Summary
ここでは、 ショウジョウバエの幼虫に冷たい痛覚を研究するための新規なアッセイを示しています。このアッセイは、焦点有害冷たい刺激を印加することが可能な特注のペルティエプローブを利用し、定量化可能な冷たい固有の動作になります。この技術は冷たい痛覚の更なる細胞および分子解剖を許可します。
Abstract
どのように生物が感知し、まだよく理解されている有害な温度に反応します。さらに、そのような末梢神経障害または損傷誘発性感を経験する患者のような感覚機械の感作を、基礎となるメカニズムは、十分に特徴付けられていません。遺伝的に扱いやすいショウジョウバエモデルは、有害な熱の検出に必要な細胞および遺伝子を研究するために使用されています これは、関心のある複数の保存された遺伝子が得られました。リトルは、細胞および有害な寒さの検出のための重要な受容体についてはしかし、知られています。 ショウジョウバエは、彼らが感知し、多分有害な冷たい刺激を避ける方法を、低温（≤10ºC）への長期暴露に耐えられないので、涼しい避けるだろう、行動好みアッセイにおける気温の上昇を好む、が、ごく最近研究されています。
ここでは、説明との最初の有害な寒さ（≤10ºC）の行動分析を特徴付けますショウジョウバエ。このツールおよびアッセイを使用して、我々は、定性的および定量的に冷たい侵害受容行動を評価するための方法を研究者を示しています。これは、通常の/健康な培養条件の下で、あるいはおそらく疾病、傷害または感作のコンテキストで行うことができます。さらに、このアッセイはthermosensation、疼痛、または侵害受容感に影響を与える可能性があり、所望の遺伝子型のために選択された幼虫に適用することができます。痛みはさらにそう脊椎動物を含む他の種の痛みプロセスの重要な理解を収集します熱痛覚を研究するために、このアッセイを用いて、高度に保存されたプロセスであることを考えます。
Introduction
ショウジョウバエは、新規保存された遺伝子と複合行動の根底にある神経回路の同定のため非常に有用であることが証明されています。ハエは、洗練された遺伝的ツールキットおよび痛覚5、6、7の細胞および分子の塩基を分析するために、正確な遺伝的および神経操作1、2、3、4を可能にする簡略化し、神経系を提供します。幼虫は、優しい肌触り8、9、10、有害な熱11、12、13及び侵害刺激4の機械的感覚のための行動アッセイことを考えると、これらの分析に特に有用です11は 、既に確立されている、透明幼虫キューティクルは、表皮とその下にある感覚ニューロンのライブまたは固定のイメージングが可能になります。最近では、有害な寒さのためのアッセイはまた、我々は、ここでより詳細に説明7を 、開発されました。
罰金、円錐先端が冷たいプローブを使用して、我々は、 ショウジョウバエの幼虫が展示優しいタッチ、次の通常の歩行運動中に観察された行動とは別個の冷特有の反応行動のセットを、その、または過酷な機械的または高温刺激7、8、11の後に示して。冷たい固有の動作は、堅牢なフルボディの収縮（CT）、後部セグメント（PR）の45-90ºレイズとU字型（US）への前部と後部セグメントの同時昇給が含まれています。これらの行動の有病率は減少温度が、Sの各ピークに増加します軽く異なる低温。最近の研究は、CT応答が有害な熱や過酷な機械的刺激7に対応するものとは異なる末梢感覚ニューロンによって媒介されることを示唆しています。
多くの脊椎動物の侵害受容器のように、 ショウジョウバエの複数の樹状（MD）末梢感覚ニューロンは、表皮1の上にarborize複雑な樹枝状構造を有しています。 MDニューロンは、腹側神経索14への軸索を投射する、すべての幼虫の身体セグメント中に存在します。 MD感覚ニューロンは、樹状形態に基づいて、4つの異なるクラス（I-IV）に分離され、感覚機能4、9、10、15、16、17を変化しています。クラスIVニューロンは、幼虫の横車体ロール応答のために必要とされる一方で高温や過酷な機械的刺激4、クラスIIIニューロンは穏やかタッチ応答9、10のために必要とされるのみ冷によって活性化されていないだけでなく、冷誘発行動応答7のために必要とされます。両方のクラスIIIおよびクラスIVニューロンが刺激9、10、17、19 7、11、18侵害および非侵害に対する行動反応を促進するために、離散的一過性受容体電位（TRP）チャネルを利用します。さらに、幼虫侵害受容は、細胞20および行動レベル12、21で、次の傷害を感作されています。
