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Neuroscience

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila - Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen.

Abstract

Wie Organismen erkennen und darauf reagieren auf schädliche Temperaturen ist noch wenig verstanden. Ferner sind die Mechanismen Sensibilisierung der sensorischen Maschinen zugrunde liegen, wie bei Patienten periphere Neuropathie oder Verletzung induzierte Sensibilisierung erfahren, nicht gut charakterisiert. Genetisch tractable Drosophila - Modell wird verwendet, um die Zellen und Gene zu untersuchen , die für schädliche Brunsterkennung, welches mehrere konservierte Gene von Interesse ergeben. Es ist wenig bekannt, aber über die Zellen und Rezeptoren wichtig für schädliche Kälte Erkundung. Obwohl nicht Drosophila nicht längere überleben Exposition gegenüber kalten Temperaturen (≤10 ° C), und vermeidet kühlen, lieber wärmere Temperaturen in Verhaltenspräferenztests, wie sie fühlen und möglicherweise schädliche Kältereize vermeiden wurde erst vor kurzem untersucht worden.

Hier beschreiben wir, und charakterisieren, die erste schädliche Kälte (≤10 ºC) Verhaltenstest inDrosophila. Mit diesem Tool und Test zeigen wir einen Ermittler, wie man qualitativ und quantitativ kalt nocizeptives Verhalten beurteilen. Dies kann unter normalen / gesunden Kulturbedingungen durchgeführt werden, oder vermutlich im Zusammenhang mit der Krankheit, Verletzung oder Sensibilisierung. Ferner kann dieser Assay für die Larven gewünschten Genotypen ausgewählt aufgebracht werden, die thermosensation auswirken könnten, Schmerzen oder nozizeptive Sensibilisierung. Da Schmerz ist ein hoch konservierter Prozess, unter Verwendung dieser Tests zum weiteren thermischen Nozizeption studieren wird wahrscheinlich wichtiges Verständnis der Schmerzprozesse in anderer Spezies aufzuzulesen, einschließlich Wirbeltiere.

Introduction

Drosophila hat sich als sehr nützlich für die Identifizierung von neuen Genen konserviert und neuronaler Schaltkreise sein , das komplexe Verhalten zugrunde liegen. Flies liefern eine hoch entwickelte genetische Toolkit und ein vereinfachtes Nervensystems , die 1, für die präzise genetische Manipulation und neuronaler erlauben 2, 3, 4 , um die zellulären und molekularen Grundlagen der Nozizeption 5, 6, 7 zu sezieren. Larven sind besonders nützlich für diese Analysen, da der Verhaltensassays für sanfte Berührung 8, 9, 10, schädliche Wärme 11, 12, 13 und die mechanische Empfindung von schädlichen Reizen 4, 11 haben bereits festgestellt worden ist , und die transparente Larvencuticula ermöglicht lebenden oder fixierten Abbildung der Epidermis und der darunter liegenden sensorischen Neuronen. Vor kurzem wurde ein Test für schädliche Kälte auch 7 entwickelt, die wir hier näher beschreiben.

Unter Verwendung eine feine, konisch bestückte kalte Sonde zeigen wir , dass Drosophila - Larven zeigen eine Reihe von Kalt spezifischen reaktiven Verhaltensweisen, die sich von Verhaltensweisen während der normalen Fortbewegung, folgenden sanfte Berührung beobachtet oder nach hartem mechanischem oder hohen Temperaturen Stimuli 7, 8, 11 . Die kalt spezifischen Verhaltensweisen beinhalten eine robuste Ganzkörper-Kontraktion (CT), ein 45-90º Erhöhung der posterioren Segmente (PR) und einer gleichzeitigen Erhöhung der vorderen und hinteren Segmente in einer U-Form (US). Die Prävalenz dieser Verhaltensweisen steigt mit abnehmender Temperatur, aber jedes Peaks bei sleicht unterschiedliche kalte Temperaturen. Neuere Arbeiten legen nahe , dass CT - Antworten von verschiedenen peripheren sensorischen Neuronen als die vermittelt werden , die 7 bis schädlicher Hitze oder groben mechanischen Reiz reagieren.

