Summary
在这里我们展示了一个新的分析来研究果蝇幼虫冷痛觉。该试验利用能够施加焦点有害低温刺激的定制珀尔帖探头和导致量化冷的特定行为。该技术将允许冷痛觉的进一步细胞和分子解剖。
Abstract
生物如何感知和有害反应的温度仍然知之甚少。此外，底层的感官机械的敏化，如在患者经历外周神经病变或损伤诱导的敏化的机制，没有得到很好的表征。经遗传易处理的果蝇模型已被用于研究对伤害性热检测所需的细胞和基因， 这已经产生了多个感兴趣的保守基因。然而鲜为人知的是，在细胞和受体的有害低温感应重要。虽然， 果蝇不下去长时间暴露在低温下（≤10℃），并且将避免凉，在的行为偏好分析，他们是如何感知宁愿气温回暖，并可能避免伤害性冷刺激仅在最近被查处。
在这里，我们描述和表征第一有害低温（≤10℃）的行为分析中果蝇。使用这个工具和分析，我们表现出研究者如何定性和定量评估冷痛觉的行为。这可以正常/健康的文化条件下的疾病，受伤或过敏的情况下完成，或者可能。另外，该测定可以应用于选择用于期望的基因型，这可能会影响thermosensation，疼痛或疼痛性致敏幼虫。由于疼痛是一种高度保守的过程中，使用这个试验进一步研究热痛觉可能会搜集其他物种，包括脊椎动物疼痛过程的重要认识。
Introduction
果蝇已被证明是用于新颖保守的基因和背后复杂行为的神经元回路的识别非常有用的。苍蝇提供一个复杂的遗传工具包和一个简化的神经系统，其允许精确遗传和神经元操作1，2，3，4至解剖伤害感受5，6，7的细胞和分子基础。幼虫可用于这些分析是特别有用的，因为对于温和触摸8，9，10，有害热11，12，13和有害刺激4的机械感觉行为分析， 11已经建立，并且透明幼虫角质层允许表皮和下面的感觉神经元的活的或固定成像。最近，有害低温的试验也已开发7，这是我们在这里详细描述。
使用细的，锥形的尖低温探针，我们表明， 果蝇幼虫表现出了一组冷特定反应性的行为，从正常运动过程中观察到的行为，以下温柔的触摸不同的，或后苛刻机械或高温的刺激7，8，11 。冷特定行为包括鲁棒的全体收缩（CT），一个45-90º加注的后段（PR）和前的同时加注以及后段成U形（US）的。这些行为的发生率随着温度的降低，但在s每个峰增加轻轻不同寒冷的气温。最近的工作表明CT响应由不同周围感觉神经元比那些对有害热或苛刻机械刺激作出反应7介导的。
很像脊椎动物伤害感受器， 果蝇多个树枝状（MD）周围感觉神经元具有arborize在表皮1复杂树枝状结构。 MD神经元存在于每个幼虫本体段，伸出的它们的轴突到腹神经索14。 MD的感觉神经元被分成基于树枝状形态四种不同的类别（I-IV）和具有不同的感觉功能4，9，10，15，16，17。而所需要的幼虫侧向车身侧倾响应IV类神经元于高温或苛刻机械刺激4，类需要III神经元温柔的触摸响应9,10和不仅由冷启动，而且还需要用于冷诱发的行为反应7。既III类和IV类神经元利用离散瞬时受体电位（TRP）通道，以促进对有害7，11，18和非有害刺激物9，10，17，19的行为反应。此外，幼虫伤害感受致敏损伤后，在细胞20和行为水平12,21。
这里所描述的试验允许quantificatio或者是正常，或潜在的n个改变行为反应冷温度范围从有害低温（≤10℃），无害的冷却（11-17℃），于环境温度下（18-22℃）。在该测定中使用的冷的温度下能够直接激活III类感觉神经元，引发健壮的，可再现的钙的增加和冷诱发的行为反应，其可以是定性和定量分析7。此测定法可应用到几乎所有的基因型的幼虫以及幼虫暴露于不同的环境条件（改变的营养，受伤，药物试剂），以确定该影响冷痛觉，疼痛致敏性或伤害性可塑性遗传和环境因素。鉴于thermosensation跨越许多物种无处不在，这种检测提供了痛觉研究中的一个有价值的工具，可能会发现新的基因目标，或将改善神经元相互作用我们的脊椎动物伤害性的理解。
定制的冷探针（见低温探针， 材料的表 ）利用控制珀耳帖装置，其冷却通过热传导的铝轴和锥形尖端的闭环温度。热敏电阻被嵌入在铝锥形尖端内报告所述控制单元上的实时温度。散热器和风扇安装于热电模块，以调节珀尔帖效应的热负荷（QC）左右（22-0℃）所需温度范围，可以实现（见热控制单元， 材料的表 ）。冷探针尖端的有害冷的刺激是通过手工施加到背中线，以链段（S）从前面和后面的端部等距离（大致段A4，参见图1A）的幼虫。为了应对寒冷刺激，幼虫通常产生三个冷诱发的行为之一的10秒内切断：一个完整的身体收缩（CT），一个45-90º加注前，后段的成U型（US）或后段（PR）（在结果描述）的加注。正常蠕动运动或觅食行为的过程中进行这些行为都没有。这些行为也可从温和的触摸响应和高温或有害机械刺激的厌恶轧制响应不同。
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Protocol
1.幼虫的制备
- 提高股票或遗传杂交在25ºC培养箱中。
- 如果培养一个十字架，使用20-25处女的女性，每个含定期玉米面飞行介质小瓶15-20男性。允许女性将其转移到食品中新的小瓶中之前产卵约48小时。
- 产卵后4-5天，收集所需的基因型的3 龄幼虫，轻轻喷出的水流到糊状食物和幼虫，并倾出的内容到一个中等规模的，干净的陪替氏培养皿（60毫米×15毫米）。
- 接着，轻轻地梳理通过使用大小镊子或画笔幼虫以排除更大的“游荡第三龄”或小多病幼虫从被测试。含有任何不期望的遗传标记或平衡器丢弃幼虫。
- 其中有排序的幼虫会放在使实验者可以用“盲目”的前资深实验室部件标签菜肴或容器perimental条件或幼虫（如果适用）的基因型。实验者可以使用由实验室部件生成的密钥实验后应用解码标签收集的数据。
- 使用scoopula，转移的新鲜食品一个硬币大小的量成（35毫米×10毫米或60毫米×15mm）中清洁，标记的培养皿填充中途用室温水。
- 轻轻地将排序幼虫移动到食品（防止饥饿或干燥如果测试预计将需要超过20分钟），使用镊子或画笔。
2.冷探针分析
- 转动冷探针单元允许其冷却至期望的温度几分钟上。如果设置为较低的温度，冷凝可能会沿探针形成。
- 擦去任何多余的水分用实验室应用到幼虫之前擦拭。当不立即使用，发生在探针绝缘帽两者绝缘，并保持尖端清洁和防止损坏。
- 放置一个中间第三龄幼虫到薄片暗可移动乙烯基的（典型地，用一小块从笔记本粘合剂切断）明视场显微镜下。黑色乙烯基有助于对比度可视化和在移动幼虫不接触到与探针正确地对齐。
- 调整显微镜（见材料的表 ）和光单元（参见材料的表 ）至中等亮度（50-75％最大亮度），以提供对比度和防止幼虫过快干燥。
- 丢弃不首先表现出正常的蠕动运动，因为它们可能混淆结果的任何幼虫。幼虫应当是湿润从水的陪替氏培养皿否则幼虫将坚持乙烯基抑制正常运动。水都不应该幼虫水坑。
- 用手朝以90°的角度的前后体轴幼虫推进所述探针，使用乙烯基移动幼虫成COR矩形的位置（参见图1A）。
- 东方探针的尖端轻轻划过与探针以大约45度角到显微镜载物台的幼虫的中间背侧表面铺设。
- 当探针接触，启动一个定时器实验室。施加足够的向下的压力稍微缩进幼虫角质层的表面，同时仍允许向前或向后移动。
- 举行的地方探头长达10秒或直到寒冷诱发的行为反应观察 - 以先到者为准。然后取出探头。
- 记录观察到的行为反应和响应延迟。没有10秒内作出反应幼虫被认为是“无反应者”。延迟也可以被记录为应答者和用于测量响应的鲁棒性/振幅的变化。
- 丢弃幼虫和准备下一个。
- 重复步骤2.3-2.11直到达到测试幼虫的期望数目（三组的n = 20-40幼虫ùsed的这里）。
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Representative Results
与包括偶尔的暂停，头圈，并在方向22变化的蠕动运动果蝇幼虫的举动。响应于有害低温刺激的焦点应用然而，幼虫表现出了一组独特的行为的，不像厌恶横向辊对有害热和机械刺激。这些行为是从也响应不同，以温柔的触摸8，9，10或至室温探针的触摸。冷诱发的行为如下：碾碎朝向它们的主体的中心其前部和后部区段在一个收缩（CT），提高其前部和后部区段（约45-90°）到空气中，使得一个U形形状（US），或者仅提高他们的后段（约45-90°）进入空气（PR）（ 图1）。实验者应注意，这些行为的描述是定性的指导方针，而不是定量的截断。这些响应的范围内从3-18℃（ 图2A）冷的温度下进行观察。然而，不同的行为在不同冷范围（ 图2B和2C）的峰：3-8ºC用于PR和美国和9-14ºC为CT。 CT是在幼虫的小百分比偶尔观察到响应于温柔的触摸，使用室温（RT）探针（ 图2）的唯一的冷诱发反应。等待时间信息也可以被收集和统计使用该测定（参见下面的使用统计检验），这可能会产生损伤后或其他环境条件有趣信息进行比较。
为了比较不同的冷行为的潜伏期，测定冷诱发反应长达20秒截止三个冷到凉爽的彩画功能（3，10和20℃），以及至室温（RT）探针和绘制为随时间观察到的累积响应（ 图3）。首先，我们观察到，在低温下（3ºC和10℃）最响应后探针的应用程序（ 图3A - 3B）在1米10秒之间观察到的，而CT应答似乎在无害的温度（20℃和室有较长的频率温度（RT）， 图3C - 3D）。其次，虽然美国，PR和CT响应对延迟曲线是彼此没有显著不同在3℃（ 图3A）在10ºC，20℃和RT中，CT响应对延迟曲线是从美国和/或PR显著不同，而美国和PR曲线是彼此没有显著不同在所测试的任何温度（由长秩（曼特尔-COX）和Gehan-布瑞斯罗夫-Wilcoxon检验， 图3B - 3D 图3E）。对于这种类型的分类比较，冷诱发的应答分为三个延迟类：小于4秒，4-10秒之间，和11-20秒（ 图3E - 3H）之间。应答者对于每个行为的百分比表示为应答者落入每个速度类别内的比例（结果进行统计行为之间通过arxc偶然性表进行比较）。同样，这分析显示PR和US延迟响应之间无显著差异（ 图3E - 3H），但是CT的响应在所有温度下进行测试，包括RT探针（ 图3E是显著不同于PR 3ºC和10ºC，和从美国- 3F）。总之，这些数据表明，10秒测定截止是绰绰有余的，以收集有意义的数据集，并且该冷诱发的CT响应在比美国或PR响应相对较长的延迟发生。由于在从幼虫到幼虫响应一些可变性，我们在每个温度下测试的三组20幼虫，并报告平均值的标准误差为每个响应（ 图3E - 3H）。
由于幼虫尺寸（以及因此冷的刺激的相对大小）可以大大早期和晚期3龄幼虫之间变化，早，中，晚第三幼虫在3ºC测试和10ºC和它们的响应进行比较（ 图4） 。四，五日龄幼虫培养用于收集幼虫然后分为早期，中期或晚期三龄通过其长度/大小（ 图4）大致阶段。有趣的是，一些respoNSE变异被认为依赖于温度被测试发育阶段之间。在3ºC，早3 龄幼虫表现出较少的PR和US反应者和更CT应答者（ 图4A - 4C）。然而在10ºC，无反应基本上横跨发育阶段（ - 4F 图4D）改变。在10秒切断为每个行为的总百分比在反应3ºC或10ºC比较表明，只有早3 龄幼虫具有在3℃（ 图4G和4H）显著不同PR和CT的响应。
III类多树突状感觉神经元直接由冷的温度启动，并在所需的CT响应于冷探头7。当施加到前的Ia的区域冷的刺激也能发生鲁棒CT应答RVA（头）（ 图5B）。要确定是否从所述头部的直接刺激导致冷诱发反应还需要的md神经元（包括III类）冷的刺激轻轻施加到幼虫（ 图5A）的头部在所有MD感觉神经元表达破伤风毒素的转基因有效电使其沉默3。当幼虫在头部刺激用冷（6℃），幼虫的大百分比仍产生一CT响应，尽管MD神经元被沉默（ 图5B）。该数据表明探测头时，MD神经元不需要感冒诱发CT，因此，这种响应必须需要其他类型的感觉神经元，它可以使用这个工具，并测定来鉴定的。
