Summary
La piastra di crescita è una regione cartilaginea nelle ossa lunghe dei bambini dove si verifica una crescita longitudinale. Quando feriti, il tessuto osseo può formare e pregiudicare la crescita. Descriviamo un modello di ratto di lesione della piastra di crescita che porta a tessuti di riparazione ossea, permettendo lo studio di meccanismi di riparazione e strategie di rigenerazione delle piastre di crescita.
Abstract
Un terzo di tutte le fratture pediatriche coinvolge la piastra di crescita e può causare una diminuzione della crescita ossea. La piastra di crescita (o physis) è il tessuto di cartilagine trovato alla fine di tutte le ossa lunghe nei bambini che è responsabile della crescita longitudinale dell'osso. Una volta danneggiata, i tessuti di cartilagine all'interno della piastra di crescita possono subire ossaficio precoce e portare ad un tessuto di riparazione ossea indesiderato, che forma un "baretto osseo". In alcuni casi, questa barra ossea può provocare deformità di crescita dell'osso, come le deformità angolari, o può fermare completamente la crescita longitudinale dell'osso. Attualmente non esiste un trattamento clinico che possa riparare completamente una piastra di crescita ferita. Utilizzando un modello animale di lesioni alla piastra di crescita per comprendere meglio i meccanismi alla base della formazione di barre ossee e per individuare i modi per inibire è una grande opportunità per sviluppare trattamenti migliori per le lesioni della piastra di crescita. Questo protocollo descrive come disfare la piastra di crescita tibiale prossimale del ratto con un difetto di foro. Questa smaLl modello animale produce in modo affidabile un baretto osseo e può provocare deformità di crescita simili a quelle osservate nei bambini. Questo modello permette di indagare sui meccanismi molecolari della formazione di barre ossea e serve come mezzo per testare le possibili opzioni di trattamento per le lesioni della piastra di crescita.
Introduction
Le lesioni della piastra di crescita rappresentano il 30% di tutte le fratture pediatriche e possono causare una diminuzione della crescita ossea 1 . Oltre alle fratture, le lesioni della piastra di crescita possono essere causate da altre eziologie, tra cui osteomielite 2 , tumori ossee primari 3 , radiazioni e chemioterapia 4 e danni iatrogeni 5 . La piastra di crescita (o physis) è una regione della cartilagine alla fine delle ossa lunghe dei bambini che è responsabile della crescita longitudinale dell'osso. Aziona l'allungamento ossea attraverso l'ossificazione endocondrale; I condrociti subiscono la proliferazione e l'ipertrofia e vengono poi rimodellati dagli osteoblasti in arrivo per formare l'osso trabecolare 6 . La piastra di crescita è anche una zona debole dello scheletro in via di sviluppo, rendendola soggetta a lesioni. La principale preoccupazione per le fratture o le lesioni della piastra di crescita è che il tessuto di cartilagine danneggiato all'interno della piastra di crescita può bE sostituito con un tessuto di riparazione ossea indesiderato, noto anche come "bar". A seconda della sua dimensione e della sua posizione all'interno della piastra di crescita, il bony bar può portare a deformità angolari o arresto completo, una sequela devastante per bambini piccoli che non hanno ancora raggiunto la loro piena altezza 7 .
Attualmente non esiste alcun trattamento che possa riparare completamente una piastra di crescita ferita. Una volta che il barile osseo si forma, il medico deve decidere se rimuoverlo o meno. I pazienti con almeno 2 anni o 2 centimetri di crescita scheletrica rimanenti e con un baretto osseo che copre meno del 50% della superficie della piastra di crescita sono solitamente candidati alla resezione ossea a barre 8 . La rimozione chirurgica del baretto osseo è spesso seguita dall'interposizione di un innesto di grasso autologo per impedire la riformazione del tessuto osseo e per consentire alla piastra di crescita circostante per rimediare la crescita. Tuttavia, queste tecniche sono problemiEmatic e spesso falliscono, portando alla ricorrenza ossea e continuando ad avere effetti negativi sulla crescita 9 . C'è una necessità fondamentale di sviluppare trattamenti efficaci che non solo impediscono la formazione di barili ossei, ma anche rigenerano la cartilagine della piastra di crescita, ripristinando così l'allungamento ossea normale.
I meccanismi molecolari sottostanti alla formazione del barile ossa devono ancora essere completamente chiariti. Una maggiore comprensione di questi meccanismi biologici potrebbe portare ad interventi terapeutici più efficaci per i bambini affetti da lesioni della piastra di crescita. Poiché lo studio di questi meccanismi negli esseri umani è difficile, sono stati utilizzati modelli animali, in particolare il modello di ratto di lesioni della piastra di crescita 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Il metodo presentato in questoLa carta descrive come un difetto di foro di trivellazione nella piastra di crescita tibiale del ratto conduce a un tessuto di riparazione prevedibile e riproducibile che inizia la ossaficazione già nei primi 7 giorni dopo la lesione e forma un baretto osseo completamente riempito con rimodellamento a 28 giorni dopo la lesione 10 . Ciò fornisce un piccolo modello in vivo animale in cui studiare i meccanismi biologici della formazione del barile ossa, nonché valutare nuove terapie che potrebbero impedire il baretto osseo e / o rigenerare la cartilagine della piastra di crescita. Ad esempio, questo modello può essere utilizzato per testare biomateriali condrogenici che possono rigenerare la cartilagine della piastra di crescita e offrire un trattamento prezioso per i bambini affetti da lesioni della piastra di crescita. Le tecniche presentate in questo documento descriveranno i metodi chirurgici impiegati per produrre lesioni alla piastra di crescita e la successiva consegna dei biomateriali al sito di lesioni. Discuteremo anche i metodi per valutare la formazione di barre ossea e la riparazione del tessuto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure animali devono essere approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). Il protocollo animale per la seguente procedura è stato approvato dall'Università del Colorado Denver IACUC.
1. Ottenere i ratti
NOTA: a meno che non siano desiderati animali geneticamente modificati, i ratti di Sprague-Dawley immaturi di sei settimane non sono necessari al momento dell'intervento. Potrebbero essere potenzialmente utilizzati altri ceppi; Tuttavia, la maggior parte degli studi pubblicati sono stati eseguiti sui ratti di Sprague-Dawley.
2. Preparazione di forniture chirurgiche
- Autoclave pacchetti di fornitura chirurgica che includono uno dei seguenti: # 3 maniglia per bisturi, supporto per aghi, pinze Adson e forbici per iride.
- Autoclave i mandrini keyless. Le punte di trivellazione possono essere sterilizzate tra gli interventi chirurgici degli animali quando operano su più animali.
NOTA: Le regole IACUC locali relative all'utilizzo di un intervento chirurgico sterileDevono essere rispettati gli strumenti icali su più animali. Ad esempio, l'Università del Colorado Denver IACUC consente di utilizzare uno strumento chirurgico da utilizzare fino a 5 animali prima della loro sospensione. Inoltre, gli attrezzi chirurgici devono essere sterilizzati a caldo utilizzando un sterilizzatore di perline tra gli animali. Per altri animali devono essere utilizzati ulteriori imballaggi chirurgici sterili. - Autoclave piedini Steinmann da 5 cm, uno per ogni animale.
NOTA: Per ridurre il rischio di infezione, i piedini Steinmann non devono essere usati per più animali. - Autoclave frese dentali da 1,8 mm, una per ogni animale.
NOTA: Per ridurre il rischio di infezione, le bacchette dentali non devono essere utilizzate per più animali. - Autoclave un applicatore di clip della ferita, se applicabile. In alternativa, possono essere utilizzate suture sepolte per chiudere lo strato cutaneo. Vedere la fase 7.3.
- Se possibile, sterilizzare una perforatrice con irradiazione o sterilizzazione a gas.
- Raccogliere le seguenti forniture supplementari: rasoio elettrico, steSiringhe di acido poliglicolico 3-0, garza sterile, povidone-iodio, salina sterile, siringhe sterili da 10 ml, aghi sterili a 23 gauze, tamponi di isopropilico, isoflurano, pinze, analgesici post-chirurgici ( ad esempio NSAID e buprenorfina) Teli chirurgici sterili, guanti chirurgici sterili, lame a scalpello sterile # 15, fermaglio sterile, macchina per anestesia, sterilizzatore di perle, rilievo di riscaldamento e sottopiedi assorbenti.
3. Anestesia e preparazione degli animali
- Anestetizza l'animale introducendolo in una camera di induzione da 1 a 2 L che riceve un flusso di ossigeno da 1 L / min con 5% di isoflurano da un sistema di vaporizzazione con un sistema passivo di scavenging.
NOTA: L'esposizione al 5% di isoflurano dovrebbe anestetizzare i ratti di 6 settimane entro 5 minuti. - Spostare l'animale sul sito chirurgico e mantenere l'animale sotto anestesia con 2 - 3% isoflurano usando un cono per il resto della procedura. Posizionare l'animale supino su un tampone di riscaldamento e un assorbimentoEnt underpad.
NOTA: L'animale non deve essere fissato al tavolo chirurgico. Tenendo la gamba come specificato nei passaggi seguenti è un metodo sufficiente di stabilizzazione.
NOTA: Tutte le procedure successive devono essere eseguite con l'animale sotto anestesia. 2 - 3% di isoflurano dovrebbe essere sufficiente a mantenere l'anestesia nei ratti di questa età. Ciò può essere confermato provando il riflesso bicolore di ritiro. - Amministrare analgesici intraoperatorie secondo politiche approvate istituzionalmente ( ad es. Buprenorfina a 0,05 mg / kg e carprofene a 5 mg / kg).
4. Preparazione della Tibia per la chirurgia
- Rasare l'intera gamba posteriore dal malleolo mediale al bacino con un rasoio elettrico.
- Misurare e registrare la lunghezza tibiale dall'altopiano tibiale anteriore al lato inferiore del malleolo mediale usando le pinze. In alternativa, misurare l'intera lunghezza tibiale usando raggi X o microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Facoltativamente, misurare le dimensioni della piastra di crescita prima dell'intervento chirurgico usando raggi X o microCT.
- Pulire il sito chirurgico spazzando l'intera gamba, l'addome e il genitali con tamponi di alcol e poi con garza imbevuta di povidone-iodio.
NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di infezione, tutte le procedure successive, fino a quando l'animale viene rimosso dall'anestesia (punto 7.4), deve essere eseguito in condizioni sterili. Tutti i materiali chirurgici devono essere accessibili usando la tecnica sterile. L'uso di un assistente chirurgico è altamente raccomandato per mantenere la sterilità durante l'intervento chirurgico. - Indossare guanti chirurgici sterili, posizionare un drappo chirurgico sterile fenestrato sopra l'animale, lasciando le gambe esposte attraverso la fenestrazione centrale.
5. Procedura chirurgica per accedere alla piastra di crescita
_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Figura 1: Panoramica della procedura chirurgica.
A) Ubicazione di diversi marcatori anatomici utilizzati per creare una lesione di piastra di successo. La capsula del ginocchio è immediatamente posteriore al kneecap (bianco), separando la tibia dal femore. La piastra di crescita tibiale (rosso scuro) può essere visto inferiori a quella del kneecap e aggirare la tibia. La piastra di crescita prossimale è un piano piuttosto piano, ad eccezione del quarto anteriore che forma un piano diagonale. L'intersezione di questi due piani forma l'angolo della piastra di crescita, che viene utilizzato per un'adeguata angolazione del trapano. L'inserimento del semitendinosus è dove i muscoli del quadricipite si inseriscono nella tibia posteriore. B) Incisione attraverso l'aspetto anteriore-mediale dei tessuti molli tibiali per accedere all'osso corticale. C) Posizione della finestra corticale che utilizza l'allineamento con l'inserimento del semitendinosso distale come punto di riferimento. D) ValutazioneLa profondità del danneggiamento allineando il bordo sulla barra dentale con la finestra corticale.
- Effettuare un'incisione di 1 cm attraverso la pelle lungo l'aspetto mediale-anteriore della tibia prossimale usando una maniglia a 3 bisturi e una lama # 15, partendo dall'estremità distale del condile femorale mediale ( Figura 1A ).
- Tirare la pelle contro l'osso sottostante e tenere saldamente la gamba durante l'incisione.
NOTA: Questo manterrà l'incisione cutanea nella posizione desiderata e aiuterà nella creazione di una incisione pulita. Non premere troppo saldamente con il bisturi per evitare di forare la capsula del ginocchio, che potrebbe provocare sanguinamenti profondi e rendere difficili i rimanenti passi.
- Tirare la pelle contro l'osso sottostante e tenere saldamente la gamba durante l'incisione.
- Prendere nota di importanti marcatori anatomici, tra cui: 1) la piastra di crescita, 2) l'angolo della piastra di crescita, 3) la capsula del ginocchio e 4) l'inserimento di semitendinosus ( figura 1A ).
- Usando il bisturi, fai un'incisione di ~ 0,5 cm attraverso la thFascia e tessuti molli sull'aspetto mediale-anteriore della tibia prossimale, dalla piastra di crescita al fondo dell'incisione cutanea ( Figura 1B ).
- Disseccare o raschiare delicatamente la fascia e i tessuti molli dalla tibia usando il bisturi ( Figura 1B ).
NOTA: È importante rimuovere o raschiare il maggior numero di tessuti molli dalla tibia, in modo da non interferire con le fasi di foratura. - Drill una finestra corticale attraverso l'osso corticale tibiale alla diafisi con un perno Steinmann attaccato ad un utensile rotativo a 10.000 giri / min. (Bassa velocità dello strumento rotante specificato nella sezione dei materiali). Crea la finestra corticale in modo che si allinea con l'inserimento distale di semitendinosus ( Figura 1C ).
- Tenere il trapano perpendicolare alla diafisi tibiale e farsi strada lentamente, facendo attenzione a non perforare l'altro lato della diafisi; La finestra corticale deve essere solo di ~ 2 mm in profondità e sarà fatta quando noSi sente la resistenza.
- Come sopra, tenere saldamente la gamba con l'altra mano.
NOTA: Per questa fase è possibile utilizzare una fresa dentale. Tuttavia, se si utilizza una borsetta dentale, la gamba deve essere tenuta molto salda per creare una finestra corticale pulita e per assicurarsi che il bur abbassa e taglia l'osso nella posizione desiderata. Per questo passo è consigliato un perno Steinmann, data la sua capacità di taglio molto superiore.
- Dab la finestra corticale con garza, come si prevede l'emorragia leggera.
6. Creazione della lesione della piastra di crescita
- Creare un danno nel foro attraverso la piastra di crescita centrale utilizzando un foro dentale da 1,8 mm attaccato ad un utensile rotante.
NOTA: La profondità, l'angolo e la direzione correnti sono fondamentali per la disfunzione della piastra di crescita centrale ( Figura 1C e D ). Le istruzioni per ottenere la profondità, l'angolo e la direzione appropriati sono riportate di seguito.- Per misurare la profondità appropriata utilizzando il burro dentale, si prega di iniziareAllineando l'estremità del fusto dentale con la tibia prossimale, dove il semitendinoso attraversa la capsula del ginocchio ( Figura 1C ).
- Con l'estremità del fusto dentale alla capsula del ginocchio, seguire l'albero di bara lungo il semitendinosus e fare notare dove il fusto si allinea con la finestra corticale. Questa è la profondità appropriata per il bur per interrompere completamente la piastra di crescita senza interrompere la superficie articolare ( Figura 1C ).
NOTA: il fusto dentale viene utilizzato per misurare la profondità appropriata. Il bur può essere contrassegnato con un indicatore permanente nella posizione in cui si allinea con la finestra corticale per riferirsi alla profondità durante la perforazione. Tuttavia, se i marcatori anatomici e il protocollo di cui sopra sono strettamente collegati, il primo smusso sulle barre dentarie specificato qui (FG6) allineerà correttamente la finestra corticale (come si vede nella figura 1C ). - Per raggiungere l'angolo di foratura appropriato, tenere premuto lo strumento rotante con un angolo di meno tHan 30 ° rispetto alla diafisi tibiale.
NOTA: questa è una approssimazione visiva. - Per raggiungere la direzione di foratura appropriata, puntare sull'angolo della piastra di crescita ( Figura 1C ). Disegnare una linea visiva lungo la bocca dentale all'angolo della piastra di crescita per aiutare a creare un difetto centrale.
- Accendere l'attrezzo rotante a 10.000 giri / minuto (bassa velocità dello strumento rotante specificato nella sezione dei materiali) prima di entrare nella finestra corticale.
- Con l'utensile rotante ad angolo e direzione appropriati, entrare nella finestra corticale e spingere l'utensile rotante finché l'indicatore di foratura non si allinea con la finestra corticale. Una volta raggiunta la profondità appropriata, rimuovere l'utensile rotante.
NOTA: eseguire la rottura della piastra di crescita in un movimento rapido, usando il tempo minimo con il fusto nella piastra di crescita per creare un danno pulito. Questo è importante per l'analisi dei dati.
- Dab la finestra corticale con garza per ~ 30 s, come sanguinamento è previsto.
- Assicurare la profondità appropriata del danneggiamento ripetendo la lunghezza della fresa (passo 6.1.2).
- Inserire il foro nella pista di trapano (con l'utensile rotante spento) e allineare il segno contrassegnato con la finestra corticale ( figura 1D ).
- Se la profondità è insufficiente, ruotare l'attrezzo rotante e spingerla fino alla profondità desiderata.
NOTA: Anche se un secondo giro di foratura non è ideale, interrompere completamente la piastra di crescita è fondamentale per lo sviluppo del baretto osseo. - Sciacquare la pista con circa 3 ml di soluzione salina sterile usando una siringa da 10 ml e un ago da 23 gauge.
- Asciugare la ferita con la garza.
7. Procedure post-Injury
- Se si valuta un trattamento a base di biomateria basata sulla piastra di crescita, iniettare il biomateriale attraverso la pista di trapano nel sito di lesioni usando un ago adeguatamente dimensionato (da 18 a 26 gauge, a seconda della viscosità biomateriale).
NOTA: Il volume della lesione della piastra di crescita è ~ 3 & #181; L e il volume del tracciato è di ~ 20 μL. Il volume massimo di materiale che può essere iniettato nella lesione della piastra di crescita e nella traccia di trapano è compresa tra 20 e 25 μL. - Chiudere la ferita suturando la fascia con suture di acido poliglicolico 3-0. Applicare la cera ossea sopra la finestra corticale per isolare l'osso sottostante (facoltativo).
- Chiudere l'incisione cutanea con suture secche o clip di ferita.
NOTA: Si raccomanda l'uso di clip di ferita, in quanto l'animale graffia nel sito di lesioni e può aprire la ferita. - Togliere l'animale dall'anestesia isoflurana, posizionarla su una coperta riscaldante e controllarla finché non si sveglia.
- Per ridurre il rischio di infezione, mettere l'animale in una nuova gabbia contenente biancheria secca e autoclavata.
- Consentire all'animale di sopportare il peso post-operativo.
- Monitorare l'animale ogni 12 h per 72 h dopo l'intervento chirurgico per verificare i segni dell'infezione, per assicurare che le clip della ferita rimangano in posizione e ad amministrare postoperativamenteE analgesici secondo le politiche istituzionalmente approvate ( ad esempio buprenorfina a 0,05 mg / kg ogni 12 h per 36 h e carprofene a 5 mg / kg ogni 24 h per 72 h).
- Rimuovere le clip della ferita 10 - 14 giorni dopo l'intervento chirurgico sotto anestesia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il successo della ferita della piastra di crescita con questo metodo comporta la rottura del centro della piastra di crescita tibiale senza interrompere la superficie della cartilagine articolare. Il tessuto di riparazione ossea è stato riportato all'inizio di circa 7 giorni dopo la lesione e diventa pienamente sviluppato da 28 giorni dopo la lesione 13 , come visualizzato dalla micro tomografia computerizzata (micro CT) ( Figura 2 ). Anche se questi tempi sono stati scelti qui per visualizzare l'inizio e la maturazione della formazione dell'osso in base ai dati pubblicati in precedenza, altri punti temporali possono essere utilizzati per indagare le varie fasi del processo di riparazione, a partire da 1 a 6 mesi dopo l'intervento 17 . La tabella 1 fornisce una panoramica della formazione di volume osseo all'interno di piante di crescita del ratto chirurgicamente ferite da 28 giorni dopo la chirurgia da tre percorsi indipendenti fornendo (1) la frazione del volume osseo nell'intera platea di crescita e (2) la boNe frazione solo all'interno del tessuto di riparazione 15 . I dati sono riportati come percentuale media ± la deviazione standard e indicano che risultati simili sono stati ottenuti tra le prove indipendenti. La varianza tra le varie correzioni è stata analizzata mediante un'analisi univoca della varianza (ANOVA) e non mostra alcuna differenza statisticamente significativa tra le correzioni, suggerendo la riproducibilità del modello. L'ematossilina blu di Alcian (ABH) con il contatore di Orange G / Eosin 18 è stato usato per mostrare istologicamente una varietà di tessuti di riparazione in diverse fasi di formazione di barre ossee ( Figura 2 ). Utilizzando questa macchia istologica possono essere identificati e quantificati diversi tipi di tessuto di riparazione, tra cui mesenchimali, cartilaginei, trabeculi ossei e midollo osseo.
Alcuni problemi possono derivare da un errore in seguito alle procedure di cui sopra. Un insufficie La profondità di trapano nt non interromperà la piastra di crescita, che si tradurrà in poco o niente formazione di barre ossee. La rottura della superficie della cartilagine articolare crea una lesione maggiore che può introdurre la cartilagine articolare nel sito di lesione della piastra di crescita, complicando il processo di guarigione ( Figura 3A ). La rottura della piastra di crescita ad un angolo o direzione non appropriato comporta un danno non centrale ( Figura 3B ). In questo caso, la formazione di barre ossea sarà ancora presente, anche se sarà laterale o mediale alla posizione desiderata. Nel complesso, il tessuto di riparazione formato dopo la lesione della piastra di crescita può essere analizzato in diversi modi, tra cui microCT, PCR quantitativo, colorazione istologica e immunohistochemistry. Oltre alle misurazioni istologiche e molecolari, la lunghezza degli arti e la misura delle piastre di crescita rappresentano una misura importante della crescita dell'osso intero. Gli arti interessati sono stati riportati a sperimentare la riduzione della crescita rispetto agli arti di controllo maligne> 13. La lunghezza degli arti può essere misurata in diversi punti temporali per tutto il corso dello studio utilizzando microCT immagini per indagare le discrepanze di lunghezza degli arti 14 . Esempi di timepoints precedentemente utilizzati includono 28 giorni e 56 giorni dopo la lesione. Le misurazioni delle piastre di crescita, comprese l'altezza complessiva, le altezze, e la formazione di tether, possono anche fornire importanti informazioni sul processo di riparazione dei tessuti 13 , 14 , 15 . Idealmente, si dovrebbe prendere lunghezze degli arti e misure della piastra di crescita prima dell'intervento chirurgico per avere un valore di base. Per chiarire ulteriormente i meccanismi biologici o per verificare l'efficacia di un trattamento, opportuni gruppi di controllo dovrebbero essere progettati e includere arti e arti non interessati che sono stati sottoposti a intervento chirurgico ma non trattati.
Anche i biomateriali possono essere testati in questo modello di lesioni sulla piastra di crescita. Come esempio, un chiIl tosan microgel 19 è stato iniettato nel sito di lesione della piastra di crescita, come descritto nel punto 7.1, ed è chiaramente visibile nel sito di lesione in Figura 4 . L'analisi successiva può comportare la determinazione degli effetti del biomateriale sulla composizione del tessuto di riparazione, la lunghezza degli arti e le misure della piastra di crescita, come discusso in precedenza.
Figura 2. Interruzione della piastra di crescita riuscita e formazione della barra ossea.
La formazione del barile ossa è osservata a 7 giorni dopo l'infortunio con microCT e confermata mediante la colorazione dell'emalossilina blu di Alcian (ABH). Il baretto osseo è completamente maturo dal giorno 28 post-lesione, come visto con microCT e ABH colorazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati potenziali di foratura non corretta.
A) La foratura troppo larga attraverso la tibia può interferire con la superficie articolare, che complica il processo di guarigione e può portare a risultati inconcludenti. B) L' angolo non corretto del trapano può portare ad un danno di piastra di crescita non centrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Trattamento di una lesione della piastra di crescita con un biomateriale.
La colorazione ABH mostra il microgel di chitosano nella piastra di crescita ferita.
| metrico | Esegui 1 | Esegui 2 | Esegui 3 | P-value |
| Fattore di volume ossea all'interno di tutta la piastra di crescita | 9,76 +/- 3,81% | 10,52 +/- 4,06% | 11,93 +/- 2,04% | 0,5493 |
| Fattore di volume dell'osso all'interno dell'area del tessuto di riparazione | 41,5 +/- 8,33% | 46.08 +/- 10.12% | 46,77 +/- 8,14% | 0,5128 |
Tabella 1. Dati Frazione del volume osseo.
I dati erano da immagini micro CT a 28 giorni dopo lesioni su ratti non trattati da tre prove indipendenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un modello di animali di lesioni sulla piastra di crescita notevolmente aggiunge alla nostra comprensione dei meccanismi biologici di questo pregiudizio, portando così potenzialmente ad interventi terapeutici più efficaci per i bambini affetti da lesioni della piastra di crescita. Per creare con successo un bony bar e per studiare la sua formazione in vivo utilizzando il modello presentato in questo lavoro, è fondamentale per interrompere la piastra di crescita perforando ad una profondità sufficiente, senza interrompere la cartilagine articolare. La variazione nell'attuazione chirurgica tra gli animali e, in misura minore, la variazione di marcatori anatomici può portare a risultati problematici. Si raccomanda di praticare le procedure sopra descritte sugli animali cadaverici per assicurare una lesione di piastre di successo, prima di eseguire la procedura per gli studi sugli animali vivi. Mentre gli animali cadaveri mancano di flessibilità del tessuto e non sanguinano, la procedura di lesione della piastra di crescita e le caratteristiche anatomiche di questi animali saranno simili a quelle degli animali vivi. FurtInoltre, la piastra di crescita tibiale cadaverica può essere facilmente disseccata, poiché l'epifisi si separa dalla metafisica attraverso l'applicazione della forza leggera e si può osservare l'ubicazione del foro di trapano. Questa rapida analisi consente di modificare le tecniche di apprendere la profondità e l'angolo appropriati di trapano sugli animali cadaverici senza la necessità di immagini.
Va notato che esistono altri modelli animali di pregiudizio della piastra di crescita. Un simile difetto trasfessionale è stato eseguito nel mouse e ha portato alla formazione di barre ossea 20 . Nonostante le dimensioni più piccole, può essere utilizzato anche per studiare i meccanismi coinvolti nella formazione di barre ossee. Coleman et al . Riportato su un altro modello valido di ratto di lesione della piastra di crescita, dove un difetto centrale transfessionale è stato creato nel femore distale perforando attraverso la cartilagine articolare 21 . Questo approccio ha anche portato alla formazione di una barra ossea e di disuguaglianze di lunghezza degli arti, come nellaModello presentato qui. Altri modelli animali di lesioni e trattamenti della piastra di crescita hanno incluso conigli 22 , suini 23 e pecore 24 . Mentre i modelli di lesioni animali più grandi possono rappresentare più da vicino lesioni cliniche, il modello del ratto è utile per la ricerca sui meccanismi biologici delle lesioni fisiologiche. Ad esempio, il modello di ratto presentato qui è stato utilizzato ampiamente per indagare meccanismi molecolari di lesioni fisiologiche e il processo di formazione della barra ossea 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Inoltre, il modello del ratto può essere utilizzato per testare vari trattamenti fisiologici prima di passare a modelli animali più grandi. Tuttavia, una sfida di questo modello di ratto di lesione della piastra di crescita è che la perforazione è fatta all'interno dell'osso, maRe impossibile osservare dove il foro di trapano si trova all'interno della piastra di crescita. Pertanto, una disgregazione efficace della piastra di crescita sugli animali vivi può essere confermata solo utilizzando tecniche di imaging al momento dell'intervento chirurgico o valutando la formazione di barre ossea tra 7 e 28 giorni dopo la chirurgia. Con la pratica si può ottenere un alto grado di successo nell'ottenimento di formazione di barre ossee, ma studi precoci possono portare ad un certo numero di animali che non hanno la formazione di un baretto osseo, dovuto a una piastra di crescita non sinuosa o ad una insufficiente rottura della crescita piatto.
Un'altra limitazione di questo modello è che le lesioni del foro di trivello non rappresentano lesioni normali della piastra di crescita nei bambini, che di solito si verificano a causa della frattura 25 . Le fratture all'interno della piastra di crescita possono essere classificate utilizzando il sistema di classificazione Salter-Harris 26 . Le fratture della piastra di crescita di tipo III e tipo IV contribuiscono più spesso alle lesioni fisiologiche che portanoAlla formazione del barile ossa. Il tipo di lesione della piastra di crescita presentato qui più da vicino si riferisce ad una lesione della piastra di crescita di tipo VI, una rara classe di lesioni in cui la physis viene rimossa da un trauma o ferita di puntura. Tuttavia, poiché i meccanismi fisiopatologici sottostanti alla formazione del barile osseo dopo la lesione della piastra di crescita rimangono elusivi, il modello del ratto resta importante per scoprire questo processo allo scopo di sviluppare nuove opzioni di trattamento per i bambini affetti da tutti i tipi di lesioni della piastra di crescita. Il metodo qui descritto crea in modo affidabile una barra ossea e può essere usata per studiare più aspetti del processo di riparazione lesioni della piastra di crescita in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . È stato anche dimostrato che questo modello di ratto produce una riduzione della crescita tibiale dopo la crescita della piastra inLa giuria 13 , che lo rende un modello animale ancora più interessante per testare nuove opzioni di trattamento che portano alla rigenerazione della piastra di crescita e al potenziale ripristino dell'allungamento delle ossa.
In conclusione, questo documento descrive i metodi per creare un modello di lesione della piastra di crescita con cui investigare la formazione di barre ossea e trattamenti potenziali per lesioni della piastra di crescita in vivo. Questo modello di ratto consente studi relativamente poco costosi e veloci, dato che un baretto osseo è completamente maturo 28 giorni dopo la lesione della piastra di crescita. Oltre a sviluppare la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della formazione del barile osseo in vivo , questo modello può essere utilizzato per testare i biomateriali che inibiscono la formazione di barili ossee e incoraggiano la rigenerazione delle cartilagini di crescita.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario dell'Istituto Nazionale di Arti e Malattie Muscoloscheletrici e Malattie della National Institutes of Health (NIH) sotto il premio R03AR068087, il Fondo di arricchimento accademico dell'Università di Colorado School of Medicine e il Gates Center for Medicina Regenerativa . Questo lavoro è stato supportato anche da NIH / NCATS Colorado CTSA Numero di sovvenzione UL1 TR001082. I contenuti sono la sola responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le viste ufficiali di NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel handle | McKesson | MCK42332500 | |
| Needle holder | Stoelting | RS-7824 | |
| Adson tissue forceps | Sklar | 50-3048 | |
| Iris Scissors | Sklar | 47-1246 | |
| Rotary Tool | Dremel | 7700 | Variable speed rotary tool |
| Keyless Rotary Tool Chuck | Dremel | 4486 | |
| Dental Burs | Dental Burs USA | FG6 | Round carbide bur, ≤2mm |
| Steinmann pins | Simpex Medical | T-078 | |
| Hair clippers | Wahl | 5537N | |
| 3-0 PGA surutes | Oasis | MV-J398-V | |
| Sterile gauze 2 x 2" | Covidien | 441211 | |
| Povidone Iodine | McKesson | 922-00801 | |
| Sterile saline | Vetone | 510224 | |
| 10 mL luer lock syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 23 gauge needle | Becton Dickinson | 305145 | |
| Isopropyl alcohol pads | Dynarex | 1113 | |
| Isoflurane | IsoFlo | 30125-2 | |
| Caliper | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Carprofen | Rimadyl | 27180 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals Inc | NDC 42023-179 | |
| Fenestrated Surgical Drape | McKesson | 25-517 | |
| Surgical Gloves | Uline | S-20204 | |
| #15 Scalpel Blade | Aven | 44044 | |
| 9 mm wound clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Reflex clip applier | World Precision Instruments | 500345 | |
| Absorbant underpads | McKesson | MON 43723110 | |
| Tec 3 Iso Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| Germinator 500 | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Warm water recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| Absorbent Underpads | Medline Industries | MSC281230 |
References
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10 (6), 713-716 (1990).
- Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198 (1), 194-199 (2012).
- Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38 (12), 1165-1170 (2012).
- Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
- Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69 (5), 684-690 (1987).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25 (5), 377-391 (2011).
- Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13 (1), 47-58 (2005).
- Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).
- Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85 (2), 134-145 (2009).
- Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).
- Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221 (1), 63-75 (2014).
- Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
- Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49 (4), 904-912 (2011).
- Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. , (2016).
- Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35 (6), 1307-1315 (2004).
- Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63 (1), 59-63 (1988).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20 (6), 802-806 (2000).
- Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
- Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57 (2), 441-448 (2016).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).
- Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
- Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. , (2016).
- Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83 (11), 1753 (2001).
- Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44 (5), 878-885 (2009).
- Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42 (6), 513-522 (2011).
- Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80 (6), 1272-1280 (2006).
- Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52 (2), 651-658 (2013).
- Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21 (7), 1075-1088 (2006).
- Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99 (2), 450-461 (2006).