Ähnlich wie wirbel Nozizeptoren, Drosophila multiple dendritische (md) periphere sensorische Neuronen haben komplexe dendritische Strukturen , die 1 über die Epidermis verzweigen. md Neuronen ist in jedem larvalen Körpersegment, ihre Axone zu der Bauchmark 14 vorsteht. md sensorische Neuronen sind in vier verschiedene Klassen eingeteilt (I-IV) auf dendritische Morphologie basierten und sensorische Funktionen haben variierende 4, 9, 10, 15, 16, 17. Während Klasse IV Neuronen sind für die Larven seitliche Wankbewegungen Antworten erforderlichgegenüber hohe Temperaturen oder aggressiven mechanischen Reiz 4, Klasse III - Neuronen sind für die sanfte Berührung Antworten 9, 10 erforderlich , und werden nicht nur durch Kalt aktiviert, sind jedoch für die Kalt evozierten Verhaltensreaktionen 7 ebenfalls erforderlich. Beiden Klassen III und Klasse IV Neuronen verwenden diskrete transient receptor potential (TRP) Kanäle Verhaltensreaktionen auf schädliches 7, 11, 18 und nicht-schädlichen Reiz 9, 10, 17, 19 zu erleichtern. Ferner ist Larven Nozizeption nach einer Verletzung sensibilisiert, auf zellulärer 20 und Verhaltensstufen 12, 21.

Der Test hier beschrieben ermöglicht die quantification entweder normal oder möglicherweise veränderte Verhaltensreaktionen auf kalte Temperaturen im Bereich von schädlicher Kälte (≤ 10 ° C), unschädliche kühlen (11-17 ºC), auf Umgebungstemperatur (18-22 ºC). Die kalten Temperaturen in diesem Test verwendet werden , sind fähig Klasse III sensorische Neuronen direkt Aktivierung Hervorrufen robust, reproduzierbar Calciumerhöhungen und kalt evozierten Verhaltensreaktionen, die qualitativ und quantitativ sein können , 7 analysiert. Dieser Test kann auf unterschiedliche Umweltbedingungen (veränderte Ernährung, Verletzungen, pharmakologische Wirkstoffe) sowohl genetische als auch Umweltfaktoren zu bestimmen, ausgesetzt von praktisch jeden Genotyp sowie den Larven Larven angewandt werden, die kalt Nozizeption, nozizeptive Sensibilisierung oder nozizeptiven Plastizität auswirken. Da thermosensation ist allgegenwärtig in vielen Arten, stellt dieser Test ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Nozizeption und kann neue Genziele oder neuronale Interaktionen aufzudecken, die verbessernunser Verständnis von Wirbeln Nozizeption.

Die angefertigten kalte Sonde (siehe kalte Sonde, Table of Materials) verwendet eine geschlossene Regelkreis Temperatur Peltier - Vorrichtung gesteuert wird , die die Aluminiumschaft und konische Spitze durch Wärmeleitung kühlt. Ein Thermistor ist im Inneren der Aluminium-konischen Spitze eingebetteten berichtet die Echtzeit-Temperatur auf die Steuereinheit. Ein Kühlkörper und Lüfter sind mit der thermoelektrischen Modul befestigt , um den Peltier - Effekt der Wärmelast (Qc) so den gewünschten Temperaturbereich von (22-0 ° C) zu regulieren (siehe Thermal Control Unit, Table of Materials) erreicht werden. Der gesundheitsschädliche Kältereiz des kalten Sondenspitze mit der Hand auf die dorsalen Mittellinie aufgebracht wird, zu segmentieren (n) im gleichen Abstand von vorderen und hinteren Enden der Larve (ungefähr Segment A4, siehe 1A). Als Reaktion auf Kältereize, Larven erzeugen im allgemeinen eine von drei Kalt evozierte Verhaltensweisen innerhalb von 10 s Cutoff: ein GanzkörperKontraktion (CT), eine Erhöhung von 45-90º anterioren und posterioren Segmente in einer U-Form (US) oder eine Erhöhung der posterioren Segmente (PR) (im beschriebenen Ergebnisse). Keines dieser Verhaltensweisen während des normalen peristaltische Fortbewegung oder Nahrungssuchverhalten durchgeführt. Diese Verhaltensweisen sind auch verschieden von sanfter Berührung Reaktionen und die aversiven Roll Reaktion auf hohe Temperaturen oder schädliche mechanische Reize.

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Protocol

1. Herstellung von Larvae

  1. Heben Sie Aktien oder genetische Kreuzungen in einem 25 ° C Inkubator.
    1. Wenn ein Kreuz Kultivierung verwendet 20-25 jungfräuliche Weibchen und Männchen 15-20 pro Fläschchen regelmäßige cornmeal Fliegen Medien enthält. Lassen Sie Weibchen Eier legen für etwa 48 Stunden, bevor sie in ein neues Fläschchen von Lebensmitteln zu übertragen.
  2. 4-5 Tage nach der Eierlegens, sammeln 3. Larvenstadium des gewünschten Genotyps durch vorsichtiges einen Strom von Wasser in die breiartige Nahrung und Larven, spritz- und den Inhalt in eine mittlere, saubere Petrischale gießen (60 mm x 15 mm).
  3. Als nächstes sanft Larven nach Größe mit einer Pinzette oder einem Pinsel sortiert größeren „wandernden 3. Instar“ oder kleine sickly Larven auszuschließen getestet vom werden. Discard Larven keine unerwünschten genetischen Markern oder Ausgleicher enthält.
  4. Haben Sie ein Kerl Labor Mitglied Etikett Gerichte oder Container, in denen sortiert Larven platziert werden, so dass der Experimentator „blind“ auf die Ex sein kannperimental Zustand oder Genotyp der Larven, wenn anwendbar. Der Experimentator kann entschlüsselten Etikett gesammelte Daten nach dem Experiment anwenden einen Schlüssel von einem Labor-Mitglied generiert.
  5. Verwendung einen Spatel, überträgt einen Dime große Menge frischer Lebensmittel in ein (35 mm x 10 mm oder 60 mm x 15 mm) sauber, markierten Petrischalen gefüllt Hälfte mit Wasser von Raumtemperatur.
  6. Sanft bewegen, um die Nahrung auf die sortierte Larven (Hungern oder Austrocknung zu verhindern, wenn der Test über 20 min zu nehmen erwartet wird) mit einer Pinzette oder einem Pinsel.

2. Kalt Probe Assay

  1. Schalten Sie den kalten Sondeneinheit ermöglicht einige min auf die gewünschte Temperatur zu kühlen. Wenn auf niedrigere Temperaturen einstellen, Kondenswasser entlang der Sonde wahrscheinlich bilden.
  2. Wischen Sie überschüssige Feuchtigkeit mit einem Labortuch vor dem Auftragen auf die Larve. Wenn er nicht in der sofortigen Einsatz, isolierende Stelle Kappe auf Sonde sowohl zu isolieren und die Spitze sauber zu halten und Schäden zu vermeiden.
  3. Legen Sie eine Mitte 3. Larvenstadium auf ein dünnes Stück dunkle beweglichen Vinyl (typischerweise mit einem kleinen Stück von einem Notebook Bindemittel geschnitten) unter einem Hellfeld - Mikroskop. Die schwarzen Vinyl AIDS in Kontrastdarstellung und in die Larve Bewegen ohne es zu berühren sie mit der Sonde richtig auszurichten.
  4. Stellen Sie das Mikroskop (siehe Tabelle of Materials) und die Lichteinheit (siehe Tabelle of Materials) bis mittlere Helligkeit (50-75% max Helligkeit) Kontrast zu schaffen und zu verhindern , die Larve vor dem Austrocknen zu schnell aus.
  5. Entsorgen Sie alle Larven, die nicht zuerst normale peristaltische Fortbewegung aufweisen, wie sie die Ergebnisse durcheinander bringen könnte. Die Larve sollte feucht sein, aus der Petrischale von Wasser sonst die Larve zum Hemmen Vinyl normale Fortbewegung haftet. Das Wasser sollte nicht um die Larve Pfütze.
  6. Voraus, um die Sonde mit der Hand in Richtung der Larve in einem 90º Winkel zu der anteroposterioren Körperachse, die mit der Vinyl Larve in cor zu bewegenrect Position (siehe 1A).
  7. Orient die Spitze der Sonde zu legen, leicht über die Mitte der dorsalen Oberfläche der Larve mit der Sonde bei etwa einem 45 ° Winkel zu dem Mikroskoptisch.
  8. Bei Antastelement, ein Labor-Timer starten. Genügend Druck nach unten zu leicht, die Oberfläche der Larvencuticula einrücken, während noch Vorwärts- oder Rückwärtsbewegung ermöglicht wird.
  9. Halten Sie die Sonde in Platz für bis zu 10 s oder bis eine Kalt evozierte Verhaltensreaktion beobachtet wird - je nachdem, was zuerst eintritt. Dann die Sonde entfernen.
  10. Notieren Sie sich die beobachteten Verhaltensreaktion und die Antwort-Latenz. Larven, die nicht innerhalb von 10 s reagieren werden „Non-Responder“ betrachtet. Latenz kann auch für Responder aufgezeichnet und verwendet, um Änderungen in Reaktion Robustheit / Amplitude zu messen.
  11. Entsorgen Larve und bereiten die nächste.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,11, bis die gewünschte Anzahl von Testlarven erreicht ist (drei Sätze von n = 20-40 Larven wurden used hier).

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Representative Results

Drosophila - Larven bewegen sich mit einer peristaltischen Bewegung , die gelegentliche Pausen umfasst, Kopf dreht, und Änderungen in der Richtung 22. Als Reaktion auf die fokale Anwendung eines schädlichen Kältereiz jedoch Larven zeigen eine Reihe von einzigartigen Verhalten, im Gegensatz zu den aversiven Seitenrolle schädliche Hitze und mechanische Reize. Diese Verhaltensweisen sind auch verschieden von Antworten auf sanfte Berührung 8, 9, 10 oder an die Berührung eines Raumtemperaturfühler. Die kalt evozierten Verhaltensweisen sind wie folgt: die vorderen und hinteren Segmente in Richtung der Mitte des Körpers in einer Kontraktion (CT) scrunching, Anheben ihres vorderen und hinteren Segmente (ca. 45-90 °) in die Luft, ein U- Herstellung Form (US), oder nur ihre hinteren Segmente (ca. 45-90 °) in die Luft (PR) (Abbildung 1) zu erhöhen. der Experimentatordarauf hingewiesen werden soll, dass diese Verhaltensbeschreibungen qualitative Richtlinien statt quantitative cut-offs sind. Diese Antworten werden über einen Bereich von kalten Temperaturen beobachtet 3-18 ºC (2A). Jedoch unterschiedliche Verhaltensweisen Spitze über verschiedene Kaltbereiche (2B und 2C): 3-8 ºC für PR und US und 9-14 ºC für CT. CT ist die einzige Kalt evozierten Reaktion gelegentlich in kleinem Prozentsatz der Larven in Reaktion auf sanfte Berührung beobachtet, eine bei Raumtemperatur (RT) Sonde (Abbildung 2). Latenzinformationen können auch gesammelt und statistisch verglichen unter Verwendung dieses Tests (siehe unten für statistische Tests verwendet), die interessanten Informationen nach einer Verletzung oder einem anderen Umgebungsbedingung ergeben kann.

Um Latenzen der verschiedenen kalten Verhalten zu vergleichen, Kälte hervorgerufenen Reaktionen wurden auf ein 20 s Cut-off bei drei kalt zu kühlen Tempera gemessen bisturen (3, 10 und 20 ºC) sowie eine bei Raumtemperatur (RT) und Sonde aufgetragen als kumulative Antworten über die Zeit beobachtet wird (Abbildung 3). Erstens haben wir beobachtet , dass die meisten Reaktionen auf kalte Temperaturen (3 ° C und 10 ° C) zwischen 1 und 10 s nach der Sondenanwendung beobachtet (3A - 3B), während der CT - Antworten mehr Frequenzen zu haben , bei unschädlichen Temperaturen erscheinen (20 ºC und Raum Temperatur (RT), 3C - 3D). Zweitens, obwohl US, PR und CT - Antwort gegenüber Latenz Kurven voneinander nicht signifikant unterschiedlich war bei 3 ºC (3A) bei 10 ºC, 20 ºC und RT, die CT - Antwort gegenüber Latenz Kurven waren signifikant verschieden von US und / oder Pr , während der US - und PR - Kurven waren nicht signifikant verschieden voneinander bei jeder Temperatur getestet (durch Lang Rang (Mantel-Cox) und Gehan-Breslow-Wilcoxon - Test, 3B - 3D (Figur 3E). Für diese Art der kategorischen Vergleich, Kälte hervorgerufenen Reaktionen wurden gruppiert in drei Kategorien Latenz: weniger als 4 s, zwischen 4-10 s, und zwischen 11 bis 20 s (3E - 3H). Der Prozentsatz der Responder für jedes Verhalten als Anteil der Responder repräsentiert wird innerhalb jeder Geschwindigkeitsklasse fallen (die Ergebnisse wurden statistisch zwischen Verhaltensweisen durch arxc Kontingenztabelle verglichen). Auch hier ergab diese Analyse keine signifikanten Unterschiede zwischen PR und US - Latenz - Antworten (3E - 3H), aber CT Reaktionen waren signifikant verschieden von PR bei 3 ºC und 10 ºC, und von uns bei allen Temperaturen getestet , einschließlich der RT - Sonde (Abbildung 3E - 3F). Zusammen stellen diese Datenzeigen, daß ein 10 s-Assay abgeschnittene mehr als ausreichend ist, sinnvolle Datensätze zu sammeln, und dass die Kalt evozierten Reaktion CT erfolgt bei relativ längeren Latenzen als US oder PR-Antworten. Da es eine gewisse Variabilität in Antworten von Larve Larve ist, testeten wir drei Sätze von 20 Larven bei jeder Temperatur und berichten den Standardfehler des Mittelwerts für jede Antwort (Abbildung 3E - 3H).

Da Larven Größe (und damit die relative Größe des Kältereiz) kann stark zwischen den frühen und späten dritten Larvenstadium, frühe, mittlere und späte 3. Larven bei 3 ºC variieren getestet wurden und 10 ºC und ihre Antworten wurden verglichen (Abbildung 4) . Vier bis fünf Tage alten Larvenkulturen wurden verwendet , Larven zu sammeln , die dann in frühen gruppiert wurden, Mitte oder Ende der 3. Häutung Stufen grob durch ihre Länge / Größe (Abbildung 4). Interessanterweise einige Response Variabilität zwischen Entwicklungsstufen in Abhängigkeit von der Temperatur getestet gesehen. Bei 3 ° C, zeigte früh 3. Larvenstadium weniger PR und US - Responder und mehr CT - Responder (4A - 4C). Bei 10 ° C jedoch variierte keine Reaktion im wesentlichen über Entwicklungsstadien (Figuren 4D - 4F). Vergleicht man die Gesamt Prozent Responder an den 10 s Cut-off für jedes Verhalten bei 3 ° C oder 10 ° C zeigt , dass nur früh 3. Larvenstadium signifikant unterschiedliche PR und CT - Antworten bei 3 ºC (Figuren 4G und 4H).

Klasse III multiple dendritischen sensorische Neuronen werden durch Kälte direkt aktiviert und werden für die CT Reaktion auf die kalte Sonde 7 erforderlich. Robust CT Reaktionen können auch entstehen, wenn ein Kältereiz angewandt wird Regionen der la nach anteriorRVA (der Kopf) (5B). Um festzustellen , ob kalt evozierten Reaktionen von den direkten Stimulation des Kopfes resultierende erfordern auch md Neuronen (einschließlich Klasse III) war ein Kältereiz sanft angelegt an den Kopf der Larven (5A) eine Tetanus - Toxin - Transgen in allen md sensorisch Neuronen exprimiert , effektiv elektrisch zum Schweigen zu bringen , sie 3. Wenn Larven auf dem Kopf stimuliert werden mit kalten (6 ºC), ein großer Prozentsatz der Larven erzeugte immer noch eine CT Reaktion trotz md Neuronen wird stumm (5B). Diese Daten legen nahe md Neuronen sind nicht für eine Kalt evozierte CT erforderlich ist, wenn der Kopf Sondieren, und diese Antwort daher andere Arten von sensorischen Neuronen benötigen, müssen, die mit diesem Werkzeug und Test identifiziert werden konnten.

Abbildung 1
Abbildung 1: Kalte - Sonden - Assay. (A) DiaGramm kalten Sonde Anwendung 3. Instar Steuerung (w 1118) Larve. Die Aluminium-Kaltsondenspitze, auf die gewünschte Temperatur, wird leicht für bis zu 10 s auf dem dorsalen A4 Segment der Larve gelegt freien Bewegungsbereich ermöglicht wird. (B) ein Querschnitt der Larve anzeigt , den Winkel der Sonde , wie sie angewendet wird. Die Sonde sollte bei einer ungefähren Winkel von 45 ° zu dem Mikroskoptisch (gestrichelte Linie) und senkrecht zur Körperachse anteroposterioren der Larve während der Stimulation statt. (C) Schematische Darstellung der drei Kalt evozierten Verhalten beobachtet: (i) Contraction (CT) der vorderen und hinteren Richtung auf das Zentrum des Larvenkörper (graue Pfeile), (ii) U-Form (US): a 45- 90 (gestrichelte Linien) Erhöhung des anterioren und posterioren und (iii) erhöhen posterior (PR): ein 45-90 (gestrichelte Linien) heben der hinter des Kopfes und Schwanzes in Richtung der Mitte des Larvenkörpers (graue Pfeile) .


Abbildung 2: Kalt-evozierten Reaktion als Funktion der Temperatur. (A) Prozent der Responder in mittlerer 3. Instar Steuerung (w 1118) Larven über einen Bereich von kalten Temperaturen (3-22 ° C) oder bei Raumtemperatur (RT) -Sonde. (B) in Prozent von PR, USA und (C) CT Responder bei verschiedenen kalten Temperaturen mit Peak - Antworten angegeben. (A - C) PR: posterior Erhöhung, US: U-Form, CT: Contract. Die Fehlerbalken sind Standardfehler des Mittelwerts für 3 Sätze von n = 40 Larven, Antworten gemittelt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
figurE 3: Kalt evozierten Reaktionslatenz gegenüber der Temperatur. (A - D) Prozent der kumulativen US (rot), PR (blau) oder CT (grün) Responder kalte Sonde bei verschiedenen Temperaturen (3e C, 10 ° C, 20 ° C und RT) über die Zeit (1-20 s) Kontrolle (w 1118) Larven. (E - H) Durchschnittliche Anteile von schnell (<4 s), langsam (4-10 s) und späten (11-12 s) reagieren Larven kalte Sonde bei verschiedenen Temperaturen (3º C, 10 ºC, 20 ºC und RT ). (A - H) für jede Temperatur, n = 3 Sätze von 40 Larven wurden getestet. PR: posterior Erhöhung, US: U-Form, CT: Vertrag, RT: Raumtemperatur. (A - D) NS: keine signifikanten Unterschiede zwischen Datensatz, * = p-Wert <0,05, ** = p-Wert <0,0001 von Lang Rang (Mantel-Cox - Test) und Gehan-Breslow-Wilcoxon - Test. (EH) Fehlerbalken zeigen SEM * = p-Wert <0,05, ** = p-Wert <0.0001 von arxc Kontingenztafel. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Kalt evozierten Reaktion Latenz in der frühen, mittleren und späten 3. Larvenstadium. Prozent kumulative Responder auf ein (A - C) 3 ºC oder (D - F) 10 ºC kalte Sonde über die Zeit (1-20 s) in der frühen (schwarz), Mitte (orange) oder spät (grün) 3. Instar Steuerung ( w 1118) Larven. Reaktionen im Vergleich zu Latenz durch Verhalten getrennt: PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = P-Wert <0,05, ** = p-Wert <0,001 von Lang Rang (Mantel-Cox-Test) und Gehan-Brelangsam-Wilcoxon-Test. (G - H) Prozentualer Anteil der kumulativen Responder auf einem (G) 3 ºC oder (H) 10 ºC kalten Sonde innerhalb von 10 s in der frühen, mittleren oder späten 3. Larvenstadium. Fehlerbalken zeigen SEM * = p-Wert <0,05 von zweiseitigen Fisher-Exact-Test. n = 3 Sätze von 20 Larven. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Wenn im Kopf stimuliert, kalt evozierte CT Antworten nicht md sensorisch Neuronen benötigen. (A) Schematische Darstellung des kalten Sondenassay , wenn anterioren wird in 3 rd instar Larven stimuliert. (B) Mittlere Prozent CT Responder auf kalte Sonde (6 ºC) , wenn Larven in dem am meisten anteri stimuliertoder Segmente. Graue Balken: Genetische Kontrollen, grüne Balken: alle md Neuronen durch die Expression der Tetanustoxin-Transgen zum Schweigen gebracht. Eine inaktive Form des Transgen Tetanustoxin wurde als zusätzliche Kontrolle ( ‚Inaktiv Tetanus‘), n = 3 Sätze von 30 Larven pro Genotyp verwendet. Grüne bar nicht signifikant von allen relevanten genetischen Kontrollen reduziert wurde zweiseitige Fisher-Exact-Test * p-Wert <0,05. (B) Die Genotypen verwendete ( von links nach rechts): w 1118 (Kontrolle), UAS-inaktive Tetanus / + (UAS allein Kontrolle), UAS-Tetanus / + (UAS allein Kontrolle), MD-Gal4 / + (Gal4 alleine Kontrolle) , MD-Gal4 / UAS-inactive Tetanus (inaktiv Tetanus Kontrolle ausgedrückt in allen Neuronen md) und MD-Gal4 / UAS-aktive Tetanus (Versuchsbedingung aktive Tetanus in alle Neuronen exprimiert md). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>

Abbildung 4
Tabelle 1: Fliegen Nahrungsmittelrezept für kalte Sonden - Assay.

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Discussion

Der Test hier beschrieben ist, kann verwendet werden, um qualitativ und quantitativ Nozizeption oder nozizeptive Sensibilisierung in Larven von verschiedenen genetischen Hintergründen, Umwelteinflüssen zu bewerten und / oder Schäden induzierten Bedingungen. Da dieser Test für Focal Anwendung eines Kältereizes ermöglicht, mit diesem Werkzeug kann man die Funktion einer Untergruppe von peripheren sensorischen Neuronen spezifisch an kalten Temperaturen bei der Reaktion abzuschätzen. Interessanterweise scheinen diese Kälte hervorgerufene Verhalten verschiedene Klassen von sensorischen Neuronen als die durch Hitze 7, 11, aber die volle thermische nozizeptive Schaltung ist noch nicht vollständig verstanden aktiviert zu nutzen. Wie viele andere lokale nozizeptiven Tests ist dieser Test zu einem gewissen Variabilität zwischen den Nutzern Thema auf der Anwendung der kalten Sonde abhängig. Allerdings ist die spezifische Anordnung der kalten Sonde in der Mitte des Körpers (der Kopf und Schwanz zu vermeiden) nicht scheinen eine significa zu habennt Auswirkungen auf dem kalten Antworten 7. Übung und Wiederholung können diesen inter Benutzer Variabilität minimieren.

Wir gekennzeichnet zuvor die kalten Sonden - Assay und berichten die spezifisch Kalt reagierende Neuronen und Sinneskanäle erforderlich , um die Reaktion CT 7 zu erzeugen. Hier weiter charakterisieren wir, wie Latenzzeit-Daten können als eine weitere Maßnahme nozizeptiven quantifiziert und analysiert werden, Daten von mehr abgeschnittene Punkte Analysieren der optimalste Zeitfenster für den Test zu bestimmen. Wir fanden heraus, dass die Mehrheit der Kälte hervorgerufenen Reaktionen innerhalb 10 Sekunden von Reizapplikation auftreten, wird ein 10 Sekunden wirtschaftlich und effektiv abgeschnitten zu machen. Auch, da verschiedenes kalt evozierte Verhalten Peak bei verschiedenen Temperaturen, die Latenzen dieser Antworten sind wichtig, separat zu analysieren, wie hier geschehen, zu schätzen voll die Robustheit der unterschiedlichen Reaktionen bei verschiedenen Temperaturen. Wir zeigen auch, je nach Verhalten ist analyzed, wie Larvengröße kann kalt hervorgerufenen Reaktionen beeinflussen. Daher wird Larvengröße konsistent in allen Verhaltensexperimenten zu halten notwendig. Schließlich zeigen wir, wie dieser Test verwendet werden kann, zu identifizieren oder auszuschließen, Sätze von sensorischen Neuronen in kalter Nozizeption beteiligt, die je nach Lage des Kältereizes auf die Larve zu verändern scheinen.

Nun, da eine Basislinie kalt Nozizeption Assay vorhanden ist, können wir Methoden der Beschädigung und / oder Sensibilisierung integrieren kompliziertere Fragen zu Schmerzen Biologie zu fragen. Beispielsweise ist es bekannt , dass seitliche Wankbewegungen Reaktionen zu unschädlichen oder schädlichen Wärme sensibilisiert sind nach der UV - Schädigung der Epidermis und erfordern spezifische genetische Mediatoren und TRP - Kanäle 12, 20, 21. Ob ähnliche UV-Schädigung der Epidermis Ergebnisse bei sensibilisierten Kälte Reaktionen und ob ähnliche genetische Wege beteiligt sind, ist nicht bekannt. Gleichfalls, 23 zu induzieren, 24 oder aussetzen Arzneimittel 25, 26, die verwendet werden können morphologische und genetische Veränderungen nozizeptiven Neuronen und Schaltungen zu befragen.

Es gibt eine Reihe von statistischen Tests, die unter Verwendung dieses Tests in Betracht gezogen werden sollte. Der statistische Test, den wir am häufigsten verwendet wird, ist der exakte Test nach Fischer mit einer Bonferroni-Korrektur für Mehrfachvergleiche oder den Chi-Quadrat-Test. Diese Tests werden verwendet, wenn mittlere Respondern in Bargraph Form zu vergleichen ( das heißt in Figur 3E - 3H, 4G - 4H und 5B). Für kumulative Latenzen in Liniendiagramm Form zu vergleichen, haben wir Lang Rang (Mantel-Cox - Test) 27, 28 und der Gehan-Breslow-WilcoxonTest 29, 30 , die beide verwendet werden typischerweise Überleben Verteilungen zu vergleichen. Wir schlagen vor, drei Sätze von 20 bis 40 Larven für jeden Genotyp / Experiment für die Berechnung der Standardabweichung vom Mittelwert zwischen wiederholten Sätzen zu ermöglichen.

Abschließend kann dieser Assay für die präzise Anwendung eines schädlichen Kältereiz und die resultierenden Verhaltensreaktionen in Drosophila - Larven wurden charakterisiert. Es gibt noch viel wir nicht wissen, über die Zellen und Gene, die für die Nozizeption erforderlich Fliegen oder Wirbeltiere. Mit diesem Test kann man das hoch lenkbar Drosophila - System verwendet schnell entscheidend Nozizeption für die Baseline für konservierte Gene zu screenen, identifizieren nozizeptiven Schaltungen und bewertet zellulären und genetische Veränderungen , die nach Gewebeschädigungen auftreten zu nozizeptive Sensibilisierung verursachen. Letztendlich wird dieser Test der Schmerz Feldverstärkung wertvolle Informationen über Schmerz Biologie in einem System, Online-Hilfe,kann leicht zu komplexeren Tiermodellen angewendet werden.

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Disclosures

Eine US-Patentanmeldung (CL) fehlt noch auf der Gestaltung der kalten Sonde. Weitere Informationen über Einzelheiten der kalten Sonde Teilenummern und Konstruktion, sowie zusätzliche Beratung über Werkzeugkonstruktion werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden.

Acknowledgments

Wir danken Sarah Wu und Camille Graham für die kritische Lektüre des Manuskripts frühen Phasen des kalten Sondentest, der Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Aktien und Galko lab Mitglieder zu entwickeln. Diese Arbeit wurde durch die NIH NRSA (NIH F31NS083306) zu HNT, und von NIH R01NS069828, R21NS087360 und University of Texas MD Anderson Clark Stipendium in der Grundlagenforschung zu MJG unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscience Ausgabe 122 sensorische Neurowissenschaften thermosensation, thermische Nozizeption Schmerzen Nozizeption kalte Verhaltensassay dendritische arborization Neuronen transient receptor potential (TRP) Kanäle.
Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae
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Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

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