Summary
Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저의 병원성 물질이기 때문에 유전자와 단백질에 대한 연구가 엄격히 규제됩니다. 또 다른 접근법은 orthologous 유전자를 연구하는 것이다. B. cereus 의 B. anthracis ortholog (bc1531)에 대한 생물학적 물리 화학적 연구는 최소한의 실험 장비를 필요로하며 심각한 안전 문제가 없다고 설명합니다.
Abstract
진정한 병원체에서 유전자와 단백질을 연구 할 때 안전 제한과 규제를 극복하기 위해 동질성을 연구 할 수 있습니다. Bacillus anthracis 는 치명적인 흡입 탄저병을 일으키는 절대 병원균입니다. Bacillus cereus 는 B. anthracis 를 가까운 진화 관계로 연구하는 데 유용한 모델로 간주됩니다. B. anthracis 의 유전자 클러스터 ba1554 - ba1558 은 Bacillus thuringiensis 의 bt1364 - bt1368 클러스터뿐만 아니라 B. cereus 의 bc1531 - bc1535 클러스터와 잘 보존되어 있으며 Bacillus 속의 관련 유전자의 중요한 역할을 나타낸다. 이 원고는 B. cereus , bc1531 에서 ortholog의 재조합 단백질을 사용하여 B. anthracis 의 유전자 클러스터에서 첫 번째 유전자 ( ba1554 )의 단백질 생성물을 준비하고 특성화하는 방법을 설명합니다.
Introduction
재조합 단백질 발현은 제한된 단백질 양 및 유해한 오염과 같은 천연 단백질 공급원과 관련된 문제점을 극복하기 위해 널리 사용됩니다. 또한 병원성 유전자와 단백질 연구에서 추가적인 안전 예방 조치가 필요없는 대체 실험실 균주를 이용할 수 있습니다. 예를 들어, Bacillus cereus 는 Bacillus anthracis 를 가까운 진화 적 관계 로 연구하는데 유용한 모델이다.
B. 탄저균은 사람과 가축에서 치명적인 흡입 탄저병을 일으키는 필수 병원체이며 잠재적으로 생물 표지 2 로 사용될 수 있습니다. 따라서 B. anthracis 에 대한 실험실 연구는 BSL-3 (생물 안전성 수준 3) 관행을 요구하는 미국 질병 통제 센터 (Centers for Disease Control)에 의해 엄격히 규제되며 실험실 구역을 음의 실내 압력으로 격리하도록 요구합니다. B. anthracis 와는 대조적으로 B. cereus 는 BSL-1 약제로 분류되어 안전에 대한 염려가 거의 없다. B. cereus 는 감염시 식중독을 일으키는 기회 주의적 병원균으로 의료 지원없이 치료할 수 있습니다. 그러나 B. cereus 는 B. anthracis 와 많은 중요한 유전자를 공유하기 때문에 B. cereus 1의 동족체를 사용하여 B. anthracis 단백질의 기능을 연구 할 수 있습니다.
B. anthracis 의 ba1554 - ba1558 유전자 클러스터는 bc1531 - bc1535 클러스터와 잘 보존되어있다. Bacillus thuringiensis 의 bt1364-bt1368 클러스터뿐만 아니라 B. cereus 의 유전자 조직 및 염기 서열에 관한 것이다. 또한, 각 클러스터의 첫 번째 유전자 ( ba1554 , bc1531 및 bt1364 )는 절대적으로 보존되어 있습니다 ( 예 : 100 % 염기 서열 동일성). implyiