Summary
Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.
Abstract
ingeniería de genes en embriones de ratón o células madre embrionarias (mESCs) permite el estudio de la función de una proteína dada. Las proteínas son los caballos de batalla de la célula y a menudo consisten en varios dominios funcionales, que pueden ser influenciados por modificaciones posteriores a la traducción. El agotamiento de la proteína completa en ratones condicional o constitutiva knock-out (KO) no tiene en cuenta esta diversidad funcional y la regulación. se informó previamente Una línea mESC y un modelo de ratón derivada, en la que se insertó un sitio de acoplamiento para FLPe intercambio casete de recombinación mediada (RMCE) dentro del locus ROSA26 (R26),. Aquí, se presenta en un enfoque de estructura-función que permite la disección molecular de las distintas funcionalidades de una proteína multidominio. Con este fin, los ratones compatible-RMCE deben ser cruzadas con ratones KO y mESCs KO compatibles RMCE-a continuación deben ser aislados. A continuación, un panel de construcciones de rescate putativos se puede introducir en el locus R26 a través de RMCE targeting. Los ADNc de rescate candidatos se pueden insertar fácilmente entre sitios RMCE de los ataques de vectores de clonación que utilizan la recombinación. A continuación, mESCs KO se transfectan con el vector de direccionamiento en combinación con un plásmido de expresión de la recombinasa FLPe. RMCE reactiva el gen de resistencia a neomicina sin promotor en los sitios de acoplamiento ROSA26 y permite la selección del evento orientación correcta. De esta manera, se obtienen altas eficiencias de focalización cercanos al 100%, lo que permite la inserción de múltiples construcciones de rescate putativo de una manera semi-alto rendimiento. Por último, una multitud de construcciones de rescate impulsadas-R26 puede ser probado por su capacidad para rescatar el fenotipo que se observó en mESCs KO parentales. Presentamos un estudio de estructura-función de prueba de principio en la catenina p120 (p120ctn) mESCs KO utilizando la diferenciación del endodermo en cuerpos embrioides (EBS) como la lectura fenotípica. Este enfoque permite la identificación de dominios importantes, las vías aguas abajo putativo, y el punto de enfermedad relevantemutaciones que subyacen fenotipos KO para una determinada proteína.
Introduction
Se estima que los genomas de mamíferos contienen alrededor de 20.000 genes codificadores de proteínas. Splicing alternativo y modificaciones postraduccionales aumentan aún más el repertorio de proteínas. Las proteínas tienen una estructura modular 1 y a menudo contienen varios dominios de interacción, que permiten su reclutamiento en diferentes complejos de proteínas y su participación en múltiples procesos celulares 2. Un ejemplo es la proteína multifuncional llamada p120ctn. p120ctn está codificada por el gen Ctnnd1 y consta de un gran dominio central armadillo repetición flanqueado por un N-terminal y una región C-terminal. El dominio armadillo de p120ctn se une a un dominio yuxtamembrana altamente conservada de cadherinas clásicas, que están implicadas en la adhesión célula-célula, pero también se une al represor transcripcional Kaiso. El dominio N-terminal de p120ctn interactúa con diferentes quinasas, fosfatasas, pequeñas RhoGTPases, y asociada a los microtúbulos proteins 3. Curiosamente, como resultado de corte y empalme alternativo, isoformas p120ctn pueden ser generados a partir de cuatro codones de inicio alternativos 4. p120ctn isoforma 1A es la más larga, ya que se traduce de la más-5' codón de inicio y contiene el segmento N-terminal de longitud completa. En p120ctn isoformas 3 y 4, este segmento N-terminal se suprime parcialmente y completamente, respectivamente. La comprensión del papel exacto de proteínas (o isoformas de proteínas) y sus dominios en diferentes funciones celulares sigue siendo un reto.
La orientación de genes en mESCs permite el estudio de la función de una proteína a través de la supresión genética del gen correspondiente y ha contribuido ampliamente a la identificación de genes y las vías de desarrollo importantes y relevantes de la enfermedad. Este avance en la genética inversa fue el resultado de los avances en los campos de aislamiento mESC y la orientación de genes debido a la recombinación homóloga 5 6, 7, pero, por desgracia, estos son propensos a los efectos fuera del objetivo 8. Una técnica más fiable para permitir la orientación de genes es RMCE, que se basa en los sistemas de recombinación específica de sitio tales como Cre / loxP o FLPe / FRT. LoxP y la secuencia Frt se encuentran en bacteriófago P1 y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente, y se componen de 34 pares de bases, incluyendo una secuencia de pares de bases asimétrica 8 que determina la orientación del sitio. Por otra parte, la orientación de, por ejemplo, dos sitios loxP dentro de un tramo de ADN determinará si el ADN floxed convierte escindió o inversed tras la recombinación mediada por Cre 9. Por otra parte, Cre también puede inducir una translocación si dos sitios están localizados en diferentes cromosomas. RMCE se aprovecha de sitios de recombinación heterospecific que no reaccionan de forma cruzada y que están incrustados en un locus genómico. En presencia de un plásmido donante que contiene un fragmento de ADN flanqueado por los mismos sitios heterospecific, la recombinasa se insertar este fragmento de ADN en el locus genómico compatible-RMCE debido a la translocación de doble simultáneo (Figura 1). Aquí, los clones solamente correctamente orientados RMCE pueden hacer de resistencia a fármacos gracias a un promotor en el vector entrante que restaura una "atrapado" promotor-menos gen de resistencia a neomicina (Neo R) presente en el genoma R26 de las células de conexión (Figura 1) 10, 11. Esto resulta en una eficiencia muy alta focalización, a menudo cerca de 100% 11, </ sup> 12. En conclusión, la selección de base RMCE es altamente eficiente y se puede utilizar para estudios de estructura-funciones; sin embargo, se requiere un locus genómico pre-ingeniería.
Figura 1. Representación esquemática de la orientación de RMCE mediada. RMCE permite el intercambio de segmentos de ADN a partir de un vector de dirección entrante a un locus genómico definido si ambos albergan dos sitios FRT heterospecific (representados por triángulos blanco y rojo). Además, el locus genómico de ingeniería contiene un gen truncado de resistencia a neomicina (Neo R) sin promotor y. Al proporcionar un promotor y el codón de inicio en el fragmento de ADN entrante, eventos de recombinación solamente correctas restaurar la resistencia a neomicina, dando como resultado altas eficiencias de focalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de tsu figura.
la ingeniería del genoma en mESCs permite la generación de ratones compatible-RMCE. En 1981, dos grupos tuvieron éxito en la captura de células pluripotentes de la masa celular interna (ICM) de blastocistos y en el mantenimiento de ellos en la cultura 13, 14. mESCs son capaces de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos de células embrionarias y adultas, incluyendo el linaje de células germinales. Por lo tanto, la orientación de genes en mESCs permite estudios inversa genéticos mediante el desarrollo de ratones KO constitutivos o condicionales (utilizando el sistema cre / loxP). Sin embargo, la manera clásica para aislar células ES de ratón es muy ineficiente. Varias mejoras importantes han aumentado en gran medida la tasa de éxito para derivar líneas mESC, incluyendo el uso de un suero de reemplazo definido (SR) medio 15, alternando entre medio mESC que contenía suero bovino SR y fetal (FBS) 16, y el uso de fármacocompuestos lógicos como pluripotin o 2i 17. Pluripotin, una molécula sintética pequeña, permite la propagación de mESCs en un estado no diferenciado en ausencia del factor inhibidor de la leucemia (LIF) y fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) 18. Por último, se ha demostrado que mESCs se pueden aislar con una eficacia muy alta (cerca de 100%) cuando un / FBS protocolo alternancia medio SR se combina con LIF y pluripotin 19, 20. Estos protocolos permiten el aislamiento eficiente de mESCs KO compatible con RMCE que posteriormente pueden ser utilizados para estudios de estructura-función.
Este documento describe un método que permite identificar los dominios o residuos clave dentro de una proteína que son responsables de los procesos celulares específicos. Con este fin, una línea de tecnologías avanzadas que permiten el aislamiento eficiente mESC, montaje vector de dirección y orientación mESC era crearre. Como tales paneles grandes, con isoformas de proteínas, mutantes de dominio, y efectores aguas abajo pueden ser introducidas en mESCs KO y se pueden evaluar por su capacidad para rescatar el fenotipo vitro KO en.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las normas de origen animal institucionales, nacionales y europeas.
1. Aislamiento de mESCs KO compatibles con RMCE
- Breed ratones KO heterocigóticas con ratones compatible-RMCE, tales como ratones ROSALUC 10 o ratones ROSA26-iPSC 21. Ambos ratones compatibles con RMCE se mantuvieron en un / fondo mixto 129 C57BL6 / suizo.
NOTA: Al cruzar con ratones KO heterocigóticos se recomienda para superar la letalidad embrionaria en ratones KO homocigóticos. - Utilice PCR para seleccionar ratones KO heterocigotos que contienen un casete de RMCE en el locus R26 12.
- Raza, ratones KO heterocigóticas compatible-RMCE con ratones KO heterocigóticas y aislar, blastocistos KO homocigóticos compatible-RMCE.
- Configurar los apareamientos de tiempo en la noche y comprobar que la cópula se conecta a la mañana siguiente.
NOTA: Los enchufes son de secreciones coaguladas de los coagulantes y vesiculares glándulas del sexo masculino.Estos tapones de llenado de la vagina de la hembra y persisten durante 8 - 24 horas después de la cría. hembras tapados se considera que llevan 0,5 dpc (días postcoital) embriones.- Para comprobar si hay enchufes, levante la hembra por la base de su cola y examinar por su abertura vaginal para una masa blanquecina. Difundir los labios de la vulva ligeramente con una sonda en ángulo cuando el tapón es difícil de ver. hembras enchufados separarse de sus hombres.
- Recoger los blastocistos a 3,5 dpc.
- La eutanasia a las hembras embarazadas por el método aprobado (por ejemplo, la dislocación cervical). Hacer una incisión medioventral y diseccionar el útero y el oviducto (todavía unido entre sí) usando bien tijera y una pinza.
- Doblar una aguja de calibre 26 en un ángulo de 45 °. Adjuntar una jeringa de 1 ml lleno de medio M2 a esta aguja doblada y usarlo para eliminar los blastocistos de útero en la tapa de una placa de 10 cm.
- Insertar la aguja en el extremo del útero que está más cercael oviducto. Mantener la aguja en su lugar con unas pinzas finas mientras empuja el émbolo; inflamación del útero indica un lavado con éxito.
- Usar una pipeta de boca (con un diámetro de los 100 - 200 micras) para recoger todos los embriones y lavarlas dos veces en una gota de medio M2 fresco. Inmediatamente después de lavarlas, transferir los blastocistos a las placas de cultivo (véase a continuación).
NOTA: La disección y la manipulación de los blastocistos de que se debe hacer en el flujo de aire laminar.
- Configurar los apareamientos de tiempo en la noche y comprobar que la cópula se conecta a la mañana siguiente.
- Aislar mESCs RMCE compatible KO
- Preparar una placa de 12 pocillos con MEFs DR4 tratados con mitomicina-C (véase la Tabla de Materiales) un día antes del aislamiento de blastocisto.
NOTA: Estos MEFs fueron aisladas de ratones Tg (DR4) 1Jae / J que contienen cuatro genes seleccionable con las drogas y confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, y 6-tioguanina 22.- Escudo todas las placas de cultivo con 0,1% de gelatina. Añadir 0,1% de gelatinaa las placas de cultivo, se incuba durante 5 min a 37 ° C en 5% de CO2, y aspirar la solución de gelatina. Seed cuarto de un vial de P2 MEFs en una placa de 12 pocillos y cultivarlas en 2 ml de medio de MEF (véase la Tabla 1, la Tabla de Materiales) a una monocapa confluente 19.
- Inactivar con mitomicina C (10 mg / ml) durante 3 h y lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 19.
- Usando una pipeta de boca, la placa de los blastocistos sobre las placas de 12 pocillos gelatinizados (1 así / embrión), con los MEFs tratadas con mitomicina C en medio de células SR-ES (2 ml / pocillo) suplementado con 2 pluripotin M o con 2i (1? M PD0325901 inhibidor de Erk y 3? M GSK3 inhibidor CHIR99021). Incubar a 37 ° C en 5% de CO2.
- Actualizar el medio celular SR-ES (suplementado con pluripotin o 2i) cada 2 - 3 días.
- Examinar cada blastocisto bajo un stereomicroalcance a un aumento de 4,0X y comprobar para incubar y unión a la capa de MEF.
NOTA: Cuando blastocistos escotilla, pierden la zona pelúcida que los encapsula. Los pozos con blastocistos solteras necesitan ser refrescado con el pipetear con la boca. - Escoja excrecencias ICM individuales (utilizando un estereomicroscopio) después de 10 - 12 días de cultivo utilizando una pipeta P10 con puntas desechables. La transferencia de la excrecencia en aproximadamente 10 l de medio a una, placa de 96 pocillos en forma de V que contiene 30! L / pocillo de PBS (a temperatura ambiente).
- Añadir 50? L de 0,25% de tripsina a cada pocillo usando una pipeta multicanal y se incuba durante 3 min a 37 ° C en 5% de CO2.
- Añadir 100 ml de FBS que contiene medio mESC; disociar las excrecencias ICM en células individuales pipeteando 10-15 veces; y transferir las células disociadas a la mitomicina-C-tratada, placas de 96 pocillos MEF que se prepararon un día antes de se recogen las colonias ICM.
- A partir de este paso adelante, omi t pluripotin o 2i del medio de mESC. En el día siguiente, cambiar el medio de FBS- a medio mESC contiene SR-(100! L / pocillo).
- Ampliar las líneas mESC establecidas a partir de 96 a formato de 24 pocillos 19.
- Lavar las células con 200 l de PBS, añadir 50 l de tripsina, y se incuba durante 5 min a 37 ° C en 5% de CO Añadir 100! L de medio de mESC a base de FBS.; disociar pipeteando 10 - 15 veces usando una pipeta multicanal; y transferir las células disociadas a mitomicina-C-tratada, placas de 24 pocillos MEF.
- Cambiar a medio basado en SR en el día siguiente. Ampliar los mESCs de una manera similar a partir de 24 a formato de 6 pocillos. Haga 3 - 4 heladas de un confluente placa de 6 pocillos 19.
- Identificar compatible-RMCE, mESCs KO homocigóticos usando cebadores de PCR para el locus R26 23 y KO alelo de elección (en este caso, p120ctn; PCRs para p120ctn nula y alelos floxed se describieron anteslass = "xref"> 12).
- Preparar una placa de 12 pocillos con MEFs DR4 tratados con mitomicina-C (véase la Tabla de Materiales) un día antes del aislamiento de blastocisto.
Tabla 1. Medios de cultivo. Todos los medios se almacenaron a 4 ° C y se calentó a 37 ° C 30 min antes de su uso.
2. Generación de un vector de dirección compatible-RMCE usando recombinación Cloning
- Clonar el rescate construye en vectores compatible-recombinación utilizando la enzima de restricción (RE) a base de o PCR basada en 24 técnicas de clonación. Asegúrese de que los ADNc contienen un codón de parada.
- Cebadores 24 Diseño AttB-tagged. Asegúrese de que el cebador directo contiene los siguientes elementos: un tramo GGGG, un sitio AttB1, un enlazador, una secuencia Kozak, y aproximadamente 25 nucleótidos de cDNA de rescate (a partir de su ATG). Asegúrese de que el cebador inverso tiene una composición similar: un tramo GGGG, un sitio AttB2, un enlazador, y cerca de 25 nucleotides de cDNA de rescate (complemento inverso).
- Amplificar el ADNc de rescate a través de PCR para obtener ADNc flanqueados-AttB.
- Realizar una reacción de 10-l BP con 100 ng de ADNc flanqueado-attB y 150 ng de vector donante compatible-recombinación, que contiene un gen de resistencia a kanamicina.
- Transformar 5 l de las mezclas de PA en MC1061 de Escherichia coli de choque térmico-competente (E. coli) bacterias (similares a los descritos en el paso 2.3).
- Identificar las colonias que contienen los vectores que contiene cDNA de rescate correctas (similares a los descritos en el paso 2.4)
- Realizar una reacción LR 10-l utilizando 100 ng de rescate vector que contiene cDNA-; 150 ng de extirpado-Cre vector pRMCE-DV1 11 (LMBP 8195); y 2! l de mezcla de recombinasa, que contiene una integrasa y escisionasa fago codificada y un factor de integración del anfitrión bacteriano. Incubar durante 2 h a 25 ° C.
NOTA: Una reacción LR es una recombinación reaccionarion en el que un clon de entrada que contiene los sitios attL y un vector de destino que contiene los sitios attR se recombinan por la mezcla de enzima clonasa LR. Esto da como resultado un clon de expresión que contiene los sitios attB que flanquean el gen de interés. - Transformar 5! L de las mezclas de LR en bacterias de E. coli MC1061 de E. de choque térmico-competente.
- Añadir 5 l de LR mezclas a un acanalado, bordeado, tubo de 2 ml con tapón de rosca con 40 l de bacterias de choque térmico-competentes de E. coli y se incuba durante 20 min en hielo. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Añadir 1 caldo de Luria (LB) ml de medio de e incubar durante 1 h a 37 ° C. Plate 50! L de ampicilina (Amp; 100 mg / ml) que contienen placas de agar y crecer durante la noche a 37 ° C.
- Identificar las colonias con el vector de orientación correcta.
- Elige 5 colonias al azar usando una punta de p200. La transferencia de la punta de un tubo de ensayo de vidrio que contiene 2 - 5 ml de medio LB y crecer durante la noche a 37 ° C.
- ExTracto el ADN plasmídico a partir de los cultivos bacterianos utilizando kits disponibles comercialmente.
- Validarlos mediante digestiones con RE y secuenciación. Cortar 0,5-2 g de plásmido usando 0,2 l de RE (20 U / l) y 1 l del tampón 10x correspondiente en una reacción de 10-mL. Incubar durante al menos 1 h a 37 ° C y se separan en un gel de agarosa al 1%. Seleccionar para colonias con el patrón predicho de los fragmentos de ADN.
- Analizar los vectores confirmados (50 ng / l) con Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) y IRES R (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG) cebadores (5 pmol / l) utilizando la secuenciación de Sanger.
3. mESC RMCE mediada por focalización de rescate Construye al R26 Locus
- Iniciar un cultivo de mESCs y el paso ellos KO compatible-RMCE al menos dos veces en MEFs en medio mESC a base de FBS. Dividir los mESCs en una placa de 6 pocillos gelatinizado.
- Al día siguiente, volver a cargar las células, a aproximadamente 50% de confluencia, con 1,5ml de medio mESC a base de FBS y transfectar las mESCs con un pRMCE-DV1 extirpado-Cre vector dirigido que contiene cDNA de rescate.
- Haga una mezcla de ADN. Añadir 1 g de vector dirigido y 1 g de plásmido FLPe-expresión 25 a 250 l de medio DMEM puro.
- Haga una mezcla de lipofección. Añadir 7 l de reactivo de transfección a base de lipofección (por ejemplo, Lipofectamine 2000) a 250 l de medio DMEM puro e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
NOTA: RMCE similares focalización eficiencias se obtuvieron utilizando otros reactivos a base de lipofección (por ejemplo, Lipofectamine LTX y Effectene). - Mezclar la mezcla de ADN con la mezcla de lipofección y se incuba durante 20 min a TA. Pipetear la mezcla de transfección a las mESCs refrescado. Agitar suavemente y dejar toda la noche.
- Un día después de la transfección, dividir todos mESCs de la placa de 6 pocillos a una placa de cultivo de 10 cm con una capa confluente de MEFs DR4 y m basada en FBS 10 ml demedio ESC.
- Dos días después de la transfección, seleccionar clones mESC con el intercambio de casete FLPe mediada correcta mediante la adición de 0,2 mg / ml de G418 (100x) al medio.
NOTA: Haga una curva de muerte para cada lote de G418 para identificar la concentración más baja de G418 que mata todos los mESCs. - Actualizar los mESCs al día con medio mESC que contiene G418. Las colonias deben aparecer después de 7 - 10 días, así que escoja y ampliar estos como en el paso 1.4.