图1：冷探针检测。 （A）直径冷探针应用的克至第三龄控制（W 1118）幼虫。铝冷探针尖端，设置为所需的温度，轻轻地放置在幼虫的背侧A4段长达10秒，允许移动的自由范围。 （B）的幼虫指示探头的角度，因为它被施加的横截面。探针应在近似45度角到显微镜载物台（虚线）被保持，并垂直于在刺激期间的幼虫的前后身体轴线。 （C）三种冷诱发的行为观察到的图：前部和后部朝向幼虫体（灰色箭头），（ⅱ）U型（US）的中心（i）的收缩（CT）：一个45- 90（虚线）提高前部和后部的，以及（iii）提高后路（PR）：头部和尾部朝向所述幼虫体的中心的后验的45-90（虚线）提高（灰色箭头） 。
图2：冷诱发的响应与温度的关系。 （A）在中间第三龄控制反应的百分比（W 1118）幼虫在一定范围的冷的温度（3-22℃）或室温（RT）探针。 PR的（B）的百分比，在不同的冷的温度与峰值响应美国和（C）反应CT指示。 （A - C）PR：后培养，US：U形，CT：合同。误差棒是平均值为3个设定n = 40幼虫的标准误差，响应平均。 请点击此处查看该图的放大版本。
FIGURE 3：冷诱发的响应延迟与温度的关系。 （A - D）累积US（红色），PR（蓝色），或CT（绿色）随时间应答者在各种温度下（3°C，10ºC，20℃和RT）冷探针（1-20多个）的百分比在控制（W 1118）幼虫。 （E - H）的快速（<4秒），慢（4-10或多个），和后期的平均比例（11-12多个）响应幼虫在各种温度下（3°C，10ºC，20℃和RT冷探针）。 （A - 1H）对于每个温度，N =测试3套40幼虫。 PR：加薪后，美国：U型，CT：合同，RT：室温。 （A - D）NS：数据组之间没有差异显著，* = p值<0.05，** = p值<0.0001由龙秩（曼特尔-Cox）检验和Gehan-布瑞斯罗夫-Wilcoxon检验。 （EH）误差棒表示SEM。* = p值<0.05，** = p值<0。0001 arxc列联表。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：在早，中，晚3 龄幼虫冷诱发的响应延迟。 ％的累积响应于（A - C）3ºC或（D - F）10ºC早期（黑色）冷探针随时间（1-20 S），中（橙色）或晚期（绿色） 第三龄控制（ w ^ 1118）的幼虫。响应对延迟由行为分离：PR（A，D），US（B，E），CT（A - F）。 * = p值<0.05，** = p值<0.001由龙秩（曼特尔-Cox）检验和Gehan-布雷松慢Wilcoxon检验。 （G - 1H）累积应答的百分比为（G）3ºC或（H）10ºC冷10秒内早期探针，中或晚3 龄幼虫。误差棒通过双尾Fisher精确试验表示SEM * = p值<0.05。 n = 3的套20的幼虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：在头部刺激，寒冷诱发的CT反应不需要MD感觉神经元。 （A）冷探针测定法的原理图，当前在第三龄幼虫被刺激。 （B）的平均百分比CT应答者冷探针（6℃）时幼虫在最anteri被刺激或片段。灰色柱：遗传控制，绿色条：通过破伤风毒素的转基因表达沉默所有MD神经元。破伤风毒素的转基因的非活性形式被用作附加的控制（“无效破伤风”）中，n = 3套每种基因型30的幼虫。绿色棒不显著通过从所有相关的遗传控制降低双尾Fisher精确，测试* p值<0.05。使用（B）基因型（左到右）：W 1118（对照），UAS-无活性破伤风/ +（UAS单独控制），UAS-破伤风/ +（UAS单独控制），MD-GAL4 / +（Gal4的单独控制） ，MD-GAL4 / UAS-无活性破伤风 （不活动破伤风控制在所有MD神经元中表达），和MD-GAL4 / UAS-活性破伤风 （实验条件活性破伤风在所有MD神经元中表达）。 请点击此处查看该图的放大版本。 </ P>
表1：飞冷探针检测食品的食谱。
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Discussion
此处所描述的测定可用于定性和定量评估各种遗传背景，环境影响，和/或损伤诱导的条件的幼虫伤害感受性或伤害性致敏。由于该测定法允许冷的刺激的焦点应用，用这种工具可以评价具体地在响应冷的温度周围感觉神经元的一个子集的功能。有趣的是，这些冷诱发的行为似乎利用不同类别的感觉神经元比由热7,11激活的，但完整的热伤害性电路是尚未完全明了。像许多其他地方伤害性试验这个实验是受到取决于冷探头的应用程序的用户之间有一些变化。然而，在中部体冷探头（避免头部和尾部）的具体位置不会出现有标志意义在寒冷的答复7 NT的影响。实践和重复可以减少这种用户间的可变性。
我们先前表征的冷探针分析和报告，以产生CT响应7所需的特定冷响应神经元和感觉通道。在这里，我们进一步确定数据延迟如何可以量化和分析其他伤害性的措施，分析从较长的截止点的数据，以确定实验的最优化的时间窗口。我们发现，大多数的感冒诱发反应发生的激励应用在10秒之内，使10秒切断既经济又有效。此外，考虑到不同的冷诱发的行为在不同温度下的峰值，这些反应的延迟是单独分析很重要，因为在这里完成，充分体会到在不同温度下的不同反应的稳健性。我们还表明，根据不同的行为是肛门yzed，如何幼虫大小可能会影响冷诱发反应。因此，保持幼虫大小在所有行为实验一致是必要的。最后，我们证明这个实验如何可以用来确认或排除，集参与痛觉寒冷，这似乎取决于冷刺激对幼虫的位置改变的感觉神经元。
现在，基线冷痛觉测定存在，我们可以将损害和/或敏感的方法来询问有关疼痛的生物学更加复杂的问题。例如，已知的是，为无害或有害热侧向车身侧倾响应于表皮UV损伤后敏化，因此需要特定的遗传介质和TRP通道12，20，21。是否致敏反应冷表皮结果是否相似的遗传途径类似紫外线的伤害都参与是未知的。同样，
这里有一些应该使用这个试验被认为是统计检验。我们使用最常用的统计检验是菲舍尔的用Bonferroni校正多重比较，或卡方检验精确检验。在条形图形式（ - 3H， 图4G - 4H和图5B在图3E 即 ）比较平均反应时，这些测试中使用。对于线图形式比较累积延迟，我们使用长秩（曼特尔-Cox）检验27，28和Gehan-布瑞斯罗夫-威尔科克森试验29，30，其均通常用于比较存活分布。我们建议三套20-40幼虫各基因型/实验允许重复集之间的平均值的标准差的计算。
最后，该测定允许有害低温刺激的精确应用和果蝇幼虫所得的行为反应已被表征。还有很多我们不知道在苍蝇或脊椎动物痛觉所需的细胞和基因。与此测定法中，一个可利用高度易处理的果蝇系统快速筛选保守的基因为基线伤害感受的关键，识别伤害性的电路，并评估组织损伤后发生的引起疼痛致敏细胞和遗传变化。最终，这一试验将有助于了解疼痛的生物学疼痛领域获得宝贵的信息，在系统可以容易地应用于更复杂的动物模型。
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Disclosures
一名美国专利申请（CL）正在等候在冷探头的设计。冷探头零件编号和结构的细节的更多信息，以及在刀具设计额外的咨询会根据要求提供。
Acknowledgments
我们感谢萨拉·Wu和卡米尔·格雷厄姆开发了冷探针分析，布鲁明顿果蝇库存中心飞股票，并Galko酒店实验室成员的早期阶段批判地阅读手稿。这项工作是由美国国立卫生研究院NRSA（NIH F31NS083306）到HNT，并通过NIH R01NS069828，R21NS087360和得克萨斯州MD安德森克拉克奖学金的基础研究到MJG大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
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