ここに記載されるアッセイはquantificatioすることができます通常の、又は潜在的に周囲温度（18〜22ºC）に有害な冷（≤10ºC）の範囲の低温、無害クール（11-17ºC）に対する行動応答の改変のいずれかのN。このアッセイで使用される低温は、堅牢で再現性のカルシウムが増加し、定性的および定量7を分析することができる冷誘発行動応答を誘発する、直接クラスIII感覚ニューロンを活性化することができます。このアッセイは、実質的に任意の遺伝子型、ならびに冷痛覚、侵害受容感または侵害受容可塑性に影響を与える遺伝的および環境的双方の因子を決定するために、多様な環境条件（変更された栄養、傷害、薬理学的物質）に曝露された幼虫の幼虫に適用することができます。 thermosensationは、多くの種間でユビキタスであることを考えると、このアッセイは、痛覚の研究のための貴重なツールを提供し、新たな遺伝子標的または改善される神経細胞の相互作用を明らかにします脊椎動物痛覚の我々の理解。
特注コールドプローブは、（コールドプローブ、 材料の表を参照）、熱伝導を介してアルミニウム軸と円錐形先端を冷却する閉ループ温度制御されたペルチェ素子を利用します。アルミニウム円錐形先端は、制御ユニットにリアルタイムの温度を報告内部サーミスタが埋め込まれています。ヒートシンクとファン（熱制御ユニット、 材料の表を参照のこと）を達成することができるペルチェ効果の熱負荷（QC）は（22-0℃）での所望の温度範囲を調節するために、熱電モジュールに取り付けられています。コールドプローブ先端の有害な冷刺激が前方および後方端部から等距離セグメント（単数または複数）に、背側正中線に手で適用される幼虫の（おおよそセグメントA4、 図1Aを参照）。フルボディ：冷たい刺激に応答して、幼虫は、一般的に10秒のカットオフ内の3つの冷誘発行動の1を生産します収縮（CT）、U字状に前方および後方セグメントの45-90º昇給（US）、または（ 結果を参照）後部セグメント（PR）の昇給。これらの行動はいずれも正常な蠕動運動や採餌行動の間に実行されません。これらの挙動も優しいタッチレスポンスと高い温度や有害な機械的刺激に対する嫌悪ローリング応答とは区別されます。
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Protocol
幼虫の調製
- 25ºCインキュベーターで株式や遺伝的交雑を上げます。
- クロスを培養する場合は、20-25処女雌と通常のコーンミールフライメディアを含むバイアルあたり15〜20人の男性を使用しています。女性は、食品の新しいバイアルにそれらを転送する前に、約48時間産卵させます。
- 4-5日産卵後、穏やかにどろどろ食品及び幼虫への水の流れを噴出することにより、所望の遺伝子型の第3齢幼虫を収集し、中型、清潔なペトリ皿に内容物を注ぎ出す（60ミリメートル×15ミリメートル）。
- 次に、穏やかに鉗子を使用して、サイズまたは試験されることから、より大きな「放浪第3齢」又は小さな病弱幼虫を排除する絵筆によって幼虫を並べ替えます。望ましくない遺伝子マーカーやバランサーを含む幼虫を捨てます。
- 実験者が元に「ブラインド」になるようにソートされた幼虫が配置される仲間のラボのメンバーのラベルの皿や容器を持っていますperimental状態または該当する場合は幼虫の遺伝子型。実験者は、実験室部材によって生成された鍵を使用して実験した後に収集されたデータに復号化されたラベルを適用することができます。
- 薬さじを用いて、（34ミリメートル×10ミリメートルまたは60ミリメートル×15ミリメートル）を室温の水できれいに、標識されたペトリ皿充填途中に生鮮食品のダイムサイズの量を転送します。
- 穏やかに鉗子またはペイントブラシを使用して（テストは20分以上かかると予想される場合飢餓や乾燥を防止するために）食品にソートされた幼虫を移動させます。
2.コールドプローブアッセイ
- それが所望の温度に冷却するためのいくつかの分を可能にコールドプローブユニットをオンにします。より低い温度に設定した場合、結露はおそらくプローブに沿って形成することになります。
- 実験室での余分な水分を拭き取り幼虫への適用前に拭きます。ない時はすぐに使用で、場所は絶縁するように、両方の、きれいな先端を保つために、損傷を防ぐため、プローブ上のキャップ絶縁。
- 暗い可動ビニルの薄片上に中間第3齢幼虫を置き、明視野顕微鏡下（典型的には、ノートブック・バインダーから切断小片を使用）。コントラスト視覚化およびプローブと適切に整列させるために、それに触れることなく、幼虫の移動の黒ビニルエイズ。
