Summary
Bu yazıda bir PEI / MNP vektörü ve mıknatıslanarak endotel hücrelerine miR verimli, viral olmayan iletimi açıklanır. Bu nedenle, genetik modifikasyon ek olarak, bu yaklaşım, manyetik hücre rehberlik ve MR taranabilirlik sağlar. teknik terapötik hücre ürünleri özelliklerini geliştirmek için de kullanılabilir.
Abstract
Bugüne kadar, kardiyovasküler hastalıklar için mevcut cerrahi ve farmakolojik tedaviler (CVD) sınırlıdır ve genellikle palyatif. Aynı zamanda, gen ve hücre tedavileri CVD tedavisi için son derece ümit verici bir alternatif yaklaşımlardır. Ancak, gen terapisi birçok klinik uygulaması büyük ölçüde uygun gen iletim sistemlerinin eksikliği ile sınırlıdır. Uygun gen dağıtım vektörlerinin gelişimi hücre tedavisi mevcut sorunlara bir çözüm sağlayabilir. Örneğin yaralı organda sınırlı verimlilik ve düşük hücre tutma gibi belirli mevcut dezavantajların, içinde, uygun hücre mühendisliği ile (yani, genetik) transplantasyondan önce üstesinden gelinebilir. Sunulan protokol, bir polietilenimin süperparamanyetik manyetik nanoparçacık (PEI / MNP) tabanlı bir iletim vektörü kullanılarak endotel hücreleri, verimli ve güvenli geçici modifikasyonu da tarif edilmektedir. Ayrıca, algoritma ve hücre karakterizasyonu için yöntemler tarif edilmiştir. başarılı intracellumikroRNA, insan göbek damarı endotel hücrelerine (MIR) (HUVECler) ve lar dağıtım hücre canlılığı, fonksiyonu veya hücreler arası iletişim etkilemeden elde edilmiştir. Üstelik bu yaklaşım tanıtıldı eksojen miR güçlü fonksiyonel etkiye neden olduğu kanıtlandı. Önemli olarak, bu MNP-esaslı vektörün uygulaması manyetik hedefleme ve invazif olmayan MR izleme olanaklarını eşlik ile hücre mıknatıslanma sağlamaktadır. Bu MR ile non-invazif olarak izlenebilir manyetik destekli, genetik olarak işlenmiş hücre terapötik bir temel teşkil edebilir.
Introduction
Gen ve hücre terapisi CVD tedavisinde güncel zorlukları çözmek için potansiyele sahip güçlü araçlardır. Bu yaklaşımların her ikisi halen klinik deneylerle test ediliyor olmasına rağmen, henüz geniş klinik uygulamada 1 için hazır değildir. Özellikle, gen ve hücre tedavisi güçlüğün üstesinden gelmek için, ortak bir yaklaşımı, klinik uygulama için uygun olan çok işlevli bir gen iletim vektörleri geliştirmektir. Güvenli ve verimli gen aktarım sistemlerinin eksikliği gen terapisinin önemli konudur. Aynı zamanda, hücresel ürünlerin genetik mühendisliği gibi düşük verim (örneğin, kalp alanında, fonksiyonel iyileşme sadece yaklaşık% 5 elde edilir sonrası kök hücre nakli 1 gibi hücre tedavisinin ciddi zorluklar üstesinden naklinden önce saat po dakika içinde% 10 -) ve zayıf tutma / yaralanma yerinde melezleme (yani, hücre tutma altında 5 damlaSt-uygulama, uygulama yolundan bağımsız 2, 3, 4).
Bugüne kadar, viral vektörler, büyük ölçüde klinik çalışmalarda daha geniş bir uygulama ile sonuçlanmıştır verimlilik açısından viral olmayan sistemler (~% 67) 5 üzerindedir. Ancak, viral araçlar taşınan genetik malzeme 6'nın boyutu ciddi (şiddetli komplikasyonlara ve sonraki enflamatuar tepki,) bu tür immünojenisite gibi riskler, onkojeniklik ve sınırlamaları taşırlar. Bu güvenlik kaygıları ve viral vektör üretiminin yüksek maliyetler nedeniyle, viral olmayan sistemlerin kullanımı bazı durumlarda 7, 8 tercih edilir. Bu, örneğin (CVD tedavisi için, örneğin,) anjiyogenezi kontrol büyüme faktörünün ekspresyonu gibi geçici genetik düzeltme gerektiren bozuklukların veya delive için özellikle uygunduraşıların ry.
Grubumuz, bir iletim sistemi dallı bir 25-kDa 'lık polietilenimin (PEI) ve biyotin-streptavidin interaksiyonundan 9 ile birbirine bağlanmış süperparamanyetik demir oksit nano-tanecikleri (MNT) birleştirilmesi ile tasarlanmıştır. Bu vektör, transplantasyondan önce bunların eşzamanlı olarak manyetizasyon sağlayan hücrelerin genetik mühendisliği için potansiyel bir araçtır. İkincisi, gelişmiş manyetik hedefleme teknikleri başarıyla 10 geliştirilmektedir olarak, günümüzde özellikle umut vericidir manyetik rehberlik / birikmesiyle bağlantılı bir temel oluşturur. Dahası, ortaya çıkan manyetik tepkili hücreler olma potansiyeline sahip olmayan invaziv manyetik rezonans görüntüleme (MRI) veya manyetik parçacık görüntüleme 11, 12 ile izlenebilir.
PEI / MNP vektörü durumunda, poliamin düşürücü etken nükleik asit yoğunlaşmasını ve böylece koruma sağlar s, hücrelerde vektör içselleştirme ve endozomal 5 kaçmak. MNPS manyetik yönlendirme açısından değil, aynı zamanda bilinen PEI toksisite 7, 13, 14 azaltarak, sadece, PEI özelliklerini tamamlar. Daha önce, PEI / MNP vektör özellikleri fibroblastlar ve mezenkimal kök hücreleri 15, 16 kullanılarak temin verimi (yani, pDNA ve miRNA) ve güvenlik açısından ayarlandı.
Bu yazıda, miRNA modifiye edilmiş hücrelerin üretilmesi için PEI / MNPS uygulanması hakkında detaylı bir protokol 17 tarif edilmiştir. Bu amaçla, HUVECler kullanılmış ve in vitro olarak anjiyojenez için kurulmuş bir modelini temsil eder. Onlar transfect zorlu ve toksik etkisi 18, 19 duyarlıdıreşek = "xref"> 20. Buna ek olarak, bunların hedefleme, hücreler arası iletişim, ve MR tespiti de dahil olmak üzere, in vitro olarak bu tür hücreleri, değerlendirmek için bir algoritma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hücre izolasyonu için İnsan göbek bağları Helsinki Bildirgesi uyarınca araştırma için bu malzemenin kullanımına yazılı onay verdi bilgilendirilmiş, sağlıklı kadınlardan doğum sonrası elde edildi. Rostock Üniversitesi etik komitesi sunulan çalışma (Reg. No. A 2011 06, uzamış 23 Eylül 2013) onayladı.
Transfeksiyon Komplekslerinin hazırlanması 1.
- polietilenimin biyotinlenmesi (PEI).
- 300 manyetik karıştırma altında, aşırı saf su içinde PEI dallanmış çözülür -, oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca 400 rpm'de ve 0.18-mM çözelti elde etmek için ışıktan korunması. 4 ° C'de çözelti saklayın.
- Elde edilen çözelti 21, 22 primer amino gruplarının konsantrasyonu ölçülür.
- Pr 100 uL karıştırılarak amin belirleme tepkime maddesi 23 olarak% 2 ninhidrin madde çözeltisini kullanarakediluted örneği (1: saf su ile 200) ve ninhidrin reaktifi 75 uL. 80 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir. soğumasını ve stabilizasyon için% 50 etanol içinde 100 uL ilave edin. absorpsiyon spektrofotometresi üzerinde 550 nm'de absorbansı ölçülür.
- glisin kullanılarak, standart bir eğri oluşturur.
- 1, 1: 0.1 M amino-N- stok çözeltisi ve seyreltileri (100 ml deiyonize su içinde glisin, 0.75 g), 1 Hazırlama 5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 100, 1: 200 ve 1: 400, 1: 600 arasındadır. Adım 1.1.2.1 olarak, bu çözüm ölçün ve eksen üzerinde konsantrasyon ve absorbans bir arsa oluşturun.
- Elde edilen arsa ve PEI solüsyonu ölçülen absorbansa göre, PEI α-amino gruplarının konsantrasyonu tanımlar.
NOT: Dikkat. Ninhidrin reaktifi çözeltisi özel olarak başlık altında kullanılmalıdır ve bir azot atmosferi altında muhafaza edilmelidir. Çözeltinin rengi, oksidasyon nedeniyle değişiklikleri zaman kullanılamaz.
- 0,01 mm'lik çözelti elde etmek için kullanımdan hemen önce, aşırı saf su içinde biyotin bağlayıcı 100 mg çözülür. biyotinlenmesi reaktifi (mol olarak) gerekli miktarda elde etmek üzere 20 ile (aşama 1.1.2 ölçülen) PEI α-amino gruplarının konsantrasyonu çarparak PEI eklemek biotin gerekli miktarını hesaplayın.
- pH 8-9 PEI solüsyonuna biyotin çözeltisi ilave edin ve oda sıcaklığında manyetik karıştırma altında, 16 saat süre ile inkübe edilir.
- Boyut dışlama kromatografisi 23 ile reaksiyona girmeyen biotin çıkarın. 25-kDA PEI saflaştırılması için bir jel filtrasyon ortamı, uygunsa ihtiva eden ticari olarak temin edilebilir sütunları kullanma ve imalatçının talimatları takip edin. bir amin saptama reaktif maddesi (aşama 1.1.2) kullanılarak bir amin konsantrasyonunun ölçülmesi için ve biyotin konjügasyon verimliliği (aşama 1.2.2) belirlemek üzere saflaştırma sonrasında alikotları al. 4 ° C 'de elde edilen biyotinile PEI saklayın.
- KarakterBiyotinlenmiş PEI leştirilmesi.
- Adım 1.1.2 de tarif edildiği gibi, biyotinilasyon sonra PEI α-amino gruplarının konsantrasyonunun belirlenmesi.
- konjugasyon prosedürü doğrulamak için PEI biyotinilasyon derecesini belirler. Ölçümü için, biyotinilasyon seviyeleri 24, 25 doğru kolorimetrik analizler elde etmek, HABA boya (4'-hydroxyazobenzene-2-karboksilik asit) uygulanmasına dayanan bir ticari olarak temin edilebilen bir kit, kullanın. Üretici tarafından verilen talimatları uygulayın.
- MNPS ve karakterizasyonu Filtrasyon.
- Daha büyük zehirli agrega hariç tutulması amacıyla, 0.45 um'lik bir şırınga-veren filtre 16, ticari olarak mevcut streptavidin kaplı MNP filtre. Standart bir fotometrik analizi 26 ile son demir konsantrasyonu ölçümü.
- kayıt ile süzüldü MNPS kalitesini incelerStandart protokollere 27, 28 uygun olarak manyetizasyon eğrisi ve TEM görüntüleme ile.
- damıtılmış su ile MNT süspansiyon seyreltilir ve TEM analizi için bir 300 ağ örgülü Formvar karbon kaplı bakır ızgara üzerine elde edilen süspansiyonun 3 uL yerleştirin. Daha sonra, bir ısıtma plakası üzerinde bir cam lam üzerine bu tabloyu yerleştirin ve kurumaya bırakın.
- 120 kV bir transmisyon elektron mikroskobu ile örnek analiz eder ve bir X-ışını detektörü 27 ile element içeriği doğrulamak.
- süper çözünürlük mikroskopi için transfeksiyon komplekslerinden 3-renkli işaretleme.
- Üreticinin talimatlarını takip NHS-Ester Atto 488 boya ile PEI ölçülen birincil amino gruplarının% 0.5 etiketleyin. (Adım 1.1.4) yukarıda tarif edildiği gibi, boyut-dışlama kromatografisi ile yıkanarak bağlanmamış boya çıkarın. bir ninhidrin assa kullanılarak amino gruplarının elde edilen konsantrasyon ölçümüy (aşama 1.1.2).
- Cyanine5 boyası (Malzeme Listesi gösterilir), uygun bir etiketleme kiti 15 kullanılarak ticari olarak temin edilebilen karıştırılmış miR (SCR-miR) etiketleyin. spektrofotometrik olarak elde edilen fluorofor miR konsantrasyonu ölçümü.
- Taze bir 1 de MNP biyotin konjuge edilmiş boya (örneğin, atto 565-biyotin) ile her etiket: 1000 oranında ağırlık / ağırlık. Doğrudan Delyangina et al detayları başına transfeksiyon komplekslerinin oluşumu sırasında miR / PEI MNP ekledikten sonra boya uygulanır. 16.
2. Hücre Hazırlanması
- HUVEC izolasyon.
- şirketinden kordon damar içinden kolajenaz sindirimi kullanılarak kordonlar elde edildikten sonra, göbek kordonları hücreleri izole; Önceden geliştirilen protokol 29 izleyin.
- t yüklenen - 60 birim / tampon içinde kolajenaz tip IV çözeltiden her kordon ~ inkübeO umbilikal ven - 13 dakika boyunca 37 ° C'de karıştırıldı.
- Bütün deneyler için, 5 hastada minimum HUVEC'Ier havuz.
NOT: Yetiştirme 4-5 pasajlar geçmemelidir. Bu transfeksiyon verimliliği azalmaya neden olduğundan, mikoplazma ile kontamine hücreleri kullanmayın. Mycoplasma kirlenme mikoplazmaların son derece hassas olarak saptanması için bir PCR kiti kullanılarak protokolü başlamadan önce test edilmelidir.- mikoplazma varlığı için test edin.
- 10 dakika (13.000 x g), hücre kültürü yüzer tabakası, Santrifüj 1 ml. 3 dakika için 17 dH 2 O uL kaynatın (93 ° C) pelet süspanse edin. DNA bölümünün yükseltilmesi için süspansiyon 2 uL kullanarak çeşitli mikoplazma türlerinin yüksek düzeyde korunmuş ribozomal RNA (16S-rRNA) kodlar.
- PCR, her bir primer, 10 pmol kullanarak gerçekleştirmek (ileri primer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; ters primer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') tarakaşağıdaki koşullar altında ticari bir PCR kitiyle terminasyonundan: 3 dakika için 94 ° C; 30 s, 30 s için 50 ° C ve 30 sn için 72 ° C ile 94 ° C arasında 45 döngü; ve 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma.
- agaroz jel elektroforezi kullanılarak PCR ürünü (292 bp), Analiz.
- mikoplazma varlığı için test edin.
- Ya% 5 CO2 içeren bir humidi fi ye bir atmosferde 37 ° C'de 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş endotel büyüme ortamında elde edilen hücreler sıvı azot ya da kültür bunları uzun süreli saklayın.
- şirketinden kordon damar içinden kolajenaz sindirimi kullanılarak kordonlar elde edildikten sonra, göbek kordonları hücreleri izole; Önceden geliştirilen protokol 29 izleyin.
- HUVEC karakterizasyonu.
- , 3 standart protokollere 30 Aşağıdaki taban membran matrisi tüpler (örneğin, Matrigel) oluşturmak için fonksiyonel kapasite ve endotelyal işaretleyici CD31 eksprese etmeleriyle (trombosit endotel hücre adhezyon molekülü, PECAM-1) cinsinden izole edilmiş HUVECler karakterize1.
3. Transfeksiyon
- stok HUVEC kültürü (adım 4.1.2 bakın.) Trypsinize ve elle hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. % 70-80 birleşme elde edilene kadar yaklaşık 13,000 hücre büyüme yüzeyinin / cm2, 48 saat önce, transfeksiyondan bir başlangıç hücre yoğunluğuyla, uygun büyüklükte plastik hücre kültürü yuvalı plakalar üzerinde HUVECler tohum.
- Hazırlama taze mıR / PEI / MNP her kompleksleri.
Not: İlk olarak, mıR / PEI kompleksleri elde edilmelidir (adımlar 3.2.1 - 3.2.3); daha sonra, MNPS transfeksiyon (aşama 3.3) için kullanılan nihai mıR / PEI / MNP formülasyonu elde etmek için miR / PEI solüsyonuna (aşama 3.2.4) eklenmelidir.- Uygun ticari olarak temin edilebilen miR miktarını hesaplayın üretici tarafından sağlanan stok konsantrasyonu kullanılarak (etiketli veya fonksiyonel, karıştırılmış, adım 4). Hücre büyümesi yüzeyinin miR / cm2 2.5 pmol kullanın. O% 5 glikoz çözeltisi içinde miR seyreltinmıR / uL 0.125 pmol bir son konsantrasyona btain.
- Adım 3.2.1 miR miktarı ve 25 32 optimal NP oranına göre, bunun ölçülen konsantrasyon (aşama 1.1.2) kullanılarak PEI miktarını hesaplamak. % 5 glukoz çözeltisi eşit hacimde PEI (hesaplanan gerekli hacim başına) seyreltin. (Adım 3.2.1 den) miR çözeltisine elde edilen ön-inceltilmiş PEI ilave edin ve 30 s için elde edilen karışımın vorteks.
- Oda sıcaklığında 30 dakika için elde edilen mıR / PEI karışımı inkübe edin.
- Oda sıcaklığında sonike su banyosuna (Malzeme Listesi bakınız) en az 20 dakika 35 kHz'de MNPS sonikasyon mıR / PEI MNT çözeltisinin uygun miktarda (5 - Elde edilen mıR / PEI demir 25 ug / ml / MNP karışım 16), 30 saniye boyunca girdap ve hazır olana kadar, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- hücreler kültür ortamına doğrudan hazırlanabilir mıR / PEI / MNP karışımı damla damla ekleyin. Hücre cul böylece elde edilenmıR / PEI / MNP ile Ture orta transfeksiyon çözelti olarak glükoz içinde seyreltilir. Taze kültür ortamı 6 saat sonra, transfeksiyon bu karışım değiştirin.
Vektör Güvenliği 4. analizi
- Hücre canlılığı incelenmesi.
- (3.1 ve 3.2 adımları) HUVECler, 24 oyuklu bir kültür plakasına ekildi transfekte; Test sondalar olarak Cy3 miR kullanımı ve akış sitometrisi için kontrol yolluk sondalar olarak miR (SCR-miR) karıştırılmış. 24 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir humidi fi ye atmosferde 37 ° C'de inkübe edilir.
- Süpernatant ve PBS ile 37 ° C'de 4 dakika boyunca, hücrelere ilave içerisinde seyreltilmiş 1 x tripsin-EDTA kullanılarak tripsinizasyon ile transfekte edilmiş hücreler toplanır. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve analiz için kullanılır.
- 24 saat sonra birleştirme oturma / ölü hücreler arasında ayrım için ticari olarak mevcut bir leke uygulayarak akış sitometrisi kullanılarak sonra hücre canlılığı ve miR emilme verimi incelemek; kullanımı standart protokoller 15
- fonksiyonel deneylerde hücreler için miR / PEI / MNP komplekslerinin güvenlik inceleyin.
- Transfekte edilmiş hücrelerin proliferasyon aktivitesini değerlendirir.
- Transfekte HUVEC'ler fonksiyonel antisens miR (örneğin, HUVECler 31, anti-miR92a) ile 12-çukurlu bir kültür plakasına (3.1 ve 3.2 adım) ekilir ve 24 saat boyunca% 5 CO2 ihtiva eden bir humidi fi ye bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin.
- lazer tabanlı konfokal mikroskobu ile edu (5-etinil-2'-deoksiüridin) ve tarama ile boyanarak çoğalan hücrelerin sayısını tanımlamak için ticari olarak mevcut bir kit kullanın. Aşağıdaki mikroskopi ayarları kullanın: yağa batırarak ile 40X objektif; (A 647 nm boya için) 633 nm uyarım lazer; 5 rastgele alanları her bir numunede kaydedilecek. (Toplam çekirdek sayısına göre edu lekeli çekirdeklere sayısına bölünmesiyle Hoech çoğalan hücrelerin oranını hesaplamak) St-boyandı.
- Daha önce 17, 31 tarif edilen şekilde, boru benzeri yapılar oluşturmak için transfekte edilmiş hücrelerin yeteneğinin değerlendirilmesi.
- Scr-miR ile (3.1 ve 3.2 adımları) HUVECler, 24 oyuklu bir kültür plakasına tohumlanmış transfekte ve% 5 CO2 içeren bir humidi fi ye bir atmosferde 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edilir. (Adım 4.1.1 gibi) transfekte edilmiş hücreler toplanır.
- Tohum taban membran matrisi 140 uL ile kaplanmış 24 oyuklu plakalar içinde tadil edilmiş HUVEC 3.5 x 10 4. % 5 CO2 içeren bir humidi fi ye bir atmosferde 37 ° C'de 18 saat boyunca inkübe edilir.
- Tutanak Her kuyu kullanılarak lazer taramalı eş odaklı mikroskopi 10 rastgele alanların görüntüleri (diferansiyel girişim kontrast) ve "Anjiyogenez Analyzer" eklentisi ile ImageJ yazılımı kullanılarak analiz. dalların toplam uzunluğunun, dal sayısına ve juncti sayısı gibi parametreleri dahildeğerlendirmesinde ons. Tedavi edilmemiş kontrol ile karşılaştırın.
- Transfekte edilmiş hücrelerin proliferasyon aktivitesini değerlendirir.
- Boşluk bileşke (GJ) üzerinde transfeksiyon komplekslerinden olası toksik etkisini incelemek 3D (sıkı bağlamak) 33 ışıkla ağartma sonra 3D floresan kurtarma test ederek hücre içi iletişim (GJIC) etkin olduğu bulunmuştur.
- canlı hücre görüntüleme (yağ daldırma) için uygun olan bir ince dipli jelatin kaplı cam lam üzerine hücreleri tohum. etiketli olmayan, işlevsel olmayan miR (SCR-miR) ile adım 3.2 de tarif edildiği gibi hücreler transfekte edildi ve 24 saat süreyle inkübe edin.
- mikroskobu önce doğrudan Kalsein onları yükleyerek görüntüleme için hücrelerin hazırlayın. Özel olarak, 20 dakika boyunca inkübe edin, 5 uM kalsein ihtiva eden taze ortam ile kültür ortamı yerine PBS ile yıkayın ve taze kültür ortamı ilave edin. 37 ° C'ye mikroskop kuluçka öncesi sıcak ve% 5 CO2 konsantrasyonunu ayarlamak.
NOT: Tüm reaktifler hücre Contrac önlemek için sıcak olmalıdırölçümden önce tion. - Hücre görselleştirme ve sıkı bağlamak deney için 561-nm uyarma lazer kullanın. Birincisi, elle ilgi bölgelerinde (YG) olarak ölçümü için hücreleri seçin; Test hücreleri en az 3, komşu hücreler olması gerekir. Ağartılmış olmayacak parlak, sabit floresan ile bir referans hücresi tanımlar. z-yığını sınırlarını tanımlar. 15 katmanları - 10 dahil etmek için alt şekilde hücrelerin floresans kaydedin.
- % 100 lazer gücü kullanarak test hücrelerinin ağartıcı ve takip eden 15 dakika boyunca (nedeniyle, komşu hücrelerden GJ özgü boya transferi) daha sonra floresan kurtarma kaydedin. Z yığınlarının her 60 s ham verileri kaydeder. deney başına 10 test hücrelerinin - Toplam olarak, en az 5 ile sıkı bağlamak ölçümleri gerçekleştirmek. untransfected hücrelere sonuçları karşılaştırın.
Transfeksiyon Etkinliğinin 5. Test
- miR alımının incelenmesi.
- ste tarif edildiği gibi problar hazırlanmasıs 4.1 ve akış sitometrisi ile miR alımını belirlemek için aynı anda kullanımı.
- Onay ve konfokal ve superresolution yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) ile transfeksiyon komplekslerinden intraselüler lokalizasyonunu tarif etmektedir.
- (Adım 3.1) daha önce tarif edildiği gibi, 24 oyuklu kültür plakaları içindeki yuvalara yerleştirilmiştir jelatin kaplı cam lameller üzerinde HUVECler tohum. MıR / PEI / MNP (adım 1.4) etiketli 3-renkli hücreleri transfekte ve% 5 CO2 içeren bir humidi fi ye bir atmosferde 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilir.
- Sadece PBS ile daha sonra fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) ile ilk lamelleri yıkayın. Standart protokollere 16 Aşağıdaki DAPI ile 15 dakika ve leke çekirdeği için 37 ° C 'de% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde inkübe edilmesi hücreleri saptamak. Fazla boya kaldırmak için çalkalayıcı üzerinde (her biri 15 dakika) 3 kez yıkanır.
NOT: PFA kanserojen ve dikkatli ele alınması gerekir. - pr yerleştirinAşağıda tarif edildiği gibi mikroskop epared lamelleri, en az 1 saat boyunca kurumaya bırakın ve mikroskopi için kullanmak, uygun bir montaj ortamı kullanılarak slaytlar.
- 63X immersiyon yağı hedefi kullanarak görüntü ve aşağıdaki SIM ayarlarını Edinme: uyarma için 405-, 488-, 561- ve 633-nm lazer çizgileri; 4 ortalama ile 5 açıları, 5 aşamasında bir 32-bit derinliği, z-yığın modunda; Bir 633 ile G2 405 lazer çizgi ile ızgara, bir 488 ile G3, bir 561 G4 ve G5.
- muamele edilmemiş hayvanlara nisbetle mıR / PEI / MNP-HUVECler RT-qPCR teslim miR işlevselliğini değerlendirir.
- HUVEC'ler fonksiyonel antisens miR ile 12 oyuklu kültür plakası adımları (3.1 ve 3.2) (örneğin, HUVECler 31, anti-miR92a) tohumlanmıştır transfekte ve% 5 CO2 içeren bir humidi fi ye bir atmosferde 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edilir.
- (Materyalleri bakınız) ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, RT-qPCR anti-miR92a teslimat ve işleme değerlendirmek; t izleyino üreticinin talimatları, başka yerde 17, 31 açıklandığı gibi. Buna paralel olarak, hedef genin ekspresyonunu incelemek (örneğin, ITGA5 31).
NOT: miR fiili sonucu değil, sadece onun hücre içi birikimi ölçümünü sağlamaktadır beri endojen miR karşı AntagomiR teslim taklitlerinin tercih edilir.
Değerlendirme ve Manyetik Hücre Ayırma Hedefleme 6. Hücre
- In vitro statik koşullarda hedefleme Hücre.
- 24 kuyucuklu bir plakanın (2.5 pmol / cm2 scr-miR NP 25 ve 15-25 ug / mL MNP), 24 saat süre ile inkübe yıkayın (aşama 4), yukarıda tarif edildiği gibi toplama veren HUVEC transfekte.
- de taze kültür ortamının 1 mL, 1 elde edilen hücre topağı karıştırın ve 12 gözlü bir levhanın gözleri içine yerleştirin. bant ile alt plaka lokal (tarafında) küçük bir mıknatıs sabitleyin.
- 24 saat hücre süspansiyonu inkübe ve bir mıknatıs olmadan mıknatıs üzerinde ve bölgede alanda hücre eki ve büyüme gözlemledik. niteliksel değerlendirme için, geleneksel bir ters mikroskop kullanılır.
- In vitro simule edilmiş dinamik koşullarda hedefleme Celi.
- Adım 3.1 ve 3.2 ortalama 24 oyuklu bir plaka içerisinde HUVECler transfekte (2.5 pmol / cm2 Cy3 miR NP 25 ve 15-25 ug / mL MNP), 24 saat süre ile inkübe yıkayın ve kullanılarak tripsinizasyon ile toplamak 1x PBS içinde seyreltilmiş Tripsin-EDTA, 37 ° C'de 4 dakika için hücrelere ilave edildi. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- de taze kültür ortamının 1 mL, 1 elde edilen hücre topağı karıştırın ve 12-çukurlu bir plaka oyuğuna yerleştirmek. bant kullanarak (bir kuyunun tarafında) lokal olarak küçük bir mıknatıs sabitleyin. Çalkalayıcı üzerinde kültür plakası yerleştirin ve dinamik koşullar 34 taklit etmek için 150 rpm'de 12 saat boyunca hücre süspansiyonu inkübe edin.
- hücre yıkayın ve düzeltmekbunları% 4 PFA kullanılmıştır. DAPI 16 çekirdekleri leke. Bir 514-nm eksitasyon lazerle lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak hücre eki kaydedin z yığın modunda (5-12 dilim) analiz için görüntüler oluşturmak için ham veriler, ve maksimum yoğunluk görüntü işleme elde edilir.
- manyetik duyarlı ve duyarlı olmayan hücrelerin nicel analizi.
- 24 oyuklu bir plaka içerisinde HUVECler transfekte (2.5 pmol / cm2 scr-miR NP 25 ve 15-25 ug / mL MNP), 24 saat süre ile inkübe yıkama, ve daha önce tarif edildiği gibi toplama (aşama 6.2.1) . Pre-sıcak PBS ve hücre ayırma tamponu, 37 ° C'ye kadar (filtrasyon ile sterilize Malzeme listesi). hücre sıralama tampon 500 uL de her birinden elde edilen hücre topağı yeniden askıya.
- mıknatıs üzerinde taze hücre ayırma tamponu ile 3 kez sütun yıkama verilen mıknatıs tarafından belirlenen bir manyetik ayırma sütununa bu hücre süspansiyonunu ve akış yoluyla MAGNETI olarak toplamakcally yanıt vermeyen fraksiyon (mıknatıslarıyla).
- mıknatıs sütun çıkarın ve hemen bir pompa kullanılarak sütun aracılığıyla taze hücre ayırma tamponu iterek manyetik tepki veren hücre fraksiyonu (Mag +) toplar.
- 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin mıknatıslarıyla ve Mag + her iki. PBS içinde hücre pelletini askıya Re hücrelerin sayısı ve Trypan mavisi eksklüzyon tahlili 35 hücre canlılığını değerlendirir. Elde edilen hücre topağı, ya uzun dönem analizi için kullanılır (diğer bir deyişle, yeniden tohumu ve 24, 48, ve 72 kültür 17 saat değerlendirmek) veya doğrudan akış sitometrisi için (adım 4.1)..
- Transfekte edilmiş hücrelerin demir yükleme tanımlar.
Not: hazırlanması sırasında, demir oksit malzemeler ve araçlar ile hücre olan sondaların herhangi birinin teması önlenmelidir.- transfekt edilmiş HuVEClerde (aşama 4.1.1 gibi) transfekte edilmemiş kontrol toplayın. PBS 36 b% 2 BSA içinde iki kez toplanan hücreleri yıkayın Y dikkatlice yıkama tamponu 1 mL hücreleri karıştırılması ve daha sonra 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj-lendi. PBS 250 uL 'de elde edilen hücre topağı yeniden askıya% 4 PFA 100 uL ekleyin ve 20 dakika hücrelerin tespit edilmeleri için inkübe edilir. Yukarıda tarif edildiği gibi, 3 kez PBS ile yıkayın.
- PBS 110 uL ile sonuçlanan sabit bir hücre pelletini yeniden askıya ve 100 uL PCR tüplerine transfer.
- Hücre sayımı için 10 uL'lik almak ve manyetik parçacık spektroskopisi (MPS) kalan örnek kullanın.
- Bir ticari olarak temin edilebilen MPS cihazının ölçüm yapın. Ölçüm sırasında, aşağıdaki ayarları uygulayın: manyetik alan B sürücü = 25 mT ve frekans f 0 = 25 kHz. Numunelerin demir ölçümü için, 2.1 ug, bilinen bir demir miktarı ile bir MNP referans örnek bir 3 karşılık gelen, ref MPS tayfının üçüncü harmonik bir 3 normalizexref "> 37. kontroller olarak işlenmemiş hücreleri kullanın.
7. Tanımlama MRG Algılama Sınırları
- Hücre hazırlanması.
- 6 yuvalı bir plaka ve transfekte Tohum HUVECler (2.5 pmol / cm2 scr-miR NP 25 ve 15-25 ug / mL MNP) (fantom hazırlanması için) hücre gerekli miktarda uygun olarak yinelenen veya üç kopya halinde. 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır ve yıkama, toplama ve (aşama 4) daha önce tarif edildiği gibi,% 4 PFA ile çözün.
- Uygun hücre sayıları (örneğin, 10 3, 10 4, 10 5, vs.) alikotları hazırlamak, elde edilen hücrelerin sayısı ve 50 uL hacmini ayarlamak.
- Agaroz fantom hazırlığı
- Tabakalar 38 arasına yerleştirilmiş, transfekte edilmiş hücrelerin farklı miktarları ile 50 ml tüpler içinde% 2 agaroz birkaç kat hazırlayın. Hazırlık, sonikasyon ve santrifüj sıcak agaroz 38 boyuncaeserler neden hava kabarcıklarını yok edin.
Not: Önemli olarak, manyetik olmayan bir miR / PEI kompleksleri ile muamele edilmiş 5.5 x 10 5 HUVECler içeren hayalet aynı şekilde hazırlanmalıdır kontrol olarak hizmet vermektedir.
- Tabakalar 38 arasına yerleştirilmiş, transfekte edilmiş hücrelerin farklı miktarları ile 50 ml tüpler içinde% 2 agaroz birkaç kat hazırlayın. Hazırlık, sonikasyon ve santrifüj sıcak agaroz 38 boyuncaeserler neden hava kabarcıklarını yok edin.
- Bobinde merkezi hayalet yerleştirdikten sonra 7.1 T hayvan, MRI sistemi ile in vitro fantom elde Tarama, manyetik alanın, z-eksenine paralel uzanmaktadır.
- Bir gradient-eko sekanslarının elde edilmesi için aşağıdaki dizi parametre uygulanır: TR = 66 ms; TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 5 / TE = 1.44 6 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01 ms; çevirme açısı = 3 °; Matris = 256 x 256 interpolasyon 128 x 128; görünüşüdür = 42 mm alanı; 100%; ortalama = 1, eko tren uzunluğu = 1 'dir; dilim kalınlığı = 1,5 mm; ve 16 dilimleri.
- Başka bir yerde 39 tarif edildiği gibi, uygun bir yazılım kullanılarak (R2 *, = 1 / T2 *) dört eko süresi sinyal çürüme değerlendirilmesi ve R2 *, haritalar hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önerilen protokolün amacı, manyetik açıdan karşılık miR-modifiye edilmiş hücreler üretmek için ve doğru olarak nitelendirilebilir (Şekil 1) yapmaktır. Sonuç olarak, MRI ile manyetik seçimi ve rehberlik duyarlı ve saptanabilir verimli transfekte hücreler, elde edilmelidir.
İlk olarak, izole edilmiş HUVEC kimlikleri endotelyal işaretleyici CD31 ile tipik boyama (PECAM) (Şekil 2A) ve uygun taban membran matrisi (Şekil 2B) üzerindeki tüpler oluşturmak kabiliyetleri ile doğrulanmıştır. Elde edilen hücreler, mıR çok verimli bir şekilde PEI / MNP tarafından ortaya atılmıştır mikroskopisi hücreleri etiketlendi miR (Cy3) 24 saat post-transfeksiyon (Şekil 3A) bir sinyal için pozitif olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, herhangi bir hücre ölümü, tedavi edilmemiş hücrelere (Şekil 3B) ile karşılaştırıldığında kaydedildi ve normal görünümü (Şekil 3A) muhafaza edilmiştir. odaklı lazer tarama mikroskobu ile gözlendiği gibi, Cy3 miR sinyal esas olarak hücrelerin içinde bulunamamıştır. Ayrıca, transfeksiyon vektörü ve miR tüm parçalarının hücre içi lokalizasyonu daha ayrıntılı bir inceleme daha yüksek çözünürlük 3-renkli işaretlenmiş kompleksleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. SİM, mıR PEI ve MNP sinyalleri tüm perinükleer bölgede bulundu (Şekil 3C) sitoplazmada tespit edilmiştir.
Ayrıca, transfeksiyon vektörü güvenlik ayrıntılı olarak incelendiğinde miR / PEI / MNP-HUVECler (Şekil 4A elde edilen ağ, bir pozitif kontrol olarak kullanılan işlem görmemiş hücrelerin karşılaştırılabilir uygun taban membran matrisi ve bu tüpler oluşturabilirler olduğu kanıtlanmıştır ). 3D-sıkı bağlamak deneyleri ortaya Dahası, transfekte edilmiş hücreler, GJIC muhafaza. Özel olarak, hücreler, floresan GJ-PERMEA ile yüklenirble boya ve bunlardan biri ağartılmıştır, kendi flüoresans nedeniyle komşu hücrelerle iletişim ve elde edilen boya transferi (Şekil 4B) kurtarır.
Önemli bir şekilde, süperparamanyetik bileşik 40 (Şekil 5A) varlığına bağlı olarak, PEI / MNP uygulaması, sadece hücre transfeksiyonu, aynı zamanda eş zamanlı olarak manyetizasyon sağlar. Hücre içi demir elde edilen miktarı, uygun bir aralık içinde uygulanmış MNP konsantrasyonları için MPS (Şekil 5B) kullanılarak ölçülmüştür (2.5 pmol / cm2 miR; NP 25 5-25 ug / mL MNP ile tamamlanabilir): 0.37 ± 0.079, 0.7 ± için 0.150 pg demir / hücre 17. Manyetik ayırma sütununun kullanılması gösterildiği gibi, bütün bu MNP konsantrasyonları için, transfekte edilmiş hücrelerin toplam hacimde manyetik cevap veren hücrelerin miktarı% 70 (Şekil 5C) ~ olmalıdır. Buna ek olarak, H, transfekteUVECs fare doku duyarlılığını taklit in vitro agaroz fantom içinde MR (Şekil 5D) ile görebilir. Bundan başka, in vitro olarak taklit dinamik koşullarda transfekte HUVEC manyetik hedefleme verimli (Şekil 6) olduğu kanıtlanmıştır. Bu deney düzeneğinde, kültür ortamının bile sürekli dinç hareketi mıknatıs uygulaması yakınındaki alanda hücre büyümesini hakim engelleyemedi.
Şekil 1. Mıknatıslanmış miR-modifiye edilmiş HUVEC ve analiz imalatı şematik gösterimi. PEI / MNP (polietilenimin / süperparamanyetik nanopartikül bazlı vektör), insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) için mikroRNA'yı (MIR) sunmak için uygulanır. Elde edilen hücre ürün aşağıdaki parametreler ile karakterize edilir: Güvenlik (dahil olmak üzere hücre canlılığı, fonksiyonelSığ, ve hücreler arası iletişim için kapasite); transfeksiyon etkinliği (yani, mıR alımı verimi ve daha sonra işlevi); Statik ve simüle dinamik koşullarda vitro hedef manyetik; Manyetik rezonans görüntüleme (MRI) taraması. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
İzole HUVEC 2. karakterizasyonu Şekil. Endotel CD31 işaretleyici ile boyanmış izole edilen ve kültürlenen HUVEC A. Örnek görüntüsü. çekirdekleri DAPI (mavi) ile ters. ölçek çubuğu 20 um'dir. İzole edilmiş HUVEC üzerinde gerçekleştirilen tüp formasyonu deneyi B. Örnek sonucu; Görüntü bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak kaydedilmiştir (diferansiyel arasıfark olmamas kontrast) taban membran matrisi üzerinde hücre ekiminden sonra 18 saat. ölçek çubuğu 100 um'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
PEI / MNP kullanılarak HUVEC'lere Şekil 3. mıR teslim etmesi. C. etiketli mıR alımı (Cy3, kırmızı) 24 saat post-transfeksiyon ile normal hücre görünüm korunması (Cy3 etiketli miR, NP 25 ve MNP 25 ug / ml 2.5 pmol / cm2) gösterilmektedir. Görüntüler bir 514-nm uyarma lazer (Cy3, kırmızı) ve diferansiyel girişim kontrast kullanılarak odaklı lazer tarama mikroskobu ile alınmıştır. ölçek çubuğu 50 um'dir. B. Hücre canlılığı, 24 saat post-transfeksiyon akış sitometrisi ile değerlendirildi. arsa HUVEC'te için elde edilen sonuçları temsilAşağıdaki kompleks kompozisyonlar ile tedavi s, Cy3 miR 2.5 pmol / cm2; NP oranı 25 MNPS bölgesinin 5-25 ug / mL ile tamamlanabilir. (;: SEM hata çubukları, n = 6) çubuklar canlı hücrelerin ortalama sayısı ve bütün hücre nüfusa oranı göstermektedir. 3-renkli C. Yapısal aydınlatma mikroskobu (SİM) görüntüleme HUVECler alınır mıR / PEI / MNP kompleksleri etiketli. Hücreler yukarıda tarif edildiği inkübe gibi transfekte ve 24 saat sonra tedavi sabitlendi; çekirdekleri DAPI ile zıt. Ham SİM veri Z yığınlarının kaydedilmiş ve işlenmiştir; temsili görüntüler maksimum yoğunluğu çıkıntının sonucudur. Aşağıdaki uyarma lazerler uygulanmıştır: 405 nm (mavi DAPI), 488 nm (Atto488-PEI, portakal), 565 nm (Atto565-MNP camgöbeği) ve 633 nm (Cy5 miR, kırmızı). ölçek çubuğu 5 um'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. mıR / PEI / MNP ile HUVECler Modifikasyon güvenlik. 48 saat sonra muamele A. bir tüp formasyonu deneyi, transfekte hücreler (NP 25 ve MNT 25 ug / mL scr-miR 2.5 pmol / cm2) ile gerçekleştirildi. Görüntüler, bir lazer tarama konfokal mikroskop ile elde edilmiştir (yani, diferansiyel-interferans-kontrast) 18 saat taban membran matrisi üzerinde hücre ekiminden sonra. mıR / PEI ile transfekte edilmiş HUVECler, bir pozitif kontrol olarak bir toksisite kontrol ve muamele edilmemiş hücreler olarak kullanıldı. ölçek çubuğu 100 um'dir. arsa transfekte HUVEC ve çeşitli parametreler kullanılarak, tedavi edilmemiş hücrelere arasındaki oranı: boru uzunluğunu, dal sayısı ve birleşme (n = 3, hata çubukları: SEM). B. mıR / PEI / MNP ile modifiye edilmiş HUVEC geçit bağlantısı aracılı arası iletişim değerlendirildi 24 saat sonra transfeksiyonununsiyon. Bu amaç için, hücreler GJ geçirgen kalsein boyası (turuncu) ile yüklendi; (Sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma Z yığınlarının test hücrelerinin taranarak 3D incelenmiştir. Örnek ağartma önce Calcein yüklü hücrelerin resim doğrudan ağartma sonra ve (geri kazanım floresan ile) 15 dakika sonra ağartma tasvir edilmiştir. ölçek çubuğu 20 um'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
PEI / MNP ve uygulama ile transfeksiyon sonucu Şekil 5. Hücre Mıknatıslanma. Kümeleşen morfolojisi gösteren TEM ile alındı, süzüldü MNPS A. Örnek resmi. Küçük bir boyutu - (süperparamanyetizma ile sonuçlanan) bir demir oksit parçacıklarının (~ 5 15 nm) ve böylece birdoğruladı. Ölçek çubuğu 100 nm'dir. B. transfekte edilmiş hücrelerin hücre içi yükleme manyetik parçacık Spektroskopisi (MPS) 24 saat sonra, transfeksiyon ile değerlendirilmiştir. Örnek paneli incelenen numunelerin MPS spektrumunu göstermektedir. Özel olarak, saf MNP süspansiyonu (50 uL), bir referans (mavi kareler) olarak görev; Gri üçgenler herhangi bir örnek olmayan bir ölçüm ile elde edilen tespit arka plan spektrumu sergilerler ise:;: daireler iki transfekte hücre örnekleri (MNP 5 ug / mL yeşil çevrelerinde MNT 25 ug / mL kırmızı daireler), MPS spektrumlarıdır. genlik (A) logaritmik ölçek edin. C manyetik olarak tadil edilmiş hücrede miktarı transfekte HUVEC uygulanması ile nicelleştirilmiştir (2.5 pmol / cm2 miR; NP 25 5-25 ug MNP / ml ile tamamlanmış), bir manyetik için, tripsinizasyon 24 saat sonra muamele ile toplanmış, hücre ayırma sütunu. Elde edilen manyetik Pozitif kısım (yani, sütun kaldığını)sayıldı, ve transfekte edilmiş hücrelerin tüm miktarın dışına yüzdesi, her MNP konsantrasyonu (kırmızı üçgenler) için arsa yansır. Hücre canlılığı, daha sonra, Trypan mavisi eksklüzyon tahlilinde (gri dörtgenleri) ile incelenmiştir. Veri, ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (N = 3). Transfekte HUVEC D. açıklayıcı bir MRI görüntüsü (300.000 hücre, 2.5 pmol / cm2 miR; NP 25 ve 25 ug MNP / ml), bir agaroz hayali içine gömülü bir 7.1 T hayvan, MRI sistemi ile kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Simüle Dinamik Koşullarda miR / PEI / MNP-HUVEC'lerin Vitro Manyetik Hedefleme olarak Şekil 6.. HUVEC'ler 24 saat sonra transfekte toplandıiyonu (2.5 pmol / cm Cy3 miR 2; NP 25 ve MNT 25 ug / mL) ve yeniden tohumlanır lokal yan duvara bağlı küçük bir mıknatıs ile, kuyu taze kültür ortamı içinde. Buna karşılık, bu kültürü plakası, 150 rpm'de dönen bir çalkalayıcı sabitlendi. Hücre birleşmesi ve büyüme lazer tarama konfokal mikroskopi, PFA ile hücrelerin tespit DAPI ile çekirdek boyanması ve gerçekleştirerek 12 saat sonra değerlendirildi (eksitasyon lazerler: mavi 405 nm DAPI; 514 nm, Cy3, turuncu). Temsilcisi görüntüleri mıknatıs uygulaması ile bölgede hücre büyümesini tasvir; Mıknatıs uygulaması olmadan; ve sıvının akış hücreleri konsantre edildi de kültür merkezinde. Ölçek çubukları 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onların bundan başka manyetik kontrollü rehberlik için superparamanyetik nanopartiküller ile yüklü genetik hücrelerin üretimi mevcut protokol sunulmuştur. Bu stratejinin başarılı bir uygulama nakli için hedeflenebilir bir hücre ürünü sunarak, örneğin yaralı alan 2, 3, 4, düşük tutma ve zayıf engraftment olarak hücre tedavisi, bazı zorluklar, çözünürlüğü sağlar. Ayrıca, uygun bir şekilde seçilmiş bir genetik materyalin eş zamanlı giriş hücre özelliklerini teşvik edebilir ve bu nedenle işlevsel faydalar 41 artış olabilir.
geçerli protokol bir model olarak HUVEClerde geliştirilmiştir. Bu hücreler, toksik etkisi 18, 19, 20 transfekte zor ve hassas olduğu bilinmektedir. demPEI / MNP transfeksiyondan sonra% 95'in üzerinde fluoroforla işaretlenmiş miR alımının onstrated seviyesi tipik olarak, PEI-tabanlı vektörler ile elde edilen ve yaygın olarak katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifleri kullanılır (örneğin, Lipofectamine) 42. NP 40 - Buna ek olarak, 25 optimal NP oranı 20 arasında, daha önce yayınlanmış değerlerle karşılık gelir. Bununla birlikte, test edilen florofor etiketli miR son derece verimli alımı mutlaka teslimat 43 sonra düzgün bir miR işleme ve işlevini garanti etmez. Bu nokta NA sıkı elektrostatik yoğunlaşma ile, PEI durumunda özellikle önemlidir. Bu nedenle, verilen miR elde edilen fonksiyonel kapasitesi de test edilmelidir. Burada, fonksiyonel mıR endojen HUVEC ifade miR-92a, 31 seçildi ve buna karşı anti-miR-PEI ve PEI / MNP kullanılarak yapılmıştır. Bunun bir sonucu olarak, hedef miR-92a hemen hemen tamamen yok etme, anti-miR f verimli bir salınmasını kanıtlanmıştırtransfeksiyon kompleksleri rom.
Önemli bir şekilde, daha önceki çalışmalarda, PEI / MNP vektörü başarılı bir uygulama için diğer hücre tiplerine plasmid DNA (pDNA) ve miR teslimi, iki yapışık (örneğin, COS7, mezenkimal kök hücreler 15, 16) için ve gösterildi süspansiyonu (örneğin kemik iliğinden türetilmiş CD133 + hematopoietik kök hücreler 44). Bütün bu deneyler, transfeksiyon verimi ve toksisite hücre tipine bağlı 45 olduğu bilinmektedir teyit etmiştir. Bu nedenle, uygun vektör bileşimin seçimi (yani, mıR miktarı, NP oranı ve MNT demir miktarı), referans noktaları olarak daha önce kurulmuş uygun koşullar kullanılarak, her özel hücre tipi için gerçekleştirilmelidir.
Ayrıca, elde edilen genetik modifikasyon geçici karakteri göz önüne alınmalıdır. Bir yandan, bent Bu gibi büyüme faktörlerinin kısa süreli teslimat olarak, belirli bir fonksiyon için çok uygundur. Diğer taraftan, ekspresyon süresi uzun süreli ifadesini gerektiren çok çeşitli amaçlar için yeterince uzun olmayabilir. koşulları daha da optimize kez Bununla birlikte, PEİ / MNP vektörünün kanıtlanmış güvenlik olası tekrarlı olarak uygulanmasını destekler.
PEI ve türevleri genel olarak diğer viral olmayan araçlar ve 7 modifikasyon için kendi esnekliği ile karşılaştırıldığında yüksek verimlilikleri nedeniyle kullanılmaktadır. Bununla birlikte, in vitro ve in vivo olarak PEI başarıya rağmen, klinik çalışmalarda uygulama çok (örneğin, birkaç 1. ve 2. faz denemeleri veya kanser hastaları) 7, 14 nedeniyle, PEI toksisite 7, 13 ile sınırlıdır. Grubumuzun 16, hem de bu protokolün önceki eserleri gibi, MNPS göstermiştirönemli ölçüde PEI toksisitesini azaltmak mümkündür. Özellikle, mıR / PEI transfeksiyon, böylece, bu hücrelerin in vitro fonksiyonel deney, bir ana olmadığı takdirde matris üzerinde tüpler oluşturmak üzere HUVEC kabiliyetini tahrip olmuştur. Bunun aksine, mıR / PEI / MNP-HUVEC'lerin tüp oluşumu performansı, tedavi edilmemiş hücrelere karşılaştırılabilir. Özellikle, PEI toksisite bu azalma, biyo-uyumlu ve rutin insan denekler 40 bir kontrast maddesi olarak kullanılmaktadır, örneğin demir oksit gibi bileşenler, düşük seviyelerde sokulması ile elde edilmiştir.
Yanı sıra fonksiyonel özelliklerini koruması ile ilgili, özellik, hücre terapötikleri transplantasyon sonrasında 46 uygun entegrasyonu için gerekli olduğu şekilde tadil edilmiş hücreler, hücreler arası iletişim kurma yeteneğine sahip olması önemlidir. Buna ek olarak, modifiye edilmiş hücreler hasarlı dokuya 47 terapötik miR verilmesi için taşıyıcı olarak kullanılabilir. Bu durumda, onların capacikomşu hücrelerle molekülleri alışverişinde Ty bir araç olarak başarılı tanımlar. PEI / MNP transfeksiyon modifiye edilmiş HuVEClerde GJIC izin verir, bunlar, in vivo olarak entegrasyon için potansiyele sahiptir ve hasarlı bölgelerde miR dağıtım sağlamak için.
Özellikle, daha sonra hedefleme hücre mıknatıslanmaya önce yayınlanmış çalışmalar hücre ~ 4 yüklenmesini ve demir / hücre 48, 49, 50, 51, 30 pg bildirmiştir. Bu numaralar önemli değerleri ~ in vitro statik ve simüle dinamik koşullarda NA / PEI / MNP-HUVEC'lerin hedefleme için yeterli olan 0,16-0,7 pg / hücre, fazla. Bu tür düşük demir miktarları güvenlik açısından faydalıdır: demir oksit nanopartiküllerinin ilişkili toksisite yaygın olarak bilinen bir mekanizma (örneğin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi), doğrudan entegrasyon miktarı ile ilişkili olduğu bilinmektedirrnalized 40 nano-tanecikleriyle. Buna ek olarak, çeşitli çalışmalar demir oksit nanopartiküllerinin yüksek hücre içi düzeyleri, doza bağlı iskelet düzensizlik ve hasar 52, 53 neden olduğunu göstermiştir. Önemli olan, çoğu genetik hücre manipülasyonu içermeyen hedefleme amacıyla hücre mıknatıslanma vaka görüldü. Bunun aksine, mıR / PEI / MNP vektörü aynı anda hücrelere değiştirmek için, manyetik özellikler eklemek için bir fırsat sağlar.
Bununla birlikte, düşük MNP yükleme kan akımı ile türbülanslı bir ortamda hedef manyetik için yeterli değildir olabilir. In vivo durumda zor yakın gelmek için, dinamik koşullar in vitro simüle edilmiştir: süspansiyon manyetize mıR / PEI / MNP-HUVEC ile kültür plakaları döner çalkalayıcıda 34 üzerine yerleştirilmiştir. Bu deney açıkça ortaya tüm etkileşimleri karşılayamazin vivo. Ancak, PEI / MNP-modifiye hücrelerin hedef potansiyelinin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Kültür ortamının bile aktif sarsıntı mıknatıs 54 doğru hücre hareketi ile müdahale etmedi Sonuç olarak, yüksek verimli hücre hedefleme kanıtlanmıştır. Bu amaçla, miR-modifiye edilmiş HUVEC demir / hücresinin en az ~ 0.16 ug ile yüklendi. Üstelik manyetik duyarlı hücreler sıralanabilir. Bu çalışmanın uygulanan bir mıknatıs-bazlı hücre ayrıştırma işlemi miR / PEI / MNP-hücrelerin canlılığını tehlikeye edilmemiştir. Önemli olan, statik manyetik alan uygulamasının (yani 12 için bir manyetik alanın uygulama dahil hedefleme deneyleri - 24 saat) hedeflenen hücreler üzerinde zararlı etkisi yoktu. Bu nedenle, manyetize genetik olarak tadil edilmiş hücrelerin ortaya üretimi manyetik kuvvet ile sağlanır hücre tutma verimliliğini ele in vivo çalışmalar ayrıca için temel sağlar. Özellikle, inciE 51, 54, 55 kullanılan hücre tutma lokal uygulama yerine hücre rehberlik sonra venöz içine enjeksiyondan sonra manyetize edilmiş hücrelerin hedefleme kullanılarak in vivo çalışmalarda, en başarılı. Bu nedenle, enjeksiyon yerinde mıknatıs tabanlı retansiyon miR / PEI / MNP-modifiye edilmiş hücrelerin in vivo uygulamalarda daha arzu görünür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa rakip mali çıkarlarını hiçbir var.
Acknowledgments
Biz filtrelenmiş superparamanyetik nanopartiküllerin TEM görüntüleri kazanılmasında ve bunların X-ışını analizi yapan teknik destek için G. Fulda (Elektron Mikroskopi Merkezi, Rostock Üniversitesi, Almanya) teşekkür etmek istiyorum. RTC Rostock yürütülen çalışmalar Federal Eğitim Bakanlığı ve Araştırma Almanya (FKZ 0312138A, FKZ 316.159 ve VIP + 03VP00241) ve AB Yapısal Fonları ile Devlet Mecklenburg-Vorpommern (ESF / IV-WM-B34- tarafından desteklenmiştir 0030/10 ve ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) ve DFG (DA 1296-1), Islak-Vakfı ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12) ile. Frank Wiekhorst AB 7.ÇP araştırma programının "Nanomag" FP7-NMP-2013-BÜYÜK-7 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEI 25 kDa | Sigma Aldrich | 408727 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | Containing Sephadex G-25 Medium |
| Ninhydrin Reagent solution 2% | Sigma Aldrich | 7285 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| Microplate reader Model 680 | Bio-Rad | ||
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega | Z5481 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 µm |
| Libra 120 transmission electron microscope | Zeiss | Acceleration Voltage 120 kV | |
| Sapphire X-ray detector | EDAX-Amatek | ||
| Cell culture plastic | TPP | ||
| NHS-Esther Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-31 | |
| NHS-Esther Atto 488 | ATTO-TEC GmbH | AD 488-31 | |
| Cy5 miRNA Label IT kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| Biotin Atto 565 | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| Collagense Type IV Gibco | Thermo Scientific | 17104019 | |
| Endothelial growth medium, EGM-2 | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 µg/mL |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| anti-PECAM-1 antibody | Santa Cruz | sc-1506 | |
| MS MACS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Scientific | L10119 | |
| Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control | Thermo Scientific | AM17120 | "Cy3-miR" or "Cyanine-miR3" in the manuscript |
| Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control | Thermo Scientific | AM17110 | "scr-miR" in the manuscript |
| Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor | Thermo Scientific | AM10916 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | 4% solution in PBS |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 | |
| NucleoSpin RNA isolation Kit | Machery-Nagel | 740955 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Scientific | AM1560 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
| hsa-miR-92a TaqMan assay | Thermo Scientific | 000431 | Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU |
| FastGene Taq Ready Mix | Nippon Genetics | LS27 | |
| ITGA5 TaqMan assay | Thermo Scientific | Hs01547673_m1 | |
| RNU6B TaqMan assay | Thermo Scientific | 001093 | |
| 18S rRNA Endogenous Control | Thermo Scientific | 4333760F | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | ||
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| 7.1 Tesla animal MRI system | Bruker Corporation | A7906 | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH) | |
| MPS device | Bruker Biospin | ||
| Matlab software | Mathworks | ||
| Ring Neodym Magnet | magnets4you GmbH | RM-10x04x05-G | ø 10 mm; remanescence is ~ 1.3 T, coercivity ≥ 955 kA/m |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Scientific | C10340 | |
| FluorSave Reagent | Merck | 345789 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin electronic | Type: RK 100 SH |
References
- Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
- Zeng, L., Hu, Q., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
- Terrovitis, J., Lautamäki, R., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J Am Coll Cardiol. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. , (2015).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv Biomed Res. 1, 27 (2012).
- Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 15 (8), 541-555 (2014).
- Chira, S., Jackson, C. S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
- Li, W., Ma, N., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. J Gene Med. 10 (8), 897-909 (2008).
- Muthana, M., Kennerley, A. J., et al. Use of magnetic resonance targeting to direct cell therapy to target sites in vivo. Nat Commun. 6, 1-11 (2013).
- Zheng, B., von See, M. P., et al. Quantitative Magnetic Particle Imaging Monitors the Transplantation, Biodistribution, and Clearance of Stem Cells In Vivo. Theranostics. 6 (3), 291-301 (2016).
- Almstätter, I., Mykhaylyk, O., et al. Characterization of magnetic viral complexes for targeted delivery in oncology. Theranostics. 5 (7), 667-685 (2015).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16023 (2016).
- Schade, A., Delyagina, E., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. Int J Mol Sci. 14 (6), 10710-10726 (2013).
- Delyagina, E., Schade, A., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), 999-1017 (2014).
- Voronina, N., Lemcke, H., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine. 12 (8), 2353-2364 (2016).
- Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
- Zhang, J., Wang, Z., Lin, W., Chen, S. Gene transfection in complex media using PCBMAEE-PCBMA copolymer with both hydrolytic and zwitterionic blocks. Biomaterials. 35 (27), 7909-7918 (2014).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Moore, S., Stein, W. H. A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds. J Biol Chem. 211 (2), 907-913 (1954).
- Jones, D. L., Owen, A. G., Farrar, J. F. Simple method to enable the high resolution determination of total free amino acids in soil solutions and soil extracts. Soil Biol Biochem. 34 (12), 1893-1902 (2002).
- Kircheis, R., Wightman, L., et al. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8 (1), 28-40 (2001).
- Green, N. M. A SPECTROPHOTOMETRIC ASSAY FOR AVIDIN AND BIOTIN BASED ON BINDING OF DYES BY AVIDIN. Biochem J. 94, 23 (1965).
- Haugland, R. P., You, W. W. Coupling of Antibodies with Biotin. Methods Mol Biol. 418, 13-23 (2008).
- Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology. J Microbiol Methods. 89 (1), 41-48 (2012).
- Andrade, ÂL., Valente, M. A., Ferreira, J. M. F., Fabris, J. D. Preparation of size-controlled nanoparticles of magnetite. J Magn Magn Mater. 324 (10), 1753-1757 (2012).
- Barbaro, D., Di Bari, L., et al. Glucose-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles prepared by metal vapour synthesis are electively internalized in a pancreatic adenocarcinoma cell line expressing GLUT1 transporter. PLoS ONE. 10 (4), e0123159 (2015).
- Gaebel, R., Ma, N., et al. Patterning human stem cells and endothelial cells with laser printing for cardiac regeneration. Biomaterials. 32 (35), 9218-9230 (2011).
- Martín de Llano, J. J., Fuertes, G., Torró, I., García Vicent, C., Fayos, J. L., Lurbe, E. Birth weight and characteristics of endothelial and smooth muscle cell cultures from human umbilical cord vessels. J Transl Med. 7, 30 (2009).
- Bonauer, A., Carmona, G., et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science. 324 (5935), 1710-1713 (2009).
- Wang, W., Li, W., et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells from patients. J Cell Mol Med. 15 (9), 1989-1998 (2011).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Cheng, K., Li, T. -S., Malliaras, K., Davis, D. R., Zhang, Y., Marbán, E. Magnetic targeting enhances engraftment and functional benefit of iron-labeled cardiosphere-derived cells in myocardial infarction. Circ Res. 106 (10), 1570-1581 (2010).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. , A.3B.1-A.3B.2 (2001).
- Chorny, M., Alferiev, I. S., et al. Formulation and in vitro characterization of composite biodegradable magnetic nanoparticles for magnetically guided cell delivery. Pharm Res. 29 (5), 1232-1241 (2012).
- Poller, W., Löwa, N., et al. Magnetic Particle Spectroscopy Reveals Dynamic Changes in the Magnetic Behavior of Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles During Cellular Uptake and Enables Determination of Cell-Labeling Efficacy. J Biomed Nanotechnol. 12 (2), 337-346 (2016).
- Lobsien, D., Dreyer, A. Y., Stroh, A., Boltze, J., Hoffmann, K. T. Imaging of VSOP Labeled Stem Cells in Agarose Phantoms with Susceptibility Weighted and T2* Weighted MR Imaging at 3T: Determination of the Detection Limit. PLoS ONE. 8 (5), 1-10 (2013).
- Hernando, D., Kühn, J. -P., et al. R2* estimation using "in-phase" echoes in the presence of fat: the effects of complex spectrum of fat. J Magn Reson Imaging. 37 (3), 717-726 (2013).
- Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., De Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6 (5), 446-465 (2011).
- Robert, D., Kirkton, N. B. Genetic Engineering and Stem Cells: Combinatorial Approaches for Cardiac Cell Therapy. IEEE Eng Med Biol Mag. 27 (3), 85 (2008).
- Chen, Y., Wang, W., et al. Development of an MRI-visible nonviral vector for siRNA delivery targeting gastric cancer. Int J Nanomedicine. 7, 359-368 (2012).
- Diener, Y., Jurk, M., et al. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells. Sci Rep. 5, 17184 (2015).
- Müller, P., Voronina, N., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem Cells Int. 2016, 1-16 (2016).
- Yang, H., Vonk, L. A., et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells. Eur J Pharm Sci. 53, 35-44 (2014).
- Chen, C. -H., Sereti, K. -I., Wu, B. M., Ardehali, R. Translational aspects of cardiac cell therapy. J Cell Mol Med. 19 (8), 1757-1772 (2015).
- Alaiti, M. A., Ishikawa, M., et al. Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in ex vivo expanded CD34+ cells enhances cell-mediated angiogenesis. J Cell Mol Med. 16 (10), 2413-2421 (2012).
- Landázuri, N., Tong, S., et al. Magnetic targeting of human mesenchymal stem cells with internalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Small. 9 (23), 4017-4026 (2013).
- Carenza, E., Barceló, V., et al. In vitro angiogenic performance and in vivo brain targeting of magnetized endothelial progenitor cells for neurorepair therapies. Nanomedicine. 10 (1), 225-234 (2014).
- Kyrtatos, P. G., Lehtolainen, P., et al. Magnetic Tagging Increases Delivery of Circulating Progenitors in Vascular Injury. JACC Cardiovasc Interv. 2 (8), 794-802 (2009).
- Huang, Z., Shen, Y., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 149 (2013).
- Wu, X., Tan, Y., Mao, H., Zhang, M. Toxic effects of iron oxide nanoparticles on human umbilical vein endothelial cells. Int J Nanomedicine. 5, 385-399 (2010).
- Soenen, S. J. H., Nuytten, N., De Meyer, S. F., De Smedt, S. C., De Cuyper, M. High Intracellular Iron Oxide Nanoparticle Concentrations Affect Cellular Cytoskeleton and Focal Adhesion Kinase-Mediated Signaling. Small. 6 (7), 832-842 (2010).
- Cheng, K., Malliaras, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell Transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
- Vandergriff, A. C., Hensley, T. M., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
