Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

Published: April 15, 2017 doi: 10.3791/55570
Automatic Translation
1, 1
1WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity

Summary

وصفنا استخدام القائم على مضان المظهري النورامينيداز تثبيط فحص لتقييم قابلية أنفلونزا A و B الفيروسات إلى فئة النورامينيداز المانع من الأدوية المضادة للفيروسات.

Abstract

والنورامينيداز (NA) مثبطات هي الطبقة الوحيدة من مضادات الفيروسات المعتمدة للعلاج والوقاية من الأنفلونزا التي هي فعالة ضد السلالات المنتشرة حاليا. بالإضافة إلى استخدامها في علاج الأنفلونزا الموسمية، وقد تم تخزينه مثبطات NA من قبل عدد من الدول لاستخدامها في حالة حدوث وباء. ولذلك فمن المهم لمراقبة قابلية فيروسات الانفلونزا لهذه الفئة من الأدوية المضادة للفيروسات. وهناك أنواع مختلفة من المقايسات التي يمكن استخدامها لتقييم قابلية فيروسات الأنفلونزا إلى مثبطات NA، ولكن المقايسات انزيم تثبيط باستخدام إما الركيزة الفلورسنت أو ركيزة chemiluminescent هي الأكثر استخداما على نطاق واسع والموصى بها. يصف هذا البروتوكول استخدام مقايسة على أساس مضان لتقييم قابلية فيروس الانفلونزا لمثبطات NA. ويستند هذا الفحص على انزيم NA الشق 2 "- (4-ميثيل مبيليفيريل) -α-D- حمض -acetylneuraminic N (MUNANA) الركيزة للافراج عن الفلورسنت المنتج 4-methylumbelliferone (4-MU). لذلك، يتم تحديد تأثير كابح من مثبطات NA على فيروس الانفلونزا NA على أساس تركيز مثبط NA ما هو مطلوب للحد من 50٪ من النشاط NA، نظرا كقيمة IC 50.

Introduction

الراصة الدموية (HA) والنورامينيداز (NA) هما بروتينات سكرية سطح الرئيسية للأنفلونزا A و B الفيروسات. HA بربط اللعابي حمض اللبن من البروتينات السكرية سطح الخلية أو السكرية، في حين أن NA تفرج عن الفيروس عن طريق الشق الحامض اللعابي من اللبن على سطح الخلية 1. مثبطات NA هي فئة من الأدوية المضادة للفيروسات الأنفلونزا التي تم تصميمها بشكل عقلاني لربط بإحكام إلى الموقع NA الأنزيمية فعال، وبالتالي منع إطلاق سراح وانتشار سلالة الفيروس. الأوسيلتاميفير والزاناميفير نوعان من مثبطات NA التي تمت الموافقة عليها في العديد من البلدان في جميع أنحاء العالم للعلاج والوقاية من الأنفلونزا. في السنوات الأخيرة، وهما مثبطات NA إضافية، أثبت عقار بيراميفير وlaninamivir، وقد تمت الموافقة للاستخدام في عدد محدود من البلدان. فحص فيروسات الأنفلونزا عن التعرض لمثبطات NA وتحديد الطفرات التي تمنح مقاومة هامة في تحديد ورصد فعاليهeness هذه الفئة من الأدوية المضادة للفيروسات.

في السنوات ال 16 الماضية، تم إجراء فحص NA تثبيط القائم على مضان بشكل روتيني في المركز المتعاون مع المنظمة بشأن المراجع والبحوث الخاصة بالأنفلونزا، ملبورن (ملبورن WHOCCRRI) لمراقبة اتجاه تغيير قابلية المضادة للفيروسات بين فيروسات الأنفلونزا. سنويا، ويتم اختبار أكثر من 2000 فيروسات الأنفلونزا عن التعرض للفيروسات. في معظم مواسم الانفلونزا،> 98٪ من الفيروسات عرضة لجميع مثبطات أربعة NA 2، 3، 4، على الرغم خلال موسم نصف الكرة الشمالي الأنفلونزا 2007-2008، كان هناك زيادة في عدد (H1N1) A الفيروسات الموسمية السابقة أن خفضت قابلية للأوسيلتاميفير 5. هذه المجموعة من الفيروسات، والتي تحتوي على الأحماض الأمينية NA استبدال H275Y وامتد إلى بقية أنحاء العالم بحلول نهاية عام 2008، مما يجعل الدواء بطريقة غير لائقةأكل عالميا لعلاج هذا الفيروس. الغالبية العظمى من تدور حاليا الأنفلونزا B والأنفلونزا A (H3N2)، وأنفلونزا A (H1N1) سلالات pdm09 عرضة للالدواء، على الرغم من أن مجموعة سكانية من A (H1N1) المتغيرات pdm09 التي تحتوي على NA الأحماض الأمينية استبدال H275Y أن يضفي تخفيض الدواء و أثبت عقار بيراميفير قابلية، قد ذكرت في أجزاء مختلفة من العالم 6 و 7.

بسبب الحاجة لعيار الفيروس عالية بما فيه الكفاية، العينات السريرية (بما في ذلك يغسل الأنف الحيوان) يجب أن passaged في أي ثقافة الخلية أو أجنة بيض الدجاج قبل اختبار الحساسية المضادة للفيروسات. مقايسة تثبيط NA الموصوفة في هذه المقالة يمكن تقسيمها إلى ثلاثة أقسام:

تحديد مجموعة خطية للمنتج الفلورسنت 4 methylumbelliferone (4-MU) على التألق معين
بسبب الخلافات المتأصلة بين الفلورية، رانه مجموعة خطية للالفلورسنت المنتج النهائي، 4-MU، ووحدة مضان النسبي (RFU)، تحتاج إلى أن تنشأ. بمجرد إنشاء مجموعة خطية لمدة 4-MU، يتم تحديد إشارة الهدف الأمثل، والتي يتم ضبط تركيز فيروسات الأنفلونزا في مقايسة النشاط NA. وبمجرد الانتهاء لالتألق معين، وهذا لا ينبغي حاجة لتكرارها.

تحديد النشاط NA من الفيروسات
النشاط فحص NA هو فحص بسيط هو أن ينطوي على إضافة 2 "- الركيزة (4-ميثيل مبيليفيريل) -α-D- N حمض -acetylneuraminic (MUNANA) إلى المخفف متسلسل الفيروسات. يتم قياس كمية الفلورسنت المنتج النهائي 4-MU الناتجة عن الانقسام من MUNANA من قبل NA باستخدام مقياس التألق. يتم تحديد تخفيف فيروس المناسب لاستخدامها في تثبيط فحص NA بالتآمر وحدات مضان ضد تمييع الفيروس. من منحنى السيني المنتجة، منتصف القسم الخطية يجب أن تتوافق معمجموعة خطية 4-MU من التألق تحديد في قسم 1، وسوف تبلغ التركيز المناسب من الفيروسات لاستخدامها في القسم 3.

تقييم قابلية الفيروس إلى مثبطات NA باستخدام تثبيط فحص NA
لتقييم قابلية الفيروسات المانع NA معين، يتم تحضين الفيروسات في التخفيف المحددة في القسم 2 مع مجموعة من تركيزات مثبط NA. وبعد حضانة لاحقة مع MUNANA، يتم قياس 4-MU الناتجة عن الفيروسات غير مأهولة في RFU من التألق. ويتم احتساب تأثير كابح للالمانع NA على نشاط انزيم NA فيروس وفقا لتركيز مثبط NA اللازمة للحد من 50٪ من النشاط NA، نظرا كقيمة IC 50.

Protocol

1. تحديد نطاق الخطي نيون المنتج 4-MU على التألق

  1. إعداد 10 مل من 6.4 ملي 4-MU حل الأسهم عن طريق إذابة 11.3 ملغ من 4-MU في 5 مل من الايثانول المطلق. إضافة 5 مل من كلوريد الصوديوم 0.9٪ (ث / ت) إلى حل الأسهم لجعل 10 مل. إعداد 640 ميكرومتر حل العمل عن طريق تمييع 1 مل من 6.4 ملي 4-MU في 9 مل من 1X العازلة فحص (33.3 ملي 2- (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES) و 4 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة 6.5).
    ملاحظة: إعداد العازلة 2X فحص عن طريق إضافة 13 غرام من MES و 8 مل من 1 M CaCl 2-992 مل من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام 10 M هيدروكسيد الصوديوم. تصفية المخزن المؤقت باستخدام معقم مرشح خلات السليلوز من حجم المسام 0.2 ميكرون. الحذر! هيدروكسيد الصوديوم هو الكاوية وقد يسبب حروقا كيميائية على الجلد والعينين. تأكد من أن معدات الحماية الشخصية الكاملة هي البالية.
  2. إعداد 5 مل من مجموعة من تركيزات 4-MU (أي 5 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 40 ميكرومتر، و 80 ميكرومتر، 160 & #181، M، و 320 ميكرومتر) من خلال التخفيف المتسلسل شقين من 640 ميكرومتر 4-MU باستخدام عازلة فحص 1X.
  3. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من كل تخفيف التسلسلي 4-MU (أي 5 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 40 ميكرومتر، و 80 ميكرومتر، 160 ميكرومتر، 320 ميكرومتر و 640 ميكرومتر) (بئرين في تمييع) في واضحة، 96- كذلك لوحة القاع شقة و 50 ميكرولتر من العازلة الفحص 1X في الآبار المتبقية (التي تشكل الفراغات لقياس الإشارات الخلفية).
    ملاحظة: تركيزات النهائي من 4-MU في حجم رد الفعل (50 ميكرولتر 4-MU + 50 ميكرولتر من 300 ميكرومتر MUNANA) هي 2.5 ميكرومتر، 5 ميكرومتر، و 10 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 40 ميكرومتر، و 80 ميكرومتر، 160 ميكرومتر و 320 ميكرومتر .
  4. إعداد مم مونانا محلول المخزون 2.5 خلال إعادة تأسيس 25 ملغ من MUNANA في 20 مل من الماء المقطر. مزيج 0.72 مل من 2.5 مم مونانا مع 5.28 مل من 1X العازلة الفحص للحصول على 300 ميكرومتر MUNANA العمل الحل (حجم كاف لوحة واحدة). تغطية الأنبوب الذي يحتوي على 300 ميكرومتر MUNANA ركينز حل بورق الألمنيوم ويبقيه على الجليد ما لم استخدامها على الفور. تجاهل أي مواد متبقية.
    ملاحظة: يمكن تخزين مم مونانا حل الأوراق المالية 2.5 في -20 درجة مئوية لمدة 1 شهر و يجب أن تستخدم في تجميد دورة واحدة / الذوبان. و-MU 4 و MUNANA حلول خفيفة حساسة ويجب حمايتها من التعرض للضوء لفترة طويلة.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من 300 ميكرومتر MUNANA إلى كل بئر، اضغط بلطف إلى مزيج، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تغطية لوحة مع سداده لوحة لمنع التبخر.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي لحساب مضان الخلفية في تثبيط فحص NA.
  6. إعداد الحل محطة وعن طريق خلط 11 مل من الايثانول المطلق مع 2.225 مل من 0.824 M هيدروكسيد الصوديوم (حجم كاف لوحة واحدة).
  7. إضافة 100 ميكرولتر من توقف حل كل بئر لوقف التفاعل والاستفادة بلطف لمزج.
  8. قراءة لوحة باستخدام مقياس التألق مع أجواء الإثارة الطول الموجي من 355 نانومتر، وبيئة الطول الموجي الانبعاثات من 460 نانومتر، والمؤسسة العامةص تعليمات الشركة الصانعة.
  9. حساب متوسط ​​إشارة الخلفية باستخدام إشارات مضان من كل الآبار لا تحتوي على 4-MU. طرح هذا متوسط ​​إشارة الخلفية من كل من الآبار التي تحتوي 4-MU وحساب متوسط ​​إشارات (RFU) لكل تركيز 4-MU. رسم منحنى مستوى RFU ضد تركيز 4-MU (ميكرومتر)، كما هو مبين في الشكل 1A. ويظهر مقطع طولي عن قرب منحنى في الشكل 1B.
  10. تصور قطعة RFU مقابل 4-MU تركيز (ميكرومتر) لتحديد نطاق الخطية وإشارة الهدف الأمثل. مجموعة الخطي هو المكان الزيادات إشارة مضان بما يتناسب مع زيادة تركيزات 4-MU على قطعة أرض، في حين أن إشارة الهدف الأمثل هو التركيز التعسفي 4-MU ضمن مجموعة خطية.
    ملاحظة: مجموعة خطية وإشارة الهدف المثلى هي التألق محددة. على سبيل المثال، والتألق في WHOCCRRI ملبورن لديها مجموعة خطية من 2،5-40 ميكرومتر 4-MU وإشارة الهدف الأمثل لل~ 30 ميكرومتر 4-MU، والتي تتطابق مع ~ 1500 RFU.

2. تحديد آخر NA من الفيروسات

ملاحظة: فيروسات الأنفلونزا يتم تربيتها لالتتر كافية في مدين، داربي الناب الكلى (MDCK) الخلايا أو بيض الدجاج المحتوي 8.

  1. الاستغناء عن 120 ميكرولتر لكل بئر من فيروسات الأنفلونزا مثقف غير مخفف في العمود 1 و 60 ميكرولتر من العازلة الفحص 1X تحتوي على 0.1٪ NP-40 إلى 11 الأعمدة المتبقية من 96 جيدا، لوحة U-القاع.
  2. متسلسل أداء التخفيف من شقين من الفيروسات عبر لوحة (أي نقل 60 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 وهكذا دواليك، حتى عمود 11) باستخدام ماصة الأقنية، وترك عمود 12 كما فارغة تحتوي عازلة فحص فقط 1X.
  3. نقل 50 ميكرولتر من كل من الآبار (الفيروسات المخفف والفراغات) في واضحة، 96-جيدا، لوحة القاع شقة.
    ملاحظة: ليس من الضروري جنصائح HANGE ماصة إذا تم نقل المواد من العمود 12 وصولا إلى العمود 1.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من 300 ميكرومتر MUNANA (المعد وفقا الخطوة 1.4) لكل بئر والاستفادة بلطف لوحة لالمزيج. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تغطية لوحة مع سداده لوحة لمنع التبخر.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من الحل محطة (المعد وفقا الخطوة 1.6) لكل بئر لإنهاء التفاعل والاستفادة بلطف لوحة لالمزيج.
  6. قراءة لوحة باستخدام مقياس التألق.
    1. استخدام إعداد الطول الموجي الإثارة من 355 نانومتر، وبيئة الطول الموجي الانبعاثات من 460 نانومتر.
  7. تحديد متوسط ​​إشارة الخلفية بناء على قراءات مضان في العمود 12 وطرح متوسط ​​إشارة الخلفية من كل بئر. رسم بياني لRFU ضد التخفيفات الفيروس.
    ملاحظة: القيم الأساسية لمدة 100 MUNANA ميكرومتر في WHOCCRRI ملبورن وعادة ما تكون بين 50 و 120 RFU، ولكن هذه سوف تختلف اعتمادا على باي التألقتستخدم نانوغرام.
  8. عرض قطعة RFU ضد التخفيفات الفيروس لتحديد منتصف قسم خطية من المنحنى لكل فيروس (الشكل 2). استخدام إشارة الهدف الأمثل (تحديدها في الخطوة 1) كنقطة مرجعية.
    ملاحظة: يجب أن تتوافق مع مجموعة خطية 4-MU من التألق المحددة في المادة 1 وسوف توفر التركيز المناسب من الفيروسات لاستخدامها في القسم 3.