- 顕微鏡を調整し、コントラストを提供し、早すぎる乾燥から幼虫を防止し、光ユニット（ 材料の表を参照）培地明るさ（50から75パーセントの最大輝度）（ 材料の表を参照のこと）。
- 彼らは結果を混乱させる可能性があるので最初に通常の蠕動運動を示さない任意の幼虫を捨てます。幼虫は、そうでなければ幼虫は、正常歩行を阻害ビニルに付着する水のペトリ皿から湿ったなければなりません。水は幼虫の周りにパドルべきではありません。
- CORに幼虫を移動するビニルを使用して、前後体軸に対して90°の角度で幼虫に向かって手でプローブを前進RECT位置（ 図1A参照 ）。
- 東洋は、プローブの先端を穏やかプローブ顕微鏡ステージに対して約45°の角度を有する幼虫の中間背側表面を横切って敷設します。
- プローブ接触すると、実験室のタイマーを起動します。依然として前方または後方に移動可能にしながら、わずかに幼虫キューティクルの表面にインデントするのに十分な下向きの圧力を加えます。
- 最大10秒間またはコールド誘発行動応答が観察されるまで、所定の位置にプローブを保持する - いずれか早い方。その後、プローブを削除します。
- 観察行動応答と応答待ち時間を記録します。 10秒以内に応答しない幼虫は、「非応答者」とみなされます。待ち時間はまた、応答のために記録および応答ロバスト性/振幅の変化を測定するために使用することができます。
- 幼虫を破棄し、次の準備。
- 試験幼虫の所望の数が（N 3組= 20-40幼虫がUた達するまで繰り返し2.3から2.11までステップ）ここでのsed。
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Representative Results
時折ポーズ、ヘッドターン、および方向22の変化を含む蠕動運動とショウジョウバエの幼虫移動します。しかし、有害な寒冷刺激の焦点用途に応じて、幼虫は、有害な熱および機械的刺激に対する嫌悪横ロールとは異なり、独自の行動の集合を示します。これらの行動は優しいタッチ8、9、10または室温プローブのタッチにも反応は異なっています。次のように冷たい誘発行動は、次のとおりです、収縮（CT）で自分の体の中心に向かって彼らの前部と後部セグメントをscrunchingその前部と後部セグメントの上昇（約45-90°）空気中に、U-を作ります形状（US）、または空気中にのみその後部セグメント（約45〜90°）を上昇させる（PR）（ 図1）。実験者これらの動作記述ではなく、定量的カットオフよりも質的なガイドラインがあることを通知しなければなりません。これらの応答は3-18ºC（ 図2A）からの低温の範囲にわたって観察されています。しかし、別の寒範囲にわたって、異なる行動のピーク（ 図2Bおよび2C）：PRと米国のための3-8ºCとCTのための9-14ºC。 CTは時折室温（RT）プローブ（ 図2）を使用して、優しい肌触りに応答して幼生のわずかな割合で観察されたのみ冷誘発応答です。待ち時間情報も収集し、統計的に、このアッセイ損傷または他の環境条件以下の興味深い情報を得ることができる、（使用統計検定については下記参照）を用いて比較することができます。
異なった冷たい振る舞いのレイテンシを比較するために、冷誘発反応は、カットオフ3風邪・ツー・クールテンペラで20秒まで測定しました。トゥーレス（3、10、20ºC）と同様に室温（RT）プローブとは、経時的に観察された累積応答（ 図3）としてプロットしました。 CT応答は無害な温度（20ºCと部屋で長い周波数を有するように見えるが、 -第一に、我々は、低温（3ºC10ºC）に最も応答がプローブのアプリケーション（3B 図3A）後、1と10の間で観察されていることが観察され温度（RT）、 図3C - 3D）。第二に、米国が、レイテンシ曲線対PR及びCT応答が10ºC、20ºC、室温で3ºC（ 図3A）で互いに有意に異なっていなかった、待ち時間曲線対CT応答は、米国および/またはPRとは有意に異なっていました、米国およびPR曲線ロングランク（マンテル-コックス）とGehan-ブレスロー-Wilcoxon検定によって（試験した任意の温度で互いに有意差がなかったが、 図3B - 3D 図3E）断固待ち時間のデータを比較するときに興味深いことに、CTの応答が3ºCでPRや米国よりもはるかに「遅い応答者」（レイテンシ3-10複数可）を持っています。 4-10秒の間、及び11-20 S（ - 3H 図3E）との間に、4未満のS：カテゴリ比較のこのタイプの、冷誘発反応は、三個の待ち時間のカテゴリーに分類しました。各動作の応答者の割合は、各速度カテゴリ（結果は統計的にarxc分割表による行動の間で比較した）内に入る応答者の割合として表されます。ここでも、この分析は、PRと米国の待ち時間の応答の間に有意差（ 図3E - 3H）を明らかにしなかったが、CTの応答は3ºC、10ºCでPR有意に異なっていた、そして全ての温度で、米国からのRTプローブ（ 図3Eを含むテスト- 3F）。一緒に、これらのデータ10秒アッセイカットオフは意味のあるデータセットを収集するために十分以上であることを示し、そして冷たい誘発CT応答は、米国やPR応答に比べて相対的に長い待ち時間で発生していること。幼虫の幼虫からの応答に多少のばらつきがあるので、我々は、各温度で20幼虫3組を試験し、各応答（ 図3E - 3H）についての平均の標準誤差を報告しました。
幼虫のサイズは（したがって、冷刺激の相対的な大きさ）が初期および後期3齢幼虫の間で大きく変化することができ、初期、中期および後期3 番目の幼虫が3ºCで試験し、10ºC及びそれらの応答を比較した（ 図4） 。四五日齢幼虫の培養物を、その後、ほぼその長さ/大きさ（ 図4）により、早期、中期または後期3齢期に分類された幼虫を収集するために使用されました。興味深いことに、いくつかのRESPONSEの変動は、試験される温度に応じて、発達段階の間で見られました。 3ºCでは、初期の第3齢幼虫は少ないPRと米国の応答者とより多くのCTレスポンダ（ - 4C 図4A）を示しました。しかしながら、10ºCで、応答は、実質的に発達段階（ - 4F 図4D）にわたって変化しません。 3ºCまたは10ºCで10秒、各動作のカットオフでの総パーセントの応答を比較するだけ早い第3齢幼虫が3ºC（ 図4G及び4H）において有意に異なるPR及びCT応答を有することが明らかになりました。
クラスIII複数の樹状感覚ニューロンを直接低温により活性化され、コールドプローブ7にCT応答に必要とされます。冷たい刺激がラの領域を前方に適用されたときに堅牢なCTの応答も発生する可能性がRVA（ヘッド）（ 図5B）。ヘッドの直接刺激に起因する冷誘発応答はまた、有効電気全てMD感覚ニューロンにおける破傷風毒素の導入遺伝子を発現冷刺激を穏やかに幼虫（ 図5A）のヘッドに適用した（クラスIIIを含む）mdのニューロンを必要とするかどうかを決定しますそれら3サイレンシング。幼虫を冷（6ºC）で頭部に刺激されると、幼虫の大部分は依然としてMDニューロンが（ 図5B）にサイレンシングされているにもかかわらず、CT応答を生じました。このデータは、MDニューロンがヘッドをプローブする際冷誘発CTのために必要とされず、この応答は、したがって、このツールおよびアッセイを用いて同定することができた感覚ニューロンの他のタイプを必要としなければならない示唆しています。
図1：コールドプローブアッセイ。 （A）ダイヤ第3齢コントロール（1118ワット ）幼虫にコールドプローブアプリケーションのグラム。所望の温度に設定したアルミニウムコールドプローブ先端は、軽く運動の自由な範囲を可能にする最大10秒間幼虫の背部A4セグメント上に配置されます。 （B）は、それが適用されるようにプローブの角度を示す幼虫の断面図。プローブは、顕微鏡ステージ（破線）に、及び垂直刺激時の幼虫の前後体軸に対しておおよそ45°の角度で保持されるべきです。 3冷誘発行動観察の（C）図：幼虫体（灰色の矢印）、（ii）のU字型（US）の中心に向かって前方および後方の（I）収縮（CT）：45- 90（破線）前部および後部の上昇、および（iii）事後（PR）を上げる：幼虫体（灰色矢印）の中心に向かって頭部と尾部の後部の45-90（破線）を上昇。
図2：温度に対するコールド誘発反応。 （A）中央の第3齢制御における応答者の割合低温（3-22ºC）または室温（RT）プローブの範囲にわたって幼虫（1118ワット ）。 （B）PRのパーセント、米国と示されるピーク応答を有する異なる低温で（C）CTレスポンダ。 （A - C）PR：後部昇給、米国：U字型、CT：契約。エラーバーは、n = 40幼虫の3セットの平均の標準誤差である、応答が平均化されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FigurE 3：対温度コールド誘発応答の待ち時間。 （A - D）時間（1-20秒）にわたって、種々の温度（3ºC、10ºC、20ºCとRT）でコールドプローブに対する累積US（赤）、PR（青）、またはCT（緑）応答のパーセントコントロール内（1118ワット ）の幼虫。 （E - H）様々な温度（3ºC、10ºC、20ºC、室温で冷プローブに速い（<4秒）、低速（4-10秒）、および後期（11〜12秒）の応答幼虫の平均割合）。 （A - H）各温度について、N = 40幼虫の3セットを試験しました。 PR：後部昇給、米国：U字型、CT：契約、RT：室温。 （A - D）NS：データセット間に有意差、* = p値<0.05、** =ロングランク（マンテル-コックス）試験とGehan-ブレスロー-ウィルコクソン検定によるp値<0.0001。 （EH）エラーバーはSEM * = p値<0.05、** = p値<0を示しています。0001 arxc分割表によります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：早期、中期および後期第3齢幼虫でコールド誘発応答の待ち時間。 （ブラック）の早期の経時10ºCコールドプローブ（1-20秒）、中間（オレンジ）または後期（緑）、 第3齢コントロール（ - 3ºCまたは（F D） - （C A）パーセント累積レスポンダ1118年 ）の幼虫ワットレイテンシー対応答は行動によって分離されている：PR（A、D）、米国（B、E）、CT（A - F）。 * = p値<0.05、** = p値<0.001ロングランク（マンテル - コックス）試験とGehan-BREによってスローウィルコクソン検定。 （G - H）（G）3ºC又は（H）10ºC早期に10秒以内にコールドプローブ、中間または後期第3齢幼虫に対する累積応答のパーセント。エラーバーは、両側フィッシャーの正確確率検定によってSEM * = p値<0.05を示しています。 N = 20幼虫の3セット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：頭の中で刺激した場合、寒冷誘発CT応答がMD感覚ニューロンを必要としません。コールドプローブアッセイの（A）は概略前面が第3齢幼虫に刺激されます。 （B）最もanteriで刺激された幼虫コールドプローブ（6ºC）の平均パーセントCTレスポンダまたはセグメント。灰色の棒：遺伝的コントロール、グリーンバー：破傷風毒素導入遺伝子の発現を介して沈黙すべてのMDニューロン。破傷風毒素の導入遺伝子の不活性形態は、追加の制御（「非アクティブ破傷風」）中、n =遺伝子型当たり30幼虫の3セットとして使用しました。緑色のバーが大幅によって、関連するすべての遺伝子のコントロールから減少しなかったフィッシャーの正確テスト* p値<0.05を両側。使用される（B）遺伝子型（左から右）：1118（コントロール）、UAS不活性破傷風/ +（UAS単独の対照）、UAS-破傷風/ +（UAS単独の対照）、MD-GAL4 / +（Gal4の単独制御）w 、MD-GAL4 / UAS不活性破傷風 （不活性破傷風コントロールが全てMDニューロンで発現される）、およびMD-GAL4 / UAS活性破傷風 （全てMDニューロンにおいて発現実験条件アクティブ破傷風）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 </ P>
表1：冷たいプローブアッセイのためのフライ食品のレシピ。
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Discussion
ここに記載のアッセイは、定性的および定量的に様々な遺伝的背景、環境の影響、および/または損傷誘導条件の幼虫に痛覚または侵害受容感を評価するために使用することができます。このアッセイは冷刺激の焦点アプリケーションを可能にするため、このツールを使用すると、ワンは、特に低温に応答して、末梢感覚ニューロンのサブセットの機能を評価することができます。興味深いことに、これらの冷誘発行動は熱7、11によって活性化されるものよりも感覚ニューロンの異なるクラスを利用するように見えるが、完全な熱侵害受容回路は、まだ完全には理解されていません。他の多くのローカル侵害受容アッセイのように、このアッセイは、コールドプローブの用途に応じてユーザ間のある程度の変動を受けます。しかし、（頭と尾を避ける）半ば体内の寒さのプローブの具体的な配置はsignificaを持っているように見えていません冷たい反応にntの影響7。実践と繰り返しは、このユーザ間のばらつきを最小限に抑えることができます。
我々は以前風邪プローブアッセイを特徴とCTレスポンス7を生成するために必要な具体的な寒応答性ニューロンと感覚のチャンネルを報告しました。ここでは、更なる分析のための最適な時間ウィンドウを決定するために長いカットオフポイントからのデータを分析し、他の侵害受容性の尺度として定量化し、分析することができますどのように、待ち時間データ特徴づけます。我々は、経済的かつ効果的カットオフ10秒を作り、冷誘発反応の大部分は、刺激印加の10秒以内に起こることを見出しました。また、異なる温度で異なる応答の堅牢性を十分に理解するために、ここで行ったように異なる冷喚起行動異なる温度でのピークは、これらの応答の待ち時間が、個別に分析することが重要であることを与えられました。また、行動されて肛門に応じて、表示さyzed、どのように幼虫の大き冷誘発反応に影響を与える可能性があります。そのため、全ての行動実験で一貫性のある幼虫の大きさを維持することが必要であろう。最後に、我々は、このアッセイは、幼虫に冷たい刺激の場所に応じて変化するように見える冷たい痛覚に関与する感覚ニューロンのセットを識別し、または排除するために使用する方法を示しています。
今ベースライン冷たい痛覚アッセイが存在することを、私たちは痛みの生物学についてのより複雑な質問をする損傷および/または感作の方法を組み込むことができます。例えば、無害または有害な熱に対して横車体ロール応答は、特定の遺伝的メディエーターおよびTRPチャネル12、20、21を必要とする、表皮へのUV損傷後の感作することが知られています。感作された冷たい反応における表皮の結果と同様に紫外線によるダメージかどうかは、同様の遺伝的経路が関与しているかどうかは不明です。同様に、
このアッセイを使用して考慮すべき統計的検定の数があります。私たちは、最も一般的に使用される統計的検定は、多重比較のためのボンフェローニ補正、またはカイ二乗検定とフィッシャーの正確検定です。 （ - 3H、 図4G - 4Hおよび図5B 図3EにIE）の棒グラフ形式で、平均応答を比較した場合、これらのテストが使用されます。折れ線グラフの形で累積待ち時間を比較するために、我々は、長ランク（マンテル-コックス）のテスト27、28及びGehan-ブレスロー-ウィルコクソンを使用しました両方とも、典型的には生存分布を比較するために使用されるテスト29、30。私たちは、繰り返しセット間の平均値の標準誤差の計算を可能にするために、各遺伝子型/実験のために20-40幼虫の三組を示唆しています。
結論には、このアッセイは、有害な冷刺激の正確な塗布を可能にし、 ショウジョウバエの幼虫で得られた行動応答が特徴づけられています。まだそこにある多くの我々は、ハエや脊椎動物における侵害受容のために必要な細胞や遺伝子について知りません。このアッセイで、一つは、迅速に、ベースライン侵害受容するための重要な保存された遺伝子をスクリーニングするために非常に扱いやすいショウジョウバエシステムを利用侵害受容回路を識別し、侵害受容感を引き起こす組織損傷後に生じる細胞と遺伝的変化を評価することができます。最終的に、このアッセイは、そのシステムに痛み生物学についての痛みフィールドゲイン貴重な情報を助けます容易に、より複雑な動物モデルに適用することができます。
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Disclosures
米国特許出願（CL）は冷たいプローブの設計に保留されています。冷たいプローブ部品番号と構成の詳細に関する追加情報だけでなく、ツールの設計上の追加的なコンサルティングは、要求に応じて提供されます。
Acknowledgments
私たちは、批判的に原稿を読み取るためのフライ株式、およびGalkoラボメンバーのために、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターを冷たいプローブアッセイの初期段階を開発するためのサラ・ウーとカミラ・グラハム感謝します。この作品はHNTに、およびNIH R01NS069828、R21NS087360や基礎研究でテキサス大学MDアンダーソンクラークフェローシップによってMJGにNIH NRSA（NIH F31NS083306）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
