Summary
غالبا ما تحتوي على البروتينات المجالات المتعددة التي يمكن أن تمارس الوظائف الخلوية المختلفة. الجينات ضرب الرافضة (KO) لا يعتبرون هذا التنوع الوظيفي. هنا، نحن الإبلاغ عن النهج المستندة إلى هيكل الوظائف بوساطة إعادة التركيب الصرف كاسيت (RMCE) في KO الخلايا الجذعية الجنينية التي تسمح للتشريح الجزيئي للمجالات أو أنواع من البروتين وظيفية مختلفة.
Abstract
الهندسة الوراثية في الأجنة الماوس أو الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) تسمح لدراسة وظيفة بروتين معين. البروتينات هي حقوله المنتجة من الخلية وتتكون غالبا من المجالات الوظيفية متعددة، والتي يمكن أن تتأثر التعديلات posttranslational. استنزاف البروتين بأكمله في مشروط أو التأسيسي الضربة القاضية من أصل (KO) الفئران لا يأخذ بعين الاعتبار هذا التنوع الوظيفي والتنظيم. وقد ذكرت سابقا خط مسك ونموذج الفأر المشتقة، التي تم إدراج موقع رسو السفن لFLPe الصرف كاسيت بوساطة إعادة التركيب (RMCE) في موضع ROSA26 (R26). هنا، ونحن التقرير على نهج هيكل الوظائف التي تسمح للتشريح الجزيئي للوظائف مختلفة من البروتين متعددة المجالات. وتحقيقا لهذه الغاية، يجب أن عبرت الفئران RMCE متوافق مع الفئران KO، ويجب أن تكون معزولة mESCs KO ثم RMCE متوافق. بعد ذلك، يمكن إدخال لجنة من ثوابت الإنقاذ المفترضة في موضع R26 عبر RMCE targetiنانوغرام. وcDNAs الإنقاذ مرشح يمكن إدراجها بسهولة بين المواقع RMCE للناقلات التي تستهدف باستخدام إعادة التركيب الاستنساخ. بعد ذلك، و transfected mESCs KO مع ناقلات تستهدف في تركيبة مع FLPe التعبير recombinase البلازميد. RMCE إعادة تنشيط الجين النيوميسين-مقاومة المروج أقل في مواقع رسو السفن ROSA26 ويسمح لاختيار الحدث الاستهداف الصحيح. وبهذه الطريقة، يتم الحصول على الكفاءات استهداف عالية قريبة من 100٪، والسماح لإدخال عدة ثوابت الإنقاذ المفترضة بطريقة الإنتاجية شبه عالية. وأخيرا، العديد من بنيات الإنقاذ مدفوعة R26-يمكن اختبار لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الذي لوحظ في mESCs KO الوالدين. نقدم دراسة بنية وظيفة إثبات صحة المبدأ في كاتينين P120 (p120ctn) mESCs KO باستخدام الأديم الباطن التمايز في الهيئات مضغي (EBS)، وقراءات المظهرية. هذا النهج يمكن تحديد المجالات الهامة، مسارات المصب المفترضة، ونقطة من الأمراض ذات الصلةالطفرات التي تكمن وراء الظواهر KO لبروتين معين.
Introduction
ويقدر أن جينومات الثدييات تحتوي على حوالي 20000 جينات تشفير البروتين. الربط البديل والتعديلات posttranslational يزيد من ذخيرة البروتين. البروتينات لديها بنية وحدات (1) وغالبا ما تحتوي على مجالات التفاعل متعددة، والتي تسمح تجنيدهم في المجمعات بروتين مختلفة، ومشاركتهم في العمليات الخلوية متعددة 2. ومن الأمثلة على ذلك البروتين متعدد الوظائف وتسمى p120ctn. يتم ترميز p120ctn بواسطة الجينات Ctnnd1 ويتكون من مجال أرماديلو تكرار مركزي كبير محاط من قبل N-المحطة ومنطقة C-المحطة. المجال أرماديلو من p120ctn بربط مجال juxtamembrane الحفظ جدا من cadherins الكلاسيكية، التي تشارك في التصاق خلية خلية، ولكنه يربط أيضا إلى قامع النسخي كايسو. المجال-N من محطة p120ctn يتفاعل مع تحركات مختلفة، فوسفاتاز، RhoGTPases صغيرة، والمرتبطة أنيبيب صroteins 3. ومن المثير للاهتمام، نتيجة الربط البديلة، الإسوية p120ctn يمكن أن تتولد من أربعة الكودونات بداية بديلة 4. p120ctn شكل الإسوي 1A هو أطول، كما ترجم من أكثر 5 "تبدأ كودون ويحتوي على شريحة-N محطة بالطول. في p120ctn الإسوية 3 و 4، يتم حذف هذه الشريحة N-المحطة جزئيا وكليا، على التوالي. فهم الدور الدقيق من البروتينات (أو الأشكال الإسوية البروتين)، والمجالات الخاصة بهم في الوظائف الخلوية المختلفة لا يزال يشكل تحديا.
الجينات التي تستهدف في mESCs يمكن دراسة وظيفة البروتين من خلال حذف الوراثي للجينات المقابلة وساهم على نطاق واسع لتحديد الجينات والممرات الهامة والأمراض ذات الصلة تنمويا. كان هذا الاختراق في علم الوراثة العكسية نتيجة التقدم في مجالات العزلة مسك والجينات التي تستهدف بسبب إعادة التركيب مثلي 5 6، 7، ولكن للأسف، هذه هي عرضة لتأثيرات بعيدا عن الهدف 8. وهناك تقنية أكثر موثوقية لتمكين الجينات الاستهداف RMCE، والتي تقوم على أنظمة إعادة التركيب في مواقع محددة مثل لجنة المساواة العرقية / loxP أو FLPe / FRT. تم العثور على LoxP وتسلسل FRT في P1 عاثية وخميرة الخباز، على التوالي، وتتكون من 34 شركة بريتيش بتروليوم، بما في ذلك شركة بريتيش بتروليوم تسلسل غير المتماثلة 8 التي تحدد التوجه للموقع. من ناحية أخرى، توجه، على سبيل المثال، موقعين loxP ضمن تمتد DNA ستحدد ما إذا كان DNA floxed يصبح رفعه أو طnversed على إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية-9. وعلاوة على ذلك، يمكن للجنة المساواة العرقية أيضا لحث على النبات إذا كانت موجودة موقعين على الكروموسومات المختلفة. RMCE يستفيد من مواقع إعادة التركيب مغاير نوعي التي لا عبر التفاعل والمضمنة في موضع الجيني. في ظل وجود البلازميد المانحة التي تحتوي على جزء DNA يحيط بها مواقع مغاير نوعي نفسها، فإن recombinase إدراج هذا جزء الحمض النووي في موضع-RMCE متوافق الجيني بسبب النبات المزدوج في وقت واحد (الشكل 1). هنا، يمكن استنساخ فقط بشكل صحيح RMCE المستهدفة تجعل بفضل المقاومة للأدوية إلى المروج على ناقلات الوارد أن يعيد "المحاصرين"، المروج أقل مقاومة نيومايسين الجين (النيو R) موجودة في الجينوم R26 من الخلايا لرسو السفن (الشكل 1) 10، 11. وهذا يؤدي إلى كفاءة استهداف عالية جدا، وغالبا ما يقرب من 100٪ 11 </ سوب> 12. وفي الختام، واستهداف القائم على RMCE ذو كفاءة عالية ويمكن استخدامها للدراسات وظائف الهيكل. ومع ذلك، فإنه يتطلب موضع الجيني سابقة الهندسة.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي لاستهداف بوساطة RMCE. RMCE يسمح لتبادل شرائح DNA من ناقلات تستهدف الواردة إلى مكان الجيني يعرف إذا كان كل من الميناء موقعين FRT مغاير نوعي (يصور مثلثات بيضاء وحمراء). وبالإضافة إلى ذلك، موضع الجيني المهندسة يحتوي على promoterless والجينات اقتطاع النيوميسين المقاومة (النيو R). من خلال توفير مروج والبدء في كودون في جزء DNA واردة، أحداث إعادة التركيب فقط الصحيحة استعادة المقاومة النيوميسين، مما أدى إلى الكفاءة استهداف عالية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من رشخصية له.
هندسة الجينوم في mESCs تسمح للجيل من الفئران RMCE متوافق. وفي عام 1981، نجحت مجموعتين في التقاط الخلايا المحفزة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) من الكيسات الأريمية والحفاظ عليها في الثقافة 13، 14. mESCs قادرة على تجديد الذات والتمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجنينية والكبار، بما في ذلك النسب الجرثومية الخلية. ولذلك، الجينات التي تستهدف في mESCs تمكن الدراسات عكس الوراثية من خلال تطوير الفئران KO التأسيسية أو المشروط (باستخدام نظام / LoxP لجنة المساواة العرقية). ومع ذلك، فإن الطريقة الكلاسيكية لعزل خلايا فأر ES غير فعالة للغاية. وزادت العديد من التحسينات الرئيسية إلى حد كبير نسبة النجاح لاشتقاق خطوط مسك، بما في ذلك استخدام تعريف مصل استبدال (SR) المتوسطة 15، بالتناوب بين مسك المتوسط تحتوي ريال والجنين مصل بقري (FBS) 16، واستخدام الصيدلانيةمركبات منطقية مثل pluripotin أو 2I 17. Pluripotin، وهو جزيء اصطناعي صغير، يسمح لنشر mESCs في حالة غير متمايزة في غياب عامل اللوكيميا المثبطة (LIF) والخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) 18. وأخيرا، فقد تبين أن mESCs يمكن عزل بكفاءة عالية جدا (قريبة من 100٪) عندما يتم الجمع بين و/ FBS بروتوكول التناوب المتوسط ريال مع LIF وpluripotin 19 و 20. وتمكن هذه البروتوكولات العزلة كفاءة mESCs KO-RMCE متوافق التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم للدراسات هيكل الوظائف.
توضح هذه الورقة الطريقة التي تمكن واحد لتحديد المجالات الرئيسية أو المخلفات داخل البروتين المسؤولة عن العمليات الخلوية محددة. تحقيقا لهذه الغاية، وكان خط أنابيب من التقنيات المتطورة التي تمكن كفاءة العزل مسك، وتستهدف الجمعية ناقلات، واستهداف مسك خلقد. على هذا النحو، لوحات كبيرة مع الإسوية البروتين، والمسوخ نطاق والمؤثرات المصب يمكن إدخالها في mESCs KO ويمكن تقييمها لقدرتها على إنقاذ في المختبر KO النمط الظاهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الفئران وفقا للوائح الحيوان المؤسسية والوطنية والأوروبية.
1. عزل mESCs KO RMCE متوافق
- تتكاثر الفئران KO متخالف مع الفئران RMCE متوافق، مثل الفئران ROSALUC 10 أو ROSA26-IPSC الفئران 21. وقد حافظت كل من الفئران RMCE متوافق على مختلطة 129 / C57BL6 / الخلفية السويسرية.
ملاحظة: عبور مع الفئران KO متخالف ينصح للتغلب على الفتك الجنينية في الفئران KO متماثل. - استخدام PCR لتحديد الفئران KO متخالف التي تحتوي على كاسيت RMCE في موضع R26 12.
- تولد-RMCE متوافق، الفئران KO متخالف مع الفئران KO متخالف وعزل-RMCE متوافق، الكيسات الأريمية KO متماثل.
- إعداد التزاوج مرة في المساء والتحقق من الجماع المقابس في صباح اليوم التالي.
مصنوعة المقابس من إفرازات متخثر من التخثر وحويصلي الغدد من الذكور: ملاحظة.هذه المقابس ملء المهبل الأنثى وتستمر ل8-24 ساعة بعد التكاثر. وتعتبر الإناث توصيله إلى أنها تحمل 0.5 DPC (أيام تال للجماع) الأجنة.- للتحقق من المقابس، ورفع الأنثى من قاعدة الذيل لها ودراسة التي صدرت لها فتحة المهبل لكتلة بيضاء. نشر شفاه الفرج قليلا مع التحقيق الزاوية عندما قابس من الصعب أن نرى. الإناث توصيل منفصلة من الذكور بهم.
- جمع الكيسات الأريمية بنسبة 3.5 DPC.
- الموت ببطء الإناث الحوامل من طريقة وافق (على سبيل المثال، خلع عنق الرحم). جعل شق وسط السطح البطناني وتشريح الرحم وقناة البيض (لا تزال تعلق على بعضها البعض) باستخدام مقص غرامة وملقط.
- ثني إبرة عيار 26 إلى زاوية 45 درجة. نعلق حقنة 1 مل مليئة M2 المتوسطة لهذه الإبرة عازمة واستخدامها لمسح الكيسات الأريمية من الرحم إلى غطاء طبق 10 سم.
- ادخال الإبرة في نهاية الرحم الأقرب إلىقناة البيض. عقد الإبرة في مكان مع ملقط غرامة في حين دفع المكبس. تورم في الرحم يشير إلى وجود احمرار ناجحة.
- استخدام ماصة الفم (التي يبلغ قطرها 100-200 ميكرون) لجمع كل الأجنة وغسلها مرتين في قطرة من متوسطة M2 الطازجة. فورا بعد غسلها، ونقل الكيسات الأريمية إلى لوحات ثقافة (انظر أدناه).
ملاحظة: تشريح والتعامل مع الكيسات الأريمية من ينبغي أن يتم في تدفق الهواء الصفحي.
- إعداد التزاوج مرة في المساء والتحقق من الجماع المقابس في صباح اليوم التالي.
- عزل mESCs RMCE متوافق مع KO
- إعداد لوحة 12-جيدا مع MEFS DR4 تعامل ميتوميسين-C (انظر جدول المواد) قبل يوم واحد من العزلة الكيسة.
ملاحظة: تم عزل هذه MEFS من الفئران تيراغرام (DR4) 1Jae / J التي تحتوي على أربع جينات اختيار المخدرات وتمنح مقاومة النيوميسين، بوروميسين، هيغروميسين، و 6 ثيوغوانين 22.- معطف جميع لوحات الثقافة بنسبة 0.1٪ الجيلاتين. إضافة الجيلاتين 0.1٪لوحات والثقافة، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، ونضح حل الجيلاتين. البذور ربع قنينة من P2 MEFS في لوحة 12-جيدا وزراعتها في 2 مل من المتوسط MEF (انظر الجدول رقم 1، جدول المواد) إلى أحادي الطبقة متموجة 19.
- تعطيل لهم ميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) لمدة 3 ساعات وغسلها مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 19.
- باستخدام ماصة الفم، لوحة من الكيسات الأريمية على مهيلم لوحات 12-جيدا (1 جيدا / جنين)، مع MEFS تعامل ميتوميسين-C-في SR-ES المتوسطة الخلية (2 مل / جيد) تستكمل مع إما 2 ميكرومتر pluripotin أو مع 2I (1 ميكرومتر PD0325901 إرك المانع و 3 ميكرومتر Gsk3 المانع CHIR99021). احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- تحديث المتوسطة خلية SR-ES (تستكمل مع pluripotin أو 2I) كل 2-3 أيام.
- دراسة كل الكيسة تحت stereomicroنطاق في 4.0X التكبير والتحقق من الفقس والتعلق طبقة MEF.
ملاحظة: عندما الكيسات الأريمية يفقس، فإنها تفقد المنطقة الشفافة التي بتغليف لهم. تحتاج إلى تحديث باستخدام pipetting لالفم الآبار مع الكيسات الأريمية غير مرتبط. - اختيار الامتداد ICM الفردية (باستخدام مجهر تشريحي) بعد 10-12 يوما من الثقافة باستخدام ماصة P10 مع نصائح التخلص منها. نقل ثمرة في ما يقرب من 10 ميكرولتر من متوسطة إلى ذلك، لوحة 96-جيدا على شكل V تحتوي على 30 ميكرولتر / بئر PBS (في درجة حرارة الغرفة).
- إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- إضافة 100 ميكرولتر من FBS التي تحتوي على مسك المتوسطة. فصل في الامتداد ICM إلى الخلايا واحد من قبل pipetting 10-15 مرات؛ ونقل الخلايا نأت إلى ميتوميسين-C-المعالجة، 96-جيدا لوحات MEF التي تم إعدادها قبل يوم واحد يتم اختيار المستعمرات ICM.
- من هذه الخطوة فصاعدا، أومي ر pluripotin أو 2I من المتوسط مسك. في اليوم التالي، وتغيير المتوسطة من FBS- والمتوسطة مسك تحتوي ريال (100 ميكرولتر / جيد).
- توسيع خطوط مسك أنشئت من 96- إلى 24 جيدا شكل 19.
- غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، إضافة 50 ميكرولتر من التربسين، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة مسك أساس FBS.. فصل من قبل pipetting 10-15 مرات باستخدام ماصة الأقنية. ونقل الخلايا نأت إلى ميتوميسين-C-المعالجة، 24-جيدا لوحات MEF.
- تغيير والمتوسطة القائمة على SR-في اليوم التالي. توسيع mESCs بطريقة مماثلة من 24- إلى تنسيق 6 جيدا. جعل 3-4 برودة شديدة من متكدسة 6 جيدا لوحة 19.
- تحديد-RMCE متوافق، mESCs KO متماثل باستخدام بادئات PCR للمكان R26 23 و KO أليل الاختيار (في هذه الحالة، p120ctn، تقارير إتمام المشروعات لp120ctn لاغية ووصفت الأليلات floxed قبلمعشوقة = "XREF"> 12).
- إعداد لوحة 12-جيدا مع MEFS DR4 تعامل ميتوميسين-C (انظر جدول المواد) قبل يوم واحد من العزلة الكيسة.
الجدول 1. وسائل الإعلام الثقافة. تم تخزين جميع وسائل الإعلام في 4 درجات مئوية ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
2. الجيل من ناقلات استهداف-RMCE متوافق عن طريق إعادة التركيب الاستنساخ
- استنساخ الإنقاذ يبني في ناقلات إعادة التركيب متوافق باستخدام انزيم التقييد (RE) القائم أو 24 تقنيات الاستنساخ PCR القائم. تأكد من أن cDNAs تحتوي على رامزة توقف.
- تصميم AttB الموسومة الاشعال 24. تأكد من أن التمهيدي إلى الأمام يحتوي على العناصر التالية: امتداد GGGG، وهو موقع AttB1، والربط، وهو تسلسل كوزاك، وحوالي 25 النيوكليوتيدات من [كدنا الإنقاذ (بدءا ATG به). تأكد من أن التمهيدي العكسي لديه تركيبة مشابهة: امتداد GGGG، وهو موقع AttB2، والربط، وحوالي 25 مجلس التوحيد الوطنىleotides من [كدنا الإنقاذ (تكملة العكسي).
- تضخيم [كدنا الإنقاذ عبر PCR للحصول كدنا] يحيط AttB.
- إجراء رد فعل 10 ميكرولتر BP مع 100 نانوغرام من [كدنا يحيط AttB-و 150 نانوغرام من ناقلات المانحين إعادة التركيب متوافق، والذي يحتوي على الجينات كانامايسين المقاومة.
- تحويل 5 ميكرولتر من خليط من BP في الحرارة صدمة المختصة MC1061 الإشريكية القولونية (إي كولاي) البكتيريا (مماثلة لتلك التي وصفها في الخطوة 2.3).
- تحديد المستعمرات التي تحتوي على إنقاذ الناقلة التي تحتوي على [كدنا الصحيحة (على غرار تلك التي وصفها في الخطوة 2.4)
- إجراء 10 ميكرولتر LR رد فعل باستخدام 100 نانوغرام من إنقاذ ناقلات التي تحتوي على كدنا]. 150 نانوغرام من رفعه لجنة المساواة العرقية ناقلات pRMCE-DV1 11 (LMBP 8195)؛ و2 ميكرولتر من مزيج recombinase، والذي يحتوي على إنزيم مدمج ترميز فج وexcisionase والبكتيريا عاملا المضيف تكامل. احتضان لمدة 2 ساعة عند 25 ° C.
ملاحظة: رد فعل LR هو إعادة التركيب يتفاعلأيون التي يتم فيها معاد استنساخ دخول تحتوي على مواقع attL وناقلات جهة التي تحتوي على مواقع ATTR من مزيج انزيم clonase LR. وهذا يؤدي إلى استنساخ التعبير التي تحتوي على مواقع attB المرافقة الجينات في المصالح. - تحويل 5 ميكرولتر من خليط LR في MC1061 E. البكتيريا القولونية الحرارة صدمة المختصة.
- إضافة 5 ميكرولتر من خليط LR لمضلع، متجنب، أنبوب 2 مل المسمار الحد الأقصى مع 40 ميكرولتر من البكتيريا القولونية E. الحرارة صدمة المختصة واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 1 مل من مرق لوريا (LB) المتوسطة واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. لوحة 50 ميكرولتر على الأمبيسلين (الأمبير؛ 100 ميكروغرام / مل) التي تحتوي لوحات أجار وتنمو بين عشية وضحاها في 37 ° C.
- تحديد المستعمرات مع ناقلات استهداف الصحيح.
- اختيار 5 المستعمرات بشكل عشوائي باستخدام طرف P200. نقل معلومات سرية إلى أنبوب اختبار يحتوي على الزجاج 2-5 مل من LB المتوسطة وتنمو بين عشية وضحاها في 37 ° C.
- السابقالمسالك الحمض النووي البلازميد من الثقافات البكتيرية باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا.
- تحقق لهم باستخدام هضم RE والتسلسل. قطع 0،5-2 ميكروغرام البلازميد باستخدام 0.2 ميكرولتر من RE (20 U / ميكرولتر) و 1 ميكرولتر من العازلة 10X المقابلة في رد فعل 10 ميكرولتر. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية ومنفصلة على agarose هلام 1٪. حدد للالمستعمرات مع النمط المتوقع لشظايا الحمض النووي.
- تحليل المتجهات وأكد (50 نانوغرام / ميكرولتر) مع Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) وIRES R (GGG GCG غا TTC GAT ATC AAG) الاشعال (5 بمول / ميكرولتر) باستخدام سانجر التسلسل.
3. مسك بوساطة RMCE استهداف الإنقاذ بنيات إلى R26 الحالة رقم
- بدء ثقافة mESCs KO-RMCE متوافق والمرور لهم على الأقل مرتين في MEFS في المتوسط مسك أساس FBS. تقسيم mESCs على مهيلم لوحة 6 جيدا.
- في اليوم التالي، وتجديد الخلايا، في حوالي 50٪ confluency، مع 1.5مل من المتوسط مسك أساس FBS وtransfect في mESCs مع رفعه لجنة المساواة العرقية pRMCE-DV1 استهداف ناقلات تحتوي على كدنا] الإنقاذ.
- جعل مزيج DNA. إضافة 1 ميكروغرام من استهداف ناقلات و 1 ميكروغرام من FLPe التعبير عن البلازميد 25-250 ميكرولتر من المتوسطة DMEM النقي.
- جعل مزيج lipofection. إضافة 7 ميكرولتر من القائم lipofection ترنسفكأيشن الكاشف (على سبيل المثال، Lipofectamine 2000) إلى 250 ميكرولتر من المتوسط DMEM نقية واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
تم الحصول على RMCE مماثلة تستهدف الكفاءات باستخدام الكواشف القائم على lipofection أخرى (على سبيل المثال، Lipofectamine LTX وEffectene): ملاحظة. - خلط مزيج DNA مع مزيج lipofection واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. ماصة الخليط ترنسفكأيشن على mESCs منتعشة. دوامة بلطف وترك بين عشية وضحاها.
- بعد يوم واحد ترنسفكأيشن، وتقسيم كل mESCs من لوحة 6 جيدا على طبق ثقافة 10 سم، وبها طبقة متموجة من MEFS DR4 وم المستندة إلى FBS 10 مل منESC المتوسطة.
- بعد يومين من ترنسفكأيشن، حدد استنساخ مسك مع الصحيح الصرف كاسيت بوساطة FLPe بإضافة 0.2 ملغ / مل G418 (100X) إلى المتوسطة.
ملاحظة: تأكد منحنى القتل لكل دفعة من G418 لتحديد أقل تركيز من G418 أن يقتل كل mESCs. - تحديث mESCs يوميا مع المحتوية على G418 مسك المتوسطة. يجب أن تظهر المستعمرات بعد 7-10 أيام، بحيث تنتقي وتوسيع هذه كما في الخطوة 1.4.
- تأكيد استنساخ الصحيحة عن طريق PCR 11.
4. تمايز mESCs في الهيئات مضغي (EBS)
- بدء ثقافة mESCs KO مع ثوابت الإنقاذ مدفوعة R26-والمرور لهم على الأقل مرتين في MEFS في المتوسط مسك أساس FBS. تمرير mESCs مرة واحدة على مهيلم 6 لوحات جيدا للتخلص من MEFS.
- يغسل مع برنامج تلفزيوني ويعرض للتريبسين الثقافات مسك ما يقرب من متموجة. نأت لوحة mESCs في التخفيفات مختلفة (1/20 و 1/40) على غير ملتصقة، والحيوانات الأليفة البكتيرية الصفأطباق ري في متوسطة التمايز.
- السماح EBS لتشكيل في هذه الأطباق لمدة 30 يوما. تحديث المتوسطة كل 2-3 أيام باستخدام الإجراء التالي: نقل تعليق EB إلى أنبوب 50 مل، والسماح للEBS تسوية عن طريق الجاذبية، وإزالة طاف، إضافة متوسطة جديدة، ونقل تعليق EB مرة أخرى إلى الصف البكتيرية طبق.
- تحليل mESCs المستهدفة وEBS المناعي والإلكترون انتقال المجهر باستخدام البروتوكولات التي تم وصفها سابقا 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصفت الإجراء لعزل خطوط KO مسك-RMCE متوافقة في الشكل 2. مطلوبة اثنين من قطعان متتالية للحصول على الكيسات الأريمية KO-RMCE متوافق. أولا، وعبرت الفئران KO متخالف مع الفئران RMCE متوافق للحصول على-RMCE متوافق، الفئران KO متخالف. ثم يتم استخدام هذه الفئران لالتزاوج في الوقت المناسب مع الفئران KO متخالف أخرى للحصول على 3.5 DPC، RMCE متوافق، الكيسات الأريمية KO متماثل. فرصة الحصول على مثل هذا الجنين هو واحد في ثمانية، كما تنبأ به وراثة مندلية. ولذلك، مطلوب بروتوكول العزلة مسك كفاءة. باستخدام البروتوكولات القائمة على pluripotin أو القائم على 2I، ونحن قادرون على عزل خطوط mESCs، بما في ذلك RMCE متوافق p120ctn mESCs KO، مع كفاءة حوالي 94٪ (ن = 114 الكيسات الأريمية) و 64٪ (ن = 22 الكيسات الأريمية)، على التوالي 12، 19. عادة، الكيسات الأريمية يفقس بعد فترة تتراوح بين 3 و 6 أيام في في السادسترو (DIV) الثقافة؛ ويلي ذلك المرفق من الامتداد ICM لMEFS أو أطباق الجيلاتين المغلفة. في يوم 12، وتشكل الامتداد ICM الكبيرة التي تعطي بإخلاص إلى ظهور خطوط مسك (الشكل 2). ونتيجة لهذا الإجراء مسك العزلة كفاءة عالية، فمن الممكن الحصول على mESCs KO-RMCE متوافق من واحد أو اثنين من الإناث توصيله.
الشكل 2. عزل mESCs KO-RMCE متوافق. (A) استراتيجية تربية للحصول على متماثل،-RMCE متوافق mESCs KO. (B) نظام الداخلي مسك العزلة pluripotin- أو القائم على 2I. شريط النطاق الأبيض: 25 ميكرون. الحانات على نطاق والأسود: 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
لتعيين المجالات أو صباحاإينو الأحماض ضمن البروتين التي تعتبر مهمة لوظائف الخلوية محددة، يمكن للمرء الآن إعادة تقديم، عبر RMCE، بالطول أو يبني متحولة في mESCs KO واختبارها لقدرتها على العودة إلى النمط الظاهري KO. استهداف ناقلات بالنسبة للكثيرين المسوخ نطاق والمسوخ نقطة مختلفة يمكن أن تتولد بكفاءة عن طريق الاستنساخ recombinational (الشكل 3A). ويستند استنساخ Recombinational على الاعتراف تسلسل الحمض النووي محددة المرفق (تى تى) من خلال مزيج recombinase، التي تتوسط تبادل شظايا الحمض النووي يحيط المتفرجين بين البلازميدات مختلفة. النظام استنساخ recombinational يختار معاد ناقلات فقط بشكل صحيح عن طريق التبديل بين ناقلات التي تحتوي على الجينات المضادات الحيوية المقاومة المختلفة وعن طريق إدراج علامة مكافحة اختيار و"السيطرة على موت الخلايا B" (ccdB) الجينات، في ناقلات الوجهة (الشكل 3A) . لقد ولدت أكثر من 25 لجنة المساواة العرقية رفعه pRMCE-DV1 استهداف ناقلات مع قرب كفاءة 100٪ (بعض الأمثلة لإعادة هو مبين في الجدول رقم 2).
الجدول 2. نظرة عامة على استهداف الجمعية المتجهات وبوساطة RMCE-مسك استهداف.
يمكن بسهولة ثوابت الإنقاذ المختلفة جزءا لا يتجزأ من على بعد رفعه لجنة المساواة العرقية pRMCE-DV1 استهداف ناقلات أن تستهدف mESCs KO باستخدام RMCE (الشكل 3B). ذكرنا سابقا على توليد 133 استنساخ مسك المستهدفة لمدة 19 ثوابت الإنقاذ المختلفة التي تم إدخالها في موضع R26 من p120ctn mESCs KO عبر RMCE بمتوسط كفاءة 93٪ 12. هنا، نحن تقريرا عن استهداف البنى إضافية مع كفاءات عالية مماثلة، بما في ذلك، CAAX الموسومة p120ctn 1A، الظهارية-لالوسيطة الانتقالية (EMT) محرضات للأسرة SNAI وZEB، وN-كادهيرين، في p120ctn mESCs KO ( الجدول 2 ).
الشكل 3. RMCE القائم على استهداف في mESCs KO. (A) التجمع بوساطة Recombinase ناقلات استهداف RMCE متوافق. (B) استهداف البنى الإنقاذ المفترضة إلى مكان R26 من mESCs KO متماثل عبر RMCE. المصادقة على أساس PCR (C) من الحيوانات المستنسخة مسك المستهدفة RMCE. تم استخراج DNA من الحيوانات المستنسخة مسك المستهدفة RMCE وتضخيمها من قبل PCR باستخدام التمهيدي إلى الأمام مضمن في موضع R26 الذاتية والتمهيدي العكسي الذي يقع في وارد بناء pRMCE-DV1. ويلاحظ وجود الفرقة 560-BP لاستنساخ استهدفت بشكل صحيح. وتظهر الحيوانات المستنسخة غير مؤكدة باللون الأحمر. M1: 1 كيلوبايت DNA سلم. M2: 1 كيلوبايت زائد DNA سلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ن الصفحات = "1"> وبمجرد الحصول على لوحة من mESCs الإنقاذ، فإنه يحتاج إلى فحص لقدرته على عكس النمط الظاهري الناجم KO. وقد تبين مؤخرا أن p120ctn تفشل mESCs KO على التمايز إلى EBS الكيسي نتيجة لخلل الأديم الباطن الاستقطاب 12. التليف EB التشكل ويمكن استخدام قراءات المظهرية لفحص التركيبات إنقاذ مختلفة (الشكل 4A). وكدليل على المفهوم، وأظهرت لنا أن يحركها R26-p120ctn شكل الإسوي 1A (R_p120_1A) يمكن انقاذ p120ctn KO النمط الظاهري (الشكل 4B، 4C) 12. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التي تم تحديدها الشاشة كادهيرين E، ولكن ليس RhoA، هو شريك حاسم من p120ctn خلال مواصفات الأديم الباطن (الشكل 4B و C) 12. سهولة إدخال الإنقاذ يبني لp120ctn KO mESCs يسمح لنا لاختبار فرضيات إضافية. أولا، E-كادهيرين مستقلة غشاء رسو p120ctn تمكين تشكيل EB الكيسي؟ لاختبارهذا، ونحن تنصهر في K-رأس تستهدف غشاء عزر (CAAX) إلى محطة كربوكسي من p120ctn، عرضه عبر RMCE إلى p120ctn mESCs KO، وجعل EBS منها. ومع ذلك، ويقدم بناء سلبي المهيمنة التي لا تسمح ملزمة واستقرار E-كادهيرين (الشكل 4D)، ونتيجة لذلك، لا إنقاذ p120ctn KO النمط الظاهري (الشكل 4C). الثانية، هي محرضات من EMT المعنية؟ EMT هو العملية التنموية الأساسية التي يحدث أيضا أثناء مسك التمايز ومدبرة من قبل الأسرة SNAI وZEB من عوامل النسخ، التي تقمع مباشرة الجينات المختلفة علامة الظهارية مثل E-كادهيرين 26 و 27. وتماشيا مع هذه النتائج، تم العثور على التعبير عن EMT محفز ZEB2 في EBS السيطرة، ولكن ليس في EBS-p120ctn فارغة (الشكل 4E). ومع ذلك، فشل mESCs p120ctn KO مع التعبير استنادا ROSA26 من EMT محرضات ZEB1، ZEB2، أو الحلزون لاستعادة الكيستشكيل جيم EB (الشكل 4C). ثالثا، يمكن cadherins الكلاسيكية الأخرى، مثل N-كادهيرين، محل ظيفيا كادهيرين E خلال مواصفات الأديم الباطن؟ ولمعالجة ذلك، تم إنشاء خطوط الإنقاذ N-كادهيرين. سابقا، فقد تبين أن التعبير خارج الرحم من E-كادهيرين في p120ctn KO EBS انقاذ جزئيا تشكيل EBS الكيسي 12. ومن المثير للاهتمام، في الإعداد مماثلة، أجبر فشل التعبير N-كادهيرين لإنقاذ (الشكل 4C و F)، مشيرا إلى أن E-كادهيرين هو نوع فرعي كادهيرين كبير اللازمة لEB التصاق ولا يمكن الاستعاضة عن N-كادهيرين. هذه الأمثلة المذكورة أعلاه تسليط الضوء على السهولة التي يمكن معالجتها الأسئلة البيولوجية من قبل النظام.
الشكل 4. المظهري فحص mESCs الإنقاذ التي تستهدف RMCE. (A) تشكيل EBS الكيسي (التي استولت عليها المجهر الضوئي، أعلى جزءتم استخدام لوحات أسفل)، وقراءات المظهرية لاختبار قدرة mESCs تستهدف إنقاذ p120ctn KO النمط الظاهري؛ ليرة سورية) والاستقطاب الصحيح الأديم الباطن في EBS (التي استولت عليها المجهر الإلكتروني النافذ. شريط النطاق الأبيض: 25 ميكرون. شريط مقياس أسود: 200 ميكرون. (B) نظرة عامة حول ثوابت الإنقاذ p120ctn. يحتوي p120ctn مجال أرماديلو المركزي، تتألف من تسعة يكرر أرماديلو (مربعات زرقاء)، التي يحيط بها مجال N-محطة (NTD) ونطاق C-محطة (CTD). الإسوية p120ctn تحتوي على واحد من أصل أربعة الكودونات بداية البديلة (الأسهم)، وربما ميزة تسلسل المشفرة بواسطة الإكسونات تستخدم بدلا من ذلك A و C (مربعات سوداء)، وتضمين أو استبعاد اثنين من المجالات رو GTPase ملزمة (RBDs). p120ctn الإسوية 1A و4A استخدام الأول والرابع موقع الترجمة الشروع، على التوالي. ويبين موقف الطفرات من AA المهم وإضافة الاصطناعية لاستهداف غشاء عزر (CAAX). EBD: E-كادهيرين نطاق ملزم. (C) رسم بيانيتصور نسبة التشكل EB الأساسي أو الكيسي في p120ctn خلايا KO التي تعبر عن مختلف بنيات الإنقاذ مدفوعة R26. (D) تلطيخ المناعي للp120ctn (الماوس وحيدة النسيلة المضادة للp120ctn) وE-كادهيرين (وحيدة النسيلة الماوس مكافحة E-كادهيرين) على mESCs G4 التحكم أو على p120ctn mESCs KO مع التعبير مدفوعة R26 من CAAX الموسومة p120ctn شكل الإسوي 1A. تظهر إدراجات مستعمرة مسك بأكملها. مقياس شريط: 10 ميكرومتر. (E) المناعية للZEB2 (الماوس وحيدة النسيلة المضادة للZEB2، 7F7، صنع في المنزل) على floxed (السيطرة) وp120ctn KO EBS. ويرد التكبير 3.5 أضعاف في لوحات أسفل. مقياس شريط: 200 ميكرون (أعلى)، و 100 ميكرون (القاع). (F) نقل الإلكترون المجهري من DIV12 EBS من p120ctn خلايا KO معربا عن E- أو N-كادهيرين من المروج R26. مقياس شريط: 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ثيالصورة الرقم.
وفي الختام، ونحن التقرير على خط أنابيب من التقنيات القوية التي تجمع بين كفاءة شبه 100٪ في مسك العزلة مع استهداف التجمع النواقل ومسك الاستهداف. هذا الخط تمكننا من كشف براعة البروتينات عن طريق الدراسات هيكل الوظائف في mESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدينا طريقة مسك العزلة هو سهل الاستعمال ولا يتطلب مهارات متقدمة أو المعدات، مثل المجهرية من الكيسات الأريمية. وهكذا، وهذه التكنولوجيا يمكن الوصول إلى نسبة كبيرة من المجتمع العلمي. يمكن لأي شخص من ذوي الخبرة الأساسية ثقافة الخلية نشر الامتداد ICM وإنشاء خطوط mESCs. ومع ذلك، فإن التنظيف والتعامل مع الكيسات الأريمية يتطلب بعض الممارسة. يتم استخدام ماصة الفم لنقل الكيسات الأريمية ويتكون من micropipette، حامل micropipette، وأنابيب، والناطقة باسم الشافطة 28. بال micropipettes يمكن حسب الطلب عن طريق تسخين الجزء خيرة من ماصة باستور لبضع ثوان، وإزالة ماصة من اللهب، وسحب كلا الطرفين. اختر الإبر التي يبلغ قطرها أكبر قليلا من الكيسة الأريمية (100-200 ميكرون). يمكن إعادة استخدامها الإبر بعد غسلها بالماء المقطر (3X) وETOH (3X). في تجربتنا، وكفاءة القائم على pluripotin مسك العزلة هو أعلى مقارنة مع 2البروتوكولات 12 ط المستندة. ومع ذلك، فقد أظهرت استخدام pluripotin في تركيزات عالية للحث على عدم الاستقرار الجيني 19.
استنادا RMCE-R26-الاستهداف في mESCs عادة ينتج 20-40 مستعمرات بعد اختيار G418. إذا لوحظ المزيد من المستعمرات، وهذا يعني أن تركيز G418 ليس الأمثل، ويسمح mESCs غير المستهدفة من أجل البقاء، مما يؤثر على كفاءة الاستهداف الشاملة. لذلك، ينصح أن لكل خط مسك ولكل دفعة G418 جديدة، يتم إجراء منحنى القتل لتحديد أقل تركيز G418 أن يقتل كل mESCs غير المستهدفة. إذا لم يلاحظ أي المستعمرات، وهذا يدل على وترنسفكأيشن فعالة. في هذه الحالة، فإنه من المفيد لتحسين إجراءات ترنسفكأيشن باستخدام البلازميدات مراسل التي تسمح التعبير عن EGFP أو LacZ. إذا كان يعمل بروتوكول ترنسفكأيشن ولكن لا يزال لم يلاحظ أي المستعمرات، والتحقق من ناقلات pRMCE-DV1 رفعه-لجنة المساواة العرقية RMCE متوافق مع ووFLPe هالبلازميد xpression مع RE هضم والتسلسل. فإنه من المستحسن أن يجعل دفعة كبيرة من mESCs الوالدين وناقلات FLPe وتجميد عدة aliquots من بينها للحد من التباين بين التجارب.
عيب واحد من هذه الاستراتيجية هيكل الوظائف هو أن يبني الانقاذ ليست أعرب عن موضع الذاتية، بل من داخل مكان ROSA26، مع كل مكان، والمروج النشط باعتدال. بالمقارنة مع التكنولوجيات الأخرى، حيث غالبا ما ينظر إلى مستويات overexpression supraphysiological، وهذا النظام يمكن التعبير التحوير الفسيولوجية، وهو مستقر في المختبر خلال التجارب التمايز وفي مختلف الأنساب الخلية. ولوحظ أن متغايرة، بوساطة ROSA26 على النتائج التعبير التحوير في تعبير البروتين p120ctn أن كان ما يقرب من نصف مستويات p120ctn الذاتية من mESCs السيطرة wildtype لكن ذلك كان كافيا لانقاذ p120ctn احظ KO الظواهر 12. وبالمثل، تم إلغاء ذلكmonstrated سبق أن متغايرة، بوساطة ROSA26-Zeb2 مستوى التعبير التحوير كافية لإنقاذ الظواهر خروج المغلوب Zeb2 لوحظ في المختبر والمجراة في مختلف الأنساب خلية 29. مأزق محتمل آخر هو حقيقة أن الجينات التي لا غنى عنها لمسك التجديد الذاتي ليست قابلة لمثل هذه الدراسات هيكل الوظائف. استبعاد هذا، وينصح لتوصيف المنشأة حديثا mESCs KO للمعايير التالية: انتشار، مورفولوجيا مستعمرة، والتعبير عن الجينات stemness. ويوصى أيضا للتحقق من التعبير عن الجينات في المصالح، سواء في mESCs وفي الخلايا التي ارتكبت النسب.
بالإضافة إلى إجراء الدراسات هيكل الوظائف في mESCs KO التأسيسي، يمكن للمرء أيضا اتخاذ نهج مشروط باستخدام نظام لجنة المساواة العرقية / loxP. يسمح هذا النهج الأخير على KO-نسب محددة دون التأثير على الخلايا المحيطة والداعمة. وبالإضافة إلى ذلك، mESCs KO مشروط ألوث لأداء الدراسات هيكل وظيفة إذا كان هناك النمط الظاهري في mESCs KO التأسيسي. لتوليد-RMCE متوافق، مشروط-KO mESCs، هي ولدت الفئران floxed متماثل مع سائق لجنة المساواة العرقية خلية من نوع معين مع الفئران RMCE متوافق. يتم عزل مسك من ذريتها. وميزة هذا النظام هو أن لا يتم التعبير عن recombinase لجنة المساواة العرقية في mESCs وإلا تصبح نشطة عندما يتم التمييز في mESCs في نسب خلية منها. في، mESCs-RMCE متوافق مشروط-KO، فإن لجنة المساواة العرقية إعادة التركيب تحفز تعطيل في وقت واحد من الجينات الذاتية والتعبير مدفوعة R26 للبناء الانقاذ باستخدام ناقلات مشروط pRMCE-DV1 تستهدف (LMBP 08870) 11.
وبالإضافة إلى ذلك، يسمح النظام هيكل وظيفة لدراسة الطفرات التي تم العثور عليها في الأمراض التي تصيب البشر وتمكننا من اختبار تأثير هذه الطفرات في وظائف البروتين. وكمثال على ذلك، حددنا ZEB2 mutatالأيونات في المرضى الذين يعانون من مرض تكاثر نقوي، أدلى ناقلات تستهدف تحتوي على هذه المسوخ ZEB2، تنقل منها إلى R26-موضع mESCs Zeb2 KO عبر RMCE، ودراسة تأثير الطفرات على استقرار البروتين نفسه 30. هذه التكنولوجيا يعطي فهم أكبر للالكيمياء الحيوية لهذه المسوخ في mESCs، وكذلك في أي نسب معينة، منذ mESCs والمحفزة.
وفي الختام، يعتمد هذا النهج هيكل الوظائف على أساس مسك على العزلة مسك كفاءة وتقنية الاستهداف ويسمح لتحديد المجالات وظائف بروتين معين مهمة في سياق البيولوجي محددة. بواسطة الفئران تقاسم (الحيوانات المنوية المجمدة متاحة عند الطلب) والبلازميدات (وزعت من BCCM / LMBP وAddgene)، ونحن نريد لفتح هذه التكنولوجيا للمجتمع العلمي بأسره.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر Jinke وD'هونت، فريدريك فان Rockeghem، ناتالي Farla، كيلي ليمير، وRIET دي Rycke حصول على الدعم الفني الممتاز. كما نشكر EEF Parthoens، Evelien فان HAMME، وأماندا جونكالفيس من مرفق Bioimaging الأساسية لمركز أبحاث التهاب للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. ونحن نعترف أعضاء مجموعتنا البحثية لإجراء مناقشات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل سياسة البلجيكي العلوم (Belspo بين الجامعات الجذب البولنديين - جائزة IAP VII-07 DevRepair، https://devrepair.be)، من قبل مؤسسة الملكة إليزابيث الطبي، بلجيكا (GSKE 2008-2010، HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية .fmre-gske.be)، ومن قبل تطبيقات البحوث المنسقة (GOA 01G01908) من جامعة غنت، بلجيكا (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG هو زميل ما بعد الدكتوراه من صناديق البحوث فلاندرز (FWO-V).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ROSALUC Mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| R26-iPSC mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| Vessel probe | Fine Science Tools | 10160-13 | to check for copulation plugs |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | make aliquots and store at -20 °C |
| Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) | Fine Science Tools | 11251-10 | spray with 70% EtOH before use (do not autoclave) |
| 23 G needles | Fine-ject | 8697 | |
| 1-mL syringes | Soft-ject | 6680 | |
| 60-mm bacterial grade plates (for flushing) | Gosselin | BB60-01 | |
| Mouth pipette | made in house | see discussion | |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) | ATTC | SCRC-1045 | |
| TgN (DR4)1 Jae mice | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M0503 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 14190-094 | |
| Tg(DR4)1Jae/J mice | JAX | 3208 | mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine |
| 0.1% Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C. |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200-056 | |
| 2 μM pluripotin | Cayman Chemical | 10009557 | |
| pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08870 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| cre-excised pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08195 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA | Addgene | 20733 | |
| heat-shock competent DH5α bacteria | made in house | ||
| Gateway pDONR221 vector | Thermo Fisher | 12536-017 | contains kanamycin-resistance gene |
| BP clonase II mix | Thermo Fisher | 11789-020 | |
| LR clonase II mix | Thermo Fisher | 11791-020 | |
| Luria Broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer | Thermo Fisher | 3730XL | |
| G418 | Thermo Fisher | 11811-023 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Lipofectamine LTX transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GATEWAY pENTR 1A vector | Thermo Fisher | A10462 | recombination-compatible vector |
| mouse monoclonal anti-p120ctn antibody | BD Transduction Laboratories | 610134 | |
| mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610181 | |
| General equipment | |||
| Sterile dissection tools | fine scissors and forceps for dissecting the uterus | ||
| Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL | |||
| 15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes | |||
| 96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) | |||
| Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells | |||
| Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) | |||
| Sterile multichannel reservoirs | |||
| Access to a laminar air flow | |||
| Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2 | |||
| Access to an inverted microscope | |||
| Access to a bench-top centrifuge | |||
| Access to a stereo microscope with transmitted-light | |||
| Culture media | |||
| MEF Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 41965-062 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-7524 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium pyruvate (0.4 mM) | Gibco | 11360-039 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| SR-based mESC medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | mixed in a 1:1 ratio |
| 15% knock-out serum replacement (SR) | Gibco | 10828–028 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| 0.1 mM non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| β-mercaptoethanol (0.1 mM) | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| 2,000 U/mL recombinant mouse LIF | (IRC/VIB Protein Service facility) | ||
| FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| Differention Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| 5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid | Gibco | 11279-023 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| 0.4 mM 1-thioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| 50 μg/mL ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A-4544 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| 2i | |||
| 1 μM Erk inhibitor PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | |
| 3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 |
References
- Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
- Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
- Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
- Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
- Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
- Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
- Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
- Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
- Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
- Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
- Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
- Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2016).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third edn (2003).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
- Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. , (2016).