- Confirmar los clones correctos mediante PCR 11.
4. Diferenciación de mESCs en cuerpos embrioides (EB)
- Iniciar un cultivo de mESCs KO con construcciones de rescate impulsadas por R26 y el paso de al menos dos veces en MEFs en medio mESC a base de FBS. Passage las mESCs vez en placas de 6 pocillos gelatinizados para deshacerse de los MEFs.
- Lavar con PBS y trypsinize los cultivos casi confluentes mESC. Plate disociado mESCs en diferentes diluciones (1/20 y 1/40) sobre no adherente, animal doméstico bacteriana gradori-platos en medio de diferenciación.
- Permitir que los EB para formar en estos platos por 30 días. Actualizar el medio cada 2 - 3 días utilizando el siguiente procedimiento: transferir la suspensión EB a un tubo de 50 ml, dejar que los EBs se depositan por gravedad, eliminar el sobrenadante, se añade medio fresco, y transferir la suspensión EB de nuevo a un grado bacteriana plato.
- Analizar los mESCs dirigidos y EBs por inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión usando protocolos que se han descrito previamente 12.
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Representative Results
El procedimiento para aislar líneas KO mESC compatible-RMCE se representa en la Figura 2. Se requieren dos crías consecutivos para obtener blastocistos KO compatible con RMCE. En primer lugar, los ratones KO heterocigóticos se cruzaron con los ratones compatibles con RMCE obtener, ratones KO heterocigóticos compatible con RMCE. Estos ratones se usan entonces para apareamientos programados con otros ratones KO heterocigóticas para obtener 3,5-dpc, compatible-RMCE, blastocistos KO homocigóticos. La posibilidad de obtener un embrión de este tipo es uno de cada ocho, según lo predicho por la herencia mendeliana. Por lo tanto, se requiere un protocolo eficiente aislamiento mESC. El uso de protocolos basados en pluripotin o basado en 2i, somos capaces de aislar líneas mESCs, incluyendo p120ctn compatible-RMCE mESCs KO, con una eficiencia de aproximadamente 94% (n = 114 blastocistos) y 64% (n = 22 blastocistos), respectivamente 12, 19. Típicamente, los blastocistos eclosionan después de entre 3 y 6 días en en vitro (DIV) de cultivo; esto es seguido por la fijación de excrecencias ICM a MEFs o a los platos recubiertos con gelatina. En el día 12, se forman grandes excrecencias ICM que fielmente dan lugar a líneas mESC (Figura 2). Debido a este procedimiento de aislamiento mESC altamente eficiente, es factible obtener mESCs KO compatible con RMCE de uno o dos hembras tapados.
Figura 2. Aislamiento de mESCs KO compatible-RMCE. (A) Estrategia de cría de obtener, mESCs KO homocigóticos compatible con RMCE. (B) Esquema de procedimiento de aislamiento mESC pluripotin- o basado en 2i. barra de escala blanca: 25 m. barras de escala negro: 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para asignar los dominios o amino ácidos dentro de una proteína que son importantes para las funciones celulares específicas, ahora uno puede reintroducir, a través de RMCE, de longitud completa o construcciones mutantes en mESCs KO y prueba de ellos por su capacidad para revertir el fenotipo KO. Vectores de abordaje para muchos mutantes de dominio y los mutantes puntuales diferente se pueden generar de manera eficiente por la clonación de recombinación (Figura 3A). la clonación de recombinación se basa en el reconocimiento de secuencias de ADN específicas de fijación (ATT) por la mezcla de recombinasa, que media un intercambio de fragmentos de ADN flanqueados-Att entre diferentes plásmidos. El sistema de clonación de recombinación selecciona recombina solamente correctamente vectores conmutando entre vectores que contienen diferentes genes de resistencia a antibióticos y mediante la inserción de un marcador contra-seleccionable, el "control de la muerte celular B" (ccdB) de genes, en el vector de destino (Figura 3A) . Hemos generado más de 25 Cre escindió-pRMCE-DV1 vectores dirigidos con una cerca de 100% de eficiencia (algunos ejemplos unare muestra en la Tabla 2).
Tabla 2. Visión general de la orientación de la Asamblea Vector y mediada por RMCE mESC focalización.
Diferentes construcciones de rescate embebidas en una cre-extirpado pRMCE-DV1 vector dirigido pueden ser fácilmente dirigidos a mESCs KO utilizando RMCE (Figura 3B). Hemos informado anteriormente de la generación de 133 clones mESC dirigidos para 19 construcciones de rescate diferentes que se introdujeron en el locus R26 de p120ctn mESCs KO través RMCE con una eficiencia promedio de 93% 12. Aquí, se presenta en la focalización de los constructos adicionales con altas eficiencias similares, incluyendo un 1A p120ctn CAAX-Tagged, epitelial a mesenquimal transición (EMT) inductores de la familia SNAI y ZEB, y N-cadherina, en p120ctn mESCs KO ( Tabla 2).
