Summary
Proteiner inneholder ofte flere domener som kan utøve ulike cellulære funksjoner. Gene knock-outs (KO) betrakter ikke dette funksjonelle mangfold. Her rapporterer vi en rekombinasjon-mediert kassett utveksling (RMCE) -basert struktur-funksjonsmetoden i KO-embryonale stamceller som gjør det mulig for den molekylære disseksjon av forskjellige funksjonelle domener eller varianter av et protein.
Abstract
Gene teknikk i museembryoer eller embryonale stamceller (mESCs) gjør det mulig å studere funksjonen av et gitt protein. Proteiner er arbeidshester av cellen og ofte bestå av flere funksjonelle domener, som kan påvirkes av post-translasjonelle modifikasjoner. Uttømming av hele proteinet i kondisjon eller konstitutiv knock-out (KO) mus som ikke tar hensyn til denne funksjonell diversitet og regulering. En Mesc linje og en avledet musemodell, hvor en festestedet for FLPe rekombinasjon-mediert kassett utveksling (RMCE) ble innført i ROSA26 (R26) locus, ble tidligere rapportert. Her rapporterer vi på en struktur-funksjon tilnærming som gjør det mulig for molekylær disseksjon av de ulike funksjonene i en multidomain protein. For å oppnå dette, må RMCE-kompatible mus krysses med KO mus og deretter RMCE-kompatible KO mESCs må isoleres. Deretter kan et panel av antatte rednings konstruksjoner innføres i R26 locus via RMCE targeting. Kandidat-rednings cDNA kan enkelt settes inn mellom RMCE områder av den målsøkende vektor ved hjelp av rekombinasjon kloning. Deretter blir KO mESCs transfektert med den målsøkende vektor i kombinasjon med et FLPe rekombinase ekspresjonsplasmid. RMCE reaktiverer den promoter-mindre neomycin-resistensgenet i ROSA26 tilkoblings områder og muliggjør valg av den riktige målretting arrangementet. På denne måten blir høy målretting virkningsgrader nær 100% oppnådd, som tillater innføring av flere mulige rednings konstruksjoner i en semi-høy gjennomstrømning måte. Endelig kan et mangfold av R26-drevne rednings konstruksjoner bli testet for deres evne til å redde den fenotype som ble observert i foreldre KO mESCs. Vi presenterer et bevis-for-prinsipp struktur-funksjon studie med p120 catenin (p120ctn) KO mESCs ved hjelp endoderm differensiering i embryoidlegemene (EBS) som fenotypiske avlesning. Denne tilnærmingen muliggjør identifikasjon av viktige områder, antatte nedstrøms trasé, og sykdomsrelevant punktmutasjoner som ligger til grunn KO fenotyper for et gitt protein.
Introduction
Det er anslått at pattedyr-genomer inneholder omtrent 20.000 protein-kodende gener. Alternativ spleising og posttranslasjonelle modifikasjoner ytterligere øke protein repertoaret. Proteiner har en modulær konstruksjon 1 og ofte inneholde flere interaksjons domener, noe som tillater deres rekruttering i forskjellige proteinkomplekser og deres deltagelse i flere cellulære prosesser 2. Et eksempel er den multifunksjonelle proteiner kjent p120ctn. p120ctn kodes for av Ctnnd1 gen og består av et stort sentralt armadillo gjenta domene flankert av en N-terminal og en C-terminal region. Armadillo domene av p120ctn binder seg til en høyt konservert juxtamembrane domene av klassiske cadheriner som er involvert i celle-celle-adhesjon, men det binder også til den transkripsjon repressoren Kaiso. Det N-terminale domenet av p120ctn samvirker med forskjellige kinaser, fosfataser, små RhoGTPases og mikrotubul-assosiert proteins tre. Det er interessant som et resultat av alternativ spleising, p120ctn isoformer kan genereres fra fire alternative startkodoner 4. p120ctn isoform 1A er den lengste, som det er oversatt fra den mest-5' startkodon og inneholder full-lengde N-terminal segmentet. I p120ctn isoformer 3 og 4 er denne N-terminale segment slettes helt henholdsvis delvis og. Å forstå den nøyaktige rolle av proteiner (eller protein isoformene) og deres domenene i forskjellige cellulære funksjoner er fortsatt en utfordring.
Gen-målsøking i mESCs gjør det mulig å studere funksjonen til et protein gjennom den genetiske delesjon av det tilsvarende genet og har bidratt mye til identifisering av utviklingsmessig viktige og sykdom-relevante gener og veier. Dette gjennombrudd i revers genetikk var et resultat av fremskrittene innen feltene Mesc isolasjon og gen-målsøking som følge av homolog rekombinasjon 5 6, 7, men dessverre disse er tilbøyelige til off-target effekter 8. En mer pålitelig teknikk for å muliggjøre gen-målsøking er RMCE, som er basert på setespesifikke rekombinasjon systemer som Cre / loxP eller FLPe / Frt. LoxP og Frt sekvens er funnet i bakteriofag P1 og Saccharomyces cerevisiae, henholdsvis, og består av 34 bp, inkludert et asymmetrisk 8 bp-sekvens som bestemmer orienteringen av området. På den annen side, kan orienteringen av, for eksempel, to loxP-seter innenfor et DNA strekning vil avgjøre hvorvidt den floxed DNA blir kuttet ut eller jegnversed ved Cre-formidlet rekombinasjon 9. Videre kan Cre også indusere en trans hvis to stedene ligger på forskjellige kromosomer. RMCE utnyttet heterospecific rekombinasjonsseter som ikke kryssreagerer og som er innebygd i et genom-locus. I nærvær av en donor plasmid som inneholder et DNA-fragment flankert av de samme heterospecific steder, vil den rekombinasen sette inn dette DNA-fragment i RMCE-kompatible genomiske lokuset på grunn av dobbel-samtidig translokasjon (figur 1). Her kan bare korrekt RMCE rettede kloner gjengi medikamentresistens, takket være en promoter på den innkommende vektoren som gjenoppretter en "fanget" promoter-mindre neomycin resistensgenet (neo R) som er tilstede i R26 genomet av dokkings-celler (Figur 1) 10, 11. Dette resulterer i en meget høy effektivitet målretting, ofte nær 100% 11 </ sup> 12. Som konklusjon, er RMCE basert målretting svært effektiv og kan anvendes for struktur-funksjoner studier; Men det krever en pre-utviklet genomisk locus.
Figur 1. Skjematisk representasjon av RMCE-mediert målretting. RMCE tillater utveksling av DNA-segmenter fra en innkommende målsøkende vektor til en definert genomisk locus hvis begge huse to heterospecific FRT steder (vist med hvite og røde trekanter). I tillegg inneholder det konstruerte genomiske lokuset en promoterfrie og avkortet neomycin-resistens (Neo R) genet. Ved å tilveiebringe en promoter og startkodon i den innkommende DNA-fragment, kun korrekt rekombinasjonshendelser gjenopprette neomycinresistens, som resulterer i høye målretting effektivitet. Klikk her for å se en større versjon av thans skikkelse.
Genome engineering i mESCs tillater generering av RMCE-kompatibel mus. I 1981 ble to grupper lyktes å pluripotente celler fra den indre cellemasse (ICM) av blastocyster, og i å opprettholde dem i kultur 13, 14. mESCs er i stand til selvfornyelse og differensiering i alle typer av embryonale og voksne celler, inkludert bakterie-cellelinjen. Derfor, gen-målsøking i mESCs muliggjør revers-genetiske studier gjennom utviklingen av konstitutive eller betingede (ved bruk av Cre / loxP-system) KO-mus. Imidlertid er den klassiske metoden for å isolere muse-ES-celler er svært ineffektiv. Flere store forbedringer har sterkt øket suksessraten for utledning av Mesc linjer, inkludert bruk av et definert serum erstatning (SR) medium 15, alternerende mellom Mesc medium inneholdende SR og føtalt bovint serum (FBS) 16, og bruken av farmakologiskelogiske forbindelser slik som pluripotin eller 2i 17. Pluripotin, en liten syntetisk molekyl, tillater forplantning av mESCs i en udifferensiert tilstand i fravær av leukemi-inhiberende faktor (LIF) og muse-embryonale fibroblaster (MEFs) 18. Endelig har det vist seg at mESCs kan isoleres med en meget høy virkningsgrad (tilnærmet 100%) ved en SR / FBS-medium alternering protokoll er kombinert med LIF og pluripotin 19, 20. Disse protokollene muliggjøre effektiv isolering av RMCE-kompatible KO mESCs som senere kan brukes for struktur-funksjonsstudier.
Dette dokumentet beskriver en metode som gjør det mulig å identifisere de viktigste domener eller ester i et protein som er ansvarlig for spesifikke cellulære prosesser. For dette formål er en rørledning av avansert teknologi som muliggjør effektiv Mesc isolasjon, målsøkende vektor montasje, og Mesc målretting var skaped. Som sådanne store paneler med proteinisoformer, domene mutanter, og nedstrøms effektorer kan innføres i KO mESCs og kan evalueres for deres evne til å redde in vitro KO fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøk på mus ble gjennomført i henhold til institusjonelle, nasjonale og europeiske dyre forskrifter.
1. Isolering av RMCE-kompatible KO mESCs
- Avle heterozygote KO-mus med RMCE-kompatibel mus, slik som ROSALUC mus 10 eller ROSA26-IPSC mus 21. Begge RMCE-kompatibel mus ble opprettholdt på en blandet 129 / C57BL6 / sveitsiske bakgrunn.
MERK: Kryssing med heterozygote KO mus anbefales å overvinne embryonale dødelighet i homozygot KO mus. - Bruke PCR for å velge heterozygote KO mus inneholdende en RMCE kassett i R26 locus 12.
- Breed RMCE-kompatibel, heterozygote KO-mus med heterozygote KO-mus, og isolere RMCE-kompatibel, homozygote KO-blastocyster.
- Sett opp tidsparringer i kveld og se etter copulation plugger neste morgen.
MERK: Plugger er laget av koagulert sekreter fra det koagulerende og vesikulær kjertler av det mannlige.Disse pluggene fylle vagina av den kvinnelige og vedvarer i 8 - 24 timer etter avl. Pluggede hunner er ansett for å være bærer 0,5 dpc (dager etter samleie) embryoer.- For å kontrollere for plugger, løfter den kvinnelige ved bunnen av halen og ved å undersøke sin vaginalåpningen for et hvitaktig masse. Spre leppene av vulva litt med en vinklet probe når pluggen er vanskelig å se. Separate plugget kvinner fra deres mannlige.
- Samle blastocyster på 3,5 DPC.
- Avlive gravide hunner av den godkjente metode (f.eks halsdislokasjon). Lag en midventral snitt og dissekere livmor og eggledere (fortsatt festet til hverandre) med fin saks og pinsett.
- Bøy en 26 gauge nål inn i en 45 ° vinkel. Fest en 1-ml sprøyte fylt med M2 medium til dette bøyd nål og bruke den til å tømme blastocyster fra livmoren inn i lokket på en 10-cm skål.
- Sett nålen inn i enden av livmor som er nærmestegglederen. Holde nålen på plass med fin pinsett mens skyve stempelet; hevelse av livmoren indikerer en vellykket spyling.
- Bruk en munn pipette (med en diameter på 100 - 200 pm) for å samle alle embryoer og vasker dem to ganger i en dråpe av friskt medium M2. Umiddelbart etter å ha vasket dem, overføre blastocystene til kulturplater (se nedenfor).
MERK: disseksjon og håndtering av blastocyster av bør gjøres i laminær luftstrøm.
- Sett opp tidsparringer i kveld og se etter copulation plugger neste morgen.
- Isoler RMCE-kompatibel KO mESCs
- Fremstill en 12-brønns plate med mitomycin-C-behandlede DR4 MEFs (se tabell of Materials) en dag før blastocysten isolasjon.
MERK: Disse MEFs ble isolert fra Tg (DR4) 1Jae / J-mus som inneholder fire medikament valgbar gener og gir resistens mot neomycin, puromycin, hygromycin, og 6-tioguanin 22.- Belegge alle kulturplatene med 0,1% gelatin. Tilsett 0,1% gelatintil kulturplatene, inkuber i 5 minutter ved 37 ° C i 5% CO2, og aspireres gelatinoppløsningen. Seed en fjerdedel av en ampulle av P2 MEFs i en 12-brønns plate og dyrke dem i 2 ml MEF-medium (se tabell 1, Table of Materials) til et sammenflytende monolag 19.
- Inaktivere dem med mitomycin-C (10 ug / ml) i 3 timer og vasker dem to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) 19.
- Ved hjelp av en munn pipette, PLATE blastocyster bort på gelatinerte 12-brønners plater (en brønn / embryo), med mitomycin-C-behandlede MEFs i SR-ES-cellemedium (2 ml / brønn) supplert med enten 2 uM pluripotin eller med 2i (1 uM Erk inhibitor PD0325901 og 3 uM GSK3p-inhibitor CHIR99021). Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2.
- Oppdatere SR-ES celle medium (supplert med pluripotin eller 2i) hver 2 - 3 dager.
- Undersøk hver blastocyst under en stereomicroOmfanget ved 4,0x forstørrelse og se etter klekking og festing til MEF lag.
MERK: Når blastocysts luke, de mister zona pellucida som omslutter dem. Brønner med fristilt blastocysts må oppdateres ved hjelp av munn pipettering. - Plukke individuelle ICM utvekster (ved hjelp av et stereomikroskop) etter 10 - 12 dagers dyrking ved anvendelse av en pipette P10 med engangsspisser. Overfør den utvekst på ca. 10 ul av medium til en V-formet, 96-brønners plate inneholdende 30 ul / brønn av PBS (ved romtemperatur).
- Tilsett 50 ul av 0,25% trypsin i hver brønn med en multikanal pipette og inkuberes i 3 min ved 37 ° C i 5% CO2.
- Tilsett 100 FBS-inneholdende Mesc medium; dissosiere ICM utvekster til enkeltceller ved å pipettere 10-15 ganger; og overfører de dissosierte cellene til mitomycin-C-behandlede, 96-brønn MEF-plater som ble fremstilt i en dag før de ICM kolonier blir plukket.
- Fra dette trinnet og utover, omi t pluripotin eller 2i fra Mesc medium. På den neste dag, bytter mediet fra FBS- til SR-holdig Mesc medium (100 pl / brønn).
- Utvide de etablerte Mesc linjene fra 96- til 24-brønners format 19.
- Vask cellene med 200 ul av PBS, tilsett 50 ul trypsin, og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C i 5% CO Tilsett 100 ul av FBS-baserte Mesc medium.; dissosierer ved å pipettere 10 - 15 ganger ved anvendelse av en multikanal pipette; og overfører de dissosierte cellene til mitomycin-C-behandlede, 24-brønn MEF platene.
- Bytt til SR-basert medium på neste dag. Utvid mESCs på en lignende måte fra 24- til 6-brønners format. Gjør 3 - 4 freezings fra et konfluent 6-brønns plate 19.
- Identifisere RMCE-kompatibel, homozygote KO mESCs ved hjelp av PCR-primere for R26 locus 23 og KO allel av valg (i dette tilfellet, p120ctn; PCR for p120ctn null og floxed alleler ble beskrevet førlass = "ekstern referanse"> 12).
- Fremstill en 12-brønns plate med mitomycin-C-behandlede DR4 MEFs (se tabell of Materials) en dag før blastocysten isolasjon.
Tabell 1. Culture Media. Alle medier ble lagret ved 4 ° C og oppvarmet til 37 ° C i 30 minutter før bruk.
2. Frembringelse av en RMCE-kompatibel målsøkende vektor ved hjelp av rekombinasjon Cloning
- Klone redning konstruksjonene inn i rekombinasjons-kompatibel vektorer ved bruk av restriksjonsenzym (RE) -baserte eller PCR-baserte 24 kloningsteknikker. Pass på at cDNA inneholder et stoppkodon.
- Design AttB-merket primere 24. Sørge for at den fremre primer inneholder følgende elementer: en GGGG strekk, en AttB1 språk, en linker, en Kozak-sekvens, og omtrent 25 nukleotider av rednings cDNA (som starter med sin ATG). Sørge for at reversprimeren har en lignende sammensetning: en GGGG strekning, en AttB2 område, en linker, og ca 25 NUCleotides rednings cDNA (reverse komplement).
- Amplifisere cDNA rednings via PCR for å oppnå AttB-flankert cDNA.
- Utføre en 10-mL BP reaksjon med 100 ng av AttB-flankert cDNA og 150 ng av rekombinasjonen-kompatible donor-vektor, som inneholder et kanamycin-resistensgen.
- Transform 5 ul av BP blandingene i varmesjokk-kompetent MC1061 Escherichia coli (E. coli) bakterier (lik de som er beskrevet i trinn 2.3).
- Identifisere kolonier inneholdende de riktige rednings cDNA-inneholdende vektorer (lik de som er beskrevet i trinn 2.4)
- Utføre en 10-mL LR reaksjon ved anvendelse av 100 ng av rednings cDNA-inneholdende vektor; 150 ng av Cre-utskåret pRMCE-DV1 vektoren 11 (LMBP 8195); og 2 ul av rekombinase blanding, som inneholder en fag-kodet integrase og excisionase og en bakteriell vert integrering faktor. Inkuber i 2 timer ved 25 ° C.
MERK: En LR reaksjon er en rekombinasjon reagereion i hvilken en inngangs klon inneholdende attL områder og et bestemmelsessted vektor som inneholder attr områder blir rekombinert av LR clonase enzymblanding. Dette resulterer i et uttrykk klon inneholdende attB seter som flankerer genet av interesse. - Transform 5 ul av LR blandingene i varmesjokk-kompetent MC1061 E. coli-bakterier.
- Tilsett 5 ul av LR blandinger til en riflet, iog 2-ml rør med skrukork med 40 ul av varmesjokk-kompetent E. coli-bakterier og inkuberes i 20 min på is. Inkuber i 5 min ved 37 ° C.
- Tilsett 1 ml av Luria-buljong (LB) medium og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Plate 50 ul med ampicillin (AMP; 100 pg / ml) -holdige agarplater og vokse over natten ved 37 ° C.
- Identifisere kolonier med riktig målsøkende vektor.
- Pick 5 kolonier vilkårlig ved hjelp av en P200 spiss. Overfør spissen til et prøverør av glass inneholdende 2-5 ml av LB-medium og vokse over natten ved 37 ° C.
- exproselyttering plasmid-DNA fra bakteriekulturer av kommersielt tilgjengelige sett.
- Validere dem ved hjelp RE fordøyer og sekvensering. Skjær 0,5 til 2 ug plasmid ved bruk av 0,2 mL av RE (20 U / pl) og 1 pl av den tilsvarende 10 x buffer i 10 ul reaksjon. Inkuber i minst 1 time ved 37 ° C og atskilt på en 1% agarosegel. Selektere for kolonier med den forutsagte mønster av DNA-fragmenter.
- Analysere de bekreftede vektorene (50 ng / ul) med Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) og IRES R (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG) primere (5 pmol / ul) ved hjelp av Sanger-sekvensering.
3. RMCE-mediert Mesc Målretting av rednings konstruksjoner som den R26 Locus
- Start en kultur for RMCE-kompatibel KO mESCs og passasje dem minst to ganger på MEFs i FBS-baserte Mesc medium. Dele mESCs på en gelatin seks-brønns plate.
- På neste dag, oppdatere cellene, på om lag 50% konfluens, med 1,5ml FBS-baserte Mesc medium og transfektere mESCs med en Cre-skåret ut pRMCE-DV1 målsøkende vektor som inneholder cDNA redning.
- Lag en DNA mix. Tilsett 1 ug av målsøkende vektor og 1 ug FLPe-ekspresjonsplasmid 25 til 250 ul av ren DMEM-medium.
- Lag en lipofeksjon mix. Legg til 7 ul av lipofeksjon basert transfeksjon reagens (f.eks Lipofectamine 2000) til 250 ul av ren DMEM-medium og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
MERK: Lignende RMCE målretting virkningsgrader ble oppnådd ved bruk av andre lipofeksjon-reagenser (f.eks Lipofectamine LTX og Effectene). - Bland DNA blandes med lipofeksjon blandingen og inkuberes i 20 minutter ved RT. Pipetter transfeksjon blandingen på den oppdaterte mESCs. Virvle forsiktig og la over natten.
- En dag etter transfeksjon, delt alle mESCs fra 6-brønns plate til en 10-cm kulturskål med et konfluent lag av DR4 MEFs og 10 ml FBS-baserte mESC medium.
- To dager etter transfeksjon, velger Mesc kloner med den korrekte FLPe-mediert kassett utveksling ved tilsetning av 0,2 mg / ml G418 (100x) til mediet.
MERK: Lag en kill kurve for hvert parti av G418 til å identifisere den laveste konsentrasjon av G418 som dreper alle mESCs. - Oppdatere mESCs daglig med G418-holdig Mesc medium. Kolonier skal vises etter 7 - 10 dager, så velg og utvide disse som per trinn 1.4.
- Bekrefte korrekte kloner via PCR-11.
4. Differensiering av mESCs i embryoidlegemer (EBS)
- Start en kultur av KO mESCs med R26-drevne rednings konstruksjoner og passasje dem minst to ganger på MEFs i FBS-baserte Mesc medium. Passage de mESCs gang på gelatin seks-brønns plater for å kvitte seg med MEFs.
- Vask med PBS og trypsineres de nesten sammenflytende kulturer Mesc. Plate dissosierer mESCs i forskjellige fortynninger (1/20 og 1/40) kopieres på ikke-klebende, bakteriell grad petRi-retter i differensieringsmedium.
- Tillat EBS å danne i disse rettene i 30 dager. Oppfriske medium hver 2 - 3 dager under anvendelse av følgende prosedyre: overføre EB suspensjonen til en 50-ml tube, la EBS slå seg ned ved tyngdekraften, fjern supernatanten, tilsett friskt medium, og overføre EB suspensjon tilbake til en bakteriell grad matrett.
- Analyser målrettede mESCs og EBS ved immunfluorescens og transmisjonselektronmikroskopi ved anvendelse av protokoller som er beskrevet tidligere 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåten for å isolere RMCE-kompatibel KO Mesc linjer er vist i figur 2. To påfølgende ynglinger er nødvendig for å oppnå RMCE-kompatibel KO blastocyster. Først blir heterozygote KO mus krysset med RMCE-kompatible mus for å oppnå RMCE-kompatibel, heterozygot KO-mus. Disse mus ble så brukt for tidsbestemt parringer med andre heterozygote KO-mus for å oppnå 3,5-DPC, RMCE-kompatibel, homozygote KO-blastocyster. Sjansen for å få en slik embryo er en av åtte, som forutsagt ved mendelsk arv. Derfor er en effektiv Mesc isolasjonsprotokoll er nødvendig. Ved hjelp av pluripotin baserte eller 2i-baserte protokoller, er vi i stand til å isolere mESCs linjer, inkludert RMCE-kompatibel p120ctn KO mESCs, med en effektivitet på ca 94% (n = 114 blastocyster) og 64% (n = 22 blastocyster), respektivt 12, 19. Vanligvis blastocyster luke etter mellom 3 og 6 dager i i VItro (DIV) kultur; Dette blir etterfulgt av festet av ICM utvekster til MEFs eller til gelatin-belagte retter. På dag 12 blir store ICM utvekster utformet som nøyaktig gir opphav til Mesc linjer (figur 2). På grunn av denne svært effektiv Mesc isoleringsfremgangsmåten, er det mulig å oppnå RMCE-kompatibel KO mESCs fra ett eller to plugget hunner.
Figur 2. Isolering av RMCE-kompatibel KO mESCs. (A) Avl strategi for å oppnå homozygote, RMCE-kompatible KO mESCs. (B) Reaksjonsskjema for pluripotin- eller 2i basert Mesc isoleringsprosedyren. Hvit skala bar: 25 mikrometer. Svart skala barer: 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Å kartlegge de domener eller amino syrer innenfor et protein som er viktig for spesifikke cellulære funksjoner, kan man nå gjeninnføre, via RMCE, full-lengde eller mutante konstrukter Ko mESCs og teste dem for deres evne til å tilbakestille KO fenotype. Målretting mot vektorer for mange ulike domener mutanter og punktmutanter effektivt kan genereres ved rekombinasjon for kloning (figur 3A). Rekombinasjon for kloning er basert på anerkjennelsen av spesifikke feste (Att) DNA-sekvenser av rekombinasen blanding, som formidler en utveksling av Att-DNA-fragmenter flankert mellom forskjellige plasmider. Den rekombinasjon for kloning systemet velger bare korrekt rekombinert vektorer ved å veksle mellom vektorer som inneholder forskjellige antibiotika-resistens gener og ved å sette inn en teller-selekterbar markør, "kontroll av celledød B" (CCDB) genet, inn i destinasjonsvektor (figur 3A) . Vi har generert over 25 Cre-skåret ut pRMCE-DV1 målretting vektorer med en nær 100% effektivitet (noen eksempler noenre er vist i tabell 2).
Tabell 2. Oversikt over Targeting Vector Montering og RMCE-mediert Mesc målretting.
Forskjellige konstruksjoner rednings innleiret i en CRE-skåret ut pRMCE-DV1 målsøkende vektor kan lett bli målrettet til KO mESCs ved hjelp RMCE (figur 3B). Vi har tidligere rapportert på genereringen av 133 målrettede Mesc kloner for 19 forskjellige rednings konstruksjoner som ble introdusert inn i R26 geometriske sted for p120ctn KO mESCs via RMCE med en gjennomsnittlig virkningsgrad på 93% 12. Her rapporterer vi har for innretningen av ytterligere konstruksjoner med tilsvarende høy effektivitet, inkludert en CAAX-tagget p120ctn 1A, epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) induktorer av den Snai og ZEB familie, og N-cadherin, i p120ctn KO mESCs ( Tabell 2).
Figur 3. RMCE basert målretting i KO mESCs. (A) rekombinase-mediert montering av RMCE-kompatible målrettet mot vektorer. (B) målretting av antatte rednings konstruksjoner til R26 geometriske sted for homozygote KO mESCs via RMCE. (C) PCR-baserte validering av RMCE målrettede Mesc kloner. DNA ble ekstrahert fra RMCE-målrettede Mesc kloner og ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av en forover-primer som er innebygd i den endogene R26 locus og en revers primer som er plassert i den innkommende pRMCE-DV1 konstruksjonen. En 560-bp bånd observert for riktig måls kloner. Ubekreftede kloner er vist i rødt. M1: stige 1 kb DNA. M2: 1 kb Plus DNA stigen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
12. Cystisk EB morfologi kan brukes som en fenotypisk avlesning for å screene forskjellige rednings konstruksjoner (Figur 4A). Som bevis på konseptet, viste vi at R26-drevet p120ctn isoform 1A (R_p120_1A) kunne redde p120ctn KO fenotype (Figur 4B, 4C) 12. I tillegg har denne skjerm-identifisert E-cadherin, men ikke RhoA, er en avgjørende partner av p120ctn under endoderm spesifikasjon (figur 4B og C) 12. Den enkle å innføre redning konstruerer å p120ctn KO mESCs tillatt oss å teste flere hypoteser. For det første vil E-cadherin-uavhengig membran forankring av p120ctn mulig cystisk EB formasjon? Å testedenne, smeltet vi K-Ras-membran målretting motiv (CAAX) til karboksyterminus p120ctn, innføres det via RMCE til p120ctn KO mESCs, og laget EBS fra dem. Men denne konstruksjon tjener en dominant negativ som ikke tillater binding og stabilisering av E-cadherin (figur 4D) og, som en konsekvens, ikke redde p120ctn KO fenotypen (figur 4C). For det andre er indusere av EMT involvert? EMT er en vesentlig dannelsesprosessen som også oppstår under Mesc differensiering og er organisert ved Snai og ZEB- familie av transkripsjonsfaktorer, som direkte undertrykker forskjellige epitelceller markørgener som E-cadherin 26, 27. I samsvar med disse funn ble ekspresjonen av EMT inducer ZEB2 oppdaget i kontroll EBS, men ikke i p120ctn-null EBS (figur 4E). Likevel p120ctn KO mESCs med ROSA26 baserte uttrykk for EMT indusere ZEB1, ZEB2 eller Snail ikke klarte å gjenopprette cysteic EB dannelse (Figur 4C). For det tredje, kan andre klassiske cadheriner, slik som N-cadherin, funksjonelt erstatte E-cadherin under endoderm spesifikasjonen? For å løse dette ble N-cadherin rednings linjer generert. Tidligere ble det vist at den ektopiske ekspresjon av E-cadherin i p120ctn KO EBS delvis reddet dannelsen av cystisk EBS 12. Interessant, i et tilsvarende oppsett, tvinges N-cadherin uttrykk ikke klarte å redde (figur 4C og F), som indikerer at E-cadherin er den viktigste cadherin-subtypen som kreves for EB adhesjon og kan ikke bli erstattet av N-cadherin. Disse ovennevnte eksemplene markere den enkle som biologiske spørsmål kan løses ved systemet.
Figur 4. Fenotypisk Screening av RMCE målrettede Rednings mESCs. (A) Dannelse av cystiske EBS (fanges opp ved hjelp av lysmikroskopi, øvre rutels) og riktig endoderm polarisering i EBS (fanges opp ved transmisjonselektronmikroskopi, bunnpaneler) ble anvendt som den fenotypiske avlesning for å teste muligheten til målrettet mESCs å redde p120ctn KO fenotype. Hvit skala bar: 25 mikrometer. Svart skala bar: 200 mikrometer. (B) Oversikt over p120ctn rednings konstruksjoner. p120ctn inneholder en sentral armadillo domene, som består av ni armadillo gjentagelser (blå bokser), som er flankert av et N-terminalt domene (NTD) og C-terminalt domene (CTD). p120ctn isoformer inneholder en av fire alternative startkodoner (piler), eventuelt utstyrt med sekvenser som blir kodet av alternativt brukes eksoner A og C (svarte bokser), og inkludere eller utelukke to Rho GTPase-bindende domener (RBDs). p120ctn isoformer 1A og 4A bruke den første og fjerde translasjons-initiering setet, hhv. Posisjonen til mutasjoner av viktige AA og kunstig tilsetning av en membran-målretting motiv (CAAX) er vist. EBV: E-cadherin bindingsdomene. (C) Diagramsom viser prosentandelen av grunnleggende eller cystisk EB morfologi i p120ctn KO-celler som uttrykker forskjellige R26-drevne rednings konstruksjoner. (D) immunofluorescensfarging for p120ctn (monoklonalt muse-anti-p120ctn) og E-cadherin (muse-monoklonalt anti-E-cadherin) på styre G4 mESCs eller på p120ctn KO mESCs med R26-drevet ekspresjon av CAAX-merket p120ctn isoform 1A. De innfellinger viser hele Mesc kolonien. Skalastolpe: 10 um. (E) Immunhistokjemi for ZEB2 (monoklonalt muse-anti-ZEB2, 7F7, laget på huset) på floxed (kontroll) og p120ctn KO EBS. En 3,5 gangers forstørrelse er vist i bunnplatene. Skalastolpe: 200 um (topp), 100 nm (nederst). (F) Transmisjonselektronmikroskopi av DIV12 EBS fra p120ctn KO-celler som uttrykker E- eller N-cadherin fra R26 promoteren. Skalastolpe: 10 um. Klikk her for å se en større versjon av this figuren.
For å konkludere, rapporterer vi på en rørledning av robuste teknologier som kombinerer en nesten 100% effektivitet i Mesc isolert med målsøkende vektor montering og Mesc målretting. Dette rør gjør det mulig å løse den allsidigheten av proteiner ved hjelp av struktur-funksjonsstudier i mESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår Mesc isolasjonsmetoden er brukervennlig og krever ikke avanserte ferdigheter eller utstyr, som for eksempel mikro av blastocyster. Dermed er denne teknologien tilgjengelig for en stor andel av det vitenskapelige samfunn. Alle med grunnleggende cellekultur erfaring kan forplante ICM utvekster og etablere mESCs linjer. Men spyling og håndtering av blastocyster krever litt øvelse. En munn pipette brukes til å overføre blastocyster, og består av en mikropipette, en mikropipette holder, rør, og en sugemunnstykke 28. Mikropipetter kan bli skreddersydd ved å varme den fineste del av en Pasteur pipette i et par sekunder, fjerne pipetten fra flammen, og trekke begge ender. Velg nåler med en diameter som er litt større enn en blastocyst (100-200 um). Nåler kan brukes om igjen etter å ha blitt vasket med destillert vann (3x) og EtOH (3 x). I vår erfaring, er effektiviteten av pluripotin baserte Mesc isolasjon høyere enn 2i-baserte protokoller 12. Imidlertid har bruken av pluripotin ved høye konsentrasjoner vist seg å indusere genomiske ustabilitet 19.
RMCE-baserte R26-målretting i mESCs vanligvis gir 20 - 40 kolonier etter G418-seleksjon. Dersom flere kolonier ble observert, innebærer dette at den G418 konsentrasjonen er ikke optimal og tillater ikke-målrettede mESCs for å overleve, påvirker den totale virkningsgrad målrettingen. Derfor er det anbefalt at det i hvert Mesc linje og for hver ny batch G418, et drepe kurve gjort for å identifisere den laveste G418-konsentrasjon som dreper alle ikke-målrettede mESCs. Hvis ingen kolonier er observert, er dette en indikasjon på en ineffektiv transfeksjon. I så fall, er det verdt å optimalisere transfeksjonsprosedyren ved hjelp av reporter plasmider som tillater ekspresjon av EGFP eller LacZ. Dersom transfeksjonsprotokoll fungerer, men likevel ingen kolonier er observert, kontroller RMCE-kompatible og cre-skåret ut pRMCE-DV1 vektoren og e FLPeXpression plasmid med RE fordøye og sekvensering. Det anbefales å gjøre en stor bunke med foreldre mESCs og FLPe vektor og å fryse flere prøver av dem til å redusere variasjonen mellom eksperimenter.
En ulempe med denne struktur-funksjon strategien er at rednings konstruksjonene ikke er uttrykt fra det endogene lokus, men snarere fra innenfor ROSA26 locus, med en allestedsnærværende, moderat aktiv promoter. Sammenlignet med andre teknologier, hvor suprafysiologiske høyekspresjonsystemer nivåer ofte blir observert, gjør dette system fysiologiske transgene uttrykk, som er stabilt i løpet av in vitro differensiering eksperimenter og på tvers av ulike cellelinjer. Det ble observert at heterozygote, ROSA26-formidlede transgenet uttrykk gir en p120ctn protein-ekspresjonsbibliotek som var omtrent halvparten av de endogene nivåene av p120ctn villtypekontroll mESCs men som var tilstrekkelig til å redde den observerte p120ctn KO fenotyper 12. Tilsvarende ble det DEmonstrated tidligere at en heterozygot, er tilstrekkelig til å redde Zeb2 knockout fenotyper observert in vitro og in vivo i forskjellige cellelinjer 29 ROSA26-mediert Zeb2 transgenekspresjon nivå. En annen potensiell fallgruve er det faktum at gener som er uunnværlige for Mesc selvfornyelse er ikke mottagelig for slike struktur-funksjonsstudier. For å utelukke dette, er det anbefalt å karakter nyetablerte KO mESCs for følgende kriterier: spredning, koloni morfologi, og uttrykk for stemness gener. Det er også anbefalt for å kontrollere ekspresjonen av genet av interesse, både i mESCs og i linje-engasjerte celler.
I tillegg til å utføre struktur-funksjonsstudier i konstitutive KO mESCs, kan man også ta en betinget tilnærming ved hjelp av Cre / loxP system. Sistnevnte metode muliggjør en linje-spesifikk KO uten å påvirke de omkringliggende og støtte celler. I tillegg betinget KO mESCs allow for utførelsen av struktur-funksjonsstudier hvis det er en fenotype i de konstitutive KO mESCs. For å generere RMCE-kompatibel, betingede-ko mESCs, homozygote floxed mus med en celletype-spesifikk Cre driver avles med RMCE-kompatibel mus; Mesc er isolert fra deres avkom. Fordelen med dette systemet er at den Cre rekombinase ikke blir uttrykt i mESCs og bare blir aktive når de mESCs er differensiert i de respektive cellelinjen. I RMCE-kompatible, betinget-KO mESCs, vil Cre rekombinasjon indusere samtidig inaktivering av det endogene gen og R26-drevet ekspresjon av rednings konstruksjonen ved å bruke en betinget pRMCE-DV1 målsøkende vektor (LMBP 08870) 11.
I tillegg gjør den struktur-funksjonssystem for undersøkelse av mutasjoner som finnes i human sykdom og gjør det mulig å teste virkningen av disse mutasjonene på funksjonene til proteinet. Som et eksempel har vi identifisert ZEB2 mutationer i pasienter med myeloproliferativ neoplasme, laget som målretter vektorer inneholdende disse ZEB2 mutanter, blir transportert dem til R26-locus av Zeb2 KO mESCs via RMCE, og undersøkt virkningen av mutasjonene på stabiliteten av proteinet i seg selv 30. Denne teknologien gir en større forståelse av biokjemi av slike mutanter i mESCs, så vel i enhver avstamning, siden mESCs er pluripotent.
Som konklusjon, er avhengig av denne Mesc basert struktur-funksjonsmetoden på effektiv Mesc isolasjon og målrettingsteknologien og muliggjør identifikasjon av viktige domener og funksjoner i et gitt protein i løpet av en definert biologisk sammenheng. Ved å dele mus (frossen sæd er tilgjengelig på forespørsel) og plasmider (distribuert fra BCCM / LMBP og Addgene), ønsker vi å åpne denne teknologien til hele vitenskapelige samfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire, og Riet De RYCKE for deres utmerkede teknisk støtte. Vi takker også EEF Parthoens, Evelien Van Hamme og Amanda Goncalves fra Bioimaging Kjerne Facility av Betennelse Research Center for deres eksperthjelp. Vi erkjenner medlemmer av vår forskningsgruppe for verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av den belgiske Science Policy (Belspo Interuniversity attraksjon polakker - Award IAP VII-07 DevRepair, https://devrepair.be), av dronning Elisabeth Medical Foundation, Belgia (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), og ved å samordne forskning handlinger (GOA 01G01908) av Ghent universitet, Belgia (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG er en postdoktor av Flandern forskningsmidler (FWO-V).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ROSALUC Mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| R26-iPSC mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| Vessel probe | Fine Science Tools | 10160-13 | to check for copulation plugs |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | make aliquots and store at -20 °C |
| Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) | Fine Science Tools | 11251-10 | spray with 70% EtOH before use (do not autoclave) |
| 23 G needles | Fine-ject | 8697 | |
| 1-mL syringes | Soft-ject | 6680 | |
| 60-mm bacterial grade plates (for flushing) | Gosselin | BB60-01 | |
| Mouth pipette | made in house | see discussion | |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) | ATTC | SCRC-1045 | |
| TgN (DR4)1 Jae mice | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M0503 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 14190-094 | |
| Tg(DR4)1Jae/J mice | JAX | 3208 | mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine |
| 0.1% Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C. |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200-056 | |
| 2 μM pluripotin | Cayman Chemical | 10009557 | |
| pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08870 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| cre-excised pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08195 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA | Addgene | 20733 | |
| heat-shock competent DH5α bacteria | made in house | ||
| Gateway pDONR221 vector | Thermo Fisher | 12536-017 | contains kanamycin-resistance gene |
| BP clonase II mix | Thermo Fisher | 11789-020 | |
| LR clonase II mix | Thermo Fisher | 11791-020 | |
| Luria Broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer | Thermo Fisher | 3730XL | |
| G418 | Thermo Fisher | 11811-023 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Lipofectamine LTX transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GATEWAY pENTR 1A vector | Thermo Fisher | A10462 | recombination-compatible vector |
| mouse monoclonal anti-p120ctn antibody | BD Transduction Laboratories | 610134 | |
| mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610181 | |
| General equipment | |||
| Sterile dissection tools | fine scissors and forceps for dissecting the uterus | ||
| Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL | |||
| 15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes | |||
| 96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) | |||
| Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells | |||
| Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) | |||
| Sterile multichannel reservoirs | |||
| Access to a laminar air flow | |||
| Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2 | |||
| Access to an inverted microscope | |||
| Access to a bench-top centrifuge | |||
| Access to a stereo microscope with transmitted-light | |||
| Culture media | |||
| MEF Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 41965-062 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-7524 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium pyruvate (0.4 mM) | Gibco | 11360-039 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| SR-based mESC medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | mixed in a 1:1 ratio |
| 15% knock-out serum replacement (SR) | Gibco | 10828–028 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| 0.1 mM non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| β-mercaptoethanol (0.1 mM) | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| 2,000 U/mL recombinant mouse LIF | (IRC/VIB Protein Service facility) | ||
| FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| Differention Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| 5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid | Gibco | 11279-023 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| 0.4 mM 1-thioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| 50 μg/mL ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A-4544 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| 2i | |||
| 1 μM Erk inhibitor PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | |
| 3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 |
References
- Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
- Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
- Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
- Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
- Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
- Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
- Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
- Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
- Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
- Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
- Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
- Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2016).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Third edn (2003).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
- Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. , (2016).