3. تقييم حساسية الفيروس إلى NA مثبطات باستخدام NA تثبيط الفحص

  1. إعداد الأسهم سيد مثبطات NA بتركيزات من 300 ميكرومتر.
    1. إعداد 300 ميكرومتر زاناميفير (الوزن الجزيئي، MW = 332.32 جم / مول) عن طريق إذابة 5.0 ملغ من زاناميفير في 50 مل من 2X العازلة فحص (66.6 ملي MES و 8 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة 6.5).
    2. إعداد 300 ميكرومتر الدواء الكربوكسيل (D-طرطرات، MW = 386.44 جم / مول) عن طريق إذابة 5.8 ملغ في 50 مل من العازلة الفحص 2X.
    3. إعداد300 ميكرومتر أثبت عقار بيراميفير هيدرات (MW = 382.45 جم / مول) عن طريق إذابة 5.7 ملغ في 50 مل من العازلة الفحص 2X.
    4. إعداد 300 ميكرومتر laninamivir (MW = 346.34 جم / مول) عن طريق إذابة 5.2 ملغ في 50 مل من العازلة الفحص 2X.
      ملاحظة: يمكن تخزين مخزون سيد المانع NA في -20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا. تحقق من MW من مثبطات NA لضمان استخدام الأوزان الصحيحة وحدات التخزين في إعادة. والكربوكسيل الدواء هو مركب نشط من الفوسفات دواء مساعد الدواء. ولذلك، ينبغي أن تستخدم فقط الكربوكسيل الدواء في تثبيط فحص NA.
  2. من الأسهم الرئيسية، إعداد مخزون من التخفيفات المسلسل عشرة أضعاف من مثبطات NA في 50 أنابيب الطرد المركزي مل يعمل في تركيزات 0.03 نانومتر، 0.3 نانومتر، 3 نانومتر و 30 نانومتر و 300 نانومتر، 3000 نانومتر، و 30،000 نانومتر في فحص 2X عازلة (66.6 ملي MES و 8 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة 6.5)؛ هذا هو للاستخدام عبر فحوصات متعددة.
    ملاحظة: تركيزات النهائي من مثبطات NA في نظام القبول رد فعله (50 ميكرولتر من التخفيف فيروس + 50 ميكرولتر من NA المانع + 50 ميكرولتر من 300 ميكرومتر MUNANA) هي 0.01 نانومتر، 0.1 نانومتر، 1 نانومتر و 10 نانومتر، 100 نانومتر، 1000 نانومتر، و 10،000 نانومتر، على التوالي. لا يتضمن التركيز النهائي 100 ميكرولتر من وقف الحل. تخزين جميع مثبطات التخفيفات NA في 2-8 ° C. تاريخ انتهاء الصلاحية هو نفسه الذي من الأسهم الرئيسية.
  3. إعداد التخفيفات الفيروس في المخزن فحص 1X تحتوي على 0.1٪ NP-40 السطحي في كتلة 96-في آبار عميقة. استخدام التخفيفات فيروس استنادا إلى نتائج النشاط فحص NA المستمدة من القسم 2. استخدام إجمالي حجم 2 مل لكل فيروس لاختبار أربعة مثبطات NA.
    ملاحظة: إعداد بئرين (1 مل لكل بئر) في الفيروس في كتلة 96-في آبار عميقة. وترد أمثلة من التخفيفات الفيروس لVIRUS 1 و 2 و 3 في الجدول 1.
  4. الاستغناء عن حجم المطلوب من مثبطات NA (المعد وفقا الخطوة 3.2) إلى خزان 8 في آبار عميقة. من هناك، الاستغناء عن 50 ميكرولتر من مثبطات NA في التخفيفات تتراوح بين 0 نانومتر (2X فحص بuffer فقط) إلى 30000 نانومتر في صفوف A إلى H في واضحة، 96-جيدا، لوحة القاع شقة.
    ملاحظة: ويتجلى تخطيط لوحة في الشكل (3).
  5. إضافة 50 ميكرولتر من الفيروسات اختبار المخفف لكل بئر إلى أعمدة 11/01 و 50 ميكرولتر لكل بئر من العازلة الفحص 1X فقط إلى العمود 12. اضغط برفق لوحة لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. تغطية لوحة مع سداده لوحة لمنع التبخر.
  6. إضافة 50 ميكرولتر من 300 ميكرومتر MUNANA (المعد وفقا الخطوة 1.4) لكل بئر والاستفادة بلطف لوحة لالمزيج. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تغطية لوحة مع سداده لوحة لمنع التبخر.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من الحل محطة (المعد وفقا الخطوة 1.6) إلى كل بئر وبلطف الاستفادة من لوحة إلى المزيج.
  8. قراءة لوحة باستخدام مقياس التألق.
    1. استخدام الطول الموجي الإثارة من 355 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات من 460 نانومتر، كما هو موضح سابقا.

4. حسابIC 50 القيم

ملاحظة: v1.2 لJASPR هو المناسب منحنى البرمجيات التي تمكن من حساب IC 50 القيم. وقد تم تطوير هذا البرنامج من قبل شعبة الأنفلونزا في CDC، أتلانتا، الولايات المتحدة الأمريكية. البرنامج يستخدم المعادلة: V = V ماكس س (1 - ([I] / (K I + [I])))، حيث V الحد الأقصى هو الحد الأقصى لمعدل الأيض، [I] هو تركيز مثبط، V هو الاستجابة التي تحول دون وK ط هو IC 50 لمنحنى كبت.

  1. نسخ ولصق البيانات الخام أنتج من قبل التألق في جدول بيانات في شكل لوحة 12 عمود (96 أيضا)، بدءا من الخلية A1.
    يجب أن تكون متداخلة الخام البيانات من كل لوحة لاحقة من قبل صف فارغ واحد: ملاحظة. إذا كان قد تم اختبار كل فيروس ضد أربعة مثبطات NA، لصق البيانات الخام في مجموعة من أربعة (مع صف فارغ بين كل لوحة).
  2. فتح البرنامج المناسب والبنودإك على علامة التبويب "تجربة". اختيار "البديل 2-المخدرات الفلوري 11 عينات."
  3. انقر فوق علامة التبويب "خيارات" ووضع علامة "إنشاء الرسوم البيانية."
  4. انقر على "خيارات" مرة أخرى وانقر فوق علامة التبويب "مفتاح جديد". حفظ "inhibition_key" ملف .csv في نفس المجلد مثل ملف جدول البيانات الخام.
  5. في ملف inhibition_key، قائمة بجميع أسماء عينة تحت ID. يجب أن يكون كل اسم عينة فريدة من نوعها.
  6. إذا تم اختبار أربعة مثبطات NA، إدراج مساحات للصفين إضافية أدناه أوسيلتاميفير واكتب في "أثبت عقار بيراميفير" و "Laninamivir". حفظ التغييرات التي أجريت على الملف inhibition_key.
  7. العودة إلى "jaspr الخامس 1.2 تثبيط المنحنى المناسب" نافذة واختر ملف البيانات الخام باسم "تجربة ملف" وinhibition_key باسم "الملف الرئيسي". تشغيل تحليل. حفظ النتائج بهيئة csv وقوات الدفاع الشعبي الأشكال.
    ملاحظة: سوف يقوم البرنامج تلقائيا مؤامرة منحنى تثبيط (RFU ضد هبوطنست NA تركيزات مثبط)، كما هو مبين في الشكل (4). أيضا بحساب برنامج IC 50 القيم لكل فيروس ضد فرد NA المانع (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، يقدم JASPR القيم IC 50 والخلفية إشارة إلى (S / B) النسبة في شكل جدول. يمكن أن القيم الأساسية تختلف من مختبر لمختبر اعتمادا على التألق المستخدمة. في WHOCCRRI ملبورن، تقدر خلفية ل 100 ميكرومتر مجموعة MUNANA 50-120 RFU. لموثوقة قيمة IC 50، ويفضل وجود نسبة S / B من ≥10، على الرغم من أن نسبة أقل من 10 لا تزال مقبولة، ولا سيما بالنسبة للفيروسات متحولة التي لديها نشاط NA منخفضة جدا.
  8. تفقد القيم IC 50 و الأشكال منحنى التي يولدها البرنامج. جميع النقاط البيانات يجب أن تقع على أو بالقرب من المنحنى. إذا لم يفعلوا ذلك، كرر تثبيط فحص NA.
    ملاحظة: للحصول على الفيروسات التي تظهر مرتفعة بشكل غير عادي IC 50 القيم، يجب أن يكون فحص تكرارإد لتأكيد النتيجة.

Representative Results

باستخدام المبادئ التوجيهية للإبلاغ موحدة من الفريق العامل منظمة الصحة العالمية بشأن مراقبة الأنفلونزا فيروسات حساسية 9، يتم الإبلاغ عن التعرض لفيروسات الأنفلونزا إلى مثبطات NA باستخدام المصطلحات تثبيط العادي (NI)، وانخفاض تثبيط (RI)، وانخفاض درجة عالية من تثبيط (HRI) . الفيروسات NI هي تلك التي IC 50 قيم أقل من 10 أضعاف مقارنة مع الإشارة متوسط IC 50 لفيروسات الأنفلونزا A (أو أقل من 5 أضعاف عن فيروسات الأنفلونزا B). الفيروسات RI هي تلك التي IC 50 القيم بين 10- و 100 أضعاف فوق إشارة متوسط IC 50 لفيروسات الأنفلونزا A (أو 5- و 50 ضعفا للأنفلونزا B). الفيروسات HRI هي تلك التي IC 50 قيم 100 أضعاف فوق إشارة متوسط IC 50 لفيروسات الأنفلونزا A (أو أكثر من 50 أضعاف لفيروسات الأنفلونزا B)؛ انظر الجدول 2.

الصفحة = "1"> المرجع متوسط IC يتم احتساب 50 قيم A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B ياماغاتا / B فيكتوريا وتحديثها سنويا في WHOCCRRI ملبورن لتعكس تغييرات طفيفة في قيم IC 50 من سلالات الأنفلونزا إلى مثبطات NA (الجدول 3). ومتوسط IC 50 القيم في انفلونزا A (H1N1) فيروسات pdm09 هي تقريبا نفسها عبر مثبطات NA أربعة، ولكن زاناميفير متوسط وlaninamivir IC 50 قيم A (H3N2) الفيروسات 2- 4 أضعاف أعلى مقارنة مع الدواء و أثبت عقار بيراميفير IC 50 القيم (الجدول 3). ومتوسط الدواء IC 50 قيمة للفيروسات الأنفلونزا B عموما 5- إلى 10 أضعاف أعلى من زاناميفير، أثبت عقار بيراميفير، وlaninamivir IC 50 القيم (الجدول 3).

تثبيط فحص NA هو فحص المظهرية التي لا توفر معلومات عن التغيرات الجينية associATED مع RI أو HRI. ولذلك، من المهم أن يتم إجراء التحليل الجيني في أعقاب الكشف عن الفيروسات مع RI أو HRI. في WHOCCRRI ملبورن، ويتم تحليل الجين NA من المتغيرات باستخدام سانجر تسلسل وبايرو التسلسل. ويرد في الجدول 4 قائمة تمثيلية من التبديلات الأحماض الأمينية التي يمكن العثور عليها في الجين NA من الفيروسات مع RI وHRI المتغيرات. قائمة أكثر شمولا من التبديلات الأحماض الأمينية التي يمكن أن تغير NAI قابلية متوفرة على موقع منظمة الصحة العالمية 10 أيضا.

شكل 1
الشكل 1: RFU ضد تركيز 4-MU. (أ) منحنى قياسي من RFU مقابل 4-MU تركيز (ميكرومتر). يظهر مربع منقط على مجموعة خطية من 4-MU لالتألق. قد تكون مشبعة إشارات مضان فوق مجموعة خطية، وبالتالي، أي الصورةقد لا يتم الكشف عن التغييرات مركز تجاري في مضان من التألق. (ب) عن قرب قسم خطية من منحنى مستوى الشكل 1A لتحديد "إشارة الهدف الأمثل". على التألق في WHOCCRRI ملبورن لديه مجموعة خطية من 2،5 حتي 40 ميكرومتر 4-MU وإشارة الهدف الأمثل لل~ 30 ميكرومتر 4-MU، والتي تتطابق مع ~ 1500 RFU. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مثال على منحنيات النشاط NA فيروسات الأنفلونزا. تم طرح متوسط ​​قيمة الخلفية من 50.61 RFU من كل نقطة التخفيف على منحنيات النشاط NA. تشير الأسهم التخفيف فيروس المناسب لاستخدامها في فحص تثبيط NA لكل الفيروس. لتسهيل الإعدادية aration من التخفيفات الفيروس، يمكن للمرء أن يختار لإجراء تخفيف 1/100 للVIRUS 3 بدلا من التخفيف 1/96. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تخطيط لوحة لإعداد تثبيط فحص NA. تتضمن كل لوحة العمود الأخير، الذي يعمل بمثابة السيطرة السلبية التي لا تحتوي على الفيروس ولكن عازلة فحص فقط 1X (AB)، NA المانع، MUNANA، ووقف الحل. ملاحظة: يستخدم JASPR قراءات من العمود 12 من كل لوحة لتحديد متوسط إشارة فارغة المستخدمة في حساب القيم IC 50. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (4)
الشكل 4: مثال على منحنى تثبيط وIC 50 قيمة فيروس pdm09 A (H1N1)، A / بيرث / 82/2015. يعرض البرنامج JASPR منحنى تثبيط كما مضان (RFU) ضد زيادة تركيز (نانومتر) من NA المانع، مع كل نوبة نقطة في المنحنى. وبناء على منحنى تثبيط، وقيمة IC 50 عازمة كما تركيز NA المانع للحد من 50٪ من النشاط NA الفيروس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيروس فيروس التخفيف المطلوب 1X حجم عازلة فحص (ميكرولتر) بالسطح-أمبير-NP-40 (10٪) (مل) حجم فيروس (مل)
1 1/20 940 10 50
2 1/40 965 10 25
3 1/100 890 10 10

الجدول 1: إعداد التخفيفات الفيروس لVIRUS 1 و 2 و 3 في تثبيط فحص NA.

نوع الفيروس / سلالة / النسب تثبيط العادي تثبيط انخفاض انخفاض درجة عالية من تثبيط
(NI) (RI) (HRI)
A (H1N1) pdm09 <10 أضعاف 10-100 أضعاف > 100 أضعاف
A (H3N2) و# 60؛ و 10 أضعاف 10-100 أضعاف > 100 أضعاف
B ياماغاتا وB فيكتوريا <5 أضعاف 5-50 أضعاف > 50 أضعاف

الجدول 2: أوصى الفريق العامل المضادة للفيروسات منظمة الصحة العالمية مبادئ توجيهية لتصنيف قابلية فيروس الانفلونزا لمثبطات NA.

<td> 0.36 (0،01-3،48)
نوع الفيروس / سلالة / النسب N زاناميفير الدواء أثبت عقار بيراميفير Laninamivir
متوسط (المدى) IC 50 نانومتر متوسط (المدى) IC 50 نانومتر متوسط (المدى) IC 50 نانومتر متوسط (المدى) IC 50 نانومتر
A (H1N1) pdm09 1326 0.42 (0،1 حتي 3،43) 0.19 (0،07-1،60) 0.55 (0،05-2،29)
A (H3N2) 1654 0.9 (،11-4،0) 0.38 (0،01-3،65) 0.33 (0،12-3،06) 1.38 (0،01-9،38)
B ياماغاتا وB فيكتوريا 1115 2.2 (1،24 حتي 10،72) 15.12 (2،39 حتي 70،75) 1.36 (0،57-6،67) 2.89 (1،62-9،15)

الجدول 3: متوسط IC 50 و 50 IC مجموعة من تثبيط العادي (NI) الفيروسات من 2015 مستمدة في CCRRI منظمة الصحة العالمية، ملبورن.

استبدال حمض أميني نوع / نوع فرعي / النسب IC 50 أضعاف تغيير المشتركmpared مرجع متوسط IC 50 القيم.
زاناميفير الدواء أثبت عقار بيراميفير Laninamivir
H275Y A (H1N1) pdm09 1 557 (HRI) 123 (HRI) 2
E119V A (H3N2) 1 63 (RI) 1 1
H134Y B فيكتوريا 1 4 76 (HRI) 2
N151T B فيكتوريا 4 4 42 (HRI) 1
G104E B فيكتوريا 1220 (HRI) 87 (HRI) 17724 (HRI) 701 (HRI)
E105K B فيكتوريا 3 5 (RI) 59 (HRI) 2
I222T B فيكتوريا 2 7 (RI) 8 (RI) 3
H273Y B ياماغاتا 1 230 (HRI) 377 (HRI) 2
D197N B ياماغاتا 4 7 (RI) 32 (RI) 3

الجدول 4: قائمة تمثل بدائل الأحماض الأمينية مرتبطة إلى انخفاض تثبيط (RI) أو خفض درجة عالية من تثبيط (HRI) لمثبطات NA.

مشكلة أسباب محتملة) محاليل)
لا أو النشاط NA منخفضة لم يكن الفيروس الحالي أو منخفضة العائد الفيروس. يجب أن يكون مثقف عينة السريرية في خطوط الخلايا (أي مدين، داربي الناب خلايا الكلى) أو في بيض الدجاج المحتويلتحميل فيروس العالي للاستخدام في تثبيط فحص NA.
بعض الفيروسات متحولة لها النشاط NA منخفضة للغاية على الرغم من في حمولة الفيروس عالية. استخدام تركيز الفيروس أنيق للاختبار. ويمكن استخدام عازلة انخفاض الرقم الهيدروجيني مقايسة (على سبيل المثال الرقم الهيدروجيني 5.3). ومع ذلك، يجب اتخاذ الحذر عند مقارنة البيانات.
لا أو انخفاض النشاط NA NA في تثبيط فحص تمت إضافة أي فيروس. إعادة تمييع الفيروس. ضمان الفيروس يضاف مباشرة إلى المخزن المؤقت 1X الفحص.
تم استخدام تخفيف فيروس الخطأ. كرر النشاط فحص NA.
فترة حضانة كافية. ضمان فترة حضانة يتبع.
تقع نقاط البيانات خارج منحنى IC 50 التلوث عبر NA المانع من تركيز أعلى. تأكد من أن الأفكار ليست على اتصال مع inhibi NAتور عندما الاستغناء الفيروسات مخففة في 96 لوحة جيدا.
إذا تم استخدام خزان 8 بئر عميقة، ونبذ وإعادة الاستغناء-وNA المانع تركيزات إلى الطازج 8 جيدا الخزان العميق.
لم يتم إضافة حجم المانع NA أو MUNANA أو فيروس مخفف على قدم المساواة في كل بئر. كرر الفحص مع ماصة متعدد القنوات معايرة. تأكد من الاستغناء عن حجم مساو من كل كاشف في كل بئر.
على غير العادة عالية IC 50 القيم تمت إضافة نسبة عالية جدا من الفيروس. تكرار فحص النشاط NA NA وتثبيط الفحص.
وتضمنت عينة الاختبار خليط من أنفلونزا A و B. الانفلونزا أداء في الوقت الحقيقي PCR لتحديد وجود خليط من الفيروس.
التلوث الجرثومي في العينة فيروس الثقافة في حالة معقمة مع وجود المضادات الحيوية.
ارتفاع خلفية إشارة مضان قد يقل MUNANA الركيزة مع مرور الوقت. استخدام دفعة جديدة من MUNANA subtrate.
الكشف عن مضان من الآبار المجاورة. استخدام السوداء 96-جيدا لوحات مسطحة القاع

الجدول 5: استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمشاكل محتملة في تثبيط فحص NA.

Discussion

ويجري حاليا إجراء الرصد العالمي للحساسية فيروس الأنفلونزا لمثبطات NA من قبل عدد من المختبرات باستخدام الفلورسنت أو chemiluminescent NA تثبيط فحوصات 11 و 12. يتم استخدام فحص الفلورسنت أكثر شيوعا من الفحص chemiluminescent. ورغم أن كلا المقايسات هي قوية وقابلة للتكرار، والقيم IC 50 تم الحصول عليها من فحص القائم على مضان غالبا ما تكون أعلى من الفحص القائمة على التوهج، مما يجعل المقارنة المباشرة للبيانات من اثنين من المقايسات صعبة (13). حتى مع استخدام نفس البروتوكول، قد تختلف البيانات التي تم إنشاؤها من مختبر واحد من آخر. وبسبب هذه الاختلافات بين المختبرات، أصدر الفريق العامل منظمة الصحة العالمية بشأن مراقبة الأنفلونزا فيروسات حساسية توجيهي للمساعدة في المقارنات بين المختبرات. بدلا من مقارنة المطلقة IC 50 القيم، هذا الاستخدام التوجيهيمقارنة سا على أساس الفرق IC 50 أضعاف لمتوسط IC 50 من فيروسات الأنفلونزا NI اختبارها في كل مختبر معين. وقد أدى القدرة على مقارنة البيانات من خمسة المراكز المتعاونة في النشرة السنوية الأنفلونزا العالمي البيانات المضادة للفيروسات قابلية 2 و 3 و 4. توافر كمية كبيرة من البيانات قابلية الانفلونزا في المجال العام يسمح للباحثين لمقارنة IC 50 البيانات من تلك الدراسات مع التي ولدت في المختبرات الخاصة.

أخرى NA فحوصات تثبيط التي تتبنى مفهوم مماثل متاحة تجاريا أيضا. هذه المجموعات التجارية التي تحتوي على المواد الكيميائية جاهزة للاستخدام (NA مثبطات غير مدرجة) هي استنساخه على حد سواء. ومع ذلك، فإن في المنزل NA تثبيط الاختبار هو أرخص بكثير من مجموعات تجارية، لأن الغالبية العظمى من الكواشف يمكن أن يتم في المنزل فيكميات أكبر والركيزة MUNANA، الأمر الذي جعل سابقا تصل التكلفة الرئيسية للفحص، ويمكن الآن شراؤها من مصادر مختلفة وبأسعار تنافسية. تكلفة اختبار عزل الإنفلونزا واحد لكل المخدرات تقريبا $ 1 (USD). في WHOCCRRI ملبورن، أدخلت تحسينات إلى NA تثبيط الفحص في المنزل بعد تأسيس منصة روبوتية لمكونات معالجة السائل من الفحص. وبصرف النظر عن إعداد دليل من التخفيفات فيروس، يتم تنفيذ معظم الإجراءات باستخدام الروبوت مناولة السائل. وهذا لا تقليل المناولة اليدوية، ولكنه يزيد أيضا من أعداد المقايسات التي يمكن تشغيلها في يوم واحد.

على الرغم من أن تثبيط فحص NA قوي للغاية، وهناك عدد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى أن تكتمل مع مزيد من الرعاية. أولا، أي عدم انتظام في تركيزات مثبط NA يمكن أن تحول منحنيات تثبيط والقيم IC 50؛ لذلك، يجب أن يكون الاهتمام الدقيقتدفع عند إعداد تركيزات مثبط NA. ثانيا، pipetting لوحضانة دقيقة فترات دقيقة وحاسمة للحفاظ على نتائج متسقة عبر فحوصات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام الماصات وتوقيت معايرة. إدراج الفيروسات تحكم في كل فحص يمكن أيضا رصد أداء الفحص من الاختبار لفحص وعلى مدى فترات طويلة من الزمن. ثالثا، لأن نشاط انزيم NA فيروسات الأنفلونزا الموسمية هو الأمثل في درجة الحموضة 6.5، ودرجة الحموضة الصحيح من المخزن المؤقت فحص مهمة. وقد وجدت بعض التقارير أن استخدام الظروف أقل درجة الحموضة قد يحسن التعرف على المتغيرات الإنفلونزا، مثل الخيار A (H7N9) التي تحتوي على طفرة R292K 14 و 15. ومع ذلك، فإن تعديل الرقم الهيدروجيني للعازلة فحص تحول القيم IC 50، وهذا قد يعقد المقارنة بين البيانات داخل المختبرات وبين المختبرات. التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي يمكن أن تكون ص أخرىوترد erformed في الجدول 5.

مثبطات NA هي الطبقة الوحيدة من مضادات الفيروسات المعتمدة التي تكون فعالة ضد فيروسات الإنفلونزا حاليا. حتى تصبح الطبقات المضادة للفيروسات أخرى متاحة للاستخدام السريري، سوف تركز على مراقبة التعرض للفيروسات من فيروسات الإنفلونزا على مثبطات NA وحدها. بسبب البساطة واستنساخ النتائج، واستخدام تثبيط فحص NA لتقييم قابلية فيروس الانفلونزا لمثبطات NA سوف تستمر.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ويدعم منظمة الصحة العالمية ملبورن مركز المراجع والبحوث الخاصة بالأنفلونزا التعاون من قبل وزارة الحكومة الأسترالية الصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Influenza A and B viruses Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC PTA-6500
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)  Biosynth AG M-5507
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)  Sigma M8639
4-Methylumbelliferone (4-MU) Sigma M1381-25G
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)  Sigma M8250-250G
Calcium Chloride (Ca Cl2)  APS AJAX Finechem  127-500G
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)  Thermo Fisher Scientific  PIE28324
Sodium Hydroxide (NaOH)  APS AJAX Finechem 482-2.5KG
Absolute Ethanol  APS AJAX Finechem 214-2.5L GL
96-well clear flat-bottom plates NUNC 456537
96-well U-bottom plates Greiner Bio-one  4650101
8 channel deep well block Pacific Laboratory Products RES-MW8-HP
96-well deep plates, 2.0 mL square wells Pacific Laboratory Products P-2ML-SQ-C
Plate sealers Thermo Fisher Scientific  236366
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) Sigma-Aldrich CLS430758-12EA
Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Multi-channel pipettes Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume)
Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) Greiner Bio-one  P7740-200EA and P7865-200EA
Pipette controller Eppendorf 4430000018
Centrifuge tubes 50 mL BD Bioscience 352070
Racked tubes Scientific Specialties, Inc. 1750-00
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm TermoFisher Scientific ASCENT FL 374
Ascent software TermoFisher Scientific 5185410CD
Incubator set at 37 °C Lab Supply Biocell 1000
Zanamivir GlaxoSmithKline Request directly from the company
Oseltamivir carboxylate Roche
Peramivir (BCX-1812) BioCryst
Laninamivir (R-125489) Daiichi-Sankyo
 JASPR v1.2 Influenza Division at the CDC Atlanta, USA  freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
  2. Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
  3. Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
  4. Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
  5. Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
  6. Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
  7. Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
  8. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  9. Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
  10. A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
  11. Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
  12. Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
  13. Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
  14. Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
  15. Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).

Tags

علم المناعة، العدد 122، الإسفار، النورامينيداز، ومقاومة والأنفلونزا، MUNANA، المضادة للفيروسات، المانع، الفحص المظهري، الدواء، زاناميفير
مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leang, S. K., Hurt, A. C.… More

Leang, S. K., Hurt, A. C. Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals. J. Vis. Exp. (122), e55570, doi:10.3791/55570 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter