغيل هلام باستخدام الجهد المستمر (20 V / سم) لمدة 30 دقيقة.
    7. تجمع الكسور التي تحتوي على S100A12. S100A12 يعمل في ~ 10 كيلو دالتون بروتين على هلام تغيير طبيعة.
    8. ركز الكسور إلى 5 مل باستخدام جهاز الترشيح الفائق (موكو 10 كيلو دالتون). أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 8 دقائق. تأخذ الجزء العلوي.
  8. استبعاد حجم اللوني
    1. يتوازن عمود S75 مع 1 كف (120 مل) من 20 ملي تريس درجة الحموضة 8، 100 ملي كلوريد الصوديوم.
    2. حقن <5 مل من كسور S100A12 المركزة (من الكروماتوغرافيا التبادل الأيوني).
    3. تطوير العمود بمعدل تدفق 1 مل / م أكثر من 120 مل. جمع 5 مل الكسور.
    4. خذ قسامة 10 ميكرولتر من كل جزء وتحليل باستخدام سدز بادج مع تلطيخ كوماسي. التحقق من صحة هوية البروتين باستخداملطخة غربية أو مطياف الكتلة (كتلة جزيئية محسوبة من وحدة فرعية أحادية 10،575.0 دا، مقاسة 10575.4 دا).
  9. كسور بركة
    1. قياس امتصاص البروتين A 280 باستخدام الطيف. استخدام المخزن المؤقت سيك كما فارغ. معامل الانقراض المحسوب ل هوموديمر S100A12 هو 5960 م -1 سم -1 .
      ملاحظة: الغلة النموذجية هي 35-45 ملغ من S100A12 لكل 50 مل من الثقافة.
    2. قسامة S100A12 إلى 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج (1 ملغ / أنبوب)، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. مضادات الميكروبات فحوصات النشاط

  1. متتالية H. بيلوري سلالة G27 على لوحات أجار الصويا أجار تستكمل مع 5٪ من الأغنام الدم (لوحات أجار الدم). تنمو 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية في الهواء الغرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  2. تطعيم H. بيلوري في مرق البروسيلا تستكمل مع الكوليسترول 1X. ثقافة أكثر(250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية في الهواء غرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  3. تمييع H. بيلوري 1:10 إلى 50٪ مرق البروسيلا، 50٪ كالبروتكتين العازلة زائد 1X الكولسترول والثقافة في المتوسطة وحدها أو تستكمل مع 100 ميكرومتر كلوريد الزنك زائد 0، 100 أو 1000 ميكروغرام / مل من S100A12 المنقى. الثقافة تهتز بين عشية وضحاها (250 دورة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية في الهواء غرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  4. في اليوم التالي، إجراء التخفيفات المسلسل ولوحة على لوحات أجار الدم. السماح للمستعمرات البكتيرية لتنمو لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية في الهواء غرفة تستكمل مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تعداد وحدات تشكيل مستعمرة لحساب نمو البكتيريا في وجود أو عدم وجود S100A12 و / أو الزنك الخارجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

S100A12 التعبير والتنقية

وتنقية من ثلاث خطوات أنتجت ~ 40 ملغ من S100A12 المؤتلف من 50 مل من ثقافة البكتيرية. وكانت الخطوة الأولى هو هطول أمونيوم كبريتات من البروتينات E. القولونية الذاتية. وأعقب هذه الخطوة كروماتوجرافيا التبادل الأنيوني ( الشكل 1A ). يتم تعقب البروتين من قبل سدز-بادج ملطخة كوماسي الأزرق الرائعة ( الشكل 1B ). الخطوة الأخيرة من إجراء تنقية شملت تجميع الكسور التي تحتوي على S100A12 لالكروماتوغرافيا حجم الاستبعاد الذي يفصل البروتينات عن طريق الوزن الجزيئي والشكل ( الشكل 2A ). S100A12 هو هوموديمر (92 الأحماض الأمينية لكل وحدة فرعية) ولها وزن الجزيئي الكلي حوالي 21 كيلو دالتون. الكسور التي تم جمعها من حجم الاستبعاد اللوني تم تحليلها من قبل سدز-بادج وتصورها تلطيخ كوماسي ( الشكل 2B

S100A12 يثبط نمو البكتيريا عن طريق النشاط الزنك خلب

للتحقيق في النشاط المضاد للميكروبات من S100A12، تم إجراء تحليلات الجدوى البكتيرية عن طريق تقنيات الثقافة الميكروبيولوجية الكمية ( الشكل 3 ). تعداد الخلايا البكتيرية يكشف أن التعرض إلى 100 ميكروغرام / مل من S100A12 في وجود أو عدم وجود مصدر خارجي من الزنك المغذيات لا تمنع بشكل كبير الجدوى البكتيرية مقارنة مع الضوابط دون S100A12 المضافة (P> 0.05، طريقة واحدة أنوفا). ومع ذلك، والتعرض إلى 1000 ميكروغرام / مل من S100A12 في المتوسطة وحدها يؤدي إلى انخفاض 69 أضعاف في الجدوى البكتيرية مقارنة المتوسطة وحدها (P = 0.0193، اختبار تي الطالب، P> 0.05 طريقة واحدة أنوفا). وهي نتيجة تم عكسها بإضافة مصدر خارجي للزنك المغذي (P = 0.023، اختبار الطالب t ). هذه النتائج ديمونسترات النشاط المضاد للميكروبات من S100A12 يعتمد على نشاطها الزنك حبس.

شكل 1
الشكل 1: تحلل الخلايا وتنقية S100A12 بواسطة اللوني التبادل أنيون . ( أ ) كروماتوغرام لتنقية التبادل الأيوني. تتبع الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر مبينة باللون الأزرق، والتدرج الملح يصور باللون الوردي، والكسور التي تم جمعها ملحوظ باللون الأحمر. ( ب ) سدز بادج هلام خطوات تنقية. الممرات: 1) الوزن الجزيئي القياسية 2) ذوبان المحللة جزء 3) كبريتات الأمونيوم بيليه 4) كبريتات الأمونيوم طاف 5-14) Q كروماتوجرافي الكسور 6-15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 الشكل 2: حجم الاستبعاد نتائج اللوني لتنقية S100A12. ( أ ) كروماتوغرام من نتائج استبعاد الحجم. تتبع الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر مبينة باللون الأزرق، والكسور التي تم جمعها ملحوظ باللون الأحمر. ( ب ) سدز بادج هلام من حجم الاستبعاد اللوني. الممرات: 1) جزيء الوزن علامة 2) عينة تحميل 3-15) الكسور 10-21. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: تحليلات ثقافة الكمية من الجدوى البكتيرية ردا على التعرض للخالف الزنك تعتمد على S100A12. تعرضت البكتيريا إلى 0، 100، أو 100 ميكروغرام / مل من S100A12 في المتوسطة وحدها (أشرطة رمادية)، أو متوسطة تستكمل مع 100 ميكرومتر كلوريد الزنك(أشرطة سوداء). التعرض إلى 1000 ميكروغرام / مل في غياب مصدر خارجي من الزنك المغذيات النتائج في تثبيط كبير للجدوى البكتيرية (* P <0.05، اختبار تي t مقارنة المتوسطة + الزنك الشرط). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد بروتوكول كفاءة لكل من التعبير وتنقية S100A12 الإنسان. نظام التعبير E. القولونية هو الأداة الأكثر شيوعا المستخدمة لإنتاج البروتينات المؤتلف، وخصوصا عندما تكون هناك حاجة كميات ملغ للدراسات البيوكيميائية والبيوفيزيائية. وهناك تعزيز رئيسي للإجراء الموصوف هنا هو استخدام وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الحث 26 مما يزيد من العائد من البروتين المنقى بعامل ما يقرب من ثلاثين بالمقارنة مع التعبير مع وسائل الإعلام القياسية لوريا مرق 18 . بالإضافة إلى ذلك، وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الاستقراء يبسط إلى حد كبير سير العمل التعبير عن البروتين. وباستخدام وسائط النمو التقليدية، يجب مراقبة الثقافات باستمرار بحيث يمكن إضافة عامل محفز خلال مرحلة النمو الأسي. ليست هناك حاجة لمراقبة أوقات مضاعفة عند استخدام وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الحث. يسمح للثقافات أن تنمو لتشبع. خلال المراحل الأولية من النمو مع السيارات الحثعلى وسائل الإعلام، E. القولونية يستخدم الجلوكوز كمصدر الكربون. مرة واحدة يتم استنفاد الجلوكوز، والبكتيريا التحول إلى اللاكتوز كمصدر الكربون الذي يدفع البروتين التعبير 26 . تكوين ضبط وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الاستقراء بشكل رائع للسماح لنمو الثقافات عالية الكثافة، وبالتالي زيادة التعبير عن البروتين المؤتلف. في تجربتنا مع S100A12، وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الاستقراء يزيد كثيرا من كمية البروتين أعرب، ولكن نحن نحذر من أن هذا قد يكون البروتين تعتمد ويجب التحقق من الناحية التجريبية.

يتم التعبير عن S100A12 في جزء سيتوبلازمي من E. القولونية مما يشير إلى أنه قابل للذوبان ومطوية جيدا. الخطوة الأولى من تنقية ينطوي على إضافة نسبة عالية من كبريتات الأمونيوم الذي يعجل العديد من البروتينات E. القولونية الذاتية. هذه الخطوة يعزز ارتفاع الاستقرار والذوبان من عائلة S100 من البروتينات. S100A12 هو حمضي معتدل (بي 5.81). وهكذا يتم تنقية S100A12 أبعد من ذلك مع الراتنج تبادل أنيون قوي. الخطوة الأخيرة من عملية التنقية هي عمود الاستبعاد حجم اللوني الذي يضمن أن S100A12 هو مونوديسبيرز و ديمريك. هذه الخطوة من بروتوكول حاسمة كما تم تبين S100A12 لتشكيل أوليغوميرس للذوبان 15 وأنه من غير المعروف ما يؤثر أوليغوميريزاتيون قد يكون على نشاطها المضاد للميكروبات. وبما أن أعضاء الفئة S100 حصة تسلسل عالية والتناظر الهيكلي، وخصائصها الفيزيائية متشابهة 27 . وبالتالي، فإن هذه الطريقة لتنقية S100A12 قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لجميع البروتينات S100 التي يتم التعبير عنها في جزء قابل للذوبان من E. القولونية .

وقد أثبت العمل السابق أن البروتينات S100، مثل الكالبروتكتين، لها نشاط مضاد للميكروبات ضد مسببات الأمراض البكتيرية مثل H. بيلوري، وأن هذا النشاط يعتمد على النشاط الزنك ملزم 25 . مضادات الميكروباتالنشاط إال من S100A12 هو أيضا تعتمد على الزنك، ولكن تثبيط النمو أظهرت في فحوصات النمو البكتيرية يكشف أن هناك حاجة إلى أكثر بكثير S100A12 لمنع نمو بالمقارنة مع غيرها من البروتينات S100 الأسرة مثل الكالبروتكتين. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان استخدام تركيزات أعلى من S100A12 من الكالبروتكتين لتحقيق المظاهر مماثلة (تثبيط النمو أو تعديلات في الفوعة). التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول يمكن تطبيقها لتحديد التغيرات العالمية في التعبير الجيني البكتيري، ميتابولوميك، أو التعديلات البروتينية ردا على عزل المعادن التي تفرضها S100A12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد أيد هذا البحث من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى جائزة التطوير الوظيفي 1IK2BX001701، كتسا جائزة UL1TR000445 من المركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية، ومؤسسة العلوم الوطنية جائزة أرقام 1547757 و 1400969، والمعاهد الوطنية للصحة منح GM05551. محتوياته هي وحدها مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250x) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290, (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268, (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13, (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76, (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15, (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41, (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290, (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12, (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88, (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391, (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60, (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7, (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83, (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136, (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32, (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338, (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13, (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42, (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51, (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10, (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59, (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319, (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10, (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11, (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11, (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6, (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44, (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22, (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290, (15), 9896-9905 (2015).
التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).More

Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter