Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Struktur og funktion Studier i embryonale stamceller fra mus Brug rekombinase-medieret Cassette Exchange

doi: 10.3791/55575 Published: April 27, 2017

Summary

Proteiner indeholder ofte flere domæner, som kan øve forskellige cellulære funktioner. Gene knock-outs (KO) anser ikke denne funktionel diversitet. Her rapporterer vi en rekombinationsmedieret kassette udveksling (RMCE) -baseret struktur-funktion tilgang i KO embryonale stamceller, som giver mulighed for den molekylære dissektion af forskellige funktionelle domæner eller varianter af et protein.

Abstract

Genmanipulation i muse embryoer eller embryonale stamceller (mESCs) giver mulighed for undersøgelse af funktionen af ​​et givet protein. Proteiner er arbejdsheste cellen og ofte bestå af flere funktionelle domæner, som kan påvirkes af posttranslationelle modifikationer. Udtømningen af ​​hele proteinet i betinget eller konstitutiv knock-out (KO) mus tager ikke højde for denne funktionel diversitet og regulering. En Mesc linje og en afledt musemodel, hvori en docking site for FLPe rekombinationsmedieret kassette udveksling (RMCE) blev indsat i ROSA26 (R26) locus, er tidligere blevet rapporteret. Her rapporterer vi på en struktur-funktion tilgang, der muliggør molekylær dissektion af de forskellige funktioner i en multidomæneproteinet protein. Med henblik herpå skal RMCE-kompatibel mus krydses med KO mus og derefter RMCE-kompatible KO mESCs skal isoleres. Dernæst kan et panel af formodede rednings konstrukter indføres i R26 locus via RMCE targeting. Kandidatforbindelserne rednings cDNA'er kan nemt indsættes mellem RMCE sites af målvektoren ved hjælp rekombination kloning. Dernæst KO mESCs transficeret med målvektoren i kombination med et FLPe rekombinase ekspressionsplasmid. RMCE reaktiverer promotorløse neomycinresistensgen i ROSA26 docking sites og tillader selektion af den korrekte targeting event. På denne måde opnås høj målretning effektivitet tæt på 100%, hvilket muliggør indsættelse af flere formodede rednings konstruktioner i en semi-high throughput måde. Endelig kan et væld af R26-drevne rednings-konstruktioner testes for deres evne til at redde fænotype, der blev observeret i forældrenes KO mESCs. Vi præsenterer en proof-of-principle struktur-funktion undersøgelse i p120 catenin (p120ctn) KO mESCs anvender endoderm differentiering i embryoide legemer (EBS) som den fænotypiske udlæsning. Derigennem kan identifikation af vigtige domæner, formodede nedstrømsstier, og sygdomsfri relevante punktmutationer, der ligger til grund for KO fænotyper for et givet protein.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det anslås, at pattedyrgenomer indeholder omkring 20.000 proteinkodende gener. Alternativ splejsning og posttranslationelle modifikationer yderligere øge protein repertoire. Proteiner har en modulær struktur 1 og ofte indeholde multiple interaktionsdomæner, som tillader deres rekruttering til forskellige protein-komplekser og deres deltagelse i flere cellulære processer 2. Et eksempel er det multifunktionelle protein kaldet p120ctn. p120ctn kodes af Ctnnd1 genet og består af et stort centralt bæltedyr gentagelsesdomæne flankeret af en N-terminal og en C-terminal region. Bæltedyret domæne p120ctn binder til en særdeles konserveret juxtamembrandomæne af klassiske cadheriner, som er involveret i celle-celle-adhæsion, men det binder også til den transskriptionsrepressor Kaiso. Det N-terminale domæne af p120ctn interagerer med forskellige kinaser, phosphataser, små RhoGTPases og mikrotubulus-associeret proteins 3. Interessant, som et resultat af alternativ splejsning, p120ctn isoformer kan genereres fra fire alternative startkodoner 4. p120ctn isoform 1A er den længste, da det er oversat fra den mest-5' startkodon og indeholder fuldlængde N-terminale segment. I p120ctn isoformerne 3 og 4 er dette N-terminale segment delvist og fuldstændigt henholdsvis slettet. Forstå den præcise rolle proteiner (eller protein-isoformer) og deres domæner i forskellige cellulære funktioner fortsat en udfordring.

Genmålretning i mESCs muliggør studiet af funktionen af ​​et protein gennem genetisk deletion af det tilsvarende gen og har bredt bidraget til identifikation af udviklingsmæssigt vigtige og sygdomsrelaterede relevante gener og veje. Dette gennembrud i revers genetik var resultatet af fremskridt inden for Mesc isolation og genmålretning grund homolog rekombination 5 6, 7, men desværre disse er tilbøjelige til off-target effekter 8. En mere pålidelig teknik til at muliggøre genmålretning er RMCE, som er baseret på stedspecifikke rekombinationssteder systemer såsom Cre / loxP eller FLPe / Frt. LoxP og Frt sekvens findes i bakteriofag P1 og Saccharomyces cerevisiae henholdsvis og består af 34 bp, herunder en asymmetrisk 8 bp sekvens, der bestemmer orienteringen af sitet. På den anden side, orienteringen af ​​for eksempel to loxP-sites inden for en DNA-strækning vil afgøre, om floxed DNA bliver udskåret eller inversed upon Cre-medieret rekombination 9. Desuden kan Cre også inducere en translokation hvis to steder er placeret på forskellige kromosomer. RMCE drager fordel af Heterospecifikke rekombinationssteder, der ikke krydsreagerer, og som er indlejret i et genomisk locus. I nærvær af et donorplasmid, der indeholder et DNA-fragment flankeret af de samme Heterospecifikke sites, vil rekombinasen indsætte dette DNA-fragment i RMCE-kompatible genomiske locus på grund af dobbeltstrenget samtidig translokation (figur 1). Her, kan kun korrekt RMCE-målrettede kloner gøre lægemiddelresistens takket være en promotor på den indkommende vektor, som genskaber en "fanget," promotor-mindre neomycinresistensgen (NeoR) til stede i R26-genomet af docking-celler (figur 1) 10, 11. Dette resulterer i en meget høj målretning effektivitet, ofte tæt på 100% 11, </ sup> 12. Afslutningsvis RMCE målretning er yderst effektiv og kan anvendes til struktur-funktioner undersøgelser; men det kræver en præfabrikerede genomiske locus.

figur 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af RMCE-medieret Målretning. RMCE giver mulighed for udveksling af DNA-segmenter fra et indkommende vektor målretning til en defineret genomisk locus hvis begge harbor to Heterospecifikke FRT-steder (skildret af hvide og røde trekanter). Derudover den konstruerede genomiske locus indeholder et promotorløst og trunkeret neomycin-resistens (NeoR) gen. Ved at tilvejebringe en promotor og startkodon i den indkommende DNA-fragment, kun korrekte rekombinationsbegivenheder genoprette neomycinresistens, hvilket resulterer i effektiviteter høje målretning. Klik her for at se en større version af thans figur.

Genommanipulation i mESCs muliggør frembringelsen af ​​RMCE-kompatibel mus. I 1981, to grupper formået at tage pluripotente celler fra den indre cellemasse (ICM) af blastocyster og opretholdelse dem i kultur 13, 14. mESCs er i stand til selvfornyelse og differentiering i alle typer af embryonale og voksne celler, herunder kim-celle afstamning. Derfor genmålretning i mESCs muliggør omvendt genetiske undersøgelser gennem udvikling af konstitutive eller betingede (ved hjælp af Cre / LoxP-system) KO-mus. Men den klassiske måde at isolere mus ES-celler er meget ineffektiv. Flere store forbedringer har stærkt forøget succesraten for afledt Mesc linjer, herunder anvendelse af et defineret serum-udskiftning (SR) medium 15, vekslende mellem Mesc medium indeholdende SR og føtalt bovint serum (FBS) 16, og anvendelsen af farmakologiske forbindelser, såsom pluripotin eller 2i 17. Pluripotin, en lille syntetisk molekyle, giver mulighed for opformering af mESCs i en udifferentieret tilstand i fravær af leukæmiinhiberende faktor (LIF) og muse embryonale fibroblaster (MEF) 18. Endelig er det blevet vist, at mESCs kan isoleres med en meget høj effektivitet (næsten 100%), når en SR / FBS medium alternerende protokol er kombineret med LIF og pluripotin 19, 20. Disse protokoller muliggør effektiv isolering af RMCE-kompatibel KO mESCs, der efterfølgende kan anvendes til struktur-funktions-undersøgelser.

Dette papir beskriver en fremgangsmåde, der gør det muligt at identificere de vigtigste domæner eller rester i et protein, der er ansvarlige for specifikke cellulære processer. Til dette formål en pipeline af avancerede teknologier, der muliggør effektiv Mesc isolation, målrettede vektor samling, og Mesc målretning var skabed. Som sådan, store paneler med proteinisoformer, domæne mutanter og nedstrømseffektorer kan indføres i KO mESCs og kan evalueres for deres evne til at redde in vitro KO fænotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forsøg på mus blev udført i henhold til de institutionelle, nationale og europæiske dyr regler.

1. Isolering af RMCE-kompatible KO mESCs

  1. Avle heterozygote KO-mus med RMCE-kompatible mus, såsom ROSALUC mus 10 eller ROSA26-iPSC mus 21. Begge RMCE-kompatible mus blev holdt på en blandet 129 / C57BL6 / Swiss baggrund.
    BEMÆRK: Passage med heterozygote KO mus tilrådes at overvinde embryonal letalitet i homozygote KO mus.
  2. Anvende PCR til at vælge heterozygote KO-mus indeholder et RMCE kassette i R26 locus 12.
  3. Avle RMCE-kompatibel, heterozygote KO-mus med heterozygote KO-mus og isolere RMCE-kompatibel, homozygote KO blastocyster.
    1. Nedsat tid parringer om aftenen og tjekke for samleje stik næste morgen.
      BEMÆRK: Stik er lavet af koagulerede sekret fra koagulerende og vesikulær kirtler i den mandlige.Disse propper hans position vagina af den kvindelige og vedvarer i 8 - 24 timer efter avl. Plugged hunner betragtes som transporterer 0,5 dpc (dage efter coitum) embryoer.
      1. At kontrollere for propper, løfte female af bunden af ​​halen og ved undersøge hendes vaginal åbning til en hvidlig masse. Spred læberne af vulva lidt med en vinklet sonde, når stikket er svært at se. Separate plugged hundyr fra deres mandlige.
    2. Saml blastocyster på 3,5 DPC.
      1. Afliv drægtige hunner af den godkendte metode (fx cervikal dislokation). Lav en midventral snit og dissekere livmoderen og æggelederen (stadig knyttet til hinanden) ved hjælp af fine saks og pincet.
      2. Bøje en 26-gauge nål i en 45 ° vinkel. Vedhæfte en 1-ml sprøjte fyldt med M2 medium til denne bøjet nål og bruge den til at skylle de blastocyster fra livmoderen i låget af en 10 cm skål.
        1. Stik nålen ind i enden af ​​livmoderen, der er tættest påæggelederen. Hold nålen på plads med fine pincet mens skubbe stemplet; hævelse af livmoderen indikerer en vellykket skylning.
      3. Bruge en mund pipette (med en diameter på 100 - 200 pm) at indsamle alle embryoner og vaskes to gange i en dråbe frisk M2 medium. Umiddelbart efter vask dem, overføre blastocysterne til dyrkningspladerne (se nedenfor).
        BEMÆRK: dissektion og håndtering af blastocyster af bør ske i laminar luftstrøm.
  4. Isoler RMCE-kompatible KO mESCs
    1. Forberede en plade med 12 brønde med mitomycin-C-behandlede DR4 MEF'er (se tabellen of Materials) en dag før blastocyst isolation.
      BEMÆRK: Disse MEF'er blev isoleret fra Tg (DR4) 1Jae / J-mus, der indeholder fire lægemiddel-selekterbare gener og bibringer resistens mod neomycin, puromycin, hygromycin, og 6-thioguanin 22.
      1. Påføre alle dyrkningsplader med 0,1% gelatine. Tilføje 0,1% gelatinetil dyrkningspladerne inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C i 5% CO2, og aspireres gelatineopløsningen. Frø en fjerdedel af et hætteglas med P2 MEF'er i en plade med 12 brønde og dyrke dem i 2 ml MEF medium (se tabel 1, Table of Materials) til et konfluent monolag 19.
      2. Inaktivere dem med mitomycin-C (10 ug / ml) i 3 timer og vaskes to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) 19.
    2. Under anvendelse af en mund pipette plade blastocysterne onto gelatinerede plader med 12 brønde (1 brønd / embryo), med mitomycin-C-behandlede MEF'er i SR-ES-celle-medium (2 ml / brønd) suppleret med enten 2 uM pluripotin eller med 2i (1 uM Erk inhibitor PD0325901 og 3 uM GSK3 inhibitor CHIR99021). Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2.
    3. Genopfriske SR-ES-celle-medium (suppleret med pluripotin eller 2i) hver 2 - 3 dage.
    4. Undersøg hver blastocyst under en stereomicroanvendelsesområde på 4,0x forstørrelse og kontrollere for skravering og fastgørelse til MEF lag.
      BEMÆRK: Når blastocyster luge, de mister zona pellucida, der indkapsler dem. Brønde med separate blastocyster skal opdateres ved hjælp af munden pipettering.
    5. Pick individuelle ICM udvækster (anvendelse af et stereomikroskop) efter 10 - 12 dages kultur under anvendelse af et P10 pipette med engangsspidser. Overfør udvæksten i ca. 10 pi medium til en V-formet, plade med 96 brønde indeholdende 30 pl / brønd PBS (ved stuetemperatur).
    6. Der tilsættes 50 pi af 0,25% trypsin til hver brønd med en multikanalpipette og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C i 5% CO2.
    7. Tilsæt 100 pi af FBS-holdigt Mesc medium; dissociere ICM udvækster i enkelte celler ved pipettering 10-15 gange; og overføre dissocierede celler til mitomycin-C-behandlede, 96-brønds MEF plader, der blev fremstillet dagen før ICM kolonier udtages.
    8. Fra dette trin og fremefter, OMI t pluripotin eller 2i fra Mesc medium. Den næste dag, ændre medium fra FBS- til SR-indeholdende Mesc medium (100 pi / brønd).
    9. Udvide de etablerede Mesc linjer fra 96- til 24-brønds format 19.
      1. Vask cellerne med 200 pi PBS, tilsættes 50 pi trypsin, og der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C i 5% CO Tilsæt 100 pi FBS-baserede Mesc medium.; dissocierer ved pipettering 10 - 15 gange under anvendelse af en multikanalpipette; og overføre dissocierede celler til mitomycin-C-behandlede, 24 brønde MEF plader.
      2. Skift til SR-baseret medie på den næste dag. Udvid mESCs på samme måde fra 24- til 6-brønds format. Gøre 3 - 4 freezings fra et sammenflydende 6-brønds plade 19.
    10. Identificere RMCE-kompatibel, homozygote KO mESCs anvendelse af PCR-primere for R26 locus 23 og KO allel af valg (i dette tilfælde, p120ctn; PCR'er for p120ctn null og floxet alleler blev beskrevet førlass = "xref"> 12).

tabel 1
Tabel 1. Kultur Medier. Alle medier blev opbevaret ved 4 ° C og opvarmet til 37 ° C 30 min før anvendelse.

2. Generation af en RMCE-kompatibel Målretning Vektor Brug Rekombination Kloning

  1. Klone redning konstruktioner i rekombinations-kompatible vektorer under anvendelse af restriktionsenzym (RE) -baseret eller PCR-baseret 24 kloningsteknikker. Sørg for, at cDNA'erne indeholder et stop-codon.
    1. Design attB-mærkede primere 24. Sikre, at den fremadrettede primer indeholder følgende elementer: en GGGG stretch, en AttB1 sted, en linker, en Kozak-sekvens, og ca. 25 nukleotider af rednings cDNA (startende med dets ATG). Sørge for, at den reverse primer har en lignende sammensætning: en GGGG strækning, en AttB2 site, en linker, og ca. 25 nucleotides af rednings cDNA (reverse komplement).
    2. Amplificere redning cDNA via PCR til opnåelse attB-flankeret cDNA.
    3. Udføre en 10-pi BP omsætning med 100 ng attB-flankeret cDNA og 150 ng af rekombination-kompatibel donor vektor, som indeholder et kanamycinresistensgen.
    4. Transform 5 pi BP blandinger i varmechok-kompetente MC1061 Escherichia coli (E. coli) bakterier (svarende til de beskrevet i trin 2.3).
    5. Identificere kolonier indeholdende de korrekte rescue cDNA-holdige vektorer (svarende til de beskrevet i trin 2.4)
  2. Udføre en 10-pi LR-reaktion under anvendelse af 100 ng af rednings- cDNA-indeholdende vektor; 150 ng af Cre-udskåret pRMCE-DV1 vektor 11 (LMBP 8195); og 2 pi af rekombinase mix, som indeholder en fag-kodet integrase og excisionase og en bakteriel integrationsværtsfaktor. Inkuber i 2 timer ved 25 ° C.
    BEMÆRK: Et LR-reaktion er en rekombination reagereion i hvilken en post klon indeholdende attL sites og en destination vektor indeholdende attR sites rekombineres af LR CLONASE enzymblandingen. Dette resulterer i et udtryk klon indeholdende attB flankerer genet af interesse.
  3. Transform 5 pi LR blandinger i varmechok--kompetente MC1061 E. coli-bakterier.
    1. Tilsættes 5 pi af LR blandinger til en ribbet, skirted, 2 ml skruelåg rør med 40 pi varmechok-kompetente E. coli-bakterier og inkuberes i 20 minutter på is. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
    2. Tilsæt 1 ml Luria-bouillon (LB) medium og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Plade 50 pi på ampicillin (Amp; 100 pg / ml) -holdige agarplader og vokse natten over ved 37 ° C.
  4. Identificere kolonierne med den korrekte vektor målretning.
    1. Pick 5 kolonier tilfældigt under anvendelse af en p200 spids. Overfør spidsen til et reagensglas indeholdende 2. - 5. ml LB-medium og vokse natten over ved 37 ° C.
    2. extarmkanalen plasmid-DNA'et fra de bakterielle kulturer ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits.
    3. Validere dem ved hjælp RE fordøjer og sekventering. Skåret 0,5-2 ug plasmid under anvendelse af 0,2 pi RE (20 U / pl) og 1 pi af den tilsvarende 10x buffer i et 10-ul reaktionssystem. Inkuber i mindst 1 time ved 37 ° C og separat på en 1% agarosegel. Selektere for kolonier med det forudsagte mønster af DNA-fragmenter.
      1. Analyser de bekræftede vektorer (50 ng / pl) med Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) og IRES R (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG) primere (5 pmol / pl) under anvendelse af Sanger-sekventering.

3. RMCE-medieret Mesc Målretning af Rescue Konstruerer til R26 Locus

  1. Start en kultur af RMCE-kompatible KO mESCs og passage dem mindst to gange på MEF i FBS-baserede Mesc medium. Split mESCs på en gelatineret 6-brønds plade.
  2. Den næste dag, opdatere cellerne, på omkring 50% sammenløb, med 1,5ml FBS-baserede Mesc medium og transficere mESCs med en Cre-udskåret pRMCE-DV1 targeting vektor indeholdende redning cDNA.
    1. Lav en DNA-mix. Tilsæt 1 ug targeting vektor og 1 ug FLPe-ekspressionsplasmid 25 til 250 pi ren DMEM-medium.
    2. Lav en lipofektion mix. Tilføje 7 pi af lipofektion-baseret transfektionsreagens (fx lipofectamin 2000) til 250 pi ren DMEM-medium og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
      BEMÆRK: Tilsvarende RMCE målretning effektiviteter blev opnået under anvendelse af andre lipofektions--baserede reagenser (fx Lipofectamine LTX og Effectene).
    3. Bland DNA-blandingen med lipofektion mix og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Pipette transfektionsblandingen onto opdateres mESCs. Bland forsigtigt og lad natten.
  3. En dag efter transfektion opdele alle mESCs fra 6-brønds plade til en 10 cm dyrkningsskål med et konfluent lag af DR4 MEF'er og 10 ml FBS-baserede mESC medium.
  4. To dage efter transfektion vælge Mesc kloner med den korrekte FLPe-medieret kassette udveksling ved tilsætning af 0,2 mg / ml G418 (100x) til mediet.
    BEMÆRK: Lav en kill kurve for hver batch af G418 for at identificere den laveste koncentration af G418, der dræber alle mESCs.
  5. Opdatere mESCs dagligt med G418-holdigt Mesc medium. Kolonier skal vises efter 7 - 10 dage, så vælg og udvide disse som pr trin 1.4.
  6. Bekræfte de korrekte kloner via PCR 11.

4. Differentiering af mESCs i embryoide legemer (EB)

  1. Start en kultur af KO mESCs med R26-drevne rednings-konstruktioner og passage dem mindst to gange på MEF i FBS-baserede Mesc medium. Passage mESCs gang på gelatinerede plader med 6 brønde til at slippe af MEF.
  2. Vask med PBS og Trypsinisér de næsten-konfluerende Mesc kulturer. Plade dissocierede mESCs i forskellige fortyndinger (1/20 og 1/40) på ikke-klæbende, bakteriel-grade kæledyrri-retter i differentieringsmedium.
  3. Tillad EB'er at danne i disse retter i 30 dage. Opdatere medium hver 2 - 3 dage under anvendelse af følgende procedure: overføre EB suspensionen til en 50 ml rør, lad EB'er bundfælde ved tyngdekraft, supernatanten fjernes, tilsættes frisk medium, og overfør EB suspensionen tilbage til et bakterielt-grade fad.
  4. Analyser de målrettede mESCs og EB'er ved immunofluorescens og transmissionselektronmikroskopi anvendelse af protokoller, der blev beskrevet tidligere 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fremgangsmåden til isolering RMCE-kompatibel KO Mesc linjer er afbildet i figur 2. To på hinanden følgende parringer skal indhente RMCE-kompatibel KO blastocyster. For det første er heterozygote KO mus krydset med RMCE-kompatibel mus for at opnå RMCE-kompatibel, heterozygote KO mus. Disse mus anvendes derefter til timede parringer med andre heterozygote KO mus for at opnå 3,5-dpc, RMCE-kompatibel, homozygote KO blastocyster. Muligheden for at opnå en sådan embryo er en ud af otte, som forudsagt af Mendelsk nedarvning. Derfor er en effektiv Mesc isolation påkrævede. Anvendelse pluripotin-baserede eller 2i-baserede protokoller, er vi i stand til at isolere mESCs linjer, herunder RMCE-kompatibel p120ctn KO mESCs, med en effektivitet på ca. 94% (n = 114 blastocyster) og 64% (n = 22 blastocyster), henholdsvis 12, 19. Typisk blastocyster luge efter mellem 3 og 6 dage i i wetro (DIV) kultur; dette efterfølges af fastgørelsen af ​​ICM udvækster til MEF'er eller gelatineovertrukne retter. På dag 12 er store ICM udvækster dannet at trofast give anledning til Mesc linier (figur 2). På grund af denne meget effektiv Mesc isolation procedure, er det muligt at opnå RMCE-kompatibel KO mESCs fra et eller to plugged hunner.

figur 2
Figur 2. Isolering af RMCE-kompatibel KO mESCs. (A) Avlsstrategi at opnå homozygote, RMCE-kompatibel KO mESCs. (B) Scheme of pluripotin- eller 2i-baserede Mesc isoleringsprocedure. Hvid skala bar: 25 pm. Sort skala stænger: 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

At kortlægge de domæner eller amino syrer inden et protein, der er vigtige for specifikke cellulære funktioner, kan man nu genindføre via RMCE, fuld længde eller mutante konstruktioner i KO mESCs og teste dem for deres evne til at tilbageføre det KO fænotype. Targeting vektorer for mange forskellige domæne mutanter og punktmutanter effektivt kan genereres ved rekombinatorisk kloning (figur 3A). Rekombinationskloning er baseret på erkendelsen af ​​specifikke binding (Att) DNA-sekvenser ved rekombinasen mix, som medierer en udveksling af Att-flankerede DNA-fragmenter mellem forskellige plasmider. Den rekombinationskloning systemet vælger rekombineret vektorer kun korrekt ved at skifte mellem vektorer, som indeholder forskellige antibiotika-resistensgener og ved at indsætte en kontra-selekterbar markør, "kontrol af celledød B" (CCDB) genet, i destination vektoren (figur 3A) . Vi har genereret over 25 Cre-udskåret pRMCE-DV1 targeting vektorer med en næsten 100% effektivitet (nogle eksempler enre vist i tabel 2).

tabel 2
Tabel 2. Oversigt over Målretning Vektor Samling og RMCE-medieret Mesc Målretning.

Forskellige rednings- konstruktioner indlejret i en cre-udskåret pRMCE-DV1 målvektor kan let målrettes til KO mESCs anvender RMCE (figur 3B). Vi tidligere rapporteret på genereringen af 133 målrettede Mesc kloner for 19 forskellige rednings-konstruktioner, der blev indført i R26 locus p120ctn KO mESCs via RMCE med en gennemsnitlig effektivitet på 93% 12. Her rapporterer vi om målretning af yderligere konstruktioner med lignende høje virkningsgrader, herunder et CAAX-mærket p120ctn 1A, epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT) inducere af SNAI og ZEB familie, og N-cadherin, i p120ctn KO mESCs ( tabel 2).

figur 3
Figur 3. RMCE-baserede Målretning i KO mESCs. (A) rekombinase-medieret samling af RMCE-kompatibel targeting vektorer. (B) Målretning af formodede rednings-konstruktioner til R26 locus i homozygote KO mESCs via RMCE. (C) PCR-baseret validering af RMCE målrettede Mesc kloner. DNA blev ekstraheret fra RMCE målrettet Mesc kloner og blev amplificeret ved PCR under anvendelse af en fremadrettet primer, der er indlejret i det endogene R26 locus og en revers primer, der er beliggende i den indkommende pRMCE-DV1 konstruktionen. En 560-bp bånd observeres for korrekt målrettede kloner. Ubekræftede kloner er vist i rødt. M1: 1 kb DNA-stige. M2: 1 kb Plus DNA-stige. Klik her for at se en større version af dette tal.

12. Cystisk EB morfologi kan anvendes som en fænotypisk udlæsning til at screene forskellige rednings- konstruktioner (figur 4A). Som proof of concept, viste vi, at R26-drevne p120ctn isoform 1A (R_p120_1A) kunne redde p120ctn KO fænotype (Figur 4B, 4C) 12. Desuden denne skærm identificerede Ecadherin, men ikke RhoA, er en afgørende partner for p120ctn under endoderm specifikation (figur 4B og C) 12. Den lette indføre redning konstruerer at p120ctn KO mESCs tilladt os at teste yderligere hypoteser. For det første ville Ecadherin-uafhængig membran forankring af p120ctn muliggøre cystisk EB formation? At testedette, vi fusioneret K-Ras membran-targeting motiv (CAAX) til carboxyterminalen af ​​p120ctn, introducerede det via RMCE at p120ctn KO mESCs og gjorde EB'er fra dem. Men denne konstrukt tjener en dominant negativ, der ikke tillader binding og stabilisering af E-cadherin (figur 4D), og som følge heraf ikke redde p120ctn KO fænotype (figur 4C). For det andet, er inducere af EMT involveret? EMT er et væsentligt udviklingsmæssig proces, som også forekommer under Mesc differentiering og er organiseret af de SNAI og ZEB familie af transskriptionsfaktorer, der direkte undertrykker forskellige epiteliale markørgener som Ecadherin 26, 27. I overensstemmelse med disse resultater, blev ekspressionen af EMT inducer ZEB2 fundet i kontrol EB'er, men ikke i p120ctn-nul EB'er (figur 4E). Ikke desto mindre, p120ctn KO mESCs med ROSA26-baserede udtryk for EMT-inducere ZEB1, ZEB2, eller Snail undladt at genoprette cysteic EB formation (figur 4C). For det tredje kan andre klassiske cadheriner, såsom N-cadherin, funktionelt erstatte Ecadherin under endoderm specifikationen? For at løse dette, blev N-cadherin rednings linjer genereret. Tidligere blev det vist, at ektopisk ekspression af E-cadherin i p120ctn KO EB'er delvist reddet dannelsen af cystisk EB'er 12. Interessant nok i en tilsvarende opstilling, tvunget N-cadherin ekspression undladt at redde (figur 4C og F), hvilket viser, at E-cadherin er den største cadherin subtype kræves til EB vedhæftning og ikke kan erstattes med N-cadherin. Disse ovennævnte eksempler fremhæver den lethed, hvormed biologiske spørgsmål kan løses af systemet.

figur 4
Figur 4. Fænotypisk Screening af RMCE målrettet Rescue mESCs. (A) Dannelse af cystiske EB'er (fanget ved lysmikroskopi; øverste rudels) og ordentlig endoderm polarisering i EB'er (opfanget ved transmissionselektronmikroskopi; bundpanel) blev anvendt som den fænotypiske udlæsning at teste evnen af ​​målrettede mESCs at redde p120ctn KO fænotype. Hvid skala bar: 25 pm. Målestokken sort: 200 um. (B) Oversigt over p120ctn rednings konstruktioner. p120ctn indeholder en central bæltedyr domæne, der består af ni bæltedyr gentagelser (blå bokse), der er flankeret af et N-terminalt domæne (NTD) og C-terminale domæne (CTD). p120ctn isoformer indeholde én ud af fire alternative startkodoner (pile), muligvis har kodes af alternativt anvendte exoner A og C (sorte bokse), og indbefatter eller udelukke to Rho GTPase bindende domæner (RBDS). p120ctn isoformerne 1A og 4A bruge det første og fjerde translationsstartstedet hhv. Positionen af ​​mutationer af vigtige AA og den kunstige tilsætning af en membran-targeting motiv (CAAX) er vist. EBD: Ecadherin bindingsdomæne. (C) Grafafbilder procentdelen af ​​basisk eller cystisk EB morfologi i p120ctn KO celler, som udtrykker forskellige R26-drevne rednings konstruktioner. (D) Immunofluorescensfarvning for p120ctn (muse monoklonalt anti-p120ctn) og E-cadherin (muse monoklonalt anti-E-cadherin) på kontrol G4 mESCs eller på p120ctn KO mESCs med R26-drevne ekspression af CAAX-tagget p120ctn isoform 1A. De mellemværker vise hele Mesc koloni. Skalasøjle: 10 um. (E) Immunhistokemi for ZEB2 (muse monoklonalt anti-ZEB2, 7F7; foretaget internt) på floxet (kontrol) og p120ctn KO EB'er. En 3,5 gange forstørrelse er vist i bundpanelerne. Skalasøjle: 200 um (øverst), 100 um (nederst). (F) Transmissionselektronmikroskopi af DIV12 EB'er fra p120ctn KO celler, der udtrykker E- eller N-cadherin fra R26 promotoren. Skalasøjle: 10 um. Klik her for at se en større version af denns figur.

Til slut, rapporterer vi på en pipeline af robuste teknologier, der kombinerer en næsten 100% effektivitet i Mesc isolation med målrettede vektor samling og Mesc målretning. Denne rørledning kan vi optrævle alsidigheden af ​​proteiner ved hjælp af struktur-funktions-undersøgelser i mESCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vores Mesc isolation metode er brugervenlig og kræver ikke avancerede færdigheder eller udstyr, såsom mikrokirurgi af blastocyster. Således er denne teknologi er tilgængelig for en stor del af det videnskabelige samfund. Enhver med grundlæggende cellekultur erfaring kan forplante ICM udvækster og etablere mESCs linjer. Men skylningen og håndtering af blastocyster kræver nogle praksis. En mundpipette bruges til at overføre blastocyster og består af en mikropipette, en mikropipette holder, slanger og en aspirator mundstykket 28. Mikropipetter kan custom-made ved opvarmning af fineste del af en Pasteur-pipette i et par sekunder, fjernelse pipetten fra flammen, og trække begge ender. Vælg nåle med en diameter lidt større end en blastocyst (100 - 200 um). Nåle kan genanvendes efter at være blevet vasket med destilleret vand (3x) og EtOH (3x). Det er vores erfaring, er effektiviteten af ​​pluripotin-baserede Mesc isolation højere i forhold til 2i-baserede protokoller 12. Men brugen af pluripotin ved høje koncentrationer er blevet vist at inducere genomisk ustabilitet 19.

RMCE-baserede R26-målretning i mESCs giver typisk 20 - 40 kolonier efter G418-selektion. Hvis der observeres flere kolonier, dette indebærer, at G418 koncentrationen ikke er optimal, og tillader ikke-målrettede mESCs at overleve, hvilket påvirker den samlede effektivitet målretning. Derfor anbefales det, at for hver Mesc linje og for hver ny G418 parti, er en drabskurve gjort for at identificere den laveste G418 koncentration, der dræber alle ikke-målrettede mESCs. Hvis der observeres ingen kolonier, dette er indikativ for en ineffektiv transfektion. I dette tilfælde er det værd at optimere transfektionsproceduren hjælp reporterplasmider, der tillader ekspressionen af ​​EGFP eller LacZ. Hvis transfektion protokol virker, men stadig ingen kolonier observeres, kontrolleres RMCE-kompatible og cre-udtaget pRMCE-DV1 vektor og FLPe eXPRESSION plasmid med RE fordøjelse og sekventering. Det er tilrådeligt at gøre en stor batch af forældrenes mESCs og FLPe vektor og at fryse flere portioner af dem til at reducere variation mellem eksperimenter.

En ulempe ved denne struktur-funktion strategi er, at rednings- konstruktioner ikke udtrykkes fra det endogene locus, men snarere fra inden ROSA26 locus, med en allestedsnærværende, moderat aktiv promotor. Sammenlignet med andre teknologier, hvor suprafysiologiske overekspression niveauer er ofte ses, dette system muliggør fysiologisk transgen ekspression, som er stabil under in vitro differentieringsforsøg og på tværs af forskellige cellelinier. Det blev observeret at heterozygot, ROSA26-medierede transgen ekspression resulterer i en p120ctn proteinekspression, der var omkring halvdelen af de endogene p120ctn niveauer af vildtype kontrol mESCs men der var tilstrækkelig til at redde den observerede p120ctn KO Fænotypers 12. Tilsvarende blev det demonstrated tidligere at en heterozygot, ROSA26-medieret Zeb2 transgenekspressionsniveau er tilstrækkeligt til at redde Zeb2 knockout fænotyper observeret in vitro og in vivo i forskellige cellelinier 29. En anden potentiel faldgrube er, at gener, der er uundværlige for Mesc selvfornyelse er ikke modtagelig for sådanne struktur-funktions studier. For at udelukke dette, anbefales det at karakterisere nyetablerede KO mESCs til følgende kriterier: spredning, kolonimorfologi og ekspressionen af ​​stemness gener. Det anbefales også at kontrollere ekspressionen af ​​genet af interesse, både i mESCs og i slægtsdestinerede celler.

Ud over at udføre struktur-funktionsundersøgelser i konstitutive KO mESCs kunne man også tage en betinget tilgang med Cre / loxP-systemet. Sidstnævnte fremgangsmåde muliggør en afstamning-specifikt KO uden at påvirke de omgivende og understøttende celler. Desuden betingede KO mESCs allow for udførelsen af ​​struktur-funktions-undersøgelser, hvis der er en fænotype i de konstitutive KO mESCs. At generere RMCE-kompatible, betingede-KO mESCs, homozygote Floxed mus med en celle-typespecifik Cre driver opdrættes med RMCE-kompatible mus; Mesc er isoleret fra deres afkom. Fordelen ved dette system er, at Cre-rekombinasen ikke udtrykkes i mESCs og kun bliver aktiv, når de mESCs differentieres i den respektive celle afstamning. I RMCE-kompatible, betinget-KO mESCs vil Cre rekombination inducerer samtidig inaktivering af det endogene gen og R26-drevet ekspression af redning konstruktionen ved anvendelse af en vektor betinget pRMCE-DV1 målretning (LMBP 08870) 11.

Desuden struktur-funktions system giver mulighed for studiet af mutationer, som er fundet i human sygdom og gør det muligt at teste virkningen af ​​disse mutationer på funktionerne af proteinet. Som et eksempel, har vi identificeret ZEB2 Mutationer i patienter med myeloproliferative neoplasme, gjort targeting vektorer, der indeholder disse ZEB2 mutanter, sendt dem til R26-locus i Zeb2 KO mESCs via RMCE, og undersøgte virkningen af mutationerne på stabiliteten af selve proteinet 30. Denne teknologi giver en større forståelse for biokemi af sådanne mutanter i mESCs, samt i en given slægt, da mESCs er pluripotente.

Afslutningsvis denne Mesc-baserede struktur-funktion tilgang er baseret på effektiv Mesc isolering og målretningsteknologi og muliggør identifikation af vigtige domæner og funktioner af et givet protein i en defineret biologisk sammenhæng. Ved at dele mus (frossen sæd er til rådighed efter anmodning) og plasmider (distribueret fra BCCM / LMBP og Addgene), vi ønsker at åbne denne teknologi til hele videnskabelige samfund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jinke D'Hont, Frederique van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire, og Riet De Rycke for deres fremragende tekniske support. Vi takker også Eef Parthoens, Evelien Van Hamme, og Amanda Goncalves fra Bioimaging Core Facility for Inflammation Forskningscenter for deres eksperthjælp. Vi anerkender medlemmer af vores forskningsgruppe for værdifulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af den belgiske Science Policy (Belspo universitetscenter Type polakker - Award IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), af Dronning Elisabeth Medical Foundation, Belgien (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), og af de samordnede Research aktioner (GOA 01G01908) af Ghent Universitet, Belgien (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG er en post.doc af Flandern forskningsmidler (FWO-V).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ROSALUC Mice made in house frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice made in house frozen sperm available upon request
Vessel probe Fine Science Tools 10160-13 to check for copulation plugs
M2 medium Sigma-Aldrich M7167 make aliquots and store at -20 °C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) Fine Science Tools 11251-10 spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23 G needles Fine-ject 8697
1-mL syringes Soft-ject 6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)  Gosselin BB60-01
Mouth pipette made in house see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) ATTC SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice The Jackson Laboratory 3208
Mitomycin C  Sigma-Aldrich M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice JAX 3208 mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin Sigma-Aldrich G1393 Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C.
Trypsin (0.25%)  Gibco 25200-056
2 μM pluripotin Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08870 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08195 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  Addgene 20733
heat-shock competent DH5α bacteria  made in house
Gateway pDONR221 vector Thermo Fisher 12536-017 contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix Thermo Fisher 11789-020
LR clonase II mix Thermo Fisher 11791-020 
Luria Broth (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer Thermo Fisher 3730XL
G418 Thermo Fisher 11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent Thermo Fisher 15338100
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
GATEWAY pENTR 1A vector Thermo Fisher A10462 recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody BD Transduction Laboratories 610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody BD Transduction Laboratories 610181
General equipment
Sterile dissection tools fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL
15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) 
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) 
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light 
Culture media
MEF Medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 41965-062
10% fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-7524
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
Sodium pyruvate  (0.4 mM) Gibco 11360-039 
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
SR-based mESC medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
DMEM/F12 Gibco 31330-038 mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR) Gibco 10828–028
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
0.1 mM non-essential amino acids  Gibco 11140-050
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
β-mercaptoethanol (0.1 mM)  Sigma-Aldrich M 3148 
2,000 U/mL recombinant mouse LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM Gibco 10829-018 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
Differention Medium stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 21980-032 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid   Gibco 11279-023 
2 mM L-glutamine Gibco 25030-024 
0.4 mM 1-thioglycerol Sigma-Aldrich M-6145
50 μg/mL ascorbic acid Sigma-Aldrich A-4544 
penicillin (100 U/mL) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/mL) Gibco 15140-122 
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901  Axon Medchem Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
  4. Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
  5. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
  6. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  7. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  8. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  9. Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
  10. Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
  11. Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
  12. Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
  13. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  14. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
  15. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
  16. Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
  17. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
  18. Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
  19. Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
  20. Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
  21. Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
  22. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
  23. Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
  24. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  25. Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
  26. Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
  27. Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2016).
  28. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third edn (2003).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
  30. Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. (2016).
Struktur og funktion Studier i embryonale stamceller fra mus Brug rekombinase-medieret Cassette Exchange
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).More

Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter