Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55568
Automatic Translation
1,2,5, 3, 1,2,4
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

Summary

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

Abstract

איך אורגניזמים לחוש ולהגיב לטמפרטורות רעילות עדיין הוא הבין היטב. בהמשך, המנגנונים רגישים של המכונות החושיות, כגון בחולים חווים נוירופתיה היקפית או רגישות מושרה פציעה, אינם מתאפיינים גם. המודל תסיסנית הגנטי הצייתן נעשה שימוש כדי לחקור את תאי גנים דרושים זיהוי חום רעיל, אשר הניב גנים שמורים מרובים של עניין. מעט מאוד ידוע זאת על תאי קולטנים חשובים עבור חישה קרה רעילה. למרות, דרוזופילה לא לשרוד חשיפה ממושכת לטמפרטורות קרות (≤10 ºC), ותמנע מגניב, והעדיפה בטמפרטורות חמות מבחני העדפה התנהגותית, איך הם מרגישים ואולי למנוע גירויים קרים רעילים יש רק נחקר לאחרונה.

כאן אנו מתארים ולאפיין הקור הרעיל הראשון (≤10 ºC) assay התנהגותייםדרוזופילה. שימוש בכלי זה assay, אנו מראים חוקרים כיצד איכותיים וכמותית להעריך התנהגויות nociceptive קרות. ניתן לעשות זאת בתנאי תרבות נורמלים / בריאים, או כנראה בהקשר של מחלה, פציעה או רגישות. יתר על כן, ניתן ליישם assay כדי זחלים שנבחרו עבור גנוטיפים רצוי, אשר עשוי להשפיע thermosensation, כאב, או רגישות nociceptive. בהתחשב בכך כאב הוא תהליך שמור ביותר, באמצעות assay ללמוד nociception תרמית נוספת יהיה ללקט הבנה חשובה סביר של תהליכי כאב מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.

Introduction

דרוזופילה הוכיחה להיות שימושי מאוד עבור זיהוי של גנים שמורים הרומן ומעגלים עצביים העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות. זבובים לספק ערכת כלים גנטיות מתוחכמת ומערכת עצבים פשוטה המאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת עצבית 1, 2, 3, 4 לנתח הבסיסים התאיים ומולקולריים של nociception 5, 6, 7. זחלים הם שימושיים במיוחד עבור ניתוחים אלו, בהתחשב בעובדת מבחני התנהגות עבור מגע עדין 8, 9, 10, חום רעיל 11, 12, 13 ו תחושה מכאנית של גירוי מזיק 4, 11 כבר הוקמו, ואת לציפורן הזחל השקופה מאפשרת הדמיה לחיות או קבועה של האפידרמיס העצב סנסורי בסיסי. לאחרונה, ב assay עבור קר רעיל גם פותח 7, אשר אנו מתארים בפירוט רב יותר כאן.

באמצעות בדיקה קרה בסדר, קוניים שקצהו, אנו מראים כי תערוכת זחלים תסיסנית סט של התנהגויות תגובתי קרות ספציפיות, נבדל התנהגויות שנצפו בזמן תנועה נורמלית, הבאים במגע עדין, או אחרי גירויי טמפרטורה מכאניים או גבוהים קשים 7, 8, 11 . ההתנהגויות הקרות ספציפיות כוללות התכווצות גוף מלא וחזקה (CT), העלאת 45-90º המגזרים האחוריים (יח"צ) ו העלאה זמנית של הקדמי ואת הפלח אחורי לתוך בצורת U (ארה"ב). השכיחות של התנהגויות אלה מגדילה עם טמפרטורות ופוחתות אך כל פסגות בבית היםטמפרטורות שונות קרות בקלילות. מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך תגובות CT מתווכות על ידי עצב סנסורי פריפריה שונה מאלו להגיב חום רעיל או גירויים מכאניים קשים 7.

בדומה קולטן אזעקה החולייתנים, דנדריטים מרובים דרוזופילה (MD) עצב סנסורי הפריפריה יש מבנים דנדריטים מורכבים arborize מעל האפידרמיס 1. נוירונים MD נמצאים בכל מגזר גוף הזחל, מקרין האקסונים שלהם כדי העצב בחוט הגחון 14. עצב סנסורי MD מופרד לארבע כיתות שונות (I-IV) המבוססות על מורפולוגיה הדנדריטים ויש לי משתנה פונקציות חושיות 4, 9, 10, 15, 16, 17. בעוד נוירונים IV בכיתה נדרשים עבור תגובות רול גוף לרוחב זחללטמפרטורות גבוהות או גירויים מכאניים קשים III נוירונים 4, בכיתה נדרשות עבור תגובות מגע עדין 9, 10 ו לא מופעלים רק על ידי קר, אלא גם נדרשים עבור התגובות התנהגותיות הקרות עורר 7. שני נוירונים IV III ומעמד בכיתה לנצל ערוצי פוטנציאל הקולטן חולף דיסקרטיים (TRP) כדי להקל על תגובות התנהגותיות 7 רעילים, 11, 18 ו גירויים שאינם רעיל 9, 10, 17, 19. בהמשך, nociception הזחל הוא רגיש לפציעה הבאה, ברמה התאית 20 והתנהגותיים 12, 21.

Assay המתואר כאן מאפשר quantification של אחד נורמלי, או פוטנציאל לשנות תגובות התנהגותיות לטמפרטורות קרות החל קר מזיק (≤ 10 ºC), מגניב מזיק (11-17 ºC), כדי בטמפרטורות הסביבה (18-22 ºC). הטמפרטורות הקרות המשמשות assay זה מסוגלות מפעיל ישירות בכיתת III נוירונים חושיים, לעורר עליות סידן חזקות, לשחזור קר עורר תגובות התנהגותיות, אשר יכולה להיות איכותית וכמותית נתחו 7. ניתן ליישם assay זה כדי זחלים של כל גנוטיפ כמעט כמו גם זחלים חשופים לתנאים סביבתיים מגוונים (תזונת שינה, פגיעה, סוכנים תרופתיים) כדי לקבוע שניהם גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים nociception הקר, רגישות nociceptive או פלסטיות nociceptive. בהתחשב בכך thermosensation הוא נמצא בכל מקום על פני מינים רבים, assay זה מספק כלי רב ערך לחקר nociception ועלול לחשוף מטרות גן רומן או אינטראקציות עצביות שתשפרנההבנתנו nociception חוליות.

החללית הקרה שהותקנה (ראה בדיקה קרה, טבלת החומרים) מנצלת טמפרטורת לולאה סגורה מבוקרת מכשיר פלטייה, אשר מקרר את פיר אלומיניום טיפ חרוטים באמצעות הולכה תרמית. Thermistor מוטבע בתוך קצה קוני אלומיניום מדווח הטמפרטורה בזמן אמת על יחידת הבקרה. כיור ומאוורר מחוברים מודול התרמו להסדיר את עומס החום של אפקט פלטייה (קוו) ולכן טווח הטמפרטורה הרצויה של (22-0 מעלות צלזיוס) יכול להיות מושגת (ראה יחידת בקרת תרמית, ענייני חומרים). הגירוי הקר המזיק של בדיקת הקצה הקר מוחל ביד אל קו אמצע הגב, כדי לפלח (הים) במרחק שווה מן הקצוות קדמיים וגם אחוריים (בערך קטע A4, לראות באיור 1 א) של הזחל. בתגובה לגירויים קרים, זחלים בדרך כלל לייצר אחד משלוש התנהגויות קרות עורר בתוך החיתוך של 10: גוף מלאהתכווצות (CT), העלאה 45-90º של מגזרים קדמיים וגם אחוריים לתוך בצורת U (ארה"ב), או העלאה של המגזרים האחוריים (יח"צ) (המתוארים תוצאות). אף אחד ההתנהגויות אלה מבוצעים בזמן תנועה פריסטלטיות רגילה או התנהגות שיחור מזון. התנהגויות אלו הן גם נבדלים תגובות מגע עדינות התגובה מתגלגלת מרתיעת טמפרטורה גבוהה או גירויים מכאניים רעילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הזחלים

  1. רם מניות או צלבים גנטיים בתוך חממת 25 ºC.
    1. אם culturing צלב, להשתמש 20-25 נקבות בתולה ו 15-20 זכרים לכל בקבוקון המכיל תקשורת זבוב קמח תירס רגילה. אפשר נקבות להטיל ביצים במשך כ 48 שעות לפני העברתי בקבוקון חדש של מזון.
  2. 4-5 ימים לאחר ליי ביצה, לאסוף הזחלים instar 3 rd של הגנוטיפ הרצוי על ידי התזת בעדינות זרם של מים לתוך המזון וזחלים רגשני, ושופכים את תוכנה אל צלחת פטרי בגודל בינוני, נקי (60 מ"מ x 15 מ"מ).
  3. הבא, ולמיין זחלים בעדינות בעזרת מלקחיים באמצעות גודל או מכחול כדי למנוע גדול "נדודי 3 rd instar" או זחלים חולניים קטנים מ נבדק. זחלי מחק המכילים כל סמנים גנטיים או מאזנים רצויים.
  4. יש מאכלי תווית חבר במעבדת בחור או מכולות שבו זחלים ממוינים יוצבו כך הנסיין יכול להיות "עיוור" על האקסתנאי או הגנוטיפ perimental של הזחלים אם רלוונטי. הנסיין יכול להחיל תוויות מפוענחות נתונים שנאספו לאחר הניסוי באמצעות מפתח שנוצר על ידי חברי מעבדה.
  5. באמצעות scoopula, להעביר סכום פרוטה בגודל של מזון טרי לתוך (35 מ"מ x 10 מ"מ או 60 מ"מ x 15 מ"מ) נקי, מלא צלחת פטרי שכותרתו בחצי הדרך עם מים בטמפרטורת החדר.
  6. בעדינות להזיז את הזחלים הממוינים על המזון (כדי למנוע רעב או התייבשות אם צפויות בדיקות לקחת יותר מ 20 דקות) באמצעות מלקחיים או מכחול.

2. הקרה Probe Assay

  1. הפעל את יחידת הבדיקה הקרה המאפשרת כמה דקות עד שיתקרר לטמפרטורה הרצויה. אם הגדרתי לטמפרטורות נמוכות, התעבות תהווה סבירה לאורך החללית.
  2. נקה את כל עודף לחות עם מעבדה לנגב לפני בקשת הזחל. כאשר אינו בשימוש מיידי, במקום בידוד כובע על החללית לשני לבודד וכדי לשמור על קצה נקי ולמנוע נזק.
  3. מניח זחל instar באמצע 3 rd גבי פיסת דקה של ויניל נייד הכהה (בדרך כלל, להשתמש חתיכה קטנה לחתוך מתוך קלסר מחברת) תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. העזרים ויניל השחורים להדמיה ניגודיות בהעברת הזחל מבלי לגעת בו כדי ליישר את זה כמו שצריך עם החללית.
  4. כוון את המיקרוסקופ (ראו טבלה של חומרים) ויחידת אור (ראו טבלה של חומרים) כדי בהירות בינונית (בהירות מקסימום 50-75%) לספק בניגוד ולמנוע הזחל מהתייבשות מהר מדי.
  5. לבטל את כל זחלים אינם מציגים נורמליות ראשון נידות פריסטלטיות כפי שיכלו לבלבל את התוצאות. הזחל צריך להיות לח מצלחת פטרי של מים אחרים הזחל תדבק ויניל עיכוב תנועה נורמלית. מים צריכים לא רופסים סביב הזחל.
  6. Advance החללית ביד לכיוון הזחל בזווית 90º לצייר גוף anteroposterior, באמצעות ויניל כדי להזיז את הזחל לתוך corעמדת rect (ראה איור 1 א).
  7. כוון את הקצה של החללית להניח בעדינות על פני השטח הגבה באמצע של הזחל עם החללית בזווית של כ -45 אל במת מיקרוסקופ.
  8. במגע חללי, להפעיל טיימר מעבדה. החל מספיק לחץ כלפי מטה על מנת להגדיל את כניסת המשטח מעט של לציפורן הזחל תוך התרה קדימה או תנועה לאחור.
  9. החזק בדיקה במקום עד 10 s או עד לתגובה ההתנהגותית קר עורר הוא ציין - המוקדם מביניהם. ואז להסיר את החללית.
  10. רשום את התגובה ההתנהגותית שנצפתה ואת חביון התגובה. זחלים כי לא ישיבו תוך 10 ימים נחשבים "לא מגיב". זמן אחזור יכול גם להיות מוקלט עבור מגיבים ומשמש למדידת שינויים / משרעת חוסן תגובה.
  11. בטל זחל ולהכין את הבא.
  12. חזור על שלבי 2.3-2.11 עד המספר הרצוי של זחלי מבחן הוא הגיע (שלושה סטים של n = 20-40 זחלים היו used כאן).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דרוזופילה מהלך זחלים בתנועה פריסטלטיות הכוללת הפסקות מדי פעם, מפנה את ראשו, ואת שינויים בכיוון 22. בתגובה לבקשת מוקד של גירוי קור רעיל אולם, תערוכת זחלי סט של התנהגויות ייחודיות, בניגוד הגליל לרוחב המרתיע חום רעיל גירויים מכאניים. התנהגויות אלו הן גם שונות מתגובות כדי מגע עדין 8, 9, 10 או למגע של החללית בטמפרטורת החדר. ההתנהגויות הקרות עורר הן כדלקמן: נגרסים המגזרים הקדמיים וגם האחוריים שלהם לכיוון מרכז הגוף שלהם ביטוי בהתכווצות (CT), גיוס של המגזרים הקדמיים וגם האחוריים שלהם (כ 45-90 מעלות) לאוויר, עושה U- לעצב (ארה"ב), או העלאת קטעי האחורי שלהם בלבד (כ 45-90 מעלות) לאוויר (יח"צ) (איור 1). הנסייןצריך לשים לב לכך תיאורים התנהגותיים אלה הם קווים מנחים איכותיים ולא-offs לחתוך כמותית. תגובות אלה הם נצפו על פני טווח של טמפרטורות קרות 3-18 מעלות צלזיוס (איור 2 א). עם זאת, התנהגויות שיא שונות לאורך טווח קר שונה (איורי 2B ו 2C): 3-8 ºC עבור יחסי הציבור בארה"ב 9-14 ºC עבור CT. CT היא התגובה הקרה עורר רק שנצפתה לעתים אחוז הקטן של זחלים בתגובת מגע עדין, באמצעות בטמפרטורת חדר (RT) בדיקה (איור 2). מידע השהיה ניתן גם לאסוף סטטיסטי בהשוואה באמצעות assay (ראה להלן לבדיקות סטטיסטיות), אשר עשוי להניב מידע מעניין בעקבות פציעה או תנאים סביבתיים אחרים.

כדי להשוות שיהוי של ההתנהגויות קרות השונות, תגובות קרות עורר נמדדו עד חתוך 20 s בשלוש טמפרה קרה-אל-מגניבטורס (3, 10 ו 20 ºC) וכן בדיקה בטמפרטורת חדר (RT) ואת זממו כתגובות מצטברות נצפו לאורך זמן (איור 3). ראשית, ראינו כי רוב התגובות לטמפרטורות קרות (3 ºC ו 10 ºC) הם נצפו בין 1 ו 10 שניות לאחר יישום בדיקה (איור 3A - 3B), בעוד שתגובות CT נראה שיש תדרים יותר בטמפרטורות מזיקות (20 ºC וחדר טמפרטורה (RT), איור 3C - 3D). שנית, למרות בארה"ב, בתגובה PR ו CT לעומת עקומות חביון לא היו שונים משמעותית זה מזה ב 3 ºC (איור 3 א) ב 10 ºC, 20 ºC ו RT, התגובה CT לעומת עקומות חביון היו שונים משמעותית מארה"ב ו / או יחסי ציבור , ואילו בארה"ב עקומות PR לא היו שונים משמעותית זה מזה בכל בדיקות טמפרטורה (על ידי-דרגה לונג (מנטל-קוקס) ולבדוק Gehan-ברסלו-ווילקוקסון, 3B איור - 3D (איור 3E). עבור סוג זה של השוואת קטגורים, תגובות קרות עורר קובץ לשלוש קטגוריות חביון: פחות מ 4 ים, בין 4-10 ים, ובין 11-20 s (האיור 3E - 3H). אחוז המגיבים לכל התנהגות מיוצג שיעור המגיבים נופלים בתוך כל קטגוריה מהירה (ותוצאות הושוו סטטיסטי בין התנהגויות ידי שולחן המגירה arxc). שוב, ניתוח זה עולה כי אין הבדלים משמעותיים בין יח"צ ותגובות שהייה בארה"ב (איור 3E - 3H), אבל תגובות CT היו שונות באופן משמעותי מ PR ב 3 ºC ו 10 ºC, ומאתנו בכלל בטמפרטורות נבדקות כולל בדיקת RT (איור 3E - 3F). יחד, נתונים אלהלהראות כי חתוכי assay של 10 הם יותר מדרוש כדי לאסוף ערכות נתונים משמעותיות, וכי תגובת CT הקרה עורר מתרחשת שיהוי ארוך יחסית מאשר בארה"ב או בתגובות יח"צ. מאז יש כמה השתנות בתגובות מן זחל הזחל, בדקנו שלושה סטים של 20 זחלים בכל טמפרטורה דיווח על שגיאת התקן של הממוצע עבור כל תגובה (האיור 3E - 3H).

מאז גודל זחל (ולכן הגודל היחסי של גירוי הקור) יכול להשתנות במידה רבה בין מוקדם זחלי instar 3rd מאוחר, מוקדם, אמצעיים ומאוחרים 3 rd זחלים נבדקו 3 ºC ו 10 ºC והתגובות שלהם הושוו (איור 4) . ארבעה עד חמש תרבויות זחל יממה שמשו לאיסוף זחלים שקובצו אז לתוך מוקדם, באמצע או בסוף instar 3 שלבים בערך לפי האורך / הגודל שלהם (איור 4). מעניין, כמה respoהשתנות NSE נתפסו בין שלבי התפתחות בהתאם לטמפרטורה נבדקת. בשעת 3 ºC, מוקדם 3 rd instar זחלים הראו פחות מגיבי יחסי ציבור בארה"ב ועוד מגיבי CT (איורים 4 א - 4C). בשעת 10 ºC זאת, אין תגובה מגוונת משמעותי על פני שלבי התפתחותיים (4D הדמוי - 4F). השוואת המגיבים אחוז בסך הכל ב 10 שנות ה חתוכים לכל התנהגות בבית 3 ºC או 10 ºC מגלה כי רק הזחלים instar rd 3 מוקדם יש תגובות יחסי ציבור CT שונה משמעותית ב 3 ºC (איורים 4G ו- 4H).

Class III נוירונים חושיים דנדריטים מרובים מופעלים ישירות על ידי טמפרטורות קרות נדרשים לתגובת CT כדי החללית הקרה 7. תגובות CT חזקות יכולות להתעורר גם כאשר גירוי קר מוחל אל קדמי אזורי laRvA (הראש) (איור 5). כדי לקבוע אם תגובות קרות עוררת נובע הגירוי ישיר של הראש גם דורשים נוירונים MD (כולל מעמד III) גירוי קור יושם בעדינות אל ראש הזחלים (איור 5 א) מביע transgene רעלן טטנוס בכל עצב סנסורי MD ביעילות חשמלית להשתיק אותם 3. כאשר זחלים מגורים על הראש עם קר (6 ºC), אחוז גדול של זחלים עדיין הפיק תגובת CT, למרות נוירונים md להיות מושתקת (איור 5). נתונים אלה רומזים נוירונים MD אינם נדרשים עבור CT קר עורר כאשר חיטוט הראש, ותגובה זו ולכן חייבת לדרוש סוגים אחרים של עצב סנסורי, אשר ניתן לזהות באמצעות כלי assay זה.

איור 1
איור 1: assay בדיקה קר. (א) Dia גרם של יישום בדיקה קר לשליטת instar 3 rd (w 1118) זחל. בדיקת הקצה קרה האלומיניום, להגדיר את הטמפרטורה הרצויה, מושם קל על פלח A4 הגב של הזחל עד 10 s ומאפשר מגוון חופשי של תנועה. (ב) הצלבה של הזחל המציין את הזווית של החללית כפי שהוא מוחל. החללית צריכה להיות מוחזקת בזווית 45 מעלות בקירוב על במת מיקרוסקופ (קו מקווקו), ו בניצב לצייר גוף anteroposterior של הזחל במהלך הגירוי. (ג) תרשים של שלוש התנהגויות הקרות עורר ציין: (i) התכווצות (CT) של הקדמי וגם אחורי לכיוון מרכז גוף הזחל (חצים אפורים), (ii) U-Shape (ארה"ב): א 45 90 (קווים מקווקווים) להעלות את הקדמי וגם האחורי, וכן (iii) posterior רם (יח"צ): העלאה 45-90 (קווים מקווקווים) של האחורי של הראש והזנב לכיוון מרכז גוף הזחל (חצים אפורים) .

FO: keep-together.within-page = "1"> איור 2
איור 2: תגובה קרה עורר לעומת טמפרטורה. (א) אחוז המגיב בשליטת instar 3 rd באמצע (w 1118) זחלים על פני טווח של טמפרטורות קרות (3-22 ºC) או בטמפרטורת חדר (RT) חללית. (B) אחוז יחסי הציבור, ארה"ב (C) מגיבי CT בטמפרטורות קרות שונות עם תגובות שיא מצוינים. (A - C) יח"צ: העלאה אחורית, ארה"ב: U-Shape, CT: חוזה. ברי שגיאה הם סטיית התקן של הממוצע עבור 3 סטים של n = 40 זחלים, תגובות בממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
Figure 3: חביון תגובה קר עורר לעומת טמפרטורה. (A - D) אחוז מאיתנו מצטבר (אדום), יחסי ציבור (כחול), או CT (ירוק) למשיבים החללית קר בטמפרטורות שונות (3º C, 10 ºC, 20 ºC ו RT) לאורך זמן (1-20 ים) זחלים בשליטה (w 1118). (E - H) פרופורציות ממוצעות של מהר (<4 s), איטי (4-10 הים), ומאוחר (11-12 s) מגיבים זחלים חלליים קרים בטמפרטורות שונות (C 3º, 10 ºC, 20 ºC ו RT ). (A - H) עבור כל טמפרטורה, n = 3 סטים של 40 זחלים נבדקו. יחסי ציבור: העלאה אחורית, ארה"ב: U-Shape, CT: חוזה, RT: בטמפרטורת חדר. (A - D) NS: אין הבדלים משמעותיים בין קבוצות נתונים, * = p-value <0.05, ** = p-value <0.0001 ידי-דרגה לונג (מנטל-קוקס) מבחן ולבדוק Gehan-ברסלו-ווילקוקסון. (EH) ברים שגיאה מצביעים SEM * = p-value <0.05, ** = p-value <0.0001 על ידי שולחן מגירה arxc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: חביון הקר עורר תגובה בתחילה, אמצעיים ומאוחרים 3 rd instar זחלים. מגיבי אחוז מצטברים ל (A - C) 3 ºC או (D - F) 10 ºC חללית קרה לאורך הזמן (1-20 ים) בתחילה (שחורה), באמצע (כתום) או מאוחר (ירוק) מלא instar 3 rd ( w 1118) זחלים. תגובות לעומת חביון מופרדים על ידי התנהגות: PR (A, D), ארה"ב (B, E), CT (A - F). * = P-value <0.05, ** = p-value <0.001 ידי לונג-דרגה (מנטל-קוקס) הבדיקה Gehan-Breלהאט-ווילקוקסון מבחן. (G - H) אחוז המגיבים המצטברים ל (G) 3 ºC או (H) 10 ºC חללית קרה בתוך 10 ימים בתחילה, באמצע או בסוף 3 rd instar זחלים. ברים שגיאה מצביעים SEM * = p-value <0.05 על ידי זנב שני מבחן מדויק של פישר. n = 3 סטים של 20 זחלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: כאשר מגורה בראש, קרות עורר CT תגובות אינן מחייבות עצב סנסורי MD. (א) סכמטי של assay הקר החללי כאשר קדמי מגורה ב זחל instar 3 rd. (ב) המגיבים ממוצע האחוז CT כדי בדיקה קרה (6 ºC) כאשר זחלים מגורים ביותר anteriאו מגזרים. ברי גריי: שולטת גנטית, בר ירוק: כל הנוירונים MD מושתקים באמצעות ביטוי של transgene רעלן טטנוס. טופס פעיל של transgene רעלן טטנוס שימש שליטה נוספת ( "טטנוס לא פעיל"), n = 3 סטים של 30 זחלים לכל גנוטיפ. בר גרין לא הופחת באופן משמעותי מכל השולטת הגנטית הרלוונטית על ידי שני זנב הפישר של מדויק, בדיקה * p-value <0.05. גנוטיפים (B) בשימוש (משמאל לימין): w 1118 (שליטה), טטנוס פעיל-כטב"מ / + (שליטה לבד כטב"מ), UAS-טטנוס / + (שליטה לבד כטב"מ), MD-Gal4 / + (Gal4 מלאה לבד) , MD-Gal4 / UAS-פעילים טטנוס (שליטה טטנוס פעיל לידי ביטוי את כל הנוירונים MD), ו MD-Gal4 / טטנוס-אקטיבי כטב"מ (הביע טטנוס מצב פעיל לניסוי בכל נוירונים MD). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. </ P>

איור 4
טבלה 1: לטוס מתכון מזון עבור assay בדיקה קר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי להעריך איכותית וכמותית nociception או רגישות nociceptive הזחלים של רקע גנטי שונים, השפעות סביבתיות, ו / או תנאי-induced נזק. מאז assay זה מאפשר יישום מוקד של גירוי קור, עם הכלי הזה אפשר להעריך את הפונקציה של קבוצת משנה של עצב סנסורי פריפריה במיוחד להגיב לטמפרטורות קרות. מעניין, התנהגויות קרות עורר אלה נראים לנצל סוגים שונים של נוירונים חושיים מאלה מופעלים על ידי חום 7, 11, אבל מעגל nociceptive תרמית המלא הוא עדיין לא ברור לגמרי. כמו רבי מבחני nociceptive מקומיים אחרים assay זה כפוף השתנות כמה בין המשתמשים בהתאם ליישום של החללית הקרה. עם זאת, את המיקום הספציפי של החללית הקרה-הגוף הבינוני (הימנעות הראש והזנב) לא נראה לי significaNT השפעה על תגובות קרות 7. תרגול וחזרות יכולים למזער השתנות משתמשים הבינו-זה.

אנחנו שאפיינו את assay הבדיקה הקר דיווחנו על נוירונים הספציפיים הקרים קשוב ערוצים חושיים הנדרשים כדי לייצר את תגובת CT 7. כאן אנו להמשיך לאפיין כמה נתונים חביון ניתן לכמת ולנתח כעוד צעד nociceptive, תוך ניתוח הנתונים כבר נקודות חתך כדי לקבוע את חלון הזמן האופטימלי ביותר עבור assay. מצאנו כי הרוב המכריע של תגובות קרות עורר להתרחש בתוך 10 השני של יישום גירוי, מה שהופך שני 10 נחתכו בשני חסכוני ויעיל. כמו כן, בהתחשב בכך התנהגויות קרות עורר שונות שיא בטמפרטורות שונות, השהיות של התגובות הללו חשובות לנתח בנפרד, כפי שנעשו כאן, כדי להעריך במלואה את חוסנו של תגובות השונות בטמפרטורות שונות. אנחנו גם להראות, תלוי אנאלי להיות התנהגותyzed, איך זחל גודל עשוי להשפיע תגובות קרות עורר. לכן, שמירה על גודל הזחל עקבי בכל ניסויים התנהגותיים יהיה צורך. לבסוף, אנו מראים כיצד assay זה יכול לשמש כדי לזהות, או לשלול, סטים של עצב סנסורי מעורב nociception הקר, אשר נראה להשתנות בהתאם למיקום של גירוי קור כדי הזחל.

עכשיו כי assay nociception קר הבסיס קיים, נוכל לשלב שיטות של נזק ו / או רגישות לשאול שאלות מסובכות יותר על ביולוגיה כאב. לדוגמא, ידוע כי תגובות רול גוף לרוחב חום מזיק או רעיל הן רגישות לאחר ניזק UV אל האפידרמיס, מחייב מתווכים גנטיים ספציפיים וערוצי TRP 12, 20, 21. בין אם ניזק UV דומה לתוצאות האפידרמיס בתגובות קרות רגישות והאם מסלולים גנטיים דומים מעורבים אינו ידוע. כְּמוֹ כֵן, 23, 24 או לחשוף לסמים התרופות 25, 26, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור שינויים מורפולוגיים וגנטיים כדי נוירונים ומעגלים nociceptive.

ישנם מספר מבחנים סטטיסטיים כי יש לשקול באמצעות assay. המבחן הסטטיסטי אנו הנפוצים ביותר הוא המבחן המדויק של הפישר עם תיקון בונפרוני להשוואות מרובות, או המבחן כי בריבוע. מבחנים אלה משמשים כאשר השווה מגיבים ממוצעים בצורת גרף עמודות (כלומר באיור 3E - 3H, איור 4G - 4H ואיור 5B). להשוואת שיהוי מצטברת בצורת גרף קו, השתמשנו-דרגה לונג (מנטל-קוקס) מבחן 27, 28 ו Gehan-ברסלו-ווילקוקסוןמבחן 29, 30 אשר שניהם משמשים בדרך כלל כדי להשוות הפצות הישרדות. אנו מציעים שלושה סטים של 20-40 זחלים לכל גנוטיפ / ניסוי כדי לאפשר חישוב של סטיית התקן של הממוצע בין קבוצות חוזרות ונשנות.

לסיכום, assay זה מאפשר יישום מדויק של גירוי קור רעיל ואת תגובות התנהגותיות כתוצאת זחלים תסיסנית אופיינו. יש עדיין הרבה שאנחנו לא יודעים על תאי הגנים דרושים nociception ב זבובים או חוליות. עם assay זה, אפשר לנצל את מערכת דרוזופילה צייתנית מאוד במהירות מסך עבור גנים שמורים חיוניים nociception בסיס, לזהות מעגלי nociceptive, ולהעריך שינויים הסלולר גנטיים המתרחשים לאחר ניזק לרקמות לגרום רגישות nociceptive. בסופו של דבר, assay זה יעזור מידע בעל ערך רווח שדה כאב על ביולוגית כאב מערכתניתן ליישם בקלות במודלים של בעלי חיים מורכבים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

בקשה לפטנט בארה"ב (CL) ממתינה על העיצוב של החללית הקרה. מידע נוסף על פרטים של מספרים הקטלוגיים קרה חללית ובנייה, וכן ייעוץ נוסף על עיצוב כלי יסופק לפי בקשה.

Acknowledgments

אנו מודים שרה וו וקמיל גרהם לפיתוח בשלבים מוקדמים של assay הבדיקה הקר, המרכז במלאי Bloomington תסיסנית מניות זבוב, וחברי מעבדת Galko עבור האנושות לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA (NIH F31NS083306) כדי HNT, ועל ידי NIH R01NS069828, R21NS087360 לבין אוניברסיטת טקסס MD Anderson קלארק המלגה בסיסי מחקר כדי MJG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cold Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit TE Technology Custom Built enclosure Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Zeiss NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries. A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott North America, Inc. Schott A08575
Forceps FST FS-1670 Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush Dick Blick Art Materials 06762-1002 Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish Falcon 351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula Fisher Scientific 14-357Q Used to move food
Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
  3. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
  4. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  5. Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
  6. Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
  7. Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
  8. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
  9. Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
  10. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  11. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  12. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
  13. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
  14. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  15. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
  16. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
  17. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
  19. Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
  20. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
  21. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  22. Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
  23. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
  24. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  25. Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
  26. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  27. Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
  28. Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
  29. Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
  30. Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).

Tags

Neuroscience גיליון 122 מדעי המוח החושי thermosensation, תרמית nociception כאב nociception קר assay התנהגותית נוירונים arborization הדנדריטים קולטן פוטנציאל חולף (TRP) ערוצי.
Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. … More

Turner, H. N., Landry, C., Galko, M. J. Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (122), e55568, doi:10.3791/55568 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter