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Developmental Biology

मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में संरचना-समारोह अध्ययन Recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज का उपयोग करना

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/55575
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2, 1,2,4, 1,2,4, 1,2, 5, 6, 1,2,4, 7, 1,2,4, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 2Inflammation Research Center, VIB, 3Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, 4Cancer Research Institute Ghent (CRIG), 5Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 6Helmholtz Center for Infection Research, 7Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

Summary

प्रोटीन अक्सर एक से अधिक डोमेन है कि विभिन्न सेलुलर कार्यों लागू हो सकते हैं। जीन दस्तक बहिष्कार (KO) इस कार्यात्मक विविधता पर विचार नहीं करते। यहाँ, हम एक पुनर्संयोजन की मध्यस्थता कैसेट विनिमय (RMCE) को भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में आधारित संरचना-समारोह दृष्टिकोण है कि विभिन्न कार्यात्मक डोमेन या एक प्रोटीन की वेरिएंट की आणविक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है रिपोर्ट।

Abstract

माउस भ्रूण या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) में जीन इंजीनियरिंग दिए गए प्रोटीन की कार्यप्रणाली के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। प्रोटीन सेल के workhorses रहे हैं और अक्सर कई कार्यात्मक डोमेन, जो posttranslational संशोधनों से प्रभावित किया जा सकता है से मिलकर। सशर्त या संघटित नॉक आउट (KO) चूहों में पूरे प्रोटीन की कमी को ध्यान में यह कार्यात्मक विविधता और विनियमन नहीं लेता है। एक mESC लाइन और एक व्युत्पन्न माउस मॉडल, जिसमें FLPe पुनर्संयोजन की मध्यस्थता कैसेट विनिमय (RMCE) के लिए एक डॉकिंग साइट ROSA26 (R26) ठिकाना भीतर डाला गया था, पहले से सूचना मिली थी। यहाँ, हम एक संरचना-समारोह दृष्टिकोण है कि एक मल्टीडोमेन प्रोटीन के विभिन्न कार्यक्षमताओं की आणविक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है पर रिपोर्ट। इस उद्देश्य के लिए RMCE संगत चूहों को चूहों के साथ पार किया जाना चाहिए और फिर RMCE-संगत को mESCs पृथक किया जाना चाहिए। इसके बाद, ख्यात बचाव निर्माणों के एक पैनल RMCE targeti के माध्यम से R26 ठिकाना में पेश किया जा सकता हैएनजी। उम्मीदवार बचाव cDNAs आसानी से पुनर्संयोजन क्लोनिंग का उपयोग कर को लक्षित वेक्टर के RMCE साइटों के बीच डाला जा सकता है। इसके बाद, KO mESCs एक FLPe recombinase अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ संयोजन में लक्षित वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं। RMCE ROSA26 डॉकिंग साइटों में प्रमोटर कम neomycin प्रतिरोध जीन reactivates और सही लक्ष्य-निर्धारण घटना के चयन के लिए अनुमति देता है। इस तरह, 100% के करीब उच्च लक्ष्य-निर्धारण क्षमता प्राप्त कर रहे हैं, एक अर्द्ध उच्च throughput ढंग से कई ख्यात बचाव निर्माणों की प्रविष्टि के लिए अनुमति देता है। अंत में, R26 चालित बचाव निर्माणों की एक भीड़ फेनोटाइप कि माता पिता को mESCs में मनाया गया बचाव करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। हम P120 catenin (p120ctn) प्ररूपी रीडआउट रूप embryoid निकायों (EBS) में एण्डोडर्म भेदभाव का उपयोग कर KO mESCs में एक-का-प्रमाण सिद्धांत संरचना-समारोह अध्ययन प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण महत्वपूर्ण डोमेन की पहचान, ख्यात नीचे की ओर रास्ते, और रोग-प्रासंगिक बिंदु सक्षम बनाता हैम्यूटेशन कि किसी दिए गए प्रोटीन के लिए KO समलक्षणियों आबाद।

Introduction

यह अनुमान है कि स्तनधारी जीनोम लगभग 20,000 प्रोटीन कोडिंग जीन होते हैं। वैकल्पिक स्प्लिसिंग और posttranslational संशोधनों आगे प्रोटीन प्रदर्शनों की सूची में वृद्धि। प्रोटीन एक मॉड्यूलर संरचना 1 है और अक्सर कई अन्योन्य क्रिया डोमेन है, जो विभिन्न प्रोटीन परिसरों में उनकी भर्ती और कई कोशिकीय प्रक्रियाओं 2 में उनकी भागीदारी के लिए अनुमति देने के होते हैं। एक उदाहरण बहुआयामी प्रोटीन p120ctn कहा जाता है। p120ctn Ctnnd1 जीन द्वारा इनकोडिंग और एक बड़े केंद्रीय वर्मी दोहराने डोमेन एक एन टर्मिनल और एक सी टर्मिनल क्षेत्र से घिरे होते हैं है। p120ctn की वर्मी डोमेन शास्त्रीय cadherins, जो सेल कोशिका आसंजन में शामिल हैं की एक अत्यधिक संरक्षित juxtamembrane डोमेन को बांधता है, लेकिन यह भी ट्रांस्क्रिप्शनल repressor Kaiso को बांधता है। p120ctn के एन टर्मिनल डोमेन अलग kinases, फास्फेटेजों, छोटे RhoGTPases, और सूक्ष्मनलिका जुड़े पी के साथ सूचना का आदान प्रदानroteins 3। दिलचस्प बात यह है विकल्प स्प्लिसिंग का एक परिणाम के रूप में, p120ctn isoforms चार विकल्प शुरू कोडोन 4 से उत्पन्न किया जा सकता है। के रूप में यह सबसे -5 से अनुवाद किया है कोडोन शुरू 'और पूर्ण लंबाई एन टर्मिनल खंड शामिल p120ctn isoform 1 ए, सबसे लंबे समय तक है। p120ctn में isoforms 3 और 4, इस एन टर्मिनल खंड आंशिक रूप से और पूरी तरह से क्रमश: हटाया जाता है। प्रोटीन (या प्रोटीन isoforms) और उनके डोमेन अलग सेलुलर कार्यों में की सटीक भूमिका को समझना एक चुनौती बनी हुई है।

जीन mESCs में लक्षित इसी जीन की आनुवंशिक विलोपन के माध्यम से एक प्रोटीन की कार्यप्रणाली के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है और व्यापक रूप developmentally महत्वपूर्ण और रोग-प्रासंगिक जीन और रास्ते की पहचान करने के लिए योगदान दिया है। रिवर्स आनुवंशिकी में यह सफलता समरूप पुनर्संयोजन 5 की वजह से mESC अलगाव और जीन लक्ष्यीकरण के क्षेत्र में प्रगति का परिणाम था 6, 7 का उपयोग कर बढ़ाया जा सकता है, लेकिन दुर्भाग्य से, इन ऑफ-टारगेट प्रभाव 8 से ग्रस्त हैं। एक और अधिक विश्वसनीय तकनीक जीन लक्ष्यीकरण सक्षम करने के लिए RMCE है, जो साइट विशिष्ट ऐसे Cre / loxP या FLPe / Frt के रूप में पुनर्संयोजन सिस्टम पर आधारित है। LoxP और Frt अनुक्रम जीवाणुभोजी P1 में पाए जाते हैं और Saccharomyces cerevisiae, क्रमशः, और 34 बीपी की, एक असममित 8 बीपी अनुक्रम है कि साइट के उन्मुखीकरण का निर्धारण करता है सहित मिलकर बनता है। दूसरी ओर,, के उन्मुखीकरण उदाहरण के लिए, एक डीएनए खिंचाव के भीतर दो loxP साइटों का निर्धारण करेगा floxed डीएनए excised हो जाता है कि क्या है या मैंCre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन 9 पर nversed। इसके अलावा, यह भी एक रचनात्मक अनुवादन पैदा कर सकते हैं, तो दो साइटों अलग गुणसूत्रों पर स्थित हैं। RMCE heterospecific पुनर्संयोजन साइटों को नहीं पार प्रतिक्रिया करते हैं और है कि एक जीनोमिक ठिकाना में एम्बेडेड रहे हैं का लाभ लेता है। एक दाता प्लाज्मिड कि एक ही heterospecific साइटों से घिरे एक डीएनए टुकड़ा होता है की उपस्थिति में, recombinase डबल एक साथ अनुवादन (चित्रा 1) की वजह से RMCE संगत जीनोमिक ठिकाना में इस डीएनए टुकड़ा डाल देंगे। इधर, केवल सही ढंग से RMCE-लक्षित क्लोन भेजे वेक्टर पर एक प्रमोटर कि पुनर्स्थापित करने के लिए दवा प्रतिरोध धन्यवाद प्रदान कर सकते हैं एक "फंस" प्रमोटर कम Neomycin प्रतिरोध जीन (नव आर) डॉकिंग कोशिकाओं के R26 जीनोम में मौजूद (चित्रा 1) 10, 11। यह एक बहुत ही उच्च लक्ष्य-निर्धारण दक्षता, अक्सर 100% 11 के करीब है, में जो परिणाम </ sup> 12। अंत में, RMCE-आधारित लक्ष्य अत्यधिक कुशल है और संरचना-कार्यों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता; तथापि, यह एक पूर्व इंजीनियर जीनोमिक ठिकाना की आवश्यकता है।

आकृति 1
चित्र 1 RMCE की मध्यस्थता लक्ष्य निर्धारण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। अगर दोनों दो heterospecific Frt साइटों (सफेद और लाल त्रिकोण द्वारा दर्शाया) बंदरगाह RMCE एक परिभाषित जीनोमिक ठिकाना को भेजे को लक्षित वेक्टर से डीएनए क्षेत्रों के आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इंजीनियर जीनोमिक ठिकाना एक promoterless और छोटा कर दिया neomycin प्रतिरोध (नव आर) जीन होता है। भेजे डीएनए टुकड़ा में एक प्रमोटर कोडोन प्रदान करने और शुरू से, केवल सही पुनर्संयोजन घटनाओं neomycin प्रतिरोध बहाल, उच्च लक्ष्य-निर्धारण क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप। टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसके आंकड़ा।

mESCs में जीनोम इंजीनियरिंग RMCE संगत चूहों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। 1981 में, दो समूहों ब्लास्टोसिस्ट की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) से pluripotent कोशिकाओं पर कब्जा करने में और उन्हें संस्कृति 13, 14 में बनाए रखने में सफल रहा। mESCs भ्रूण और वयस्क कोशिकाओं के सभी प्रकार, जर्म सेल वंश सहित में आत्म नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं। इसलिए, जीन mESCs में लक्षित संघटित या सशर्त (Cre / LoxP प्रणाली का उपयोग कर) को चूहों के विकास के माध्यम से रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन सक्षम बनाता है। हालांकि, शास्त्रीय तरीका माउस ES कोशिकाओं को अलग करने के बहुत अक्षम है। कई प्रमुख सुधार बहुत पाने mESC लाइनों के लिए सफलता की दर में वृद्धि हुई है, एक परिभाषित सीरम बदलने (एसआर) मध्यम 15 के उपयोग सहित, mESC मध्यम के बीच अदल-एसआर और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) 16 युक्त, और फार्माको के उपयोगइस तरह के pluripotin या 2i 17 के रूप में तार्किक यौगिकों। Pluripotin, एक छोटे से सिंथेटिक अणु, ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF) और माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) 18 के अभाव में एक undifferentiated राज्य में mESCs के प्रसार के लिए अनुमति देता है। अंत में, यह दिखाया गया है कि mESCs एक बहुत ही उच्च दक्षता (100% के करीब) एक एसआर / एफबीएस मध्यम प्रत्यावर्तन प्रोटोकॉल, LIF के साथ और 19 pluripotin 20 संयुक्त है जब साथ अलग किया जा सकता। इन प्रोटोकॉल RMCE-संगत को mESCs कि बाद में संरचना-समारोह के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की कुशल अलगाव सक्षम करें।

इस पत्र के लिए एक विधि है कि एक एक प्रोटीन है कि विशिष्ट कोशिकीय प्रक्रियाओं के लिए जिम्मेदार हैं के भीतर प्रमुख डोमेन या अवशेषों की पहचान करने के लिए सक्षम बनाता है वर्णन करता है। इस उद्देश्य के लिए उन्नत प्रौद्योगिकियों कि कुशल mESC अलगाव सक्षम, को लक्षित वेक्टर विधानसभा, और mESC लक्ष्य-निर्धारण की एक पाइप लाइन बनाने थाघ। प्रोटीन isoforms, डोमेन उत्परिवर्ती, और नीचे की ओर प्रभावोत्पादक के साथ इस तरह, बड़े पैनल को mESCs में पेश किया जा सकता है और इन विट्रो KO phenotype बचाव करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है।

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Protocol

चूहों पर सभी प्रयोगों, संस्थागत राष्ट्रीय और यूरोपीय पशु नियमों के अनुसार आयोजित की गई।

1. RMCE-संगत को mESCs का अलगाव

  1. इस तरह के ROSALUC चूहों 10 या ROSA26-IPSC चूहों 21 के रूप में RMCE संगत चूहों, साथ विषमयुग्मजी KO चूहों नस्ल। दोनों RMCE संगत चूहों एक मिश्रित 129 / C57BL6 / स्विस पृष्ठभूमि पर बनी रहें।
    नोट: विषमयुग्मजी KO चूहों के साथ पार समयुग्मक KO चूहों में भ्रूण घातकता को दूर करने के लिए सलाह दी जाती है।
  2. R26 ठिकाना 12 में एक RMCE कैसेट युक्त विषमयुग्मजी KO चूहों को चुनने के लिए पीसीआर का प्रयोग करें।
  3. विषमयुग्मजी KO चूहों के साथ RMCE-संगत, विषमयुग्मजी KO चूहों नस्ल और RMCE-संगत, समयुग्मक को ब्लास्टोसिस्ट को अलग।
    1. शाम को समय संभोग सेट करें और संभोग अगली सुबह प्लग के लिए जाँच करें।
      नोट: प्लग पुरुष के coagulating और vesicular ग्रंथियों से जमा हुआ स्राव के बने होते हैं।ये प्लग महिला की योनि को भरने और 8 के लिए जारी रहती है - प्रजनन के बाद 24 घंटे के। खामियों को दूर महिलाओं 0.5 डीपीसी (दिन के बाद coitum) भ्रूण ले जाने जा माना जाता है।
      1. प्लग के लिए जाँच, उसकी पूंछ के आधार द्वारा महिला को उठाकर द्वारा एक सफेद जन के लिए उसे योनि खोलने की जांच करना। थोड़ा कोणीय जांच के साथ भग के होठों फैल जब प्लग को देखने के लिए मुश्किल है। अपने पुरुष से अलग खामियों को दूर महिलाओं।
    2. 3.5 डीपीसी पर ब्लास्टोसिस्ट इकट्ठा।
      1. अनुमोदित विधि (जैसे, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था) द्वारा गर्भवती मादाओं euthanize। एक midventral चीरा बनाने और गर्भाशय और डिंबवाहिनी काटना (अभी भी एक दूसरे से जुड़ी) ठीक कैंची और संदंश का उपयोग कर।
      2. 45 ° कोण में एक 26 गेज सुई मोड़। इस तुला सुई को एक 1 एमएल M2 मध्यम से भर सिरिंज संलग्न करें और इसका इस्तेमाल एक 10 सेमी पकवान के ढक्कन में गर्भाशय से ब्लास्टोसिस्ट फ्लश करने के लिए।
        1. गर्भाशय के अंत कि के सबसे करीब है में सुई डालेंडिंबवाहिनी। ठीक संदंश के साथ जगह में सुई पकड़ो, जबकि सवार धक्का; गर्भाशय की सूजन एक सफल फ्लशिंग इंगित करता है।
      3. सभी भ्रूण को इकट्ठा करने और उन्हें ताजा M2 मध्यम की एक बूंद में दो बार धोने के लिए - एक मुंह विंदुक (200 सुक्ष्ममापी 100 की एक व्यास के साथ) का प्रयोग करें। इसके तत्काल बाद उन्हें धोने के बाद, संस्कृति प्लेटों के लिए ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण (नीचे देखें)।
        नोट: विच्छेदन और लामिना हवा का प्रवाह में किया जाना चाहिए की ब्लास्टोसिस्ट की हैंडलिंग।
  4. पृथक RMCE-संगत को mESCs
    1. Mitomycin सी का इलाज DR4 MEFs साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली (सामग्री की तालिका देखें) एक दिन ब्लास्टोसिस्ट अलगाव से पहले तैयार करें।
      नोट: ये MEFs टीजी (DR4) 1Jae / जम्मू चूहों कि चार दवा के चयन जीन होते neomycin, puromycin, hygromycin के लिए प्रतिरोध प्रदान से पृथक किया गया, और 6-thioguanine 22।
      1. कोट 0.1% जिलेटिन के साथ सभी संस्कृति प्लेटें। 0.1% जिलेटिन जोड़ेंसंस्कृति प्लेटों के लिए, 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, और जिलेटिन समाधान aspirate। बीज एक 12 अच्छी तरह से थाली में P2 MEFs की एक शीशी के एक चौथाई और उन्हें MEF माध्यम की 2 एमएल में वृद्धि (देखें तालिका 1, सामग्री की तालिका) एक सहधारा monolayer 19 के लिए।
      2. 3 घंटे के लिए mitomycin सी (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ उन्हें निष्क्रिय और उन्हें फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 19 के साथ दो बार धोएं।
    2. एसआर ES कोशिका माध्यम में mitomycin सी का इलाज MEFs के साथ, एक मुंह विंदुक का प्रयोग, gelatinized 12-अच्छी तरह से प्लेटों पर ब्लास्टोसिस्ट (1 अच्छी तरह से / भ्रूण) प्लेट (2 एमएल / अच्छी तरह से) या तो 2 माइक्रोन pluripotin साथ या 2i के साथ पूरक (1 माइक्रोन Erk अवरोध करनेवाला PD0325901 और 3 सुक्ष्ममापी Gsk3 अवरोध करनेवाला CHIR99021)। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. 3 दिन - एसआर ES कोशिका मध्यम हर 2 (pluripotin या 2i के साथ पूरक) को ताज़ा करें।
    4. एक stereomicro के तहत प्रत्येक ब्लास्टोसिस्ट की जांच4.0x आवर्धन पर गुंजाइश और अंडे सेने और MEF परत को कुर्की के लिए जाँच करें।
      नोट: ब्लास्टोसिस्ट पक्षियों के बच्चे, वे zona pellucida है कि उन्हें समाहित खोना है। स्वाधीन ब्लास्टोसिस्ट के साथ वेल्स मुंह pipetting का उपयोग कर ताज़ा करने की जरूरत है।
    5. संस्कृति के 12 दिन डिस्पोजेबल सुझावों के साथ एक P10 पिपेट का उपयोग - 10 के बाद (एक stereomicroscope का उपयोग) अलग-अलग आईसीएम outgrowths उठाओ। एक वी के आकार का, 96-अच्छी तरह प्लेट (कमरे के तापमान पर) / अच्छी तरह से पीबीएस के 30 μL युक्त करने के लिए माध्यम के लगभग 10 μL में परिणाम स्थानांतरित करें।
    6. 0.25% ट्रिप्सिन के 50 μL प्रत्येक अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग करें और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. mESC मध्यम एफबीएस युक्त के 100 μL जोड़ें; 10-15 बार pipetting द्वारा एकल कक्षों में आईसीएम outgrowths अलग कर देना; और करने के लिए mitomycin सी का इलाज अलग कोशिकाओं हस्तांतरण, 96-अच्छी तरह MEF प्लेटों कि एक दिन के लिए तैयार थे आईसीएम कालोनियों उठाया जाता है से पहले।
    8. इस कदम के बाद, ओमी से टी pluripotin या mESC मध्यम से 2i। अगले दिन (100 μL / अच्छी तरह से) एसआर युक्त mESC माध्यम से FBS- से मध्यम बदल जाते हैं।
    9. 96- से 24-अच्छी तरह प्रारूप 19 के लिए स्थापित किया mESC लाइनों का विस्तार करें।
      1. , पीबीएस के 200 μL के साथ कोशिकाओं को धो लें ट्रिप्सिन के 50 μL जोड़ने के लिए, और 5% सीओ में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं एफबीएस आधारित mESC माध्यम के 100 μL जोड़ें।; 10 pipetting द्वारा अलग कर देना - एक multichannel विंदुक का उपयोग 15 बार; और सी का इलाज mitomycin को अलग कोशिकाओं हस्तांतरण, 24-अच्छी तरह से MEF प्लेटों।
      2. अगले दिन पर एसआर आधारित मध्यम करने के लिए परिवर्तित करें। इसी तरह से 24 से 6 अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए में mESCs का विस्तार करें। एक संगामी 6-अच्छी तरह से थाली 19 से 4 freezings - 3 बनाओ।
    10. P120ctn अशक्त के लिए पीसीआर और floxed जेनेटिक तत्व से पहले वर्णित किया गया; R26 ठिकाना 23 और इस मामले में, p120ctn में पसंद की KO एलील (के लिए पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर RMCE-संगत, समयुग्मक KO mESCs पहचानेंलड़की = "xref"> 12)।

तालिका एक
तालिका 1. संस्कृति मीडिया। सभी मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए गरम कर रहे थे।

2. एक RMCE-संगत लक्ष्य निर्धारण वेक्टर की पीढ़ी पुनर्संयोजन क्लोनिंग का उपयोग करना

  1. बचाव पुनर्संयोजन संगत प्रतिबंध एंजाइम (आरई) का उपयोग कर वैक्टर में निर्माण करती आधारित या पीसीआर आधारित 24 क्लोनिंग तकनीक क्लोन। सुनिश्चित करें कि cDNAs एक स्टॉप कोडोन होना सुनिश्चित करें।
    1. डिजाइन attB-टैग प्राइमरों 24। सुनिश्चित करें कि आगे प्राइमर निम्नलिखित तत्व शामिल हैं: एक gggg खिंचाव, एक AttB1 साइट, एक लिंकर, एक कोज़ाक अनुक्रम, और बचाव सीडीएनए के बारे में 25 न्यूक्लियोटाइड (अपने ATG से शुरू)। एक gggg खिंचाव, एक AttB2 साइट, एक लिंकर, और लगभग 25 nuc: सुनिश्चित करें कि रिवर्स प्राइमर समान है कि बनाओबचाव सीडीएनए (रिवर्स पूरक) की leotides।
    2. AttB-घिरे सीडीएनए प्राप्त करने के लिए पीसीआर के माध्यम से बचाव सीडीएनए बढ़ाएं।
    3. AttB-घिरे सीडीएनए के 100 एनजी और पुनर्संयोजन संगत दाता वेक्टर है, जो एक केनामाइसिन प्रतिरोध जीन होता है के 150 एनजी के साथ एक 10 μL बीपी प्रतिक्रिया निष्पादित करें।
    4. गर्मी झटका सक्षम MC1061 कोलाई (ई कोलाई) बैक्टीरिया (कदम 2.3 में वर्णित के समान) में बीपी मिश्रण के 5 μL रूपांतरण।
    5. सही बचाव सीडीएनए युक्त वैक्टर युक्त कालोनियों को पहचानें (चरण में वर्णित के समान 2.4)
  2. बचाव सीडीएनए युक्त वेक्टर के 100 एनजी का उपयोग कर एक 10 μL एलआर प्रतिक्रिया करते हैं; Cre पर excised pRMCE-DV1 वेक्टर 11 (LMBP 8195) के 150 एनजी; और recombinase मिश्रण है, जो एक फेज एन्कोड इंटिग्रेस और excisionase और एक जीवाणु एकीकरण मेजबान कारक शामिल हैं के 2 μL। 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: एक एलआर प्रतिक्रिया एक पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया हैआयन जिसमें एक प्रवेश attL साइटों और एक गंतव्य ATTR साइटों को शामिल करते वेक्टर युक्त क्लोन एलआर clonase एंजाइम मिश्रण द्वारा पुनर्संयोजन कर रहे हैं। यह एक अभिव्यक्ति ब्याज की जीन अगल attB साइटों को शामिल करते क्लोन का परिणाम है।
  3. गर्मी झटका सक्षम MC1061 ई कोलाई बैक्टीरिया में एलआर मिश्रण के 5 μL रूपांतरण।
    1. एक धारीदार करने के लिए 5 एलआर की μL मिश्रण जोड़ें, गर्मी सदमे सक्षम ई कोलाई बैक्टीरिया के 40 μL के साथ skirted, 2-एमएल पेंच टोपी ट्यूब और बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 1 Luria शोरबा (LB) माध्यम के एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। प्लेट एम्पीसिलीन पर 50 μL (एम्प; 100 माइक्रोग्राम / एमएल) अगर प्लेटों इन्तेरेलयूकिन और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में हो जाना।
  4. सही लक्ष्य-निर्धारण वेक्टर साथ कालोनियों को पहचानें।
    1. बेतरतीब ढंग से एक P200 टिप का उपयोग कर 5 कालोनियों उठाओ। एक गिलास परीक्षण युक्त 2 ट्यूब को टिप स्थानांतरण - 5 पौंड माध्यम की एमएल और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में हो जाना।
    2. भूतपूर्वव्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर बैक्टीरियल संस्कृतियों से प्लाज्मिड डीएनए पथ।
    3. आरई डाइजेस्ट और अनुक्रमण का उपयोग कर उन्हें मान्य करें। एक 10 μL प्रतिक्रिया में 2 माइक्रोग्राम आरई के 0.2 μL का उपयोग कर प्लाज्मिड (20 यू / μL) और इसी 10x बफर के 1 μL की - 0.5 काटें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे और एक 1% agarose जेल पर अलग के लिए सेते हैं। डीएनए टुकड़े की भविष्यवाणी की पैटर्न के साथ कालोनियों के लिए का चयन करें।
      1. इस बात की पुष्टि वैक्टर (50 एनजी / μL) Tlox एफ (एटीसी ATG TCT GGA TCC सीसीए टीसी) और IRES आर (GGG GCG GAA टीटीसी GAT एटीसी आग) प्राइमरों (5 pmol / μL) के साथ सेंगर अनुक्रमण का उपयोग कर विश्लेषण करें।

3. RMCE की मध्यस्थता mESC बचाव का लक्ष्य निर्धारण R26 लोकस के निर्माणों

  1. RMCE-संगत को mESCs और उन्हें पारित होने की संस्कृति एफबीएस आधारित mESC माध्यम में MEFs पर कम से कम दो बार शुरू करो। एक gelatinized 6-अच्छी तरह से थाली पर mESCs विभाजित करें।
  2. अगले दिन, कोशिकाओं, के बारे में 50% confluency पर, 1.5 के साथ ताज़ाएफबीएस आधारित mESC माध्यम की एमएल और एक Cre पर excised pRMCE-DV1 को लक्षित बचाव सीडीएनए युक्त वेक्टर के साथ mESCs transfect।
    1. एक डीएनए मिश्रण बनाओ। को लक्षित वेक्टर के 1 माइक्रोग्राम और 1 माइक्रोग्राम FLPe अभिव्यक्ति प्लाज्मिड 25 का शुद्ध DMEM माध्यम के 250 μL में जोड़े।
    2. एक lipofection मिश्रण बनाओ। Lipofection आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक (जैसे, 2000 Lipofectamine) शुद्ध DMEM माध्यम के 250 μL करने के लिए और कमरे के तापमान पर 5 मिनट (आर टी) के लिए सेते के 7 μL जोड़ें।
      नोट: इसी प्रकार RMCE को निशाना बनाने की क्षमता अन्य lipofection आधारित अभिकर्मकों (जैसे, Lipofectamine LTX और Effectene) का उपयोग कर प्राप्त किया गया।
    3. lipofection मिश्रण के साथ डीएनए मिश्रण मिलाएं और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। ताजा mESCs पर अभिकर्मक मिश्रण पिपेट। भंवर धीरे और रात भर छोड़ दें।
  3. अभिकर्मक के बाद एक दिन, DR4 MEFs के एक संगामी परत और 10 एमएल एफबीएस आधारित मीटर के साथ एक 10 सेमी संस्कृति डिश के लिए 6-अच्छी तरह से थाली से सभी mESCs विभाजितESC मध्यम।
  4. दो दिन अभिकर्मक के बाद, मध्यम करने के लिए 0.2 मिलीग्राम / एमएल G418 (100x) जोड़कर सही FLPe की मध्यस्थता कैसेट आदान प्रदान के साथ mESC क्लोन का चयन करें।
    नोट: G418 के प्रत्येक बैच G418 है कि सभी mESCs को मारता के सबसे कम एकाग्रता की पहचान करने के लिए एक को मार वक्र बनाओ।
  5. G418 युक्त mESC माध्यम के साथ दैनिक mESCs ताज़ा करें। कालोनियों 7 के बाद दिखाई देनी चाहिए - 10 दिन, तो लेने और कदम 1.4 के अनुसार इन का विस्तार करें।
  6. पीसीआर 11 के माध्यम से सही क्लोन की पुष्टि करें।

4. embryoid निकायों में mESCs की विभेदन (EBS)

  1. R26 चालित बचाव निर्माणों और उन्हें पारित होने के साथ KO mESCs की संस्कृति एफबीएस आधारित mESC माध्यम में MEFs पर कम से कम दो बार शुरू करो। एक बार gelatinized 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर पारित mESCs MEFs से छुटकारा पाने के।
  2. पीबीएस के साथ धो लें और लगभग-संगामी mESC संस्कृतियों trypsinize। प्लेट गैर पक्षपाती, बैक्टीरियल ग्रेड पालतू पर विभिन्न dilutions में mESCs (1/20 और 1/40) अलगभेदभाव माध्यम में री-व्यंजन।
  3. ईबीएस 30 दिनों के लिए इन व्यंजनों में बनाने के लिए अनुमति दें। मध्यम ताज़ा हर 2 - 3 दिन निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग कर: एक 50 एमएल ट्यूब ईबी निलंबन हस्तांतरण, ईबीएस गंभीरता से व्यवस्थित करते हैं, सतह पर तैरनेवाला हटाने, ताजा मध्यम जोड़ने के लिए, और EB निलंबन एक जीवाणु ग्रेड पर वापस भेजने पकवान।
  4. प्रोटोकॉल है कि पहले 12 में वर्णित किया गया का उपयोग कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा लक्षित mESCs और ईबीएस का विश्लेषण करें।

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Representative Results

RMCE-संगत को mESC लाइनों को अलग करने की प्रक्रिया चित्र 2 में दिखाया गया है। लगातार दो breedings RMCE-संगत को ब्लास्टोसिस्ट प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, विषमयुग्मजी KO चूहों RMCE-संगत, विषमयुग्मजी KO चूहों प्राप्त करने के लिए RMCE संगत चूहों के साथ पार कर रहे हैं। इन चूहों फिर अन्य विषमयुग्मजी KO चूहों के साथ समय संभोग 3.5 डीपीसी, RMCE-संगत, समयुग्मक को ब्लास्टोसिस्ट प्राप्त करने के लिए के लिए उपयोग किया जाता है। के रूप में मेंडेलियाई विरासत ने भविष्यवाणी की इस तरह के एक भ्रूण प्राप्त करने का मौका, आठ में से एक है। इसलिए, एक कुशल mESC अलगाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। pluripotin आधारित या 2i आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम क्रमश: RMCE संगत p120ctn KO mESCs सहित mESCs लाइनों, अलग करने के लिए बदलकर लगभग 94% (n = 114 ब्लास्टोसिस्ट) और 64% (n = 22 ब्लास्टोसिस्ट) के एक दक्षता के साथ कर रहे हैं, 12, 19। आमतौर पर, ब्लास्टोसिस्ट पक्षियों के बच्चे 3 और 6 के बीच के बाद के दिनों में में vitro (DIV) संस्कृति; इस MEFs करने के लिए या जिलेटिन में लिपटे व्यंजनों के लिए आईसीएम outgrowths का लगाव द्वारा पीछा किया। 12 दिन, बड़े आईसीएम outgrowths का गठन कर रहे हैं कि ईमानदारी से mESC लाइनों को जन्म (चित्रा 2) दे। इस अत्यधिक कुशल mESC अलगाव प्रक्रिया के कारण, यह एक या दो खामियों को दूर महिलाओं से RMCE-संगत को mESCs प्राप्त करने के लिए संभव है।

चित्र 2
चित्रा 2. RMCE-संगत को mESCs के अलगाव। (ए) प्रजनन रणनीति समयुग्मक, RMCE-संगत को mESCs प्राप्त करने के लिए। (बी) pluripotin- या 2i आधारित mESC अलगाव प्रक्रिया की योजना। व्हाइट पैमाने बार: 25 सुक्ष्ममापी। काले पैमाने सलाखों: 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डोमेन या बजे मैप करने के लिएएक प्रोटीन है कि विशिष्ट सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं के भीतर एसिड ino, एक अब RMCE, पूर्ण लंबाई या KO mESCs में उत्परिवर्ती निर्माणों के माध्यम से reintroduce, और KO फेनोटाइप वापस लौटने के लिए की क्षमता के लिए उन्हें परीक्षण कर सकते हैं। कई अलग अलग डोमेन उत्परिवर्ती और बिंदु उत्परिवर्ती के लिए लक्ष्य निर्धारण वैक्टर कुशलतापूर्वक recombinational क्लोनिंग (चित्रा 3A) द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। Recombinational क्लोनिंग recombinase मिश्रण है, जो विभिन्न प्लास्मिड के बीच Att-घिरे डीएनए टुकड़े के आदान-प्रदान की मध्यस्थता करता द्वारा विशिष्ट लगाव (Att) डीएनए अनुक्रम की मान्यता पर आधारित है। Recombinational क्लोनिंग प्रणाली केवल सही ढंग से वैक्टर कि विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन होते बीच स्विच करके और एक काउंटर के चयन मार्कर, "कोशिका मृत्यु बी के नियंत्रण" डालने से वैक्टर पुनर्संयोजन का चयन (ccdB) जीन, गंतव्य वेक्टर में (चित्रा 3 ए) । हम जेनरेट किया है 25 से अधिक Cre पर excised pRMCE-DV1 (लगभग 100% दक्षता के साथ वैक्टर को लक्षित कुछ उदाहरण एकतालिका 2 में दिखाया गया है फिर से)।

सारणी 2
तालिका 2. वेक्टर विधानसभा और RMCE की मध्यस्थता mESC लक्ष्य निर्धारण लक्ष्य निर्धारण का अवलोकन।

विभिन्न बचाव एक रचनात्मक-excised pRMCE-DV1 को लक्षित वेक्टर में एम्बेडेड निर्माणों आसानी से RMCE (चित्रा 3 बी) का उपयोग कर KO mESCs करने का लक्ष्य रखा जा सकता है। हम पहले 19 अलग अलग बचाव निर्माणों के लिए 133 लक्षित mESC क्लोन कि 93% 12 के एक औसत दक्षता के साथ RMCE के माध्यम से p120ctn KO mESCs की R26 ठिकाना में शुरू किए गए थे की पीढ़ी को सूचना दी। यहाँ, हम एक CAAX-टैग्ड p120ctn 1 ए सहित समान उच्च क्षमता के साथ अतिरिक्त निर्माणों,, को लक्ष्य पर रिपोर्ट उपकला करने वाली मेसेंकाईमल संक्रमण (EMT) SNAI और ZEB परिवार के inducers, और एन cadherin, p120ctn KO mESCs में ( सारणी 2)।

चित्र तीन
चित्रा 3. RMCE आधारित KO mESCs में लक्ष्य निर्धारण। (ए) RMCE-संगत को लक्षित वैक्टर की Recombinase की मध्यस्थता विधानसभा। (बी) RMCE के माध्यम से समयुग्मक KO mESCs की R26 लोकस पर ख्यात बचाव निर्माणों का लक्ष्य निर्धारण। RMCE-लक्षित mESC क्लोन की (सी) पीसीआर आधारित सत्यापन। डीएनए RMCE-लक्षित mESC क्लोन से निकाला गया था और एक आगे प्राइमर कि अंतर्जात R26 ठिकाना और एक रिवर्स प्राइमर कि आने pRMCE-DV1 निर्माण में स्थित है में एम्बेडेड है का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा विस्तार दिया जाता था। एक 560 बी.पी. बैंड सही ढंग से लक्षित क्लोन के लिए मनाया जाता है। अपुष्ट क्लोन लाल रंग में दिखाया गया है। एम 1: 1 केबी डीएनए सीढ़ी। M2: 1 केबी प्लस डीएनए सीढ़ी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

12 के परिणाम के रूप सिस्टिक ईबीएस में भेद करने में विफल रहते दिखाया गया था। सिस्टिक ईबी आकृति विज्ञान अलग बचाव निर्माणों (चित्रा 4 ए) स्क्रीन करने के लिए एक प्ररूपी रीडआउट रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अवधारणा के सबूत के रूप में, हम पता चला है कि R26 चालित p120ctn isoform 1 ए (R_p120_1A) p120ctn KO phenotype बचाव कर सकता है (चित्रा 4 बी, 4C) 12। इसके अलावा, इस स्क्रीन-पहचान ई cadherin, लेकिन नहीं RhoA, एण्डोडर्म विनिर्देश (चित्रा 4 बी और सी) 12 के दौरान p120ctn का एक महत्वपूर्ण भागीदार है। बचाव शुरू करने में आसानी p120ctn को KO mESCs हमें अतिरिक्त परिकल्पना का परीक्षण करने की अनुमति दी निर्माण करती है। सबसे पहले, ई cadherin स्वतंत्र p120ctn की झिल्ली प्रस्तोता सिस्टिक ईबी गठन के लिए सक्षम होगा? परीक्षा करनाइस के लिए, हम p120ctn की carboxy टर्मिनस के लिए कश्मीर रास झिल्ली को लक्षित मूल भाव (CAAX) आपस में जुड़े, RMCE के माध्यम से इसे पेश किया KO mESCs p120ctn के लिए, और उन लोगों से ईबीएस बनाया है। बहरहाल, यह निर्माण एक प्रभावी नकारात्मक कि बाध्यकारी अनुमति नहीं देता और ई cadherin (चित्रा 4D) के स्थिरीकरण और, एक परिणाम के रूप, p120ctn KO फेनोटाइप (चित्रा 4C) बचाव नहीं करता है कार्य करता है। दूसरा, EMT के inducers शामिल कर रहे हैं? EMT एक आवश्यक विकास की प्रक्रिया भी mESC भेदभाव के दौरान होता है और प्रतिलेखन कारक, जो सीधे ई cadherin 26, 27 जैसे विभिन्न उपकला मार्कर जीन को दबाने की SNAI और ZEB परिवार द्वारा ऑर्केस्ट्रेटेड जाता है। इन निष्कर्षों के साथ लाइन में, EMT प्रेरक ZEB2 की अभिव्यक्ति नियंत्रण ईबीएस में पाया गया था, लेकिन p120ctn-अशक्त ईबीएस (चित्रा 4E) में नहीं है। बहरहाल, EMT inducers ZEB1, ZEB2, या घोंघा की ROSA26 आधारित अभिव्यक्ति के साथ p120ctn KO mESCs पुटी बहाल करने में विफल रहाआईसी ईबी गठन (चित्रा 4C)। तीसरा, इस तरह के एन cadherin के रूप में अन्य शास्त्रीय cadherins,, कार्यात्मक ई cadherin एण्डोडर्म विनिर्देश के दौरान जगह ले सकता है? इस समाधान के लिए, एन cadherin बचाव लाइनों उत्पन्न किया गया। इससे पहले, यह दिखाया गया था कि p120ctn KO ईबीएस में ई cadherin के अस्थानिक अभिव्यक्ति आंशिक रूप से सिस्टिक ईबीएस 12 के गठन को बचाया। दिलचस्प बात यह है एक ऐसी ही सेटअप में, मजबूर एन cadherin अभिव्यक्ति को बचाने के लिए (चित्रा 4C और एफ) में विफल रहा है, यह दर्शाता है कि ई cadherin प्रमुख cadherin उप प्रकार ईबी आसंजन के लिए आवश्यक है और एन cadherin द्वारा बदला नहीं जा सकता। इन उपरोक्त उदाहरण कितनी आसानी से जैविक सवालों प्रणाली द्वारा संबोधित किया जा सकता पर प्रकाश डाला।

चित्रा 4
चित्रा 4. RMCE-लक्षित बचाव mESCs की प्ररूपी स्क्रीनिंग। (ए) सिस्टिक ईबीएस (प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कब्जा कर लिया के गठन के शीर्ष फलकls) और ईबीएस में उचित एण्डोडर्म ध्रुवीकरण (संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कब्जा कर लिया, नीचे पैनल) p120ctn KO फेनोटाइप को बचाने के लिए लक्षित mESCs की क्षमता का परीक्षण करने के लिए प्ररूपी रीडआउट के रूप में इस्तेमाल किया गया। व्हाइट पैमाने बार: 25 सुक्ष्ममापी। काले पैमाने बार: 200 सुक्ष्ममापी। (बी) p120ctn बचाव निर्माणों का अवलोकन। p120ctn एक केंद्रीय वर्मी डोमेन, नौ वर्मी दोहराता (नीले बॉक्स) से मिलकर है कि एक एन टर्मिनल डोमेन (NTD) और सी-टर्मिनल डोमेन (सीटीडी) से जुड़ा है शामिल है,। p120ctn isoforms विकल्प शुरू कोडोन (तीर) चार में से एक होते हैं, संभवतः वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया एक्सॉनों ए और सी (ब्लैक बॉक्स) द्वारा इनकोडिंग दृश्यों सुविधा है, और शामिल करने या छोड़ने दो रो GTPase बाध्यकारी डोमेन (RBDS)। p120ctn 1 ए और 4 ए पहले और चौथे अनुवाद दीक्षा साइट का उपयोग क्रमश: isoforms। महत्वपूर्ण ए.ए. और एक झिल्ली-लक्ष्य मूल भाव (CAAX) के कृत्रिम अलावा के उत्परिवर्तन की स्थिति दिखाई जाती हैं। EBD: ई cadherin बाध्यकारी डोमेन। (सी) ग्राफ़p120ctn KO कोशिकाओं है कि अलग अलग R26 चालित बचाव निर्माणों व्यक्त में बुनियादी या सिस्टिक ईबी आकृति विज्ञान का प्रतिशत चित्रण। (डी) p120ctn (माउस मोनोक्लोनल विरोधी p120ctn) और ई cadherin के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (माउस मोनोक्लोनल विरोधी ई cadherin) नियंत्रण जी -4 mESCs पर या के isoform 1 ए p120ctn CAAX-टैग R26 चालित अभिव्यक्ति के साथ p120ctn KO mESCs पर। सन्निवेश वाली पूरे mESC कॉलोनी दिखा। स्केल बार: 10 सुक्ष्ममापी। (ई) ZEB2 के लिए Immunohistochemistry (माउस मोनोक्लोनल विरोधी ZEB2; 7F7; घर में बनाया) floxed (नियंत्रण) पर और p120ctn KO ईबीएस। एक 3.5 गुना आवर्धन नीचे पैनल में दिखाया गया है। स्केल बार: 200 सुक्ष्ममापी (ऊपर), 100 सुक्ष्ममापी (नीचे)। (एफ) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन p120ctn KO कोशिकाओं R26 प्रमोटर से ई या एन cadherin व्यक्त करने से DIV12 ईबीएस की माइक्रोस्कोपी। स्केल बार: 10 सुक्ष्ममापी। थी की एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंरों आंकड़ा।

समाप्त करने के लिए, हम मजबूत प्रौद्योगिकियों के एक पाइपलाइन कि वेक्टर विधानसभा को निशाना बनाने और mESC को निशाना बनाने के साथ mESC अलगाव में एक लगभग 100% क्षमता को जोड़ती है पर रिपोर्ट। यह पाइपलाइन mESCs में संरचना-समारोह के अध्ययन के माध्यम से प्रोटीन की बहुमुखी प्रतिभा को जानने के लिए सक्षम बनाता।

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Discussion

हमारे mESC अलगाव विधि उपयोगकर्ता के अनुकूल है और इस तरह ब्लास्टोसिस्ट की microsurgery के रूप में उन्नत कौशल या उपकरण, की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, इस तकनीक के वैज्ञानिक समुदाय का एक बड़ा हिस्सा के लिए सुलभ है। बुनियादी सेल संस्कृति के अनुभव के साथ किसी को भी आईसीएम outgrowths प्रचार और mESCs लाइनों की स्थापना कर सकते हैं। हालांकि, फ्लशिंग और ब्लास्टोसिस्ट की हैंडलिंग कुछ अभ्यास की आवश्यकता है। एक मुंह विंदुक ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक micropipette, एक micropipette धारक, ट्यूबिंग, और एक चूषित्र मुखपत्र 28 के होते है। Micropipettes, कुछ सेकंड के लिए एक पाश्चर विंदुक का बेहतरीन हिस्सा हीटिंग लौ से पिपेट को दूर करने, और दोनों सिरों खींच कर विशेष रूप से निर्मित किया जा सकता है। (- 200 सुक्ष्ममापी 100) एक व्यास के एक ब्लास्टोसिस्ट तुलना में थोड़ा बड़ा के साथ सुइयों का चयन करें। सुई आसुत जल (3x) और EtOH (3x) के साथ धोया होने के बाद पुन: उपयोग किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, pluripotin आधारित mESC अलगाव की दक्षता में 2 की तुलना में है उच्चमैं आधारित प्रोटोकॉल 12। हालांकि, उच्च सांद्रता में pluripotin के उपयोग जीनोमिक अस्थिरता 19 प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है।

mESCs में RMCE आधारित R26-लक्ष्य आम तौर पर 20 पैदावार - G418 चयन के बाद 40 कालोनियों। अधिक कालोनियों मनाया जाता है, तो यह संकेत मिलता है कि G418 एकाग्रता इष्टतम नहीं है और संपूर्ण लक्ष्यीकरण दक्षता को प्रभावित करने, गैर लक्षित mESCs जीवित रहने के लिए अनुमति देता है। इसलिए, यह, कि सलाह दी जाती है प्रत्येक mESC लाइन के लिए और प्रत्येक नए G418 बैच के लिए, एक को मार वक्र न्यूनतम G418 एकाग्रता है कि सभी गैर-लक्षित mESCs मारता है पहचान करने के लिए किया जाता है। कोई कालोनियों मनाया जाता है, तो यह एक अक्षम अभिकर्मक का संकेत है। उस मामले में, यह संवाददाता प्लास्मिड कि EGFP या lacZ की अभिव्यक्ति की अनुमति का उपयोग कर अभिकर्मक प्रक्रिया का अनुकूलन करने के सार्थक है। अभिकर्मक प्रोटोकॉल काम करता है, लेकिन अभी भी कोई कालोनियों मनाया रहे हैं, तो RMCE-संगत और रचनात्मक-excised pRMCE-DV1 वेक्टर और FLPe ई जाँचआरई डाइजेस्ट और अनुक्रमण के साथ है xpression प्लाज्मिड। यह माता पिता का mESCs और FLPe वेक्टर का एक बड़ा बैच बनाने के लिए और उनमें से कई aliquots फ्रीज करने के लिए प्रयोगों के बीच भिन्नता को कम करने की सलाह दी जाती है।

इस संरचना-समारोह रणनीति का एक दोष है कि बचाव निर्माणों एक सर्वव्यापी, मध्यम सक्रिय प्रमोटर के साथ अंतर्जात ठिकाना से व्यक्त नहीं कर रहे हैं, बल्कि ROSA26 ठिकाना भीतर से, है। अन्य प्रौद्योगिकियों, जहां supraphysiological overexpression स्तर अक्सर देखा जाता है की तुलना में, इस प्रणाली शारीरिक ट्रांस्जीन अभिव्यक्ति है, जो इन विट्रो भेदभाव प्रयोगों के दौरान और विभिन्न कोशिका वंश भर में स्थिर है सक्षम बनाता है। ऐसा नहीं है कि विषम, एक p120ctn प्रोटीन अभिव्यक्ति में ROSA26 की मध्यस्थता ट्रांस्जीन अभिव्यक्ति परिणाम है कि wildtype नियंत्रण mESCs के अंतर्जात p120ctn स्तरों के बारे में आधे था, लेकिन है कि मनाया p120ctn KO समलक्षणियों 12 को बचाने के लिए पर्याप्त था मनाया गया। इसी तरह, यह डी थापहले से monstrated है कि एक विषम, ROSA26 की मध्यस्थता Zeb2 ट्रांस्जीन अभिव्यक्ति स्तर Zeb2 नॉकआउट इन विट्रो में और विभिन्न कोशिका वंश 29 इन विवो में मनाया समलक्षणियों को बचाने के लिए पर्याप्त है। एक अन्य संभावित ख़तरा तथ्य यह है कि जीन है कि mESC आत्म नवीकरण के लिए अपरिहार्य हैं ऐसे संरचना-समारोह के अध्ययन के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। प्रसार, कॉलोनी आकृति विज्ञान, और stemness जीनों की अभिव्यक्ति: यह निकालने के लिए, उस पर निम्न के लिए नव स्थापित KO mESCs चिह्नित करने के लिए सलाह दी जाती है। यह भी ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने, दोनों mESCs में और वंश-प्रतिबद्ध कोशिकाओं में सिफारिश की है।

संघटित KO mESCs में संरचना-समारोह के अध्ययन प्रदर्शन के अलावा, एक भी Cre / loxP प्रणाली का उपयोग करते हुए एक सशर्त दृष्टिकोण ले सकता है। बाद दृष्टिकोण आसपास के और समर्थन कोशिकाओं को प्रभावित किए बिना एक वंश विशेष को अनुमति देता है। इसके अलावा, सशर्त KO mESCs alloसंरचना-समारोह के अध्ययन के प्रदर्शन के लिए डब्ल्यू अगर वहाँ संघटित KO mESCs में एक phenotype है। RMCE-संगत बनाने के लिए, सशर्त-KO mESCs ने कोशिका विशेष प्रकार के रचनात्मक ड्राइवर के साथ समयुग्मक floxed चूहों RMCE संगत चूहों के साथ नस्ल कर रहे हैं; mESC उनके वंशज से अलग हैं। इस प्रणाली का लाभ यह है कि Cre recombinase mESCs में व्यक्त नहीं है और केवल सक्रिय हो जाता है जब mESCs संबंधित सेल वंश में भिन्न-भिन्न हों है। RMCE-संगत, सशर्त-KO mESCs में, Cre पुनर्संयोजन एक सशर्त pRMCE-DV1 को लक्षित वेक्टर (LMBP 08870) 11 का उपयोग करके अंतर्जात जीन और बचाव निर्माण की R26 चालित अभिव्यक्ति का एक साथ निष्क्रियता के लिए प्रेरित करेगा।

इसके अलावा, संरचना-समारोह प्रणाली परिवर्तन के अध्ययन है कि मानव रोग में पाया और प्रोटीन के कार्यों पर इन म्यूटेशनों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है कर रहे हैं के लिए अनुमति देता है। एक उदाहरण के रूप में, हम ZEB2 mutat की पहचान की हैम्येलोप्रोलिफेरातिवे सूजन के साथ रोगियों में आयनों,, इन ZEB2 उत्परिवर्ती युक्त लक्षित कर वैक्टर बना RMCE के माध्यम से Zeb2 KO mESCs की R26-ठिकाना करने के लिए उन्हें shuttled, और प्रोटीन में ही 30 की स्थिरता पर परिवर्तन के प्रभाव की जांच की। यह तकनीक, mESCs में इस तरह के उत्परिवर्ती के जैव रसायन, साथ में किसी भी वंश का एक बड़ा समझ देता है के बाद से mESCs pluripotent हैं।

अंत में, इस mESC-आधारित संरचना-समारोह दृष्टिकोण कुशल mESC अलगाव और लक्षित तकनीक पर निर्भर करता है और एक परिभाषित जैविक संदर्भ में महत्वपूर्ण डोमेन और किसी दिए गए प्रोटीन के कार्यों की पहचान के लिए अनुमति देता है। साझा करने चूहों (जमे हुए शुक्राणु अनुरोध पर उपलब्ध है) तथा प्लास्मिड तक (BCCM / LMBP और Addgene से वितरित), हम पूरे वैज्ञानिक समुदाय के लिए इस तकनीक का खोलना चाहते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जिनके डी 'होंट, फ़्रेडरिक वान Rockeghem, नेटली Farla, कैली लेमेयर, और Riet डे RYCKE धन्यवाद। हम भी उनके विशेषज्ञ सहायता के लिए सूजन अनुसंधान केंद्र के Bioimaging कोर सुविधा से EEF Parthoens, Evelien वान Hamme, और अमांडा गोन्साल्वेस धन्यवाद। हम बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए हमारे शोध समूह के सदस्य को स्वीकार करते हैं। इस काम बेल्जियम विज्ञान नीति द्वारा समर्थित किया गया (Belspo इंटर यूनिवर्सिटी आकर्षण डंडे - पुरस्कार आईएपी सातवीं-07 DevRepair; https://devrepair.be), रानी एलिजाबेथ मेडिकल फाउंडेशन, बेल्जियम (GSKE 2008-2010 द्वारा; http: // www .fmre-gske.be), और गेन्ट विश्वविद्यालय, बेल्जियम (http://www.ugent.be/en/ghentuniv) के ठोस रिसर्च क्रिया (गोवा 01G01908) द्वारा। एसजी फ्लैंडर्स रिसर्च फंड (FWO-V) के पोस्टडॉक्टरल साथी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ROSALUC Mice made in house frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice made in house frozen sperm available upon request
Vessel probe Fine Science Tools 10160-13 to check for copulation plugs
M2 medium Sigma-Aldrich M7167 make aliquots and store at -20 °C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) Fine Science Tools 11251-10 spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23 G needles Fine-ject 8697
1-mL syringes Soft-ject 6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)  Gosselin BB60-01
Mouth pipette made in house see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) ATTC SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice The Jackson Laboratory 3208
Mitomycin C  Sigma-Aldrich M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice JAX 3208 mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin Sigma-Aldrich G1393 Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C.
Trypsin (0.25%)  Gibco 25200-056
2 μM pluripotin Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08870 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08195 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  Addgene 20733
heat-shock competent DH5α bacteria  made in house
Gateway pDONR221 vector Thermo Fisher 12536-017 contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix Thermo Fisher 11789-020
LR clonase II mix Thermo Fisher 11791-020 
Luria Broth (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer Thermo Fisher 3730XL
G418 Thermo Fisher 11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent Thermo Fisher 15338100
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
GATEWAY pENTR 1A vector Thermo Fisher A10462 recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody BD Transduction Laboratories 610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody BD Transduction Laboratories 610181
General equipment
Sterile dissection tools fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL
15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) 
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) 
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light 
Culture media
MEF Medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 41965-062
10% fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-7524
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
Sodium pyruvate  (0.4 mM) Gibco 11360-039 
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
SR-based mESC medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
DMEM/F12 Gibco 31330-038 mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR) Gibco 10828–028
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
0.1 mM non-essential amino acids  Gibco 11140-050
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
β-mercaptoethanol (0.1 mM)  Sigma-Aldrich M 3148 
2,000 U/mL recombinant mouse LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM Gibco 10829-018 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
Differention Medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 21980-032 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid   Gibco 11279-023 
2 mM L-glutamine Gibco 25030-024 
0.4 mM 1-thioglycerol Sigma-Aldrich M-6145
50 μg/mL ascorbic acid Sigma-Aldrich A-4544 
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901  Axon Medchem Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 122 संरचना-समारोह मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं सेल अलगाव pluripotin पुनर्संयोजन की मध्यस्थता कैसेट विनिमय ROSA26 लक्ष्यीकरण नॉक-आउट ROSA26 ठिकाना embryoid निकायों बचाव निर्माणों स्टेम
मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में संरचना-समारोह अध्ययन Recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज का उपयोग करना
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Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).

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