Summary
Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.
Abstract
Genmanipulatie in muizenembryo's of embryonale stamcellen (mESCs) maakt voor de studie van de functie van een bepaald eiwit. Eiwitten zijn de werkpaarden van de cel en vaak uit meerdere functionele domeinen, die kan worden beïnvloed door posttranslationele modificaties. De uitputting van het gehele eiwit in conditionele of constitutief knock-out (KO) muizen geen rekening houden met deze functionele diversiteit en regelgeving. Een mES lijn en een afgeleide muismodel, waarbij een docking site voor FLPe-recombinatie gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) binnen de ROSA26 (R26) locus was ingebracht, werd eerder beschreven. Hier doen we verslag van een structuur-functie benadering die het mogelijk maakt voor de moleculaire dissectie van de verschillende functionaliteiten van een multidomein eiwit. Daartoe moet RMCE compatibele muizen worden gekruist met KO muizen en RMCE-compatibele KO mESCs moeten worden geïsoleerd. Vervolgens kan een panel van vermeende redding constructen worden geïntroduceerd in de R26 locus via RMCE targeting. De kandidaat rescue cDNAs kunnen gemakkelijk ingebracht tussen RMCE plaatsen van de richtende vector door middel van recombinatie klonering. Vervolgens worden KO mESCs getransfecteerd met het richtende vector in combinatie met een FLPe recombinase expressieplasmide. RMCE reactiveert het promoter-loze neomycine-resistentiegen in het ROSA26 aanlegplaatsen en maakt de keuze van de juiste targeting. Daardoor worden hoge targeting efficiëntie bijna 100% verkregen, waardoor het inbrengen van meerdere mogelijke redding constructen in een semi-high throughput manier. Tenslotte kan een veelvoud van R26-aangedreven rescue constructen worden getest op hun vermogen om het fenotype dat waargenomen ouderlijke KO mESCs redden. We presenteren een proof-of-principle structuur-functie studie p120 catenine (p120ctn) KO mESCs behulp endoderm differentiatie embryo lichamen (EB's) als fenotypische uitlezing. Deze benadering maakt de identificatie van belangrijke domeinen vermoedelijke stroomafwaartse routes en ziekte-relevante gegevensmutaties die KO fenotypes voor een bepaald eiwit ten grondslag liggen.
Introduction
Geschat wordt dat zoogdieren genomen bevatten ongeveer 20.000 eiwitcoderende genen. Alternatief splitsen en posttranslationele modificaties verder te verhogen het eiwit repertoire. Eiwitten een modulaire constructie 1 en bevatten vaak meerdere interactie-domeinen, waardoor hun rekrutering in verschillende eiwitcomplexen en hun deelname aan verschillende celprocessen 2 mogelijk. Een voorbeeld is de multifunctionele eiwit genaamd p120ctn. p120ctn wordt gecodeerd door het gen Ctnnd1 en bestaat uit een groot centraal armadillo herhalende domein geflankeerd door een N-terminale en C-terminale gebied. De armadillo domein van p120ctn bindt aan een sterk geconserveerd juxtamembraandomein klassieke cadherinen, die betrokken zijn bij cel-cel adhesie, maar bindt ook aan de transcriptionele repressor Kaiso. Het N-terminale domein van p120ctn interageert met andere kinasen, fosfatasen, kleine RhoGTPases en microtubule geassocieerde pProteins 3. Interessant is dat als gevolg van alternatieve splicing, p120ctn isovormen kunnen worden gegenereerd uit vier alternatieve startcodons 4. p120ctn isovorm 1A is het langst, zoals vertaald vanaf de meest 5' startcodon en bevat de volledige lengte N-eindstandige segment. In p120ctn isovormen 3 en 4, wordt dit N-eindstandige segment gedeeltelijk en volledig respectievelijk verwijderd. Inzicht in de precieze rol van eiwitten (of eiwit isovormen) en hun domeinen in verschillende cellulaire functies blijft een uitdaging.
Gen-targeting in mESCs maakt het bestuderen van de functie van een proteïne door genetische deletie van het overeenkomstige gen en heeft een grote bijdrage tot de identificatie van ontwikkelings belangrijk en ziekte-relevante genen en pathways. Deze doorbraak in reverse genetics was het gevolg van de ontwikkelingen op het gebied van mES isolatie en gene targeting als gevolg van homologe recombinatie 5 6, 7, maar helaas zijn deze gevoelig voor off-doeleffecten 8. Een meer betrouwbare techniek voor gen targeting inschakelen is RMCE, die gebaseerd is op plaatsspecifieke recombinatie systeem zoals Cre / loxP of FLPe / Frt. LoxP en Frt sequentie in bacteriofaag P1 en Saccharomyces cerevisiae, respectievelijk, en bestaan uit 34 bp, waaronder een asymmetrische 8 bp sequentie die de oriëntatie van de site bepaalt. Anderzijds de oriëntatie van, bijvoorbeeld twee loxP plaatsen in de DNA strook bepaalt of de floxed DNA wordt uitgesneden of inversed upon Cre gemedieerde recombinatie 9. Bovendien kan Cre ook translocatie induceert wanneer twee plaatsen zich op verschillende chromosomen. RMCE maakt hiervan heterospecifiek recombinatie locaties die niet kruisreageren en die zijn ingebed in een genomische locus. In aanwezigheid van een donor plasmide dat een DNA-fragment geflankeerd door dezelfde heterospecifiek plaatsen bevat, zal de recombinase dit DNA-fragment in te voegen in de RMCE-compatibele genomische locus verdubbelen als gevolg van gelijktijdige translocatie (figuur 1). Hier kunnen alleen correct RMCE gerichte klonen render geneesmiddelresistentie door een promotor van de inkomende vector die herstelt een "gevangen" promoter-less neomycine resistentiegen (neo R) in de R26 genoom van het docking cellen (figuur 1) 10, 11. Dit resulteert in een zeer hoge targeting efficiency, vaak in de buurt van 100% 11, </ sup> 12. Concluderend-RMCE gebaseerde targeting is zeer efficiënt en kan worden gebruikt voor structuur-functie studies; echter, het vereist een prefab genomische locus.
Figuur 1. Schematische weergave van RMCE-gemedieerde targeting. RMCE maakt de uitwisseling van DNA-segmenten uit een inkomend richtende vector op een bepaalde genomische locus als zowel haven heterospecifiek twee FRT-plaatsen (aangegeven door witte en rode driehoekjes). Bovendien, de gemanipuleerde genome locus bevat een promoter en afgeknot neomycine-resistentie (Neo R) gen. Door een promoter en startcodon in het inkomende DNA-fragment, enige juiste recombinatiegebeurtenissen herstellen neomycine resistentie, wat resulteert in hoge rendementen targeting. Klik hier om een grotere versie van t bekijkenzijn figuur.
Genome Engineering in mESCs maakt het mogelijk om het genereren van RMCE-compatibele muizen. In 1981, twee slaagden in het vastleggen van pluripotente cellen van de binnenste celmassa (ICM) van blastocysten en het handhaven in kweek 13, 14. mESCs in staat zijn zelfvernieuwing en differentiatie tot alle embryonale en volwassen cellen, inclusief de geslachtscellen-cellijn. Daarom gen-targeting in mESCs maakt reverse genetische studies door de ontwikkeling van constitutieve of voorwaardelijke (via het Cre / loxP systeem) KO muizen. Echter, de klassieke manier om de muis ES-cellen te isoleren is zeer inefficiënt. Aantal belangrijke verbeteringen sterk verhoogd succes voor het afleiden mES lijnen, inclusief het gebruik van een bepaald serum-vervanging (SR) -medium 15, afwisselend mES medium met SR en foetaal runderserum (FBS) 16 en het gebruik farmacologische verbindingen zoals pluripotin of 17 2i. Pluripotin, een klein synthetisch molecuul, maakt de voortplanting van mESCs in een ongedifferentieerde toestand bij afwezigheid van leukemie remmende factor (LIF) en muis embryonale fibroblasten (MEF) 18. Tenslotte is aangetoond dat mESCs kan worden geïsoleerd met een zeer hoog rendement (bijna 100%) wanneer een SR / FBS medium afwisseling protocol wordt gecombineerd met LIF en pluripotin 19, 20. Deze protocollen maken de efficiënte isolatie van RMCE-compatibele KO mESCs die vervolgens kunnen worden gebruikt voor structuur-functie studies.
Dit artikel beschrijft een werkwijze die het mogelijk maakt om de belangrijkste domeinen of resten te identificeren in een eiwit dat verantwoordelijk is voor specifieke cellulaire processen. Te dien einde, een pijpleiding van geavanceerde technologieën die het mogelijk maken een efficiënte mES isolatie, targeting vector assemblage en mES targeting was creërend. Als zodanig grote panelen met eiwit isovormen, domain mutanten en downstream effectoren in KO mESCs kan worden ingevoerd en kan worden geëvalueerd op hun vermogen om de in vitro KO fenotype te redden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens institutioneel, nationaal en Europees dierenpaspoort regelgeving.
1. Isolatie van RMCE-compatibele KO mESCs
- Ras heterozygote KO muizen met RMCE-compatibele muizen, zoals ROSALUC muizen 10 of ROSA26-iPSC 21 muizen. Beide RMCE-compatibele muizen werden gehouden op een gemengd 129 / C57BL6 / Swiss achtergrond.
LET OP: De kruising met heterozygote KO muizen wordt geadviseerd om embryonale dodelijkheid overwinnen in homozygote KO muizen. - Met PCR heterozygote knock-out muizen die een RMCE cassette in de R26 locus 12 selecteren.
- Ras RMCE-compatibel, heterozygote knock-out muizen met heterozygote KO muizen en isoleren RMCE-compatibel, homozygote KO blastocysten.
- Stel de tijd paringen in de avond en te controleren op copulatie de volgende ochtend stekkers.
OPMERKING: Stekkers zijn gemaakt van gestold afscheiding uit de coagulerende en blaasvormige klieren van de mannelijke.Deze pluggen vul de vagina van het vrouwelijke en aanhouden gedurende 8-24 uur na kweek. Plugged vrouwen worden geacht te zijn het dragen van 0,5 dpc (dagen na coïtus) embryo's.- Om te controleren op stekkers, til de vrouw door de basis van haar staart en door het bestuderen haar vaginale opening voor een witachtige massa. Spreid de schaamlippen enigszins met een schuine probe wanneer de plug is moeilijk te zien. Aparte aangesloten vrouwtjes van hun mannelijke.
- Verzamel blastocysten op 3,5 dpc.
- Euthanaseren zwangere vrouwtjes door de goedgekeurde methode (bijvoorbeeld cervicale dislocatie). Voeg een midventral incisie en ontleden de baarmoeder en eileider (nog aan elkaar) met behulp van fijne schaar en forceps.
- Buig een 26-gauge naald in een hoek van 45 °. Bevestig een 1 ml spuit met M2-medium bij het gebogen naald en gebruik deze om de blastocysten uit de baarmoeder spoelen in de deksel van een 10-cm schaal.
- Steek de naald in het uiteinde van de baarmoeder die het dichtst bijde eileider. Houd de naald vast met fijne tang tijdens het duwen van de plunjer; zwelling van de baarmoeder wijst op een succesvolle blozen.
- Gebruik een mond pipet (met een diameter van 100-200 pm) waardoor alle embryo's te verzamelen en was ze twee keer in een druppel vers M2 medium. Onmiddellijk na het wassen, overdracht van de blastocysten om de cultuur platen (zie hieronder).
OPMERKING: De dissectie en behandeling van blastocysten van moet worden gedaan in laminaire luchtstroom.
- Stel de tijd paringen in de avond en te controleren op copulatie de volgende ochtend stekkers.
- Isoleer RMCE-compatibele KO mESCs
- Bereid een 12-wells plaat met mitomycine-C behandelde DR4 MEF (zie de tabel van Materials) één dag voor de blastocyst isolement.
Opmerking: Deze MEFs werden geïsoleerd uit Tg (DR4) 1Jae / J muizen die vier drug-selecteerbare genen bevatten en resistentie verlenen tegen néomycine, puromycine, hygromycine en 6-thioguanine 22.- Smeer alle kweekplaten met 0,1% gelatine. Voeg 0,1% gelatinede kweekplaten, incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 5% CO2, en zuig de gelatineoplossing. Zaad een kwart flesje P2 MEFs in een 12-putjesplaat en groeien ze in 2 ml MEF medium (zie Tabel 1, Tabel Materials) een confluente monolaag 19.
- Inactiveren ze met mitomycine C (10 ug / ml) gedurende 3 uur en tweemaal wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 19.
- Gebruik mondpipet, plaat de blastocysten op gegelatiniseerde 12-well platen (1 en / embryo), met mitomycine-C behandelde MEFs in SR-ES-celmedium (2 ml / putje) aangevuld met ofwel 2 uM pluripotin of 2i (1 uM remmer Erk PD0325901 en 3 uM GSK3 remmer CHIR99021). Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2.
- Vernieuw de SR-ES-cel medium (aangevuld met pluripotin of 2i) om de 2-3 dagen.
- Onderzoek elk blastocyst onder een stereomicroscope in 4,0X vergroting en controleer uitkomen en bevestiging aan de MEF laag.
OPMERKING: Wanneer blastocysten uitkomen, verliezen ze de zona pellucida die hen samenbrengt. Wells met losse blastocysten moeten worden vernieuwd met de mond pipetteren. - Pick individuele ICM uitwassen (met behulp van een stereomicroscoop) na 10 - 12 dagen culture met behulp van een P10 pipet met wegwerp tips. Breng de uitgroei bij ongeveer 10 ul medium om een V-vormig, 96-wells plaat met 30 ul / putje PBS (bij kamertemperatuur).
- Voeg 50 ul van 0,25% trypsine aan elk putje met een multichannel pipet en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C in 5% CO2.
- Voeg 100 ul van FBS bevattend medium mES; dissociëren de ICM uitwassen in afzonderlijke cellen door pipetteren 10-15 keer; en overdragen van de gedissocieerde cellen mitomycine-C behandelde 96-well platen MEF die een dag werden bereid vóór de ICM kolonies worden opgepikt.
- Vanaf deze stap verder, omi t pluripotin of 2i van het mES medium. De volgende dag, verandert het medium uit FBS- tot SR-bevattende mES (100 ul / putje).
- Vouw de gevestigde mES lijnen van 96- tot 24-well formaat 19.
- Spoel de cellen met 200 pl PBS, voeg 50 ul trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in 5% CO Voeg 100 ul van FBS-gebaseerde mES medium.; dissociëren pipetteren 10-15 keer met een multichannel pipet; en overdragen van de gedissocieerde cellen mitomycine-C behandelde, 24-wells platen MEF.
- Wissel naar-SR medium op basis van de volgende dag. Vouw de mESCs op een vergelijkbare manier van 24- tot en met 6 putjes. Voeg 3-4 freezings uit een confluente 6-well plaat 19.
- Identificeer RMCE-compatibel, homozygote KO mESCs behulp van PCR primers voor de R26 locus 23 en KO allel van keuze (in casu p120ctn; PCRs voor p120ctn waardeloos floxed allelen beschreven vóórlass = "xref"> 12).
- Bereid een 12-wells plaat met mitomycine-C behandelde DR4 MEF (zie de tabel van Materials) één dag voor de blastocyst isolement.
Tabel 1. Culture Media. Alle media werden bij 4 ° C en opgewarmd tot 37 ° C 30 min vóór gebruik.
2. Genereren van een RMCE-compatibele Targeting vector door middel van recombinatie Klonen
- Kloon hulp constructen in recombinatie-verenigbare vectoren onder gebruikmaking van restrictie-enzym (RE) gebaseerde of PCR-gebaseerde 24 kloneringstechnieken. Zorg ervoor dat de cDNA's bevatten een stopcodon.
- Ontwerp AttB-gelabeld primers 24. Zorgen dat de voorwaartse primer bevat de volgende elementen: a GGGG rek, een AttB1 site, een koppelaar, een Kozak sequentie en ongeveer 25 nucleotiden reddings- cDNA (te beginnen met de ATG). Zorg ervoor dat de omgekeerde primer heeft een soortgelijke samenstelling: een GGGG stretch, een attB2 site, een linker, en ongeveer 25 nucleotides van rescue cDNA (omgekeerde complement).
- Amplificeren het cDNA redding via PCR voor AttB-geflankeerd cDNA te verkrijgen.
- Voer een 10-ul BP reactie met 100 ng AttB-geflankeerd cDNA en 150 ng recombinatie-compatibele donor vector, die een kanamycine-resistentiegen bevat.
- Transformatie 5 pl van de BP mengsels warmteschok-competente MC1061 Escherichia coli (E. coli) bacteriën (vergelijkbaar met die in stap 2.3).
- Identificeren van kolonies die de juiste rescue-cDNA bevattende vectoren (vergelijkbaar met die beschreven in stap 2.4)
- Voer een 10-pl LR reactie met 100 ng rescue-cDNA bevattende vector; 150 ng Cre-uitgesneden pRMCE-DV1 vector 11 (LMBP 8195); en 2 pi van recombinase mix, die een faag-gecodeerde integrase en excisionase en bacteriële integratie gastheer factor bevat. Incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C.
Opmerking: Een LR reactie is een recombinatie reactieion waarin een invoer kloon met attL locaties en een bestemmingsvector die attR-plaatsen gerecombineerd worden door de LR-clonase enzymmengsel. Dit leidt tot een expressie kloon die attB locaties flankeren het gen van belang. - Transformatie 5 pl van de LR mengsels warmteschok-competente MC1061 E. coli bacteriën.
- Voeg 5 ul van LR mengsels geribd, rokken, 2 ml schroefdop buis met 40 pl warmteschok-competente E. coli bacteriën en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 1 ml Luria-bouillon (LB) medium en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Plaat 50 pl op ampicilline (Amp; 100 gg / ml) bevattende agarplaten en gedurende de nacht groeien bij 37 ° C.
- Identificeer de kolonies met de juiste targeting vector.
- Pick 5 kolonies willekeurig gebruik van een p200 tip. Breng de tip om een glazen reageerbuis met 2-5 ml LB-medium en gedurende de nacht groeien bij 37 ° C.
- Exdarmkanaal het plasmide DNA van de bacteriële kweken met behulp van commercieel verkrijgbare kits.
- Valideren ze met behulp van RE verteert en sequencing. Cut 0,5-2 pg plasmide gebruik van 0,2 ui RE (20 U / pl) en 1 pi van de overeenkomstige 10x buffer in 10 pi reactie. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C en gescheiden op een 1% agarosegel. Selecteren van kolonies met het voorspelde patroon van DNA fragmenten.
- Analyseer de bevestigde vectoren (50 ng / pl) met Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) en IRES R (GCG GGG GAA TTC GAT ATC AAG) primers (5 pmol / ul) via Sanger sequentiebepaling.
3. RMCE-gemedieerde mES Richten van Rescue Constructen de R26 Locus
- Start een cultuur van RMCE-compatibele KO mESCs en passage hen ten minste tweemaal op MEFs in FBS-gebaseerde mES medium. Splits de mESCs op een ontsloten 6-well plaat.
- Op de volgende dag, vernieuwen van de cellen, op ongeveer 50% samenvloeiing, met 1,5ml FBS-gebaseerde mES medium en het transfecteren mESCs met een Cre-uitgesneden pRMCE-DV1 richtende vector die cDNA redding.
- Maak een DNA-mix. Voeg 1 ug targeting vector en 1 ug FLPe-expressieplasmide 25-250 pl zuivere DMEM medium.
- Maak een lipofectie mix. Voeg 7 pl-lipofectie gebaseerd transfectiereagens (bijvoorbeeld Lipofectamine 2000) 250 pi zuivere DMEM medium en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Vergelijkbare RMCE targeting efficiënties werden verkregen met behulp van andere lipofectie-gebaseerde reagentia (bijvoorbeeld Lipofectamine LTX en Effectene). - Meng de DNA mix met lipofectie mix en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer de transfectie mengsel op de vernieuwde mESCs. Roer voorzichtig en laat het een nacht.
- Eén dag na transfectie gesplitst alle mESCs van de 6-well plaat op 10 cm kweekschaal een confluente laag van DR4 MEFs en 10 ml FBS-gebaseerde mESC medium.
- Twee dagen na transfectie, selecteert mES klonen met de juiste FLPe-gemedieerde cassette uitwisseling door toevoeging van 0,2 mg / ml G418 (100x) aan het medium.
OPMERKING: Maak een kill curve voor elke partij van de G418 om de laagste concentratie van G418 dat alle mESCs doodt identificeren. - Vernieuw de mESCs dagelijks met G418 bevat mES medium. Kolonies moet verschijnen na 7-10 dagen, dus kies en uit te breiden deze als per stap 1.4.
- Bevestig de correcte klonen door PCR 11.
4. Differentiatie van mESCs in embryoiden lichamen (EB's)
- Start een cultuur van KO mESCs met R26-gedreven rescue bouwt en passage hen ten minste tweemaal op MEFs in FBS-gebaseerde mES medium. Passage de mESCs eenmaal op ontsloten 6-well platen om zich te ontdoen van de MEF.
- Was met PBS en trypsinize de bijna-confluente mES culturen. Plaat gedissocieerd mESCs in verschillende verdunningen (1/20 en 1/40) op niet-hechtende bacteriën kwaliteit petri-gerechten in differentiatie medium.
- Laat EBS te vormen in deze gerechten voor 30 dagen. Vernieuwen het medium elke 2-3 dagen met behulp van de volgende procedure: breng de EB suspensie op 50 ml buis, laat de EBS bezinken door de zwaartekracht, de bovenstaande vloeistof, voeg vers medium en breng de EB suspensie naar een bacterieel-grade schotel.
- Analyseer de beoogde mESCs en EBS immunofluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie via protocollen die eerder 12 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De procedure voor RMCE-compatibele KO mES lijnen te isoleren is weergegeven in figuur 2. Twee opeenvolgende dekkingen zijn verplicht om RMCE-compatibele KO blastocysten te verkrijgen. Eerst worden heterozygote KO muizen gekruist met RMCE-compatibele muizen om RMCE-compatibele, heterozygote KO muizen te verkrijgen. Deze muizen worden vervolgens gebruikt voor getimede paringen met andere heterozygote KO muizen 3,5 dpc, RMCE-compatibele homozygote KO blastocysten verkregen. De kans op het verkrijgen van een dergelijk embryo is een op de acht, zoals voorspeld door Mendeliaanse overerving. Derhalve wordt een efficiënte mES isolatieprotocol vereist. Met behulp van pluripotin gebaseerde of 2i gebaseerde protocollen, kunnen wij mESCs lijnen, waaronder RMCE-compatibele p120ctn KO mESCs isoleren, met een rendement van ongeveer 94% (n = 114 blastocysten) en 64% (n = 22 blastocysten) respectievelijk 12, 19. Gewoonlijk blastocysten komen na 3 tot 6 dagen in vitro (DIV) cultuur; Dit wordt gevolgd door de hechting van ICM uitwassen tot MEFs of gelatine beklede schalen. Op dag 12 worden grote ICM uitwassen gevormd die getrouw tot mES lijnen geven (Figuur 2). Als gevolg van deze zeer efficiënte mES isolatie procedure, is het mogelijk om RMCE-compatibele KO mESCs te verkrijgen van één of twee aangesloten vrouwtjes.
Figuur 2. Isolatie van RMCE-compatibele KO mESCs. (A) Fokstrategie homozygoot, RMCE-compatibele KO mESCs verkrijgen. (B) Regeling van pluripotin- of-2i op basis mES isolatie procedure. White schaal bar: 25 pm. Zwarte schaal bars: 100 pm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Om de domeinen of am kaartino zuren in een eiwit dat belangrijk is voor specifieke cellulaire functies, kan men nu herintroduceren via RMCE, volledige lengte of mutant constructen KO mESCs en testen op hun vermogen om de KO fenotype herstellen. Richtende vectoren voor veel verschillende domein mutanten en puntmutanten efficiënt worden gegenereerd door recombinatie klonering (Figuur 3A). Recombinatorische klonen is gebaseerd op het inzicht specifieke hechting (Vrd) DNA-sequenties door de recombinase mix, die uitgewisseld Att geflankeerde DNA-fragmenten tussen verschillende plasmiden medieert. Het recombinatorische kloneringssysteem selecteert alleen correct gerecombineerd vectoren door te schakelen tussen vectoren met verschillende antibiotica-resistentiegenen bevatten en door toevoeging van een tegen-selecteerbare merker, de "controle van celdood B" (ccdB) gen in de bestemming vector (Figuur 3A) . We hebben gegenereerd dan 25 Cre-uitgesneden pRMCE-DV1 richtende vectoren met een bijna 100% efficiëntie (voorbeelden aopnieuw getoond in tabel 2).
Tabel 2. Overzicht van targeting vector Vergadering en RMCE-gemedieerde mES Targeting.
Verschillende constructen rescue ingebed in een cre uitgesneden pRMCE-DV1 targeting vector kan gemakkelijk worden gericht KO mESCs behulp RMCE (Figuur 3B). We hebben eerder gemeld op het genereren van 133 gerichte mES klonen op 19 verschillende reddings- constructen die via RMCE in de R26 locus van p120ctn KO mESCs werden met gemiddeld rendement van 93% 12. Hier doen we verslag van de doelgerichtheid van extra constructies met vergelijkbare hoog rendement, met inbegrip van een CAAX--gelabelde p120ctn 1A, epitheliale-to-mesenchymale transitie (EMT) inductoren van de SNAI en ZEB familie, en N-cadherine, in p120ctn KO mESCs ( tafel 2).
Figuur 3. RMCE-based targeting in KO mESCs. (A)-recombinase gemedieerde assemblage van RMCE-compatibele richtende vectoren. (B) richten van vermeende redding constructen de R26 locus homozygote KO mESCs via RMCE. (C) PCR-gebaseerde validatie van RMCE gerichte mES klonen. DNA werd geëxtraheerd uit-RMCE gerichte mES klonen en werd geamplificeerd met PCR onder toepassing van een voorwaartse primer die is ingebed in de endogene locus R26 en een reverse primer die zich in de binnenkomende pRMCE-DV1 construct. Een 560-bp band wordt waargenomen voor het correct gerichte klonen. Onbevestigde klonen worden getoond in het rood. M1: 1 kb DNA ladder. M2: 1 kb Plus DNA ladder. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
12. Cystische EB morfologie kan worden gebruikt als een fenotypische uitlezing verschillende rescue constructen (figuur 4A) te screenen. Als proof of concept hebben we laten zien dat de R26-driven p120ctn isovorm 1A (R_p120_1A) de p120ctn KO fenotype zou kunnen redden (Figuur 4B, 4C) 12. Bovendien, dit scherm geïdentificeerde E-cadherine, maar niet RhoA, een belangrijke partner van p120ctn tijdens endoderm specificatie (Figuur 4B en C) 12. Het gemak van de invoering van redding construeert om p120ctn KO mESCs liet ons toe om extra hypothesen te toetsen. Ten eerste zou E-cadherine-onafhankelijk membraan verankering van p120ctn mogelijk te maken cystic EB vorming? TestenDit gefuseerd we de K-Ras-membraan-doel motief (CAAX) aan de carboxyterminus van p120ctn, geïntroduceerd via RMCE KO mESCs p120ctn en maakte EBS daaruit. Echter, deze constructie wordt een dominant negatieve die geen binding toestaat en stabilisatie van E-cadherine (Figuur 4D) en, bijgevolg, niet red de p120ctn KO fenotype (Figuur 4C). Ten tweede, induceren, EMT betrokken? EMT is een essentieel ontwikkelingsproces dat ook optreedt tijdens mES differentiatie en wordt georkestreerd door de SNAI en ZEB familie van transcriptiefactoren, die verschillende epitheliale merkergenen zoals E-cadherine 26, 27 direct onderdrukken. Overeenkomstig deze bevindingen, de expressie van EMT inducer ZEB2 werd gevonden in controle EBS, maar niet in p120ctn-null EBS (figuur 4E). Toch p120ctn KO mESCs met de ROSA26-gebaseerde uitdrukking van EMT inducerende ZEB1, ZEB2 of Snail niet cyste te herstellenic EB vorming (Figuur 4C). Ten derde kunnen andere klassieke cadherinen, zoals N-cadherine functioneel vervangen E-cadherine tijdens endoderm specificatie? Om dit aan te pakken, werden N-cadherine rescue lijnen gegenereerd. Eerder werd aangetoond dat de ectopische expressie van E-cadherine in p120ctn KO EB gedeeltelijk de vorming van cystische EBS 12 gered. Interessant is dat in een gelijkaardige opstelling, gedwongen N-cadherine-expressie niet redden (figuur 4C en F), wat aangeeft dat E-cadherine is het belangrijkste subtype cadherine vereist voor EB adhesie en kan niet worden vervangen door N-cadherine. Deze bovengenoemde voorbeelden benadrukken het gemak waarmee biologische vragen door het systeem kan worden aangepakt.
Fenotype figuur 4. Screening van RMCE gerichte Redding mESCs. (A) De vorming van cystic EBS (gevangen genomen door lichtmicroscopie; ruit topls) en endoderm juiste polarisatie in EBS (opgevangen door transmissie-elektronenmicroscopie; bodempanelen) werden gebruikt als fenotypische uitlezing om het vermogen van gerichte mESCs de p120ctn KO fenotype te redden testen. White schaal bar: 25 pm. Zwarte schaal bar: 200 pm. (B) Overzicht van p120ctn redding constructies. p120ctn bevat een centrale armadillo domein, bestaande uit negen repeats armadillo (blauwe vakken), dat wordt geflankeerd door N-terminale domein (NBD) en C-eindstandige domein (CTD). p120ctn isovormen bevatten één van vier alternatieve start codons (pijlen), eventueel voorzien die worden gecodeerd door afwisselend gebruikt exons A en C (zwarte dozen) en omvatten of uitsluiten twee Rho GTPase bindingsdomeinen (SGD). p120ctn isovormen 1A en 4A gebruik de eerste en vierde translatie-initiatieplaats, respectievelijk. De positie van de mutaties van belang AA en de kunstmatige toevoeging van een membraan gericht motief (CAAX) getoond. EBD: E-cadherine bindend domein. (C) Grafiekdie het percentage basis- of cystic EB morfologie p120ctn KO cellen die verschillende R26 aangedreven rescue constructen. (D) Immunofluorescentie kleuring voor p120ctn (monoklonaal anti-p120ctn) en E-cadherine (monoklonaal anti-E-cadherine) aan controle G4 mESCs of p120ctn KO mESCs de R26-gestuurde expressie van CAAX-gemerkte p120ctn isovorm 1A. De inzetstukken tonen de gehele mES kolonie. Schaal bar: 10 micrometer. (E) Immunohistochemie voor ZEB2 (muis monoklonaal anti-ZEB2, 7F7, gemaakt in-house) op floxed (controle) en p120ctn KO EBS. Een 3,5-voudige vergroting in de bodempanelen. Schaalstaaf 200 urn (boven), 100 urn (onder). (F) van transmissie elektronenmicroscopie DIV12 EBS van p120ctn KO cellen die E- en N-cadherine van de R26 promoter. Schaal bar: 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkenen figuur.
Tot slot vermelden we een pijpleiding van robuuste technologieën die een bijna 100% rendement in mES isolatie gecombineerd met targeting vector montage en mES targeting. Deze pijpleiding kunnen we de veelzijdigheid van proteïnen ontrafelen door middel van structuur-functie studies in mESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze mES isolatie methode is gebruiksvriendelijk en vereist geen geavanceerde vaardigheden of apparatuur, zoals microchirurgie van blastocysten. Zo, deze technologie is toegankelijk voor een groot deel van de wetenschappelijke gemeenschap. Iedereen met basic celkweek ervaring kan voortplanten ICM uitwassen en stellen mESCs lijnen. Echter, de spoelen en de behandeling van blastocysten enige oefening vereist. Een mond pipet wordt gebruikt om blastocysten overdracht en bestaat uit een micropipet, een micropipet houder, slangen en een aspirator mondstuk 28. Micropipetten kunnen op maat worden gemaakt door verhitting van de fijnste van een Pasteur pipet gedurende enkele seconden, het verwijderen van de pipet uit de vlam en beide uiteinden trekken. Select naalden met een diameter die iets groter is dan een blastocyst (100-200 pm). Naalden kan worden gebruikt na wassen met gedestilleerd water (3x) en EtOH (3 x). In onze ervaring, is de efficiëntie van pluripotin gebaseerde mES isolatie hoger in vergelijking tot en met 2i-gebaseerde protocollen 12. Echter, het gebruik van pluripotin bij hoge concentraties is aangetoond dat genomische instabiliteit 19 induceren.
RMCE gebaseerde R26-targeting in mESCs levert typisch 20-40 kolonies na G418 selectie. Indien meer kolonies worden waargenomen, betekent dit dat de G418-concentratie niet optimaal en maakt ongerichte mESCs te overleven, waardoor de totale efficiëntie targeting. Daarom wordt geadviseerd dat voor elke mES lijn en voor elke nieuwe batch G418 wordt een doden curve aan de laagste concentratie die G418 alle ongerichte mESCs doodt identificeren. Als er geen kolonies worden waargenomen, dit wijst op een inefficiënte transfectie. In dat geval is het nuttig de transfectieprocedure behulp reporter plasmiden die de expressie van EGFP of LacZ mogelijk te optimaliseren. Indien de transfectie protocol werkt maar nog geen koloniën waargenomen, controleer de RMCE-compatibel en cre-uitgesneden pRMCE-DV1 vector en FLPe expression plasmide met RE digestie en sequentie. Het is raadzaam om een grote partij van de ouderlijke mESCs en FLPe vector te maken en om een aantal monsters van hen te bevriezen om de variatie tussen de experimenten te verminderen.
Een nadeel van deze structuur-functie strategie is dat de redding constructen niet tot expressie gebracht uit het endogene locus, maar vanuit de ROSA26 locus, met een alomtegenwoordige, matig actieve promotor. In vergelijking met andere technieken, waarbij overexpressie suprafysiologische niveaus vaak gezien Dit systeem maakt fysiologische transgenexpressie, die stabiel is in in vitro experimenten en differentiatie in verschillende cellijnen. Waargenomen werd dat heterozygoot, ROSA26-gemedieerde transgen de expressie leidt tot een p120ctn eiwitexpressie dat ongeveer de helft van de endogene p120ctn niveaus van wildtype controle mESCs maar dat was voldoende om het waargenomen p120ctn KO fenotypen 12 redden. Op dezelfde manier werd Dèmonstrated eerder dat heterozygoot, ROSA26 gemedieerde Zeb2 transgenexpressie voldoende is om de Zeb2 knockout fenotypes waargenomen in vitro en in vivo in verschillende cellijnen 29 redden. Een andere potentiële valkuil is het feit dat genen die onmisbaar zijn voor mES zelfvernieuwing zijn niet geschikt voor een dergelijke structuur-functie studies. Om dit uit te sluiten, is het aangeraden om nieuw opgerichte KO mESCs voor de volgende criteria te karakteriseren: proliferatie, kolonie morfologie en expressie van stemness genen. Ook wordt aanbevolen om de expressie van het gen van belang te controleren, zowel in mESCs en in-lijn-voorbestemde cellen.
Naast het uitvoeren van structuur-functie studies in constitutieve KO mESCs, zou men ook een conditionele benadering met het Cre / loxP systeem. Deze laatste benadering maakt een lijn-specifieke KO zonder dat de omgeving en steuncellen. Daarnaast voorwaardelijke KO mESCs allow voor het uitvoeren van structuur-functie studies als er een fenotype in de constitutieve KO mESCs. Om RMCE-compatibel te genereren, voorwaardelijke-KO mESCs, homozygote gefloxte muizen met een celtype-specifieke Cre driver worden gefokt met RMCE-compatibele muizen; mES worden geïsoleerd uit hun nageslacht. Het voordeel van dit systeem is dat het Cre recombinase niet wordt uitgedrukt in mESCs slechts actief wanneer de mESCs gedifferentieerd in de betreffende cellijn. In RMCE-compatibele voorwaardelijke-KO mESCs zal Cre recombinatie gelijktijdige inactivatie van het endogene gen en R26-gestuurde expressie van het construct te redden induceren door een voorwaardelijke pRMCE-DV1 targeting vector (LMBP 08870) 11.
Daarnaast is de structuur-functie systeem maakt het mogelijk voor de studie van mutaties die zijn gevonden in menselijke ziekte en stelt ons in staat om het effect van deze mutaties op de functie van het eiwit te testen. Als voorbeeld hebben we ZEB2 mutat geïdentificeerdionen bij patiënten met myeloproliferatieve aandoening, gemaakt richtende vectoren bevattende deze ZEB2 mutanten, brachten zij de R26-locus van Zeb2 KO mESCs via RMCE en onderzocht het effect van de mutaties op de stabiliteit van het eiwit zelf 30. Deze technologie biedt een beter begrip van de biochemie van dergelijke mutanten in mESCs, alsmede in een bepaalde lijn, aangezien mESCs zijn pluripotent.
Samenvattend, dit mES-gebaseerde structuur-functie benadering berust op efficiënte mES isolatie en targeting technologie maakt de identificatie van belangrijke domeinen en functies van een bepaald eiwit in een gedefinieerde biologische context. Door het delen van muizen (ingevroren sperma is beschikbaar op aanvraag) en plasmiden (gedistribueerd vanuit BCCM / LMBP en Addgene), willen we deze technologie open te stellen voor het gehele wetenschappelijke gemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire en Riet De Rycke voor hun uitstekende technische ondersteuning. We danken ook Eef Parthoens, Evelien Van Hamme, en Amanda Goncalves uit de bio-imaging Core Facility van de Ontsteking Onderzoekscentrum voor hun deskundige hulp. Wij erkennen de leden van onze onderzoeksgroep voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door het Federaal Wetenschapsbeleid (Belspo Interuniversitaire attractiepolen - Award IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), door de Geneeskundige Stichting Koningin Elisabeth, België (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), en door de gecoördineerde Research Actions (GOA 01G01908) van de Universiteit Gent, België (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG is een postdoctoraal onderzoeker van het Flanders Research Funds (FWO-V).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ROSALUC Mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| R26-iPSC mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| Vessel probe | Fine Science Tools | 10160-13 | to check for copulation plugs |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | make aliquots and store at -20 °C |
| Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) | Fine Science Tools | 11251-10 | spray with 70% EtOH before use (do not autoclave) |
| 23 G needles | Fine-ject | 8697 | |
| 1-mL syringes | Soft-ject | 6680 | |
| 60-mm bacterial grade plates (for flushing) | Gosselin | BB60-01 | |
| Mouth pipette | made in house | see discussion | |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) | ATTC | SCRC-1045 | |
| TgN (DR4)1 Jae mice | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M0503 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 14190-094 | |
| Tg(DR4)1Jae/J mice | JAX | 3208 | mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine |
| 0.1% Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C. |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200-056 | |
| 2 μM pluripotin | Cayman Chemical | 10009557 | |
| pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08870 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| cre-excised pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08195 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA | Addgene | 20733 | |
| heat-shock competent DH5α bacteria | made in house | ||
| Gateway pDONR221 vector | Thermo Fisher | 12536-017 | contains kanamycin-resistance gene |
| BP clonase II mix | Thermo Fisher | 11789-020 | |
| LR clonase II mix | Thermo Fisher | 11791-020 | |
| Luria Broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer | Thermo Fisher | 3730XL | |
| G418 | Thermo Fisher | 11811-023 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Lipofectamine LTX transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GATEWAY pENTR 1A vector | Thermo Fisher | A10462 | recombination-compatible vector |
| mouse monoclonal anti-p120ctn antibody | BD Transduction Laboratories | 610134 | |
| mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610181 | |
| General equipment | |||
| Sterile dissection tools | fine scissors and forceps for dissecting the uterus | ||
| Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL | |||
| 15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes | |||
| 96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) | |||
| Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells | |||
| Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) | |||
| Sterile multichannel reservoirs | |||
| Access to a laminar air flow | |||
| Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2 | |||
| Access to an inverted microscope | |||
| Access to a bench-top centrifuge | |||
| Access to a stereo microscope with transmitted-light | |||
| Culture media | |||
| MEF Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 41965-062 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-7524 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium pyruvate (0.4 mM) | Gibco | 11360-039 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| SR-based mESC medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | mixed in a 1:1 ratio |
| 15% knock-out serum replacement (SR) | Gibco | 10828–028 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| 0.1 mM non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| β-mercaptoethanol (0.1 mM) | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| 2,000 U/mL recombinant mouse LIF | (IRC/VIB Protein Service facility) | ||
| FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| Differention Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| 5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid | Gibco | 11279-023 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| 0.4 mM 1-thioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| 50 μg/mL ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A-4544 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| 2i | |||
| 1 μM Erk inhibitor PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | |
| 3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 |
References
- Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
- Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
- Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
- Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
- Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
- Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
- Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
- Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
- Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
- Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
- Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
- Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2016).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third edn (2003).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
- Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. , (2016).
