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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert Published: May 17, 2017 doi: 10.3791/55565
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,6, 2, 2, 1,2
1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

Summary

Wir stellen ein Verfahren zur Quantifizierung der DNA-Methylierung auf der Basis des 5-Methylcytosin (5-mC) -Dot-Blots vor. Wir haben die 5-mC-Werte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung bestimmt. Diese einfache Technik könnte verwendet werden, um schnell den Chondrozyten-Phänotyp in der ACI-Behandlung zu bestimmen.

Abstract

Die Dedifferenzierung von hyalinen Chondrozyten in fibroblastische Chondrozyten begleitet oft die Monolayer-Expansion von Chondrozyten in vitro . Der globale DNA-Methylierungsgrad von Chondrozyten gilt als geeigneter Biomarker für den Verlust des Chondrozyten-Phänotyps. Allerdings können die Ergebnisse auf der Grundlage verschiedener experimenteller Methoden inkonsistent sein. Daher ist es wichtig, eine präzise, ​​einfache und schnelle Methode zu etablieren, um globale DNA-Methylierungswerte während der Chondrozyten-Dedifferenzierung zu quantifizieren.

Die derzeitigen genomweiten Methylierungsanalysetechniken beruhen weitgehend auf der genomischen Sequenzierung von Bisulfit. Aufgrund des DNA-Abbaus während der Bisulfit-Umwandlung erfordern diese Verfahren typischerweise ein großes Probenvolumen. Andere Methoden zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierungsstufen umfassen die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Allerdings erfordert HPLC eine vollständige Verdauung der genomischen DNA. Darüber hinaus sind die unerschwinglich hohen Kosten der HPLC inStruments begrenzt die erweiterte Anwendung von HPLC.

In dieser Studie wurde genomische DNA (gDNA) aus menschlichen Chondrozyten extrahiert, die mit variierender Anzahl von Passagen kultiviert wurden. Der gDNA-Methylierungsgrad wurde unter Verwendung eines methylierungsspezifischen Dot-Blot-Assays nachgewiesen. Bei diesem Dot-Blot-Ansatz wurde eine gDNA-Mischung, die die zu detektierende methylierte DNA enthielt, direkt auf eine N + -Membran als Punkt innerhalb eines zuvor gezeichneten kreisförmigen Templatmusters gesichtet. Im Vergleich zu anderen Gelelektrophorese-basierten Blotting-Ansätzen und anderen komplexen Blotting-Prozeduren spart die Dot-Blot-Methode erhebliche Zeit. Zusätzlich können Punktblots den Gesamt-DNA-Methylierungsgrad unter Verwendung eines im Handel erhältlichen 5-mC-Antikörpers nachweisen. Wir fanden, dass sich der DNA-Methylierungsgrad zwischen den Monolayer-Subkulturen unterscheidet und daher eine Schlüsselrolle bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung spielen könnte. Der 5-mC-Dot-Blot ist eine zuverlässige, einfache und schnelle Methode, um die allgemeine DNA-Methylierungsstufe zu ermittelnE-Chondrozyten-Phänotyp

Introduction

Die autologe Chondrozytenimplantation (ACI) ist ein relativ neues, hochmodernes Verfahren zur Behandlung von Gelenkknorpeldefekten 1 , 2 . Einer der entscheidenden Schritte in ACI ist die Verstärkung von Chondrozyten über die Monolayerkultur in vitro . Während der Amplifikation verlieren die hyalinen Chondrozyten leicht ihren Phänotyp und werden dedifferenziert, was für die ACI-Behandlung 3 , 4 unerwünscht ist . Um das Ergebnis der ACI-Behandlung zu optimieren, sollte das Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung vor der Wiederbepflanzung bestimmt werden. Es ist zwingend notwendig, einen wirtschaftlichen und schnellen Weg zu finden, um den Status der Chondrozyten zu bestimmen. In jüngster Zeit hat die Assoziation zwischen DNA-Methylierung und Chondrozyten-Dedifferenzierung viel Aufmerksamkeit erregt 4 , 5 , 6 . DNA-Methylierung ist ein Prozess von whIch werden der DNA zugesetzt, was zur Umwandlung von Cytosinresten zu 5-Methylcytosin (5-mC) führt.

Zur Aufklärung der Biologie der DNA-Methylierung bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung ist der erste Schritt die Auswertung der DNA-Methylierungsstufe von Chondrozyten, die sich bislang als herausfordernd erwiesen hat. Bisulfit-Genomsequenzierung ist die am weitesten verbreitete Technik zur Analyse der DNA-Methylierung 7 , 8 . In diesem Assay verursacht die Bisulfitumwandlung einen DNA-Abbau, und daher muß eine beträchtliche Menge an Probe für den Assay bereitgestellt werden. Außerdem wurde eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet, um die globalen DNA-Methylierungsstufen 9 , 10 zu quantifizieren. Allerdings erfordert die HPLC-Analyse eine genomische DNA-Verdauung. Darüber hinaus sind fortgeschrittene und teure experimentelle Instrumente erforderlich. Daher sind neben den hohen Kosten diese experimentellen Verfahren zeitgenauUming Anti-5-mC-Antikörper sind mittlerweile kommerziell verfügbar, was die Möglichkeit zur Immun-Blotting von 5-mC-haltiger genomischer DNA aus komplexen Genomen geschaffen hat.

In diesem Bericht haben wir genomische DNA aus Chondrozyten extrahiert, die in einer Reihe von Monolayer-Kulturen angebaut wurden. Wir verwendeten einen Dot-Blot-Assay, um den 5-mC-Gehalt in menschlichen Chondrozyten mit einer unterschiedlichen Anzahl von Passagen zu bewerten. Wir fanden, dass der 5-mC-Gehalt in hochdifferenzierten Chondrozyten im Vergleich zu Chondrozyten mit geringer Diffifferenzierung erhöht wurde. Darüber hinaus haben wir eine Beziehung zwischen Dedifferenzierungsstatus und 5-mC-Pegeln identifiziert. Schließlich berichteten wir, dass die Veränderungen im 5-mC-Gehalt mit dem Chondrozyten-Phänotyp assoziiert waren. Daher ist der 5-mC-Punkt-Blot-Assay ein zuverlässiges, einfaches und schnelles Verfahren, um das DNA-Methylierungsniveau in Chondrozyten zu detektieren.

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Protocol

Diese Studie wurde von der Human Ethics Committee der Shenzhen Second People's Hospital genehmigt.

1. Menschliche Gelenkknorpel-Gewebe-Sammlung und Chondrozyten-Kultur

  1. Vorbereitung von Materialien
    1. Bereiten Sie Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM) Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin, vor. 1 mg / ml Kollagenase II, 0,25% Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und ein Zellfilter (40 μm Nylon) zubereiten.
  2. Menschliche Knorpelgewebesammlung
    1. Isolieren Sie Knorpelknorpel aus den Kniegelenken von Spenderpatienten nach Trauma. Erhalten Sie eine informierte Zustimmung von allen Teilnehmern.
    2. Den Knorpel in 1-2 mm 3 Stücke unter Verwendung eines sterilen Skalpells würfeln und Chondrozyten aus dem gehackten Knorpel mit 1 mg / ml Kollagenase II in DMEM bei 37 ° C für 12-16 h verdauen.
    3. Filtern Sie die resultierende celL Suspension durch einen Zellfilter (40 μm) und zweimal mit PBS waschen.
    4. Zählzellen mit einem Hämocytometer und Samen mit einer Dichte von 20.000-30.000 Zellen / cm 2 in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin.
    5. Kultur in einem Inkubator bei 37 ° C.
  3. Monolayer Chondrozyten Expansion
    1. Ernte unterkonfluierende Zellen unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA und Re-Platte mit einer Dichte von 6.600 Zellen / cm 2 . Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche.
    2. Kultur-Chondrozyten in Monoschichten für bis zu sechs Passagen und beurteilen an den Passagen 1, 2, 3, 4 und 5.

2. Genomische DNA (gDNA) Extraktion

  1. Sammeln Sie die Zellen und resuspendieren Sie in 500 & mgr; l Lysepuffer (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 & mgr; g / ml RNase A) pro 10 Million Zellen. Zellen durch Pipettieren und schnelle Umkehrung resuspendieren und dann 1 h bei 37 ° C inkubieren.
  2. EINDd-Proteinase K bei einer Konzentration von 160 μg / ml Zelllysat und invertieren die Mischung kräftig. 6 h bei 55 ° C inkubieren.
  3. Füge ein Volumen Tris pH 7,9 gesättigtes Phenol hinzu: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zur Probe. Vortex oder schütteln Sie die Probe von Hand gründlich für ca. 20 s.
  4. Zentrifugieren der Probe bei Raumtemperatur für 5 min bei 13.000 × g. Die obere wässrige Phase entfernen und die Schicht auf ein frisches Röhrchen übertragen.
  5. Mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahieren, um Phenol zu entfernen und die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen zu überführen.
  6. Filtriere DNA durch Zugabe von 0,1 Probenvolumen von 3 M Natriumacetat pH 8,0 und 2 Volumina von 100% Ethanol.
  7. Das Röhrchen bei -20 ° C über Nacht aufbewahren, um die gDNA auszufällen.
  8. Zentrifugieren der Probe bei 4 ° C für 10 min bei 16.000 xg zur Pellet-gDNA.
  9. Die Probe dreimal mit 70% igem Ethanol waschen und bei 4 ° C für 2 min bei 13 000 x g zentrifugieren.
  10. Den Überstand entfernenT sorgfältig und dann lufttrocknen Resuspendieren der DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. DNA-Methylierungs-Profilierung

  1. Verwenden Sie ein DNA-Methylierungskit, um die Bisulfit-Umwandlungsreaktion unter Verwendung von insgesamt 500 ng der genomischen DNA nach dem Protokoll des Herstellers durchzuführen. Eluieren in 10 & mgr; l Elutionspuffer (50 ng / & mgr; l).
  2. Führen Sie die DNA-Methylierungsprofile mit einem kommerziellen Kit nach dem Protokoll des Herstellers durch.

4. Dot-Blot-Analyse

  1. Den isolierten DNA (1 mg pro Probe) in 0,1 M NaOH für 10 min bei 95 ° C denaturieren. Neutralisieren Sie die DNA mit 1 M NH 4 OAc auf Eis und verdünnen Sie dann zweimal. Spot 2 μl der seriell verdünnten genomischen DNA auf einer N + Membran.
  2. Die Membran bei 80 ° C für 30 min auftragen.
  3. Blockieren von unspezifischen Antikörperbindungsstellen durch Einweichen der N + -Membran in 5% BSA in TBS-T für 1 h. Verwenden Sie eine 10 cm Petrischale als ReaktionIonenkammer bei Raumtemperatur.
  4. Nach dem Waschen 5 min dreimal in TBST inkubieren die Membran mit einem Maus-anti-5-Methylcytosin (5-mC) monoklonalen Antikörper (1: 1000) in TBS-T bei 4 ° C über Nacht.
  5. Die Membran für 5 min dreimal in TBS-T waschen und dann mit einem sekundären Antikörper, HRP-konjugiertes Schaf-anti-Maus-Immunglobulin-G (IgG) (1: 5000) in TBS-T für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Die Membran für 5 min dreimal in TBS-T waschen.
  7. Füge das Enzymsubstrat der Membran hinzu und inkubiere für 5-10 min. Visualisieren Sie das sekundäre Antikörpersignal mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

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Representative Results

Chondrozyten wurden in einer Monoschicht bis zur Passage 6 (P6) kultiviert. Chondrozyten zeigten progressive phänotypische Veränderungen mit aufeinanderfolgenden Passagen der Monolayer-Kultur. Die P0-Chondrozyten-Morphologie war rund, während die Zellen stark eingeklemmt und mit aufeinanderfolgenden Passagen bis zu P6 abgeflacht wurden (Abbildung 1 ). Dieser Morphologie-Wandel ist typisch für den Chondrozyten-Dedifferenzierungsprozess. Mittlerweile zeigten die Ergebnisse der Wärmekarte, dass der allgemeine Methylierungsgrad der CpG-Stellen mit verlängerter Subkultur zunahm. Die 5-mC-Punkt-Blot-Analyse zeigte weiter, dass höhere CpG-Methylierungsstufen die Chondrozytenausbreitung begleiteten (Abbildung 2 ). Diese Ergebnisse schlugen eine Assoziation zwischen allgemein erhöhten Methylierungsniveaus und Chondrozyten-Dedifferenzierung vor.

Abbildung 1
Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: 5-mC-spezifischer Dot-Blot-Assay der gDNA von Chondrozyten. Genomische DNA wurde aus Chondrozyten nach variierender Anzahl von Passagen isoliert. Progressiv erhöhte 5-mC-Werte wurden beobachtet. 200 ng, 100 ng, 50 ng und 25 ng gDNA wurden pro Punkt geladen. ( A ) Bild von 5-mC-spezifischem Dot-Blot; ( B ) Punktintensitätsanalyse durch die ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Chondrozyten-Dedifferenzierung in vitro beeinträchtigt das Ergebnis von ACI bei der Behandlung der Knorpeldefektreparatur 11 , 12 . Um das ACI-Ergebnis zu optimieren, ist es entscheidend, die Verwendung von dedifferenzierten Chondrozyten zu vermeiden 13 . Studien haben vorgeschlagen, dass das allgemeine DNA-Methylierungsniveau mit dem Ausmaß der Chondrozyten-Dedifferenzierung 4 , 6 assoziiert ist . Daher ist es unerlässlich, eine zuverlässige und schnelle Methode zu etablieren, um den allgemeinen DNA-Methylierungsstatus der Chondrozyten vor ihrer klinischen Anwendung zu detektieren.

Um allgemeine DNA-Methylierungsniveaus in dedifferenzierten menschlichen Chondrozyten zu detektieren, konnten wir den 5-mC-Spiegel in seriell passierten Chondrozyten messen. 5-mC ist gegen die Desaminierung durch Bisulfitbehandlung resistent. Diese Eigenschaft wurde ausgenutzt, um DNA-Cytosin-Methylierungsmuster unter Verwendung von t zu analysierenEr bisulfit sequenzierung Ansatz 14 . Bisulfit-Genomsequenzierung und Methylierungs-empfindliche Restriktionsverdauung wurden als Gold-Standard-Technologien für den Nachweis der DNA-Methylierung 15 , 16 angesehen. Diese Ansätze können 5-mC mit einer einzigen Basis-Paar-Auflösung identifizieren. Allerdings ist der größte Nachteil der Bisulfit-Sequenzierung der DNA-Abbau während der Bisulfit-Umwandlung. Wenn dieser Ansatz verwendet wurde, um die Chondrozyten-Dedifferenzierung zu beurteilen, würde dies zu einer Verschwendung der propagierten Chondrozyten für ACI führen. HPLC ist eine weitere praktikable Methode zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierungsstufen, ist aber nur für Laboratorien mit HPLC-Geräten geeignet. So macht die Notwendigkeit größerer Probenvolumina oder moderner Geräte diese Ansätze unpraktisch für die routinemäßige 5-mC-Niveauprüfung in typischen klinischen Laboratorien.

Die kommerzielle Verfügbarkeit von 5-mC-Antikörper bietet die Möglichkeit zu erkennenAllgemeine DNA-Methylierungsstufen unter Verwendung eines Dot-Blot-Assays. Im Vergleich zu anderen Blotting-Techniken ist ein 5-mC-Dot-Blot ein einfacheres Verfahren, das weder große Mengen an gDNA noch Elektrophorese erfordert. Darüber hinaus sind die Instrumente in mäßig ausgestatteten Labors erhältlich. Daher sollte die 5-mC-Punkt-Blot-Methode als ein alternativer Ansatz des DNA-Methylierungs-Assays anwendbar sein.

In diesem Bericht haben wir eine Assoziation zwischen höheren 5-mC-Ebenen und Chondrozyten-Dedifferenzierung identifiziert; 5-mC-Stufen mit zunehmender Subkultur-Passage erhöht Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass 5-mC könnte eng in die Dedifferenzierung durch Monolayer Chondrozyten Expansion Bedingungen verursacht beteiligt sein. Wichtig war, dass höhere 5-mC-Werte mit dem Verlust des Chondrozyten-Phänotyps verbunden waren, was eine breite Anwendung von ACI zur Reparatur von Knorpeldefekten verhindert. Daher deuten unsere Studienergebnisse darauf hin, dass 5-mC-Dot-Blotting eine zuverlässige Möglichkeit sein könnte, das Ausmaß zu messenChondrozyten-Dedifferenzierung, insbesondere wenn eine größere Anzahl von Proben und kleinere Mengen von gDNA analysiert werden sollen.

Um Dot-Blot-Methoden auf DNA-Methylierungsanalyse anwenden zu können, ist das wichtigste Thema, das berücksichtigt werden muss, die Qualität der DNA-Probe. Daher ist der kritische Schritt bei der 5-mC-Detektion über Dot-Blot der genomische gDNA-Extraktionsschritt. Wir empfehlen Forschern, einen handelsüblichen gDNA Extraktionskit zu verwenden, um die gDNA Konzentration und Reinheit zu maximieren. Zusätzlich sollte die DNA-Probe auf eine Nylonmembran geladen werden. Ein weiteres wichtiges Thema ist, dass die DNA-Probe immobilisiert und vollständig von der Nylonmembran absorbiert wurde.

Die Technik, die wir hier beschreiben, gibt uns die Möglichkeit, mehrere Assays zu den niedrigsten Kosten durchzuführen. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist seine Abhängigkeit von einfachen und erschwinglichen Geräten, um den Assay durchzuführen und die Ergebnisse zu interpretieren. Auch kann es verwendet werden, um relativ zu vergleichenUnterschiede in globalen Methylierungsniveaus zwischen 2 oder mehr Proben. Dieser Assay kann jedoch nicht für eine genaue Quantifizierung von DNA-Methylierungsniveaus oder zur Bestimmung des CpG-Methylierungsstatus einer spezifischen DNA-Sequenz verwendet werden. Darüber hinaus hat dieses Verfahren eine begrenzte Empfindlichkeit, da der Methylierungsstatus in gDNA-Proben unter 50 ng nicht genau nachgewiesen werden kann. Obwohl diese Methode eine qualitative Analyse der globalen DNA-Methylierung vorsieht, könnte sie zu falsch-positiven Ergebnissen führen, wenn sie nicht ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Zusammenfassend ist der 5-mC-Punkt-Blot eine zuverlässige, einfache und schnelle Methode, um das allgemeine DNA-Methylierungsniveau zu detektieren, um den Chondrozyten-Phänotyp zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Naturwissenschaftliche Stiftung von China (Nr. 81572198, Nr. 81260161, Nr. 81000460); Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Guangdong, China (Nr. 2015A030313772); China Postdoktoranden-Stiftung gefördertes Projekt (Nr. 2013M530385); Die medizinische Forschungsstiftung der Provinz Guangdong, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschafts- und Technologieprojekte (Nr. JCYJ20160301111338144, Nr. JSGG20151030140325149, Nr. JSGG20140519105550503; Nr. GJHZ20130412153906739; Nr. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Gibco Inc. 11965–092 Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS) HyClone Inc. SH30256.01B D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
FBS Gibco Inc. 10099-141
0.25% Trypsin/EDTA Gibco Inc. 25200-056
1% Penicillin-Streptomycin Gibco Inc. 15140-122
Chloroform Mallinckrodt 4440
Isoamyl Alcohol Sigma I-3643
Phenol Gibco BRL 15513-039
Proteinase K Gibco BRL 24568-2
TAE buffer  Bio Whittaker 16-011V
Distilled Water Gibco BRL 15230-170
1 M Tris-HCl Biosharp Inc. BL514A
Tween20 Biotopped Inc. C58H114O26
BSA Proliant Inc. 68700
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hemocytometer ISOLAB Inc. 075.03.001
Falcon 100 mm dish Corning 353003
Centrifuge Tubes TPP AG 91050 Gamma-sterilized
High-speed centrifuge Eppendorf 5804R
ThermoMixer MIULAB MTH-100
Carbon dioxide cell incubator Thermo scientific 3111
Chemi-imaging Analyse System UVITEC Cambridge ALLIANCE

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References

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Jia, Z., Liang, Y., Ma, B., Xu, X., Xiong, J., Duan, L., Wang, D. A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro. J. Vis. Exp. (123), e55565, doi:10.3791/55565 (2017).

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