Figura 3. RMCE-basa focalización en mESCs KO. (A) el ensamblaje de recombinasa mediada por vectores de abordaje compatible-RMCE. (B) de orientación de las construcciones de rescate putativos al locus R26 de mESCs KO homocigóticos través RMCE. Validación basada en PCR (C) de clones mESC orientados RMCE. Se extrajo el ADN a partir de clones mESC RMCE orientada y se amplificó por PCR usando un cebador directo que se incrusta en el locus endógeno R26 y un cebador inverso que se encuentra en el constructo pRMCE-DV1 entrante. Una banda de 560 pb se observa para clones correctamente orientados. clones no confirmados se muestran en rojo. M1: escalera de ADN de 1 kb. M2: 1 kb escalera de ADN Plus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
12. Morfología quística EB se puede utilizar como una lectura fenotípica para cribar diferentes construcciones de rescate (figura 4A). Como prueba de concepto, demostramos que impulsada por el R26 1A p120ctn isoforma (R_p120_1A) podría rescatar el fenotipo p120ctn KO (Figura 4B, 4C) 12. Además, este E-cadherina pantalla-identificado, pero no RhoA, es un socio crucial de p120ctn durante la especificación endodermo (Figura 4B y C) 12. La facilidad de introducción de rescate construye a p120ctn KO mESCs nos permitió probar hipótesis adicionales. En primer lugar, sería E-cadherina independiente de anclaje a la membrana de p120ctn permitir la formación quística EB? Probaresto, fusiona el motivo membrana de metas de K-Ras (CAAX) al extremo carboxi de p120ctn, lo introdujo a través de RMCE a p120ctn mESCs KO, e hizo EBs de ellos. Sin embargo, esta construcción sirve un dominante negativo que no permite la unión y estabilización de E-cadherina (Figura 4D) y, como consecuencia, no rescatar el p120ctn KO fenotipo (Figura 4C). En segundo lugar, son inductores de la EMT involucrados? EMT es un proceso de desarrollo esencial que también se produce durante la diferenciación mESC y está orquestada por la familia SNAI y ZEB de factores de transcripción, que reprimen directamente varios genes marcadores epiteliales como E-cadherina 26, 27. En línea con estos descubrimientos, la expresión de EMT ZEB2 inductor se encontró en EBs de control, pero no en EBs p120ctn-null (Figura 4E). No obstante, mESCs p120ctn KO con la expresión basada en ROSA26 de la EMT inductores ZEB1, ZEB2 o caracol no pudieron restaurar quisteformación ic EB (Figura 4C). En tercer lugar, pueden otras cadherinas clásicas, tales como N-cadherina, reemplazar funcionalmente E-cadherina durante la especificación endodermo? Para abordar esto, se generaron líneas de rescate N-cadherina. Anteriormente, se demostró que la expresión ectópica de E-cadherina en p120ctn KO EBs rescató parcialmente la formación de EBs quística 12. Curiosamente, en una configuración similar, forzado expresión N-cadherina no para rescatar (Figura 4C y F), indicando que la E-cadherina es el principal subtipo cadherina requerida para la adhesión EB y no puede ser reemplazado por N-cadherina. Estos ejemplos antes mencionados ponen de manifiesto la facilidad con la que las cuestiones biológicas pueden ser abordados por el sistema.
Figura 4. fenotípica Proyección de mESCs rescate RMCE-dirigida. (A) La formación de EBs quística (capturados por microscopía de luz; panel superiorLS) y la polarización adecuada endodermo en EBs (capturado por microscopía electrónica de transmisión; paneles inferiores) se utilizaron como la lectura fenotípico para probar la capacidad de mESCs dirigidos a rescatar el p120ctn KO fenotipo. barra de escala blanca: 25 m. barra de escala negro: 200 m. (B) Vista general de las construcciones de rescate p120ctn. p120ctn contiene un dominio central armadillo, que consiste en nueve repeticiones armadillo (cajas azules), que está flanqueado por un dominio N-terminal (NTD) y el dominio C-terminal (CTD). isoformas p120ctn contienen uno de cada cuatro codones de inicio alternativos (flechas), posiblemente la característica secuencias codificadas por los exones utilizados alternativamente A y C (cajas negras), y incluir o excluir dos dominios de unión a Rho GTPasa (RBDS). p120ctn isoformas 1A y 4A utilizan el primer y cuarto sitio de iniciación de la traducción, respectivamente. se muestra la posición de las mutaciones de importante AA y la adición artificial de un motivo de membrana de segmentación (CAAX). EBD: E-cadherina dominio de unión. (C) Gráficoque representa el porcentaje de la morfología básica o quística EB en células KO p120ctn que expresan diferentes construcciones de rescate impulsadas-R26. (D) La tinción de inmunofluorescencia para p120ctn (monoclonal de ratón anti-p120ctn) y E-cadherina (monoclonal de ratón anti-E-cadherina) en mESCs G4 de control o en p120ctn mESCs KO con la expresión impulsada por el R26 de CAAX-tagged p120ctn isoforma 1A. Los recuadros muestran toda la colonia mESC. barra de escala: 10 m. (E) Inmunohistoquímica para ZEB2 (monoclonal de ratón anti-ZEB2; 7F7; hecha en casa) en floxed (control) y p120ctn KO EBs. Un aumento de 3,5 veces se muestra en los paneles inferiores. Barra de escala: 200 m (arriba), 100 m (abajo). (F) Microscopía electrónica de transmisión de DIV12 EBs a partir de células KO p120ctn que expresan E- o N-cadherina a partir del promotor R26. barra de escala: 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de This figura.
Para concluir, se presenta en una línea de tecnologías robustas que combina una eficiencia de casi el 100% en forma aislada mESC con la orientación de montaje del vector y mESC orientación. Este gasoducto nos permite desentrañar la versatilidad de proteínas por medio de estudios de estructura-función en mESCs.
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Discussion
Nuestro método de aislamiento mESC es fácil de usar y no requiere de técnicas y equipos avanzados, tales como la microcirugía de los blastocistos. Por lo tanto, esta tecnología se puede acceder a una gran parte de la comunidad científica. Cualquier persona con experiencia básica cultivo celular puede propagarse excrecencias ICM y establecer líneas mESCs. Sin embargo, el enrojecimiento y la manipulación de los blastocistos requiere algo de práctica. Una pipeta boca se utiliza para transferir los blastocistos y se compone de una micropipeta, un soporte de micropipeta, la tubería, y una boquilla de aspiración 28. Micropipetas pueden ser por encargo por calentamiento de la mejor parte de una pipeta Pasteur durante unos segundos, la eliminación de la pipeta de la llama, y tirando de ambos extremos. Seleccione agujas con un diámetro ligeramente más grande que un blastocisto (100 - 200 micras). Las agujas pueden ser reutilizados después de ser lavado con agua destilada (3x) y EtOH (3x). En nuestra experiencia, la eficacia del aislamiento mESC basada en pluripotin es mayor en comparación con 2protocolos 12 i-basadas. Sin embargo, el uso de pluripotin a altas concentraciones se ha demostrado que induce la inestabilidad genómica 19.
basado en RMCE R26-focalización en mESCs produce típicamente 20 - 40 colonias después de la selección con G418. Si se observan más colonias, esto implica que la concentración de G418 no es óptima y permite mESCs que no son objeto de sobrevivir, lo que afecta la eficiencia global focalización. Por lo tanto, se aconseja que, para cada línea mESC y para cada nuevo lote de G418, se realiza una curva de muerte para identificar la concentración de G418 más bajo que mata todos los mESCs no objetivo. Si no se observan colonias, esto es indicativo de una transfección ineficiente. En ese caso, es conveniente para optimizar el procedimiento de transfección utilizando plásmidos informadores que permiten la expresión de EGFP o LacZ. Si todavía se observan funciona el protocolo de transfección pero ninguna colonia, compruebe el vector pRMCE-DV1 extirpado-cre-compatible y RMCE y la FLPe correoplásmido Xpression con RE digestión y secuenciación. Es aconsejable hacer una gran tanda de mESCs de los padres y del vector FLPe y para congelar varias alícuotas de ellas para reducir la variación entre los experimentos.
Un inconveniente de esta estrategia estructura-función es que las construcciones de rescate no se expresan a partir del locus endógeno, sino más bien desde dentro del locus ROSA26, con un promotor ubicuo, moderadamente activo. En comparación con otras tecnologías, donde se ven a menudo niveles de sobreexpresión suprafisiológicas, este sistema permite la expresión del transgen fisiológico, que es estable durante experimentos de diferenciación in vitro y a través de diversos linajes de células. Se observó que heterocigoto, mediadas por ROSA26 expresión transgén da como resultado una expresión de la proteína p120ctn que era aproximadamente la mitad de los niveles endógenos de p120ctn mESCs de control de tipo salvaje pero que fue suficiente para rescatar el p120ctn observado KO fenotipos 12. Del mismo modo, se dèmonstrated previamente que un heterocigoto, el nivel de expresión de los transgenes Zeb2 mediada por ROSA26 es suficiente para rescatar a los fenotipos knockout ZEB2 observadas in vitro e in vivo en varios linajes de células 29. Otro problema potencial es el hecho de que los genes que son indispensables para mESC auto-renovación no se prestan para este tipo de estudios de estructura-función. Para excluir esto, se aconseja para caracterizar mESCs recién establecidas KO para los siguientes criterios: la proliferación, morfología de la colonia, y la expresión de los genes stemness. También se recomienda para comprobar la expresión del gen de interés, tanto en mESCs y en células comprometidas con el linaje.
Además de realizar los estudios de estructura-función en mESCs KO constitutivos, también se podría adoptar un enfoque condicional usando el sistema Cre / loxP. El último enfoque permite un KO-linaje específico sin afectar a las células que rodean y sostienen. Además, mESCs KO condicionales Allow para la realización de estudios de estructura-función si hay un fenotipo en las mESCs KO constitutivos. Para generar compatible RMCE-, condicionales-KO mESCs, los ratones homocigotos floxed con un conductor de Cre célula de tipo-específica se crían con ratones compatible-RMCE; mESC están aislados de su progenie. La ventaja de este sistema es que la recombinasa Cre no se expresa en mESCs y sólo se activa cuando los mESCs se diferencian en el respectivo linaje de células. En, mESCs compatible-RMCE condicional-KO, Cre recombinación induce la inactivación simultánea del gen endógeno y la expresión impulsada por el R26 de la construcción de rescate mediante el uso de un vector condicional pRMCE-DV1 de orientación (LMBP 08870) 11.
Además, el sistema de estructura-función permite el estudio de las mutaciones que se encuentran en las enfermedades humanas y nos permite probar el impacto de estas mutaciones sobre las funciones de la proteína. A modo de ejemplo, hemos identificado mutat ZEB2iones en pacientes con neoplasia mieloproliferativa, hechas vectores de abordaje que contienen estos ZEB2 mutantes, ellos transportados a la R26-locus de mESCs Zeb2 KO través RMCE, y examinaron el efecto de las mutaciones sobre la estabilidad de la propia proteína 30. Esta tecnología da una mayor comprensión de la bioquímica de tales mutantes en mESCs, así como en cualquier linaje dado, desde mESCs son pluripotentes.
En conclusión, este enfoque estructura-función basada en mESC se basa en el aislamiento eficiente mESC y tecnología de orientación y permite la identificación de los dominios y funciones de una proteína dada importantes dentro de un contexto biológico definido. Al compartir los ratones (esperma congelado está disponible bajo petición) y plásmidos (distribuido desde BCCM / LMBP y Addgene), queremos abrir esta tecnología a toda la comunidad científica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire y Riet De Rycke por su excelente soporte técnico. Agradecemos también a Eef PARTHOENS, Evelien Van Hamme y Amanda Goncalves del Fondo para el Bioimagen Núcleo del Centro de Investigación inflamación por su ayuda experta. Reconocemos los miembros de nuestro grupo de investigación valiosa para los debates. Este trabajo fue apoyado por la política belga Ciencia (BELSPO Interuniversitario de atracción Postes - Premio IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), por la Fundación Reina Elisabeth médica, Bélgica (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), y mediante la acción concertada de investigación (GOA) 01G01908 de la Universidad de Gante, Bélgica (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG es un compañero postdoctoral de los fondos de Investigación Flandes (FWO-V).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ROSALUC Mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| R26-iPSC mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| Vessel probe | Fine Science Tools | 10160-13 | to check for copulation plugs |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | make aliquots and store at -20 °C |
| Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) | Fine Science Tools | 11251-10 | spray with 70% EtOH before use (do not autoclave) |
| 23 G needles | Fine-ject | 8697 | |
| 1-mL syringes | Soft-ject | 6680 | |
| 60-mm bacterial grade plates (for flushing) | Gosselin | BB60-01 | |
| Mouth pipette | made in house | see discussion | |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) | ATTC | SCRC-1045 | |
| TgN (DR4)1 Jae mice | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M0503 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 14190-094 | |
| Tg(DR4)1Jae/J mice | JAX | 3208 | mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine |
| 0.1% Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | Dissolve 0.5 g in 500 mL distilled water, autoclave and store at 4 °C. |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200-056 | |
| 2 μM pluripotin | Cayman Chemical | 10009557 | |
| pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08870 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| cre-excised pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08195 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA | Addgene | 20733 | |
| heat-shock competent DH5α bacteria | made in house | ||
| Gateway pDONR221 vector | Thermo Fisher | 12536-017 | contains kanamycin-resistance gene |
| BP clonase II mix | Thermo Fisher | 11789-020 | |
| LR clonase II mix | Thermo Fisher | 11791-020 | |
| Luria Broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer | Thermo Fisher | 3730XL | |
| G418 | Thermo Fisher | 11811-023 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Lipofectamine LTX transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GATEWAY pENTR 1A vector | Thermo Fisher | A10462 | recombination-compatible vector |
| mouse monoclonal anti-p120ctn antibody | BD Transduction Laboratories | 610134 | |
| mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610181 | |
| General equipment | |||
| Sterile dissection tools | fine scissors and forceps for dissecting the uterus | ||
| Sterile pipettes: 5 mL, 10 mL and 25 mL | |||
| 15-mL and 50-mL conical centrifuge tubes | |||
| 96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) | |||
| Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells | |||
| Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μL) | |||
| Sterile multichannel reservoirs | |||
| Access to a laminar air flow | |||
| Access to an incubator at 37 °C with 5% CO2 | |||
| Access to an inverted microscope | |||
| Access to a bench-top centrifuge | |||
| Access to a stereo microscope with transmitted-light | |||
| Culture media | |||
| MEF Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 41965-062 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-7524 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium pyruvate (0.4 mM) | Gibco | 11360-039 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| SR-based mESC medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | mixed in a 1:1 ratio |
| 15% knock-out serum replacement (SR) | Gibco | 10828–028 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| 0.1 mM non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| β-mercaptoethanol (0.1 mM) | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| 2,000 U/mL recombinant mouse LIF | (IRC/VIB Protein Service facility) | ||
| FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium) | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| Differention Medium | stored at 4 °C; warm 30 min at 37 °C before use | ||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| 5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid | Gibco | 11279-023 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| 0.4 mM 1-thioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| 50 μg/mL ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A-4544 | |
| penicillin (100 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| 2i | |||
| 1 μM Erk inhibitor PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | |
| 3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 |
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