Summary
Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.
Abstract
Hoe organismen voelen en te reageren op schadelijke temperaturen is nog steeds slecht begrepen. Verder zijn de onderliggende mechanismen sensibilisatie van de sensorische machines, zoals bij patiënten met perifere neuropathie of letsel geïnduceerde sensibilisatie, zijn niet goed gekarakteriseerd. De genetisch handelbaar Drosophila model is gebruikt om de cellen en genen die nodig zijn voor schadelijke tochtdetectie bestuderen die meerdere geconserveerde genen van belang heeft opgeleverd. Weinig is echter bekend over de cellen en receptoren belangrijk voor schadelijke koud detectie. Hoewel, Drosophila langdurige blootstelling aan koude temperaturen (≤10 ºC) niet overleeft, en wordt voorkomen dat cool, liever warmere temperaturen in behavioral voorkeur assays, hoe ze aanvoelen en eventueel te voorkomen schadelijke koude stimuli is pas sinds kort onderzocht.
Hier beschrijven wij en karakteriseren de eerste schadelijke koud (≤10 ºC) behavioral test inDrosophila. Met behulp van deze tool en assay tonen we een onderzoeker hoe koud nociceptieve gedrag kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit kan gedaan worden onder normale / gezonde kweekomstandigheden, of vermoedelijk in het kader van ziekte, verwonding of sensibilisatie. Verder kan deze bepaling worden toegepast op larven geselecteerd voor gewenste genotypes, wat kan beïnvloeden thermosensation, pijn of nociceptieve sensibilisatie. Aangezien pijn een sterk behouden proces met behulp van deze bepaling voor verdere studie thermische nociceptie waarschijnlijk vergaren belangrijke inzicht pijn processen in andere soorten, waaronder vertebraten.
Introduction
Drosophila heeft bewezen zeer nuttig voor de identificatie van nieuwe geconserveerde genen en neuronale circuits die complexe gedrag ten grondslag liggen zijn. Vliegen te verfijnde genetische toolkit en een vereenvoudigd zenuwstelsel waarmee nauwkeurige genetische manipulatie en neuronale 1, 2, 3, 4 om de cellulaire en moleculaire basis van nociceptie 5, 6, 7 ontleden. Larven zijn bijzonder bruikbaar voor deze analyses, aangezien behavioral tests voor zachte aanraking 8, 9, 10, schadelijke warmte 11, 12, 13 en mechanische sensatie van schadelijke stimuli 4, 11 zijn reeds vastgesteld, en de transparante larvale cuticula maakt levende of vaste beeldvorming van de onderliggende epidermis en sensorische neuronen. Onlangs is een test voor schadelijke koud is ook ontwikkeld 7, die we in meer detail beschrijven hier.
Met een fijne, conisch getipt koude probe wordt aangetoond dat vertonen Drosophila larven een aantal koude-specifieke reactieve gedrag, verschillend van gedragingen die tijdens normaal voortbewegen, na zachte aanraking, of na zware mechanische of hoge temperatuur stimuli 7, 8, 11 . De koude-specifieke gedragingen, zoals een robuust full-body contractie (CT), een 45-90º verhoging van de achterste segmenten (PR) en een gelijktijdige verhoging van de voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US). De prevalentie van deze gedragingen toeneemt met afnemende temperatuur, maar elke pieken bij slichtjes verschillende koude temperaturen. Recent onderzoek suggereert dat CT responsen gemedieerd door verschillende perifere sensorische neuronen dan die reageren op schadelijke warmte of agressieve mechanische stimuli 7.
Net als nociceptoren vertebraat, Drosophila meerdere dendritische (md) perifere sensorische neuronen complexe dendritische structuren die arborize via epidermis 1. md neuronen aanwezig in alle larvale lichaamssegment, projecteren de axonen op de ventrale zenuwkoord 14. md sensorische neuronen worden gescheiden in vier verschillende klassen (I-IV) op basis van dendritische morfologie en hebben verschillende gevoelsfuncties 4, 9, 10, 15, 16, 17. En klasse IV neuronen vereist larven zijdelingse rolbewegingen reactieshoge temperaturen of zware mechanische stimuli 4, klasse III neuronen vereist voor zachte aanraking reacties 9, 10 en worden niet alleen geactiveerd door koude, maar ook vereist voor de koude opgewekte gedragsreacties 7. Zowel klasse III en klasse IV neuronen gebruiken discrete transient receptor potential (TRP) kanalen gedragsreacties aan schadelijke 7, 11, 18 en onschadelijke stimuli 9, 10, 17, 19 te vergemakkelijken. Verder wordt larvale nociceptie gesensibiliseerd volgende blessure, op het cellulaire 20 en gedragsmatige niveaus 12, 21.
De hier beschreven test maakt de quantification hetzij normaal of potentieel veranderd gedragsreacties op koude temperaturen van schadelijke koude (≤ 10 ° C), onschadelijke koel (11-17 ° C), bij omgevingstemperatuur (18-22 ° C). De koude temperaturen die in deze assay die direct activeren III sensorische neuronen, uitlokken robuust, reproduceerbaar calcium verhoogt en koud opgewekte gedragsreacties, die kwalitatief en kwantitatief kan worden geanalyseerd 7. Deze test kan worden toegepast op larven van vrijwel elke genotype en larven blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden (veranderde voeding, verwonding, farmacologische middelen) zowel genetische en omgevingsfactoren die invloed koude nociceptie, nociceptieve sensibilisatie of nociceptieve plasticiteit bepalen. Aangezien thermosensation alomtegenwoordig in vele soorten, deze test een waardevol hulpmiddel voor de studie van nociceptie en kunnen nieuw gen doelen of neuronale interacties verbetert ontdekkenons begrip van gewervelde nociceptie.
De op maat gemaakte koude probe (zie koude sonde, Table of Materials) gebruikt een gesloten lus geïsoleerde Peltier-inrichting, waarbij de aluminium schacht en conische punt met warmtegeleiding afkoelt. Een thermistor is ingebed in het aluminium kegelpunt meldt de real-time temperatuur op de bedieningseenheid. Een koelelement en de ventilator zijn verbonden aan de thermo-module warmtebelasting het Peltier effect is (Qc) zodat het gewenste temperatuurbereik van (22-0 ° C) worden bereikt regelen (zie Thermal regeleenheid, tabel of Materials). De schadelijke stimulus koude van de sondepunt koude wordt handmatig aangebracht op de dorsale middellijn, om segment (en) op gelijke afstand van voorste en achterste einden (ruwweg segment A4, zie Figuur 1A) van de larve. In reactie op koude stimuli, larven produceren in het algemeen een van de drie koude opgewekte gedrag binnen een 10 s cutoff: een full bodycontractie (CT), een 45-90º verhoging van voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US) of een verhoging van het achterste segmenten (PR) (Results beschreven). Geen van deze gedragingen worden uitgevoerd tijdens de normale peristaltische beweging of foerageergedrag. Dit gedrag ook verschillend van zachte aanraking reacties en de rollen aversieve respons op hoge temperaturen of schadelijke mechanische stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Larven
- Verhogen bestanden of genetisch kruisen in een 25 ° C incubator.
- Als het kweken van een kruis, gebruiken 20-25 maagdelijke vrouwtjes en 15-20 mannen per flacon met regelmatige maïsmeel fly media. Toestaan vrouwtjes eieren gedurende ongeveer 48 uur alvorens hen naar een nieuw buisje voedsel.
- 4-5 dagen na eieren leggen, verzamel 3e instar larven van het gewenste genotype door voorzichtig spuiten van een waterstroom in de slappe eten en larven, en giet de inhoud in een middelgroot, schone petrischaal (60 mm x 15 mm).
- Vervolgens zachtjes larven sorteren op grootte behulp van een tang of een penseel grotere "zwervende 3 e instar" of kleine ziekelijk larven belet wordt getest. Ontdoen larven die ongewenste genetische merkers of balanceerelementen.
- Heeft u een collega-lab lid label gerechten of containers waarin naargelang larven zal worden geplaatst, zodat de experimentator "blind" kan zijn om de experimental conditie of genotype van de larven, indien van toepassing. De experimentator kan gedecodeerde labels van toepassing op de verzamelde gegevens na het experiment met behulp van een sleutel gegenereerd door een lab-lid.
- Gebruik een scoopula overdragen dime een kleine hoeveelheid verse levensmiddelen in een (35 mm x 10 mm of 60 mm x 15 mm) schoon, gelabeld petrischaal gevuld halverwege met water op kamertemperatuur.
- Beweeg de gesorteerde larven op het voedsel (uithongering en uitdroging te voorkomen als testen verwachting meer dan 20 minuten duren) behulp van een tang of kwast.
2. Cold Probe Assay
- Schakel de koude sonde eenheid waardoor enkele minuten voor te koelen tot de gewenste temperatuur. Als instelling lagere temperaturen condensatie waarschijnlijk gevormd langs de sonde.
- Veeg overtollig vocht af met een laboratorium vegen voordat deze op de larve. Wanneer niet in onmiddellijk gebruik, plaats isolatiekapje op de probe zowel isoleren en de punt schoon te houden en te voorkomen.
- Plaats een mid 3e instar larven op een dun stukje donkere beweegbare vinyl (gewoonlijk met een kleine stukje gesneden uit een notitieboekjemultomap) onder een helderveld microscoop. De zwarte vinyl helpt bij contrast visualisatie en bewegen van de larve zonder te raken om goed uit te lijnen met de probe.
- Stel de microscoop (zie tabel of Materials) en de verlichtingseenheid (zie tabel of Materials) tot gemiddelde helderheid (50-75% helderheid max) om het contrast te verschaffen en te voorkomen dat de larve uitdrogen te snel.
- Gooi alle larven die niet eerst de normale peristaltische beweging vertonen omdat ze de resultaten kunnen verwarren. De larven moet vochtig worden uit de petrischaal van water anders de larve zal vasthouden aan het vinyl remmende normale voortbeweging. Water moet niet plas rond de larve.
- Schuif de sonde handmatig naar de larve op een 90 ° hoek met de achterwaartse lichaamsas, met de platen naar de larve in cor verplaatsenrect positie (zie figuur 1A).
- Plaats de punt van de sonde voorzichtig leggen over het midden dorsale oppervlak van de larve met de sonde ongeveer 45 ° hoek met de microscoop podium.
- Bij sonde contact, start een laboratorium timer. Breng voldoende neerwaartse druk enigszins inspringen het oppervlak van het larvale cuticula terwijl voorwaartse of achterwaartse beweging mogelijk.
- Houd de sonde in plaats maximaal 10 seconden of totdat een koude opgewekte gedragsreactie waargenomen - wat het eerste optreedt. verwijder de sonde.
- Noteer de waargenomen gedrags-respons en de respons latency. Larven die niet reageren binnen 10 s worden beschouwd als "non-responders". Latentie kan worden opgenomen responders en gebruikt om veranderingen in reactie robuustheid / amplitude te meten.
- Gooi larve en de voorbereiding van de volgende.
- Herhaal stap 2,3-2,11 totdat het gewenste aantal larven-test is bereikt (drie reeksen n = 20-40 larven waren used hier).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila larven bewegen met een peristaltische beweging die incidenteel pauzes, hoofd bochten en richtingsveranderingen 22 omvat. In reactie op focale toepassing van een schadelijke stimulus koude vertonen echter larven een reeks unieke gedrag, in tegenstelling tot de aversieve laterale rol op pijnlijke hitte en mechanische stimuli. Dit gedrag ook verschillend van reacties op zachte aanraking 8, 9, 10 of de aanraking van kamertemperatuur probe. De koude opgewekte gedrag zijn: scrunching de voorste en achterste segmenten naar het midden van hun lichaam in een contractie (CT), verhoging van de voorste en achterste segmenten (ongeveer 45-90 °) in de lucht, waardoor een U- vorm (US), of het verhogen van alleen het onderste segment (ca. 45-90 °) lob (PR) (figuur 1). de experimentatormoeten erop gewezen worden dat deze gedragsproblemen beschrijvingen zijn kwalitatieve richtlijnen in plaats van kwantitatieve cut-offs. Deze responsen worden gemeten over een traject van koude temperaturen 3-18 ° C (figuur 2A). Echter, verschillende gedragingen piek in verschillende trajecten koude (figuren 2B en 2C): 3-8 ° C voor PR en VS en 9-14 * C CT. CT is de enige koud opgewekte reactie soms waargenomen bij klein percentage larven in reactie op zachte aanraking, onder toepassing van een kamertemperatuur (KT) probe (Figuur 2). Latency informatie kan worden verzameld en statistisch vergeleken met deze assay (zie hieronder voor statistische testen gebruikt), die interessante informatie na letsel of andere omgevingsomstandigheden kunnen opleveren.
Om latencies van de verschillende gedragingen koude vergelijken, werden koud opgewekte responsen gemeten tot 20 s afgesneden drie koud te koelen temperaturen (3, 10 en 20 ° C) en tot kamertemperatuur (RT) probe en uitgezet als cumulatieve responsen waargenomen in de tijd (Figuur 3). Ten eerste hebben we waargenomen dat de meeste reacties op koude temperaturen (3 ° C en 10 ° C) worden waargenomen tussen 1 en 10 seconden na probe applicatie (Figuur 3A - 3B), terwijl CT reacties lijken meer frequenties in onschadelijke temperaturen (20 ° C en room temperatuur (RT), Figuur 3C - 3D). Anderzijds wordt in de VS, PR en CT respons versus latentie curven waren niet significant verschillend van elkaar bij 3 ° C (Figuur 3A) bij 10 ° C, 20 ° C en kamertemperatuur, het CT respons versus latency curves significant verschillend van VS en / of PR , terwijl de VS en PR bochten waren niet significant verschillend van elkaar bij elke geteste temperatuur (door Long-rank (Mantel-Cox) en Gehan-Breslow-Wilcoxon test, figuur 3B - 3D (Figuur 3E). Voor dergelijke categorische vergelijking werden koud opgewekte responsen onderverdeeld in drie categorieën latentie: minder dan 4S, 4-10 s, en tussen 11-20 s (Figuur 3E - 3H). Het percentage responders per gedrag is weergegeven als een percentage van responders binnen elke categorie snelheid (resultaten werden statistisch vergeleken tussen gedrag van ARXC kruistabellen). Nogmaals, deze analyse toonde geen belangrijke verschillen tussen PR en US latentie responsen (Figuur 3E - 3H), maar CT reacties waren significant verschillend van PR 3 ° C en 10 ° C, en uit US bij alle temperaturen getest waaronder RT probe (Figuur 3E - 3F). Samen vormen deze gegevenstonen aan dat een 10 s assay cut-off is meer dan voldoende om betekenisvolle data sets verzamelt en dat de koude opgewekte CT reactie plaatsvindt bij relatief langere latenties dan US PR of responsen. Omdat er enige variabiliteit in reacties van larven rups, testten we drie sets van 20 larven bij elke temperatuur en meldde de standaardfout van het gemiddelde voor elke reactie (Figuur 3E - 3H).
Aangezien larvale grootte (en dus de relatieve omvang van de koude stimulus) kan sterk variëren tussen vroege en late 3e instar larven, vroege, middelste en late 3e larven werden getest bij 3 ° C en 10 ° C en de reacties werden vergeleken (figuur 4) . Vier tot vijf dagen oude larven culturen werden gebruikt om larven die vervolgens in gegroepeerd waren vroeg, midden of late 3e instar stadia ruw bij de lengte / grootte (figuur 4) te verzamelen. Interessant, sommige RespoNSE variabiliteit werd waargenomen tussen ontwikkelingsstadia afhankelijk van de temperatuur te testen. Bij 3 ° C, vroege 3e instar larven toonde minder PR en US responders en CT responders (Figuren 4A - 4C). Bij 10 ° C echter, geen reactie varieerde aanzienlijk per ontwikkelingsstadia (Figuren 4D - 4F). Het vergelijken van het totale percentage responders in de 10 s cut-off per gedrag op 3 ° C of 10 ° C blijkt dat slechts vroege 3e instar larven significant verschillend PR en CT responsen 3 ° C (Figuren 4G en 4H).
Klasse III meerdere dendritische sensorische neuronen rechtstreeks geactiveerd door kou en vereist voor CT reactie op de koude probe 7. Robuuste CT reacties kunnen ook ontstaan wanneer een koude stimulus aangebracht op gebieden van de voorste larva (hoofd) (Figuur 5B). Om te bepalen of koud opgewekte responsen van de directe stimulering van het hoofd ook eisen md neuronen (inclusief klasse III) een koude stimulus werd voorzichtig aangebracht op het hoofd van larven (figuur 5A) expressie brengen van een tetanustoxine transgen in alle md sensorische neuronen effectief elektrisch de mond te snoeren 3. Wanneer larven worden gestimuleerd op het hoofd met koude (6 ° C), een groot percentage van de larven nog produceerde een CT respons, hoewel md neuronen tot zwijgen gebracht (figuur 5B). Deze gegevens suggereren md neuronen zijn niet vereist voor een koud opgewekte CT bij het sonderen van de kop en het antwoord moet daarom om andere vormen van sensorische neuronen, die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze functie en test.
Figuur 1: Cold probe assay. (A) Diag koude probe toepassing 3e instar control (w 1118) larven. De aluminium koude sonde, op de gewenste temperatuur, is licht geplaatst op het dorsale A4 segment van de larve tot 10 s waardoor vrije bewegingsbereik. (B) een dwarsdoorsnede van de larve waarin de hoek van de sonde wordt toegepast. De sonde moet worden gehouden op bij benadering 45 ° hoek met de microscooptafel (stippellijn) en loodrecht op het sagittale lichaamsas van de larve tijdens de stimulatie. (C) Schematische weergave van de drie koude opgewekte gedrag waargenomen: (i) Krimp (CT) van de voorste en achterste naar het midden van het larvale lichaam (grijze pijlen), (ii) U-vorm (US): a 45- 90 (stippellijnen) verhogen van de voorste en achterste, en (iii) posterior heffen (PR): een 45-90 (stippellijnen) verhogen van de achterkant van de kop en staart naar het midden van het larvale lichaam (grijze pijlen) .
Figuur 2: Cold opgewekte respons versus temperatuur. (A) Percentage responders op middelbare 3e instar control (w 1118) larven over een gebied van lage temperaturen (3-22 ° C) of bij kamertemperatuur (RT) probe. (B) Percentage van PR, VS en (C) CT responders bij verschillende temperaturen met koude piek reacties aangegeven. (A - C) PR: postérieure raise, US: U-vorm, CT: Contract. Foutenstaven zijn standaard fout van het gemiddelde van 3 sets van n = 40 larven responsen gemiddeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figure 3: Cold-opgewekte reacties latency versus temperatuur. (A - D) Percentage cumulatieve US (rood), PR (blauw) of CT (groen) responders koude probe bij verschillende temperaturen (3 ° C, 10 ° C, 20 ° C en kamertemperatuur) in de tijd (1-20 s) controle (w 1118) larven. (E - H) Gemiddelde hoeveelheden snel (<4 s), langzaam (4-10 s) en late (11-12 s) reageren larven koude probe bij verschillende temperaturen (3 ° C, 10 ° C, 20 ° C en RT ). (A - H) Bij elke temperatuur, n = 3 sets van 40 larven werden getest. PR: posterior raise, US: U-vorm, CT: Contract, RT: kamertemperatuur. (A - D) NS: geen significante verschillen tussen gegevenssets, * = p-waarde <0,05, ** = p-waarde <0,0001 bij lange-rank (Mantel-Cox) testen Gehan-Breslow-Wilcoxon test. (EH) Foutenbalken geven sem * = p-waarde <0,05, ** = p-waarde <0.0001 door ARXC contingency tafel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Cold-opgewekte reacties latency in het begin, midden en late 3 e instar larven. Cumulatieve percentage responders een (A - C) 3 ° C of (D - F) 10 ° C koude probe tijd (1-20 s) begin (zwart), middelste (oranje) of laat (groen) 3e instar control ( w 1118) larven. Respons versus latency gescheiden door het gedrag: PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = P-waarde <0,05, ** = p-waarde <0,001 met lange-rank (Mantel-Cox) testen Gehan-Brelangzaam-Wilcoxon test. (G - H) Percentage cumulatieve responders een (G) 3 ° C of (H) 10 ° C koude sonde binnen 10 s in het begin, midden of late 3e instar larven. Fout balken geven sem * = p-waarde <0,05 door Exact test voor tweezijdig Fisher's. n = 3 sets van 20 larven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Bij stimulatie in het hoofd, kan koud opgewekte CT reacties vereisen md sensorische neuronen. (A) Schematische koude probe assay wanneer anterior wordt gestimuleerd 3e instar larven. (B) Gemiddeld percentage CT responders koude probe (6 ° C) wanneer larven worden gestimuleerd in de anteriof segmenten. Grijze balken: Genetische controles Groene balk: Alle md neuronen geluidgedempt expressie van het tetanustoxine transgen. Een inactieve vorm van het tetanustoxine transgen werd gebruikt als extra controle ( 'Inactief Tetanus'), n = 3 sets van 30 larven per genotype. Groene balk was niet significant af van alle relevante genetische controles verminderd met tweezijdige Fisher's Exact-test * p-waarde <0,05. (B) gebruikte genotypen (links naar rechts): W 1118 (controle), UAS-inactief tetanus / + (UAS alone), UAS-tetanus / + (UAS alone), MD-Gal4 / + (Gal4 alleen controle) MD-Gal4 / UAS-inactief tetanus (inactief tetanus controle tot expressie gebracht in alle neuronen md) en MD-Gal4 / UAS-actieve tetanus (experimentele conditie actieve tetanus expressie gebracht in alle neuronen md). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. </ P>
Tabel 1: vlieg voedselrecept voor koude probe assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven test kan worden gebruikt om nociceptie of nociceptieve sensibilisatie kwalitatief en kwantitatief beoordelen larven van verschillende genetische achtergronden, omgevingsinvloeden en / of beschadiging geïnduceerde omstandigheden. Aangezien deze test maakt voor focale toepassing van een koude stimulus, dit gereedschap kan men de functie van een subset van perifere sensorische neuronen evalueren specifiek reageren op lage temperaturen. Interessant is dat deze koud opgewekte gedrag lijken verschillende klassen van sensorische neuronen dan geactiveerd door warmte 7, 11 gebruiken, maar de volledige thermische nociceptieve circuit is nog niet volledig begrepen. Zoals vele andere lokale nociceptieve assays deze test wordt onderworpen aan enige variabiliteit tussen de gebruikers afhankelijk van de toepassing van de koude probe. Echter, de specifieke plaatsing van de koude sonde in het midden van het lichaam (het vermijden van de kop en staart) niet lijken een significa hebbennt effect op koude reacties 7. Praktijk en herhaling kan deze onderlinge gebruiker variabiliteit te minimaliseren.
We eerder gekenmerkte koude probe assay en meldde de specifieke kouderesponsieve neuronen en sensorische kanalen nodig zijn om de reactie CT 7 produceren. Hier hebben we te karakteriseren hoe latentiegegevens kan worden gekwantificeerd en geanalyseerd zoals een nociceptieve maatregel analyseren van gegevens uit meer afkappunten de meest optimale tijdsvenster voor de test te bepalen. We vonden dat de meeste koude opgewekte responsen optreden binnen 10 seconde stimulustoediening Dankzij een 10 tweede afgesneden zowel economisch en effectief. Ook, gezien het feit dat verschillende koude opgewekte gedrag piek bij verschillende temperaturen, de latencies van deze reacties zijn belangrijk om afzonderlijk te analyseren, zoals hier gedaan, om ten volle waarderen de robuustheid van de verschillende reacties bij verschillende temperaturen. We tonen ook aan, afhankelijk van het gedrag van zijn analeyzed, hoe larvale grootte kan koud-reacties van de consument beïnvloeden. Daarom houden larvale grootte consistent in alle behavioral experimenten nodig zal zijn. Tot slot laten we zien hoe deze test kan worden gebruikt voor het identificeren, of uit te sluiten, sets van sensorische neuronen die betrokken zijn bij koud nociceptie, die lijkt te variëren, afhankelijk van de locatie van de koude stimulatie van de larve.
Nu er een basislijn koude nociceptie test bestaat, kunnen we methoden voor schade en / of sensibilisatie op te nemen om meer ingewikkelde vragen over pijn biologie vragen. Zo is bekend dat zijdelings overhellen reacties op onschadelijke of schadelijke warmte gevoelig na UV schade aan de epidermis, die specifieke genetische mediatoren en TRP kanalen 12, 20, 21. Of vergelijkbaar UV-schade aan de epidermis resultaten bij gevoelige koude reacties en of gelijkaardige genetische pathways betrokken zijn is onbekend. Hetzelfde,
Er zijn een aantal statistische tests die moeten worden overwogen het gebruik van deze test. De statistische test hebben we het meest gebruikt is exact test van de Fischer met een Bonferroni correctie voor meerdere vergelijkingen, of de chi-kwadraat test. Deze tests worden gebruikt bij het vergelijken van de gemiddelde responders in staafgrafiekvorm (dus in figuur 3E - 3H figuur 4G - 4H en Figuur 5B). Voor het vergelijken van de cumulatieve latencies in lijngrafiek vorm, gebruikten we Long-rank (Mantel-Cox)-test 27, 28 en de Gehan-Breslow-Wilcoxon-test 29, 30, die beide doorgaans worden gebruikt om te overleven distributies te vergelijken. Wij stellen drie sets van 20-40 larven per genotype / experiment mogelijk te maken voor de berekening van een standaardafwijking van het gemiddelde tussen herhaalde sets.
Tot slot deze assay maakt precieze toepassing van een schadelijke stimulus koude en de resulterende gedragsreacties in Drosophila larven zijn gekarakteriseerd. Er is nog veel weten we niet over de cellen en genen die nodig zijn voor de nociceptie in vliegen of gewervelde dieren. Met deze test kan men de zeer handelbaar Drosophila systeem om snel te screenen op geconserveerde genen essentieel voor baseline nociceptie benutten identificeren nociceptieve circuits en cellulaire en genetische veranderingen die optreden na weefselbeschadiging nociceptieve sensibilisatie beoordelen. Uiteindelijk zal deze test de pijn veld winst waardevolle informatie over pijn biologie te helpen in een systeem datkan gemakkelijk worden toegepast op meer complexe diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Een Amerikaanse octrooiaanvrage (CL) wordt in afwachting op het ontwerp van de koude sonde. Bijkomende informatie over de details van de koude sonde onderdeelnummers en de bouw, evenals extra advies over het hulpmiddel ontwerp zal worden verstrekt op aanvraag.
Acknowledgments
Wij danken Sarah Wu en Camille Graham voor de ontwikkeling van de vroege stadia van de koude probe assay, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly voorraden en Galko lab leden voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NRSA (NIH F31NS083306) naar HNT, en door het NIH R01NS069828, R21NS087360 en een Universiteit van Texas MD Anderson Clark Fellowship in Basic Research naar MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
