Summary
Aquí se demuestra un nuevo ensayo para estudiar la nocicepción frío en larvas de Drosophila. Este ensayo utiliza una sonda Peltier hecha a la medida capaz de aplicar un estímulo frío nocivo focal y da lugar a comportamientos específicos de frío cuantificables. Esta técnica permitirá además disección celular y molecular de la nocicepción frío.
Abstract
Cómo los organismos detectar y responder a las temperaturas nocivas aún es poco conocido. Además, los mecanismos de sensibilización de la maquinaria sensorial, tal como en los pacientes que experimentan la neuropatía periférica o sensibilización inducida por la lesión subyacentes, no están bien caracterizados. El modelo de Drosophila genéticamente tratables se ha utilizado para estudiar las células y los genes necesarios para la detección de calor nocivo, que ha dado múltiples genes conservados de interés. Poco se sabe sin embargo sobre las células y los receptores importantes para la detección frío nocivo. Aunque, Drosophila no sobrevive a la exposición prolongada a temperaturas frías (≤10 ºC), y evitará fresco, prefiriendo las temperaturas más cálidas en ensayos de preferencias de comportamiento, cómo se detectan y, posiblemente, evitar estímulos de frío nocivos sólo recientemente ha sido investigado.
Aquí se describen y caracterizan los primeros fríos nocivo (≤10 ºC) en el ensayo de conductaDrosophila. El uso de esta herramienta y el ensayo, se muestra un investigador cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente comportamientos nociceptivos fríos. Esto puede hacerse en condiciones de cultivo normales / sanos, o presumiblemente en el contexto de una enfermedad, lesión o sensibilización. Además, este ensayo puede ser aplicado a larvas seleccionadas para los genotipos deseados, lo que podría impactar thermosensation, dolor, o sensibilización nociceptiva. Dado que el dolor es un proceso altamente conservada, utilizando este ensayo para estudiar más a fondo la nocicepción térmica es probable que recoger importante comprensión de los procesos de dolor en otras especies, incluyendo vertebrados.
Introduction
Drosophila ha demostrado ser de gran utilidad para la identificación de nuevos genes conservados y circuitos neuronales que subyacen a los comportamientos complejos. Moscas proporcionan un conjunto de herramientas genético sofisticado y un sistema nervioso simplificado, que permiten la manipulación precisa genética y neuronal 1, 2, 3, 4 para diseccionar las bases celulares y moleculares de la nocicepción 5, 6, 7. Las larvas son particularmente útiles para estos análisis, dado que los ensayos de comportamiento para el tacto suave 8, 9, 10, calor nocivo 11, 12, 13 y la sensación mecánica de estímulos nocivos 4, 11 ya se han establecido, y la cutícula larval transparente permite la obtención de imágenes en vivo o fijo de la epidermis y de las neuronas sensoriales subyacentes. Recientemente, un ensayo frío nocivo También se ha desarrollado 7, que se describe con más detalle aquí.
Usando una sonda fría bien,-cónica con punta, mostramos que exhiben las larvas de Drosophila un conjunto de comportamientos reactivos específicos de frío, distinto de comportamientos observados durante la locomoción normal, siguientes toque suave, o después de duras estímulos mecánico de temperatura o alta 7, 8, 11 . Los comportamientos específicos de frío incluyen un robusto contracción de todo el cuerpo (CT), un aumento de 45-90º de los segmentos posteriores (PR) y un aumento simultáneo de la parte anterior y posterior segmentos en forma de U (Estados Unidos). La prevalencia de estos comportamientos se incrementa con temperaturas decrecientes pero cada picos a sligeramente diferentes temperaturas frías. Trabajos recientes sugieren que las respuestas de TC están mediadas por diferentes neuronas sensoriales periféricas que los que responden a estímulos calor nocivo o mecánica dura 7.
Al igual que los nociceptores vertebrados, Drosophila dendríticas múltiple (MD), las neuronas sensoriales periféricas tienen estructuras dendríticas complejos que ramifican sobre la epidermis 1. neuronas MD están presentes en cada segmento del cuerpo de las larvas, la proyección de sus axones al cordón nervioso ventral 14. neuronas sensoriales MD están separados en cuatro clases diferentes (I-IV) en base a la morfología dendrítica y tienen diferentes funciones sensoriales 4, 9, 10, 15, 16, 17. Si bien se requieren neuronas clase IV para las respuestas de balanceo de la carrocería lateral de larvasa altas temperaturas o estímulos mecánicos dura 4, clase III se requieren las neuronas para las respuestas de suave tacto 9, 10 y no sólo se activan por frío, pero también son necesarios para las respuestas de comportamiento evocada por frío 7. Ambos de clase III y clase IV neuronas utilizan potenciales canales discretos receptor transitorio (TRP) para facilitar las respuestas de comportamiento a nociva 7, 11, 18 y no nocivo estímulos 9, 10, 17, 19. Además, la nocicepción larval se sensibiliza después de la lesión, en los niveles celular 20 y de comportamiento 12, 21.
El ensayo descrito aquí permite la quantification de cualquiera normal, o potencialmente alteró las respuestas de comportamiento a bajas temperaturas que van desde nocivo frío (≤ 10 ºC), enfriar inocuo (11-17 ºC), a temperatura ambiente (18-22 ºC). Las temperaturas frías utilizadas en este ensayo son capaces de activar directamente de clase III neuronas sensoriales, provocando robustos, los aumentos de calcio reproducibles y respuestas de comportamiento evocada por frío, que puede ser cualitativa y cuantitativamente analizadas 7. Este ensayo puede ser aplicado a larvas de virtualmente cualquier genotipo, así como a las larvas expuestas a diversas condiciones ambientales (nutrición alterado, lesión, agentes farmacológicos) para determinar los factores tanto genéticos como ambientales que afectan a la nocicepción frío, sensibilización nociceptiva o plasticidad nociceptivo. Dado que thermosensation es ubicuo en muchas especies, este ensayo proporciona una herramienta valiosa para el estudio de la nocicepción y puede descubrir nuevas dianas de genes o interacciones neuronales que mejorennuestra comprensión de la nocicepción vertebrados.
La sonda fría hecha a la medida (ver sonda fría, Tabla de Materiales) utiliza una temperatura de bucle cerrado controlado dispositivo Peltier, que enfría el tubo de aluminio y punta cónica a través de la conducción térmica. Un termistor está incorporado dentro de la punta cónica de aluminio informa de la temperatura en tiempo real sobre la unidad de control. Un disipador de calor y el ventilador están unidos al módulo termoeléctrico para regular la carga del efecto Peltier calor (Qc) de modo que el intervalo de temperatura deseado de (22-0 ° C) se puede lograr (véase la unidad de control térmico, Tabla de Materiales). El estímulo frío nocivo de la punta de sonda fría se aplica a mano a la línea media dorsal, a segmento (s) equidistante de los extremos anterior y posterior (aproximadamente segmento A4, véase la Figura 1A) de la larva. En respuesta a estímulos de frío, las larvas generalmente producen uno de los tres comportamientos evocados frías dentro de un 10 s de corte: un cuerpo llenocontracción (TC), un aumento de 45-90º segmentos anterior y posterior en forma de U (Estados Unidos), o un aumento de los segmentos posteriores (PR) (descritos en los resultados). Ninguno de estos comportamientos se llevan a cabo durante la locomoción peristáltica normal o comportamiento de forrajeo. Estos comportamientos también son distintas de las respuestas táctiles suaves y la respuesta aversiva rodadura a alta temperatura o estímulos mecánicos nocivos.
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Protocol
1. Preparación de las larvas
- Elevar acciones o cruces genéticos en una incubadora a 25 ºC.
- Si el cultivo de una cruz, utilizar 20-25 hembras vírgenes y 15-20 varones por cada vial que contiene medios de comunicación regular de mosca harina de maíz. Permitir que las hembras ponen huevos a aproximadamente 48 h antes de transferirlos a un nuevo vial de alimentos.
- 4-5 días después de la puesta de huevos, recoger 3 rd instar larvas del genotipo deseado por chorros suavemente una corriente de agua en la comida blanda y larvas, y verter el contenido en una, placa de Petri limpia de tamaño mediano (60 mm x 15 mm).
- A continuación, ordenar suavemente larvas por tamaño usando fórceps o un pincel para impedir más grande "errante 3 rd instar" o larvas enfermizo pequeña de ser probado. larvas de Descarte contiene ningún marcadores genéticos no deseadas o equilibradores.
- Tener un compañero de platos de etiquetas miembro del laboratorio o recipientes donde se colocará larvas ordenados de modo que el experimentador puede ser "ciegos" a la experimental condición o genotipo de las larvas en su caso. El experimentador puede aplicar etiquetas decodificadas a los datos recogidos después de que el experimento utilizando una clave generada por un laboratorio-miembro.
- El uso de un scoopula, transferir una cantidad tamaño de una moneda de alimentos frescos en una (35 mm x 10 mm o 60 mm x 15 mm) limpio, placa de Petri etiquetada lleno hasta la mitad con agua a temperatura ambiente.
- mover suavemente el larvas ordenados sobre el alimento (para evitar la inanición o desecación si se anticipa pruebas que tomar más de 20 min) usando fórceps o pincel.
2. Fría ensayo de sondas
- A su vez en la unidad de sonda fría permitiendo unos pocos minutos para que se enfríe a la temperatura deseada. Si el ajuste a temperaturas más bajas, la condensación es probable que formar a lo largo de la sonda.
- Limpiar cualquier exceso de humedad con un laboratorio de toallita antes de la aplicación a la larva. Cuando no está en uso inmediato, el lugar de aislamiento tapa de la sonda a la vez aislar y mantener la punta limpia y evitar daños.
- Colocar un 3 rd instar larva mediados sobre una pieza delgada de vinilo movible oscuro (típicamente, utilice un pequeño trozo cortado de un aglutinante notebook) bajo un microscopio de campo brillante. Las ayudas de vinilo negros en la visualización de contraste y en mover la larva sin tocarlo para alinearlo correctamente con la sonda.
- Ajuste el microscopio (véase la Tabla de Materiales) y la unidad de luz (véase la Tabla de Materiales) a brillo medio (50-75% de brillo max) para proporcionar contraste y evitar que la larva se seque demasiado rápido.
- Descarte cualquier larva que no exhiben primera locomoción peristáltica normal, ya que podrían confundir los resultados. La larva debe estar húmedo de la placa de Petri de agua de lo contrario la larva se adherirá a la de vinilo inhibir la locomoción normal. El agua no debe formar un charco alrededor de la larva.
- Avanzar en la sonda con la mano hacia la larva en un ángulo de 90º con respecto al eje anteroposterior del cuerpo, utilizando el vinilo para mover la larva en corposición rect (véase la Figura 1A).
- Oriente la punta de la sonda para sentar suavemente por la superficie dorsal media de la larva con la sonda en un ángulo de aproximadamente 45º a la platina del microscopio.
- Tras el contacto de la sonda, iniciar un temporizador de laboratorio. Aplicar suficiente presión hacia abajo para sangrar ligeramente la superficie de la cutícula larval mientras que todavía permite adelante o movimiento hacia atrás.
- Mantener la sonda en su lugar durante un máximo de 10 s o hasta que se observó una respuesta de comportamiento evocada por el frío - lo que ocurra primero. A continuación, retire la sonda.
- Registrar la respuesta conductual observada y la latencia de respuesta. Las larvas que no responde dentro de 10 s se consideran "no respondedores". Latencia también se puede grabar para los respondedores y se usa para medir los cambios en respuesta robustez / amplitud.
- Descartar larva y preparar el siguiente.
- Repetir los pasos 2.3 a 2.11 hasta que se alcanza el número deseado de larvas de prueba (tres conjuntos de n = 20-40 larvas fueron used aquí).
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Representative Results
Drosophila larvas se mueven con un movimiento peristáltico que incluye pausas ocasionales, cabeza vueltas, y los cambios de dirección 22. En respuesta a la aplicación focal de un estímulo nocivo frío sin embargo, las larvas presentan un conjunto de comportamientos únicos, a diferencia del rodillo lateral aversivo al calor nocivo y estímulos mecánicos. Estos comportamientos también son diferentes de las respuestas al toque suave 8, 9, 10 o al contacto de una sonda de temperatura ambiente. Los comportamientos evocados fríos son los siguientes: arrugando sus segmentos anterior y posterior hacia el centro de su cuerpo en una contracción (CT), crianza de sus segmentos anterior y posterior (aproximadamente 45-90 °) en el aire, haciendo un U- moldear (US), o elevar únicamente sus segmentos posteriores (aproximadamente 45-90 °) en el aire (PR) (Figura 1). el experimentadorSe debe advertir que estas descripciones del comportamiento son directrices cualitativos más que cuantitativos puntos de corte. Estas respuestas se observaron en un rango de temperaturas frías de 3-18 ºC (Figura 2A). Sin embargo, diferentes comportamientos pico sobre diferentes rangos de frío (Figuras 2B y 2C): 3-8 ºC para PR y US y 9-14 ºC para CT. CT es la única respuesta evocada por frío de vez en cuando se observa en pequeño porcentaje de larvas en respuesta al tacto suave, usando una sonda de temperatura ambiente (RT) (Figura 2). información de latencia también puede ser recogida y estadísticamente comparó usando este ensayo (véase más adelante para las pruebas estadísticas utilizadas), que pueden proporcionar información interesante después de una lesión o de otras condiciones ambientales.
Para comparar las latencias de los diferentes comportamientos fríos, las respuestas evocadas por frío se midieron hasta un 20 s de corte del tres al temple frío a-coolturas (3, 10 y 20 ºC), así como a una sonda de temperatura ambiente (RT) y se representaron como respuestas acumuladas observadas con el tiempo (Figura 3). En primer lugar, se observó que se observan la mayoría de las respuestas a temperaturas frías (3 ºC y 10 ºC) entre 1 y 10 s después de la aplicación de la sonda (Figura 3A - 3B), mientras que las respuestas CT parecen tener frecuencias más largos a temperaturas inocuo (20 ºC y sala temperatura (RT), la Figura 3C - 3D). En segundo lugar, aunque los Estados Unidos, PR y CT respuesta frente a las curvas de latencia no fueron significativamente diferentes entre sí en 3 ºC (Figura 3A) a 10 ºC, 20 ºC y RT, la respuesta CT frente a las curvas de latencia fueron significativamente diferentes de los Estados Unidos y / o PR , mientras que las curvas de relaciones públicas de Estados Unidos y no fueron significativamente diferentes entre sí a cualquier temperatura probado (por Long-rank (Mantel-Cox) y la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon, la figura 3B - 3D (Figura 3E). Para este tipo de comparación categórica, las respuestas evocadas por frío se agruparon en tres categorías de latencia: menos de 4 s, entre 4-10 s, así como entre 11-20 s (Figura 3E - 3H). El porcentaje de respondedores para cada comportamiento está representada como una proporción de respondedores que caen dentro de cada categoría de velocidad (los resultados se compararon estadísticamente entre los comportamientos por tabla de contingencia arxc). Una vez más, este análisis no reveló diferencias significativas entre PR y las respuestas de latencia de los Estados Unidos (Figura 3E - 3H), pero las respuestas CT fueron significativamente diferentes de PR a 3 ºC y 10 ºC, y de US a todas las temperaturas probadas, incluyendo la sonda de RT (Figura 3E - 3F). En conjunto, estos datosmuestran que un 10 s ensayo de corte es más que suficiente para recoger conjuntos de datos significativos, y que la respuesta CT-evocado frío se produce en latencias relativamente más largos que los de Estados Unidos o respuestas PR. Puesto que hay cierta variabilidad en las respuestas de larva a larva, hemos probado tres conjuntos de 20 larvas en cada temperatura y reportamos el error estándar de la media para cada respuesta (Figura 3E - 3H).
Dado que el tamaño de las larvas (y por lo tanto el tamaño relativo del estímulo frío) puede variar mucho entre principios y finales de tercera estadio las larvas, temprano, larvas de 3 rd mediados y finales se ensayaron a 3 ºC y 10 ºC y sus respuestas se compararon (Figura 4) . Se utilizaron cuatro a cinco días de edad cultivos de larvas para recoger larvas que a continuación se agruparon en temprano, mediados o finales de tercera instar etapas más o menos por su longitud / tamaño (Figura 4). Curiosamente, algunos RESPOvariabilidad NSE se observó entre las etapas de desarrollo en función de la temperatura que se está probando. A 3 ºC, a principios de larvas 3ª mostró un menor número de relaciones públicas y de Estados Unidos respondedores y los respondedores más TC (Figuras 4A - 4C). A 10 ºC, sin embargo, no hay respuesta varió sustancialmente a través de las etapas de desarrollo (Figuras 4D - 4F). La comparación de los respondedores porcentaje total en los 10 s de corte para cada comportamiento a 3 ºC o 10 ºC revela que sólo temprana larvas 3ª tienen respuestas significativamente diferentes de relaciones públicas y CT a 3 ºC (Figuras 4G y 4H).
III múltiples neuronas sensoriales dendríticas clase son activadas directamente por las bajas temperaturas y son necesarios para la respuesta CT a la sonda fría 7. También pueden surgir respuestas CT robustos cuando se aplica un estímulo frío a anterior regiones del larva (la cabeza) (Figura 5B). Para determinar si las respuestas evocadas fríos resultantes de la estimulación directa de la cabeza también requerir neuronas MD (incluyendo clase III) un estímulo frío se aplicó suavemente a la cabeza de las larvas (Figura 5A) que expresan un transgén de la toxina tetánica en todas las neuronas sensoriales md efectiva eléctricamente silenciándolas 3. Cuando las larvas se estimulan en la cabeza con frío (6 ° C), un gran porcentaje de larvas todavía se produce una respuesta CT, a pesar de las neuronas MD siendo silenciada (Figura 5B). Estos datos sugieren que no se requieren las neuronas MD para un CT-evocado frío cuando sondeo de la cabeza, y por lo tanto esta respuesta debe requerir otros tipos de neuronas sensoriales, que podrían ser identificados usando esta herramienta y ensayo.
Figura 1: ensayo de sonda fría. (A) Diagramo de aplicación sonda fría al control instar 3 rd (w 1118) larva. La punta de la sonda en frío de aluminio, ajustado a la temperatura deseada, es ligeramente coloca en el segmento dorsal A4 de la larva por hasta 10 s permitiendo libre de la gama de movimiento. (B) Una sección transversal de la larva que indica el ángulo de la sonda a medida que se aplica. La sonda debe mantenerse a un ángulo aproximado de 45º a la platina del microscopio (línea discontinua), y perpendicularmente al eje anteroposterior del cuerpo de la larva durante la estimulación. (C) Diagrama de los tres comportamientos evocados frías observado: (i) Contracción (CT) de la parte anterior y posterior hacia el centro del cuerpo larval (flechas de color gris), (ii) en forma de U (US): a 45- 90 (líneas discontinuas) recaudar de la anterior y posterior, y (iii) posterior raise (PR): un (líneas discontinuas) aumento de la parte posterior de la cabeza y la cola hacia el centro del cuerpo de la larva 45-90 (flechas grises) .
Figura 2: La respuesta evocada en frío frente a la temperatura. (A) Porcentaje de pacientes que responden en el control de instar 3 rd media (w 1118) larvas en un rango de temperaturas frías (3-22 ºC) o sonda de temperatura ambiente (TA). (B) Porcentaje de PR, los respondedores de Estados Unidos y (C) CT a diferentes temperaturas frías con respuestas de los picos indica. (A - C) PR: aumento posterior, los Estados Unidos: en forma de U, CT: Contrato. Las barras de error son el error estándar de la media de 3 series de n = 40 larvas, las respuestas se promediaron. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
figure 3: latencia de respuesta evocada fría frente a la temperatura. (A - D) Porcentaje de acumulativo de Estados Unidos (rojo), PR (azul), o CT (verde) respondedores a sonda fría a diversas temperaturas (3º C, 10 ºC, 20 ºC y RT) con el tiempo (1-20 s) en control (w 1118) larvas. (E - H) proporciones medias de rápido (<4 s), lento (4-10 s), y tardía (11-12 s) responder larvas de sonda fría a diversas temperaturas (3º C, 10 ºC, 20 ºC y RT ). (A - H) Para cada temperatura, n = Se ensayaron 3 series de 40 larvas. PR: aumento posterior, los Estados Unidos: en forma de U, CT: Temporal, RT: temperatura ambiente. (A - D) NS: no hay diferencias significativas entre los conjuntos de datos, * = valor de p <0,05, ** = p-valor <0,0001 por Long-rank (Mantel-Cox) de prueba y la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Bares (EH) de error indican sem * = valor de p <0,05, ** = p-valor <0.0001 por la tabla de contingencia arxc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: latencia de respuesta evocada por frío en larvas de instar temprano, medio y tardío 3 rd. Porcentaje de respuesta acumulativas a un (A - C) 3 ºC o (D - F) 10 ºC sonda fría con el tiempo (1-20 s) a principios de (negro), media (naranja) o tardía (verde) de control instar 3 rd ( w 1118) larvas. Las respuestas frente a la latencia están separados por comportamiento: PR (A, D), Estados Unidos (B, E), CT (A - F). * = Valor de p <0,05, ** = p-valor <0,001 por Long-rank (Mantel-Cox) de prueba y Gehan-BreSlow-prueba de Wilcoxon. (G - H) por ciento de respondedores acumulativos a un (G) 3 ºC o (H) 10 sonda fría ºC en 10 s en la primera, larvas instar 3 rd media o tardía. Las barras de error indican SEM * = valor de p <0,05 por la prueba exacta de dos colas de Fisher. n = 3 series de 20 larvas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuando se estimula en la cabeza, las respuestas CT-evocó fríos no requieren neuronas sensoriales md. (A) Esquema de ensayo de sonda fría cuando anterior se estimula en 3 rd larva instar. (B) Promedio de respondedores ciento CT a sonda fría (6 ºC) cuando las larvas son estimulados en el más anterio segmentos. Las barras grises: los controles genéticos, barra verde: Todas las neuronas md silenciados través de la expresión del transgen toxina del tétanos. Una forma inactiva del transgén toxina del tétanos se utilizó como un control adicional ( 'Inactivo Tétanos'), n = 3 series de 30 larvas por genotipo. bar verde no se redujo significativamente de todos los controles genéticos pertinentes por Fisher de Exact, prueba * valor de p <0,05 de dos colas. (B) Los genotipos utilizados (de izquierda a derecha): w 1,118 (control), el tétanos UAS-inactivo / + (UAS solo control), UAS-tétanos / + (UAS solo control), MD-Gal4 / + (Gal4 de control solo) , tétanos MD-Gal4 / UAS-inactivo (control tétanos inactivo expresa en todas las neuronas MD), y MD-Gal4 / tétanos UAS-activo (experimental tétanos condición activa expresa en todas las neuronas MD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ P>
Tabla 1: Mosca receta de comida para el ensayo de sonda fría.
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Discussion
El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la nocicepción o sensibilización nociceptiva en larvas de varios fondos genéticos, influencias ambientales, y / o condiciones de avería inducida. Dado que este ensayo permite la aplicación focal de un estímulo frío, con esta herramienta se puede evaluar la función de un subconjunto de neuronas sensoriales periféricas específicamente en respuesta a las temperaturas frías. Curiosamente, estos comportamientos evocados fríos parecen utilizar diferentes clases de neuronas sensoriales que los activados por el calor 7, 11, pero el circuito nociceptiva térmica completo no es todavía completamente comprendidas. Al igual que muchos otros ensayos nociceptivas locales este ensayo está sujeto a cierta variabilidad entre los usuarios dependiendo de la aplicación de la sonda fría. Sin embargo, la colocación específica de la sonda frío en la mitad del cuerpo (evitando la cabeza y la cola) no parecen tener un SIGNIFICAnt impacto en las respuestas frías 7. La práctica y la repetición pueden minimizar esta variabilidad entre usuarios.
Previamente se caracterizó el ensayo de sonda fría y reportamos las neuronas-frío sensible específicos y canales sensoriales requeridas para producir la respuesta CT 7. Aquí caracterizamos además cómo los datos de latencia se puede cuantificar y analizar como otra medida nociceptivo, el análisis de los datos de los puntos de corte más largo para determinar el intervalo de tiempo más óptimo para el ensayo. Hemos encontrado que la mayoría de las respuestas evocadas en frío se producen dentro de 10 segundos de aplicación del estímulo, por lo que un segundo 10 cortada a la vez económica y eficaz. Además, dado que los diferentes comportamientos evocados frías pico a diferentes temperaturas, las latencias de estas respuestas son importantes para analizar por separado, como se hace aquí, para apreciar plenamente la solidez de las diferentes respuestas a diferentes temperaturas. También mostramos, en función del comportamiento de ser analyzed, la forma larvaria tamaño puede afectar las respuestas evocadas en frío. Por lo tanto, se mantiene el tamaño de las larvas consistente en todos los experimentos de comportamiento será necesario. Por último, se muestra cómo este ensayo se puede utilizar para identificar o descartar, conjuntos de neuronas sensoriales implicados en la nocicepción frío, que parece variar dependiendo de la ubicación de estimulación por frío a la larva.
Ahora que existe un ensayo de nocicepción en frío línea de base, podemos incorporar métodos de daños y / o sensibilización a hacer preguntas más complicadas sobre la biología del dolor. Por ejemplo, se sabe que las respuestas laterales balanceo de la carrocería a calor inocuo o nocivo se sensibilizan después de daño UV a la epidermis, lo que requiere mediadores genéticos específicos y canales TRP 12, 20, 21. Si el daño UV similar a la epidermis resultados en las respuestas frías sensibilizados y si las vías genéticas similares están involucrados es desconocida. Igualmente,
Hay una serie de pruebas estadísticas que deben ser considerados utilizando este ensayo. La prueba estadística se utilizó con mayor frecuencia es la prueba exacta de Fischer con una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples, o la prueba de chi-cuadrado. Estas pruebas se utilizan cuando se comparan respondedores medio en forma de gráfico de barras (es decir, en la figura 3E - 3H, la Figura 4G - 4H y la Figura 5B). Para la comparación de las latencias acumuladas en forma de gráfico de línea, hemos utilizado a largo rango (Mantel-Cox) de prueba 27, 28 y la Gehan-Breslow-Wilcoxonprueba de 29, 30, que son a la vez suele utilizar para comparar las distribuciones de supervivencia. Sugerimos tres series de 20-40 larvas para cada genotipo / experimento para permitir el cálculo del error estándar de la media entre las series repetidas.
Para concluir, este ensayo permite la aplicación precisa de un estímulo frío nocivo y las respuestas de comportamiento resultantes en larvas de Drosophila se han caracterizado. Todavía hay mucho que no sabemos acerca de las células y los genes necesarios para la nocicepción en las moscas o vertebrados. Con este ensayo, se puede utilizar el sistema altamente tratable Drosophila a pantalla rápidamente para genes conservados cruciales para la nocicepción línea de base, identificar circuitos nociceptivos, y evaluar los cambios celulares y genéticos que se producen después de daño en el tejido para causar sensibilización nociceptiva. En última instancia, este ensayo ayudará a la ganancia de campo dolor valiosa información acerca de la biología del dolor en un sistema quepuede aplicarse fácilmente a los modelos animales más complejos.
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Disclosures
Una solicitud de patente de Estados Unidos (CL) está pendiente en el diseño de la sonda fría. Información adicional sobre los detalles de los números de pieza sonda fría y la construcción, así como la consulta adicional sobre el diseño de la herramienta se puede proporcionar a petición.
Acknowledgments
Agradecemos a Sarah Wu y Camille Graham para el desarrollo de las primeras fases del ensayo enfriado sonda, el Centro de Bloomington Drosophila para poblaciones de moscas, y los miembros del laboratorio Galko para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIH NRSA (NIH F31NS083306) a HNT, y por el NIH R01NS069828, R21NS087360 y una Universidad de Texas MD Anderson Clark Fellowship en Investigación Básica a MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
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