Summary
Aqui demonstramos um novo ensaio para estudar nocicepção frio em larvas de Drosophila. Este ensaio utiliza uma sonda de Peltier-construído sob encomenda capaz de aplicar um estímulo frio nocivo focal e resulta em comportamento quanto ao frio quantificáveis. Esta técnica permitirá ainda dissecção celular e molecular da nocicepção frio.
Abstract
Como organismos perceber e responder a temperaturas nocivos ainda é mal compreendido. Além disso, os mecanismos subjacentes a sensibilização das máquinas sensorial, tal como em doentes com neuropatia periférica ou sensibilização induzida pela lesão, não estão bem caracterizados. O modelo de Drosophila geneticamente tratável foi usado para estudar as células e os genes necessários para a detecção de calor nocivo, que produziu vários genes conservados de interesse. Pouco se conhece no entanto sobre as células e receptores importantes para a detecção de frio nocivo. Embora, a Drosophila não sobreviver à exposição prolongada a temperaturas frias (≤10 ºC), e vai evitar fresco, preferindo temperaturas mais quentes em ensaios de preferência comportamentais, como eles detectam e possivelmente evitar estímulos nocivos frio só recentemente foi investigado.
Aqui nós descrever e caracterizar o primeiro frio nocivo (≤10 ºC) ensaio comportamentalDrosophila. Usando esta ferramenta e ensaio, mostramos um investigador como avaliar qualitativamente e quantitativamente comportamentos nociceptivos frias. Isto pode ser feito sob condições de cultura normais / saudáveis, ou presumivelmente no contexto de doença, lesão ou sensibilização. Além disso, este ensaio pode ser aplicado a larvas seleccionados para os genótipos desejados, que pode ter impacto thermosensation, dor, ou sensibilização nociceptiva. Dado que a dor é um processo altamente conservado, utilizando este ensaio para um estudo mais aprofundado nocicepção térmica provavelmente vai recolher compreensão importante de processos de dor em outras espécies, incluindo vertebrados.
Introduction
Drosophila tem provado ser altamente útil para a identificação de novos genes e conservada circuitos neuronais subjacentes a comportamentos complexos. Moscas fornecer um conjunto de ferramentas genéticas sofisticado e um sistema nervoso simplificado que permite a manipulação de precisão genética e neuronal 1, 2, 3, 4 para dissecar as bases celulares e moleculares da nocicepção 5, 6, 7. As larvas são particularmente úteis para estas análises, dado que os ensaios comportamentais para toque suave 8, 9, 10, o calor nocivo 11, 12, 13 e sensação mecânica de estímulos nocivos 4, 11 já foram estabelecidos, ea cutícula larval transparente permite imagens ao vivo ou fixo da epiderme e neurônios sensoriais subjacentes. Recentemente, um ensaio para frio nocivo também foi desenvolvido 7, que descrevemos em mais detalhes aqui.
Usando uma sonda de frio fino, cónico de ponta, mostra-se que as larvas de Drosophila exibem um conjunto de comportamentos reactivos específicos do frio, distinto de comportamentos observados durante a locomoção normais, seguindo toque suave, ou após dura mecânica ou alta estímulos temperatura 7, 8, 11 . Os comportamentos específicos de frio incluem uma contracção robusta de corpo inteiro (CT), um aumento de 45-90º os segmentos posteriores (RP) e um aumento simultâneo do segmentos anterior e posterior em forma de U (US). A prevalência destes comportamentos aumenta com a diminuição da temperatura mas cada picos a slevemente diferentes temperaturas frias. Um trabalho recente sugere que as respostas CT são mediadas por diferentes neurónios sensoriais periféricos do que aqueles que respondem ao calor nocivo ou estímulos mecânicos dura 7.
Muito como nociceptores vertebrados, Drosophila dendrítica múltipla (MD) neurónios sensoriais periféricos têm estruturas dendríticas complexos que arborize sobre a epiderme 1. neurónios MD estão presentes em cada segmento do corpo das larvas, que se projecta seus axónios para o cordão nervoso ventral 14. neurónios sensoriais md são separados em quatro classes diferentes (I-IV), com base em morfologia dendrítica e têm diferentes funções sensoriais 4, 9, 10, 15, 16, 17. Embora os neurónios da classe IV, são necessárias para as respostas de rolo lateral do corpo larvaisa temperaturas elevadas ou estímulos mecânicos dura 4, classe III são necessários para os neurónios respostas suave de toque, 9 e 10 não são apenas activados por frio, mas também são necessárias para as respostas comportamentais evocadas frios-7. Ambas as classes III e IV neurónios utilizar canais discretos do receptor transiente potencial (TRP) para facilitar as respostas comportamentais a estímulos 9, 10, 17, 19 nocivo 7, 11, 18 e não nocivo. Além disso, nocicepção larval é sensibilizado lesão seguinte, nos níveis celular 20 e comportamentais 12, 21.
O ensaio aqui descrito permite a quantification de qualquer normal, ou potencialmente alterados respostas comportamentais a temperaturas baixas que variam de frio nocivo (≤ 10 ºC), arrefecer inócuo (11-17 ° C), a temperaturas ambiente (18-22 ° C). As temperaturas frias utilizados neste ensaio são capazes de activar directamente classe III neurónios sensoriais, provocando robustos, reprodutíveis e cálcio aumenta as respostas comportamentais evocadas a frio, que pode ser qualitativamente e quantitativamente analisadas 7. Este ensaio pode ser aplicado a virtualmente qualquer larvas de genótipo, bem como para as larvas expostas a diversas condições ambientais (nutrição alterada, ferimentos, agentes farmacológicos) para determinar os factores genéticos e ambientais que têm impacto sobre a nocicepção frio, sensibilização nociceptiva ou plasticidade nociceptiva. Dado que thermosensation é ubíqua em muitas espécies, este ensaio proporciona uma ferramenta valiosa para o estudo da nocicepção e pode descobrir novos alvos gicos ou interacções neuronais que irão melhorarnossa compreensão da nocicepção vertebrados.
A sonda fria com especificação (ver sonda fria, Tabela de Materiais) utiliza uma temperatura de circuito fechado controlado dispositivo Peltier, o qual arrefece o eixo de alumínio e ponta cónica através de condução térmica. Um termistor é incorporado no interior da ponta cónica alumínio relata a temperatura em tempo real na unidade de controlo. Um dissipador de calor e do ventilador estão ligados ao módulo termoeléctrico, para regular a carga do efeito Peltier calor (Qc) de modo que o intervalo de temperatura desejado de (22-0 ° C) pode ser obtida (ver a Unidade de Controlo térmica, Tabela de Materiais). O estímulo frio nocivo da ponta da sonda a frio é aplicada à mão à linha média dorsal, ao segmento (s) equidistante das extremidades anterior e posterior (aproximadamente segmento A4, ver Figura 1A) da larva. Em resposta a estímulos frios, geralmente larvas produzir um dos três comportamentos evocado a frio a cerca de 10 s de corte: um corpo completocontracção (CT), um aumento de 45-90º segmentos anterior e posterior em forma de U (US), ou um aumento dos segmentos posteriores (PR) (descritos nos resultados). Nenhum desses comportamentos são realizadas durante a locomoção peristáltico normal ou comportamento de forrageamento. Estes comportamentos são também distintas das respostas de toque suave e a resposta de rolamento aversivo a alta temperatura ou estulos mecicos nocivos.
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Protocol
1. Preparação de Larvas
- Levante ações ou cruzamentos genéticos em uma incubadora de 25 ºC.
- Se o cultivo de uma cruz, use 20-25 fêmeas virgens e 15-20 machos por frasco contendo media milho mosca regular. Permitir fêmeas põem ovos por aproximadamente 48 h antes de transferi-los para um novo frasco de alimentos.
- 4-5 dias após a postura de ovos, recolher 3 rd instar larvas do genótipo desejado por esguichando suavemente uma corrente de água para a comida mole e larvas, e despejar o conteúdo em, um prato de Petri limpo de tamanho médio (60 mm x 15 milímetros).
- Em seguida, delicadamente classificar larvas por tamanho usando uma pinça ou um pincel para impedir maior "vagando 3º instar" ou pequenas larvas doentia de ser testado. Rejeitar larvas contendo quaisquer marcadores ou equilibradores genéticos indesejados.
- Tenha um colega de laboratório pratos rótulo ou recipientes onde as larvas classificadas serão colocados de modo que o experimentador pode ser "cego" ao excondição perimental ou genótipo do larvas se for o caso. O experimentador pode aplicar etiquetas descodificados aos dados recolhidos após a experiência utilizando uma chave gerada por um laboratório-membro.
- Usando um scoopula, transferir uma quantidade do tamanho de dime-de alimento fresco para um (35 milímetros x 10 mm ou 60 mm x 15 mm) limpa, marcada placa de Petri cheia de meio caminho com água à temperatura ambiente.
- mover-se suavemente as larvas classificadas na alimentos (para evitar a fome ou dessecação se o teste é antecipado para tomar mais do que 20 min) usando uma pinça ou pincel.
2. Fria Probe Assay
- Ligar a unidade de sonda fria permitindo um min poucos que arrefeça para a temperatura desejada. Se definir a temperaturas mais baixas, a condensação irá provavelmente formar ao longo da sonda.
- Enxugar qualquer excesso de humidade com um laboratório limpar antes da aplicação para a larva. Quando não está em uso imediato, lugar isolante tampa em ambos sonda para isolar e manter a ponta limpa e evitar danos.
- Coloque um meio 3 rd instar larva sobre uma folha fina de escuro vinil móvel (tipicamente, usar uma pequena peça cortada a partir de uma pasta do caderno) sob um microscópio de campo brilhante. Os auxiliares de vinil preto em contraste visualização e em movimento a larva sem tocá-lo para alinhar adequadamente com a sonda.
- Ajustar o microscópio (ver Tabela de Materiais) e unidade de luz (ver Tabela de Materiais) de brilho médio (50-75% de brilho máximo) para proporcionar o contraste e a impedir que a larva de secar demasiado depressa.
- Descarte qualquer larvas que não primeira exposição locomoção peristáltico normal, como eles poderiam confundir os resultados. A larva deve ser húmido a partir da placa de Petri de água de outro modo a larva vai ficar com o vinil inibir locomoção normal. A água não deve poça em torno da larva.
- Avançar a sonda com a mão em direcção a larva em um ângulo de 90º em relação ao eixo ântero-posterior do corpo, usando o vinilo para mover a larva em CRposição rect (ver Figura 1A).
- Orientar a ponta da sonda a colocar suavemente através da superfície dorsal meados da larva com a sonda a aproximadamente um ângulo de 45º para a platina do microscópio.
- No momento do contacto da sonda, iniciar um temporizador de laboratório. Aplicar pressão descendente suficiente para recuar ligeiramente a superfície da cutícula larvar permitindo ainda para a frente ou para trás, movimento.
- Manter a sonda no lugar até 10 s ou até que uma resposta comportamental evocado a frio é observado - o que ocorrer primeiro. Em seguida, remover a sonda.
- Grave a resposta comportamental observada ea latência de resposta. Larvas que não respondem dentro de 10 s são considerados "não-respondedores". Latência também podem ser gravadas para respondedores e usadas para medir as alterações em resposta robustez / amplitude.
- Descarte larva e preparar a próxima.
- Repita os passos 2,3-2,11 até que o número desejado de larvas de teste é alcançada (três conjuntos de n = 20-40 larvas foram used aqui).
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Representative Results
Drosophila larvas movimento com um movimento peristáltico que inclui pausas ocasionais, vira a cabeça, e mudanças de direção 22. Em resposta ao pedido focal de um estímulo frio nocivo no entanto, as larvas apresentam um conjunto de comportamentos únicos, ao contrário do rolo de lateral aversiva para calor nocivo e estímulos mecânicos. Estes comportamentos são também diferentes de respostas ao toque suave 8, 9, 10 ou para o toque de uma sonda de temperatura ambiente. Os comportamentos evocado a frio são como se segue: amassando os segmentos anterior e posterior em direcção ao centro do corpo em uma contracção (CT), aumento dos seus segmentos anterior e posterior (cerca de 45-90 °) para o ar, tornando um U- moldar (EUA), ou aumentar apenas os seus segmentos posteriores (cerca de 45-90 °) para o ar (PR) (Figura 1). o experimentadordevem ser alertados de que essas descrições comportamentais são orientações qualitativas em vez de cut-offs quantitativos. Estas respostas são observados ao longo de um intervalo de temperaturas baixas de 3-18 ° C (Figura 2A). No entanto, diferentes comportamentos pico ao longo de diferentes intervalos de frio (Figuras 2B e 2C): 3-8 ºC para o PR e US e 9-14 ºC para CT. CT é a única resposta evocada a frio ocasionalmente observada em pequena percentagem de larvas, em resposta ao toque suave, utilizando uma sonda de temperatura ambiente (TA) (Figura 2). Latência informação também pode ser recolhido e comparados estatisticamente utilizando este ensaio (ver abaixo para os testes estatísticos utilizados), que produzem informações interessantes após uma lesão ou de outras condições ambientais.
Para comparar as latências dos diferentes comportamentos frias, as respostas evocadas a frio foram medidos até um 20 s de corte em três tempera a frio para-coolturas (3, 10 e 20 ºC), bem como a uma temperatura ambiente de sonda (RT) e representados graficamente como respostas cumulativos observados ao longo do tempo (Figura 3). Em primeiro lugar, foi observado que a maioria das respostas a temperaturas baixas (3 ºC e 10 ºC) são observados entre 1 e 10 s após a aplicação da sonda (Figura 3A - 3B), enquanto que as respostas CT parecem ter frequências mais longos a temperaturas inócuos (20 ºC e quarto temperatura (TA), Figura 3C - 3D). Em segundo lugar, apesar dos EUA, resposta PR e CT contra curvas de latência não foram significativamente diferentes um do outro a 3 ºC (Figura 3A) a 10 ºC, 20 ºC e à TA, a resposta CT contra curvas de latência foram significativamente diferentes dos Estados Unidos e / ou PR , enquanto as curvas de PR dos EUA e não foram significativamente diferentes um do outro em qualquer temperatura testado (por Long-rank (Mantel-Cox) e ensaio de Gehan-Breslow-Wilcoxon, Figura 3B - 3D (Figura 3E). Para este tipo de comparação categórica, respostas evocadas a frio foram agrupadas em três categorias de latência: menos de 4 s, entre 4-10 s, e entre 11-20 s (Figura 3E - 3H). A percentagem de respondedores para cada comportamento está representada como uma percentagem de respondedores que caem dentro de cada categoria de velocidade (resultados foram estatisticamente comparados entre os comportamentos de tabela de contingência arxc). Mais uma vez, esta análise não revelou diferenças significativas entre o PR e respostas de latência dos EUA (Figura 3E - 3H), mas as respostas de CT foram significativamente diferentes do PR a 3 ºC e 10 ºC, e a partir dos EUA em todas as temperaturas testadas, incluindo a sonda de RT (Figura 3E - 3F). Juntos, estes dadosmostram que um 10 ensaio s de corte é mais do que suficiente para recolher conjuntos de dados significativos, e que a resposta evocada a frio CT ocorre em latências relativamente mais longos do que as respostas dos EUA ou PR. Uma vez que existe alguma variabilidade nas respostas de larva de larva, testou-se três conjuntos de 20 larvas em cada temperatura e relatou o erro padrão da média para cada resposta (Figura 3E - 3H).
Uma vez que o tamanho das larvas (e, por conseguinte, o tamanho relativo do estímulo frio) pode variar muito entre o início e terceira instar tardia, no início, meio e final de larvas de 3º foram testados a 3 ° C e 10 ° C e as suas respostas foram comparadas (Figura 4) . Quatro a cinco dias culturas de larvas idade foram usados para coletar larvas que foram então agrupadas em início, meio ou final de terceiro instar estágios mais ou menos pelo seu comprimento / tamanho (Figura 4). Curiosamente, alguns RESPOvariabilidade NSE foi observada entre os estágios de desenvolvimento, dependendo da temperatura a ser testado. Ao 3 ° C, no início larvas 3 rd mostraram menos respondedores PR e dos Estados Unidos e mais respondedores de TC (figuras 4A - 4C). A 10 ºC no entanto, nenhuma resposta variou sensivelmente entre fases de desenvolvimento (Figuras 4D - 4F). Comparando os respondedores totais por cento a 10 s de corte para cada um comportamento em 3 ° C ou 10 ° C revela que apenas precoce larvas 3 rd têm significativamente diferentes respostas PR e CT a 3 ºC (Figuras 4G e 4H).
Classe III vários neurónios sensoriais dendríticas são directamente accionados por baixas temperaturas e são requeridas para a resposta CT para a sonda fria 7. respostas CT robustas também podem surgir quando um estímulo frio é aplicada ao anterior regiões do laRVA (a cabeça) (Figura 5B). Para determinar se as respostas evocadas a frio resultante da estimulação directa da cabeça também requerem neurónios MD (incluindo classe III) um estímulo frio foi cuidadosamente aplicada à cabeça de larvas (Figura 5A) que expressam um transgene de toxina do tétano em todos os neurios sensoriais md eficazmente electricamente silenciando-3. Quando as larvas são estimuladas na cabeça com frio (6 ° C), uma grande percentagem de larvas ainda produziu uma resposta CT, apesar dos neurónios MD sendo silenciados (Figura 5B). Estes dados sugerem que os neurónios MD não são necessários para uma CT-evocado frio ao sondar a cabeça, e esta resposta deve, portanto, requerem outros tipos de neurónios sensoriais, o que poderia ser identificados usando esta ferramenta e ensaio.
Figura 1: Ensaio de sonda fria. (A) Diâmetrograma de aplicação sonda fria a 3 de controlo instar (w 1118) larva. A ponta da sonda fria alumínio, definida como a temperatura desejada, é levemente colocada no segmento dorsal A4 da larva para até 10 segundos, permitindo que a faixa livre de movimento. (B) uma secção transversal da larva indicando o ângulo da sonda, uma vez que é aplicado. A sonda deve ser mantida a um ângulo de 45º aproximado para a fase de microscópio (linha tracejada), e perpendicularmente ao eixo ântero-posterior do corpo da larva durante a estimulação. (C) Diagrama dos três comportamentos evocado frio observado: (i) Contracção (CT) do anterior e posterior em direcção ao centro do corpo de larvas (setas cinzentas), (ii) em Forma de U (US): um 45- 90 (linhas tracejadas) levantar do anterior e posterior, e (iii) elevar posterior (PR): a (linhas tracejadas) aumento da parte posterior da cabeça e cauda em direcção ao centro do corpo de 45-90 larvas (setas cinzentas) .
Figura 2: A resposta a frio evocada versus a temperatura. (A) Percentagem de respondedores de controlo em instar 3 rd meio (w 1118) larvas ao longo de um intervalo de temperaturas baixas (3-22 ºC) ou sonda de temperatura ambiente (RT). (B) Percentagem de PR, respondedores US e (C) TC em diferentes temperaturas frias, com respostas de pico indicado. (A - C) PR: aumento posterior, R: L-forma, CT: contrato. As barras de erro são o erro padrão da média de 3 grupos de n = 40 larvas, as respostas em média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figure 3: latência de resposta evocada a frio em função da temperatura. (A - D) Percentagem cumulativa de US (vermelho) respondedores a sonda fria a várias temperaturas (3º C, 10 ºC, 20 ºC e RT) ao longo do tempo (1-20 s), PR (azul), ou CT (verde) no controlo (w 1118) larvas. (E - H) A média de proporções rápido (<4 s), lento (4-10 s) e tardia (11-12 s) para responder larvas sonda fria a várias temperaturas (3º C, 10 ºC, 20 ºC e RT ). (A - H) Para cada temperatura, n = 3 conjuntos de 40 larvas foram testadas. PR: aumento posterior, R: L-forma, CT: Contrato, RT: temperatura ambiente. (A - D) NS: não há diferenças significativas entre os conjuntos de dados, * = p <0,05, ** = p <0,0001 por Long-rank (Mantel-Cox) teste e ensaio de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Barras (EH) de erro indicam o EPM * = valor de p <0,05, ** = p <0.0001 pela tabela de contingência arxc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: latência de resposta evocada a frio em larvas no início, meio e final instar 3 rd. A percentagem de respondedores cumulativos para um (A - C) 3 ºC ou (D - F) 10 ° C sonda de frio ao longo do tempo (1-20 s) no início (preto), médio (laranja) ou tardia (verde) de controlo instar 3 rd ( w 1118) larvas. Respostas contra latência estão separados por comportamento: PR (A, D), R (B, E), CT (A - F). * = P <0,05, ** = p <0,001 por Long-rank (Mantel-Cox) teste e Gehan-Breslow-Wilcoxon teste. (G - H) Percentagem de respondentes cumulativos para um (L) 3 ºC ou (H) a 10 ° C sonda de frio dentro de 10 s, no início, as larvas instar 3 rd intermediária ou final. As barras de erro indicam EPM * = valor de p <0,05 pelo teste exacta de duas caudas de Fisher. n = 3 conjuntos de 20 larvas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quando estimulados na cabeça, respostas evocadas frio CT não exigem neurônios sensoriais md. (A) Esquema de ensaio de sonda fria quando anterior é estimulada em 3 rd instar de larva. (B) Média de respondedores por cento ct a sonda de frio (6 ° C) quando larvas são estimulados na maioria anteriou segmentos. barras cinzentas: controles genéticos, barra verde: todos os neurônios md silenciados através da expressão do transgene toxina tetânica. Uma forma inactiva do transgene a toxina do tétano foi utilizado como um controlo adicional ( 'Inactivo Tétano'), n = 3 conjuntos de 30 larvas por genótipo. barra verde não foi significativamente reduzida de todos os controlos genéticas relevantes por duas caudas de Fisher Exact, teste * valor de p <0,05. (B) Os genótipos usados (da esquerda para a direita): W 1118 (controlo), tétano UAS-inactivo / + (UAS sozinho controlo), UAS-tétano / + (UAS sozinho controlo), MD-Gal4 / + (Gal4 controlo sozinho) , MD-Gal4 / tétano UAS-inactiva (inactiva tétano controlo expresso em todos os neurónios MD), e MD-Gal4 / tétano UAS-activo (tétano condição experimental-activo expresso em todos os neurónios MD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>
Tabela 1: Mosca receita alimentar para o ensaio de sonda fria.
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Discussion
O ensaio aqui descrito pode ser utilizado para avaliar quantitativamente e qualitativamente nocicepção ou sensibilização nociceptiva em larvas de várias origens genéticas, as influências ambientais, e / ou condições induzidas por danos. Uma vez que este ensaio permite a aplicação de um estímulo de foco frio, com esta ferramenta pode-se avaliar a função de um subconjunto de neurónios sensoriais periféricos especificamente em resposta a temperaturas frias. Curiosamente, estes comportamentos evocou a frio parecem utilizar diferentes classes de neurônios sensoriais do que aqueles ativado pelo calor 7, 11, mas o circuito nociceptivo térmico completo ainda não é totalmente compreendido. Tal como muitos outros ensaios nociceptivos locais neste ensaio é sujeita a alguma variabilidade entre os utilizadores dependendo da aplicação da sonda fria. No entanto, o posicionamento específico da sonda fria no meio-corpo (evitando a cabeça ea cauda) não parecem ter um Significant impacto sobre as respostas frios 7. Prática e repetição pode minimizar esta variabilidade inter-usuário.
Nós previamente caracterizado no ensaio de sonda fria e relataram os neurónios responsivos a frio específicos e canais sensoriais necessários para produzir a resposta CT 7. Aqui nós caracterizar adicionalmente como os dados de latência pode ser quantificada e analisada como uma outra medida nociceptiva, a análise de dados a partir de pontos mais de corte para determinar a janela de tempo mais óptima para o ensaio. Descobrimos que a maioria das respostas evocadas a frio ocorrer dentro de 10 segundo da aplicação do estímulo, fazendo um 10 segundo cortar simultaneamente económico e eficaz. Além disso, dado que diferentes comportamentos evocado a frio dos picos a diferentes temperaturas, as latências de estas respostas são importantes para analisar separadamente, como é feito aqui, para apreciar a robustez das diferentes respostas a diferentes temperaturas. Mostramos também, dependendo do comportamento sendo analyzed, como larval tamanho pode afetar respostas evocadas frio. Portanto, manter o tamanho das larvas consistente em todos os experimentos comportamentais serão necessários. Por fim, mostramos como este ensaio pode ser usado para identificar ou descartar, conjuntos de neurônios sensoriais envolvidos na nocicepção frio, o que parece variar dependendo da localização da estimulação fria para a larva.
Agora que existe um ensaio de nocicepção frio linha de base, podemos incorporar métodos de danos e / ou sensibilização a fazer perguntas mais complicadas sobre a biologia da dor. Por exemplo, sabe-se que as respostas laterais rolamento da carroçaria ao calor inócuo ou nocivo são sensibilizados após danos de UV para a epiderme, exigindo mediadores genéticos específicos e canais TRP 12, 20, 21. Se os danos UV semelhante à epiderme resulta em respostas frias sensibilizados e se vias genéticas semelhantes estão envolvidos é desconhecido. Da mesma forma,
Há uma série de testes estatísticos que devem ser considerados com este ensaio. O teste estatístico que usamos mais comumente é o teste exato de Fischer com uma correção de Bonferroni para comparações múltiplas, ou o teste do qui-quadrado. Estes testes são usados quando se comparam respondedores médios em forma de gráfico de barras (ou seja, na Figura 3E - 3H, Figura 4G - 4H e Figura 5B). Para comparar as latências cumulativos em forma de gráfico de linha, usamos longa-rank (Mantel-Cox) teste de 27, 28 e o Gehan-Breslow-Wilcoxonteste 29, 30 os quais são ambos tipicamente utilizado para comparar as distribuições de sobrevivência. Sugerimos três conjuntos de 20-40 larvas para cada genótipo / ensaio para permitir o cálculo do erro padrão da média entre as séries repetidas.
Para concluir, este ensaio permite a aplicação precisa de um estímulo nocivo frio e as respostas comportamentais resultantes em larvas de Drosophila têm sido caracterizados. Ainda há muito que não sabemos sobre as células e os genes necessários para a nocicepção em moscas ou vertebrados. Com este ensaio, pode-se utilizar o sistema de Drosophila altamente dócil para rastrear rapidamente para genes conservados cruciais para a nocicepção linha de base, identificar circuitos nociceptivos, e avaliar as alterações celulares e genéticas que ocorrem após danos no tecido para provocar uma sensibilização nociceptiva. Em última análise, este ensaio vai ajudar o ganho campo dor informações valiosas sobre a biologia da dor em um sistema quepode ser facilmente aplicado a modelos animais mais complexos.
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Disclosures
Um pedido de patente dos Estados Unidos (CL) está pendente no projeto da sonda fria. Informações adicionais sobre detalhes de números de peça de sonda fria e construção, bem como consultoria adicional no desenho das ferramentas será fornecido mediante solicitação.
Acknowledgments
Agradecemos Sarah Wu e Camille Graham para o desenvolvimento de fases iniciais do ensaio frio sonda, a Bolsa de Centro Bloomington Drosophila para as populações da mosca, e membros do laboratório Galko pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH NRSA (NIH F31NS083306) para HNT, e pelo NIH R01NS069828, R21NS087360 e uma Universidade do Texas MD Anderson Clark Fellowship em pesquisa básica para MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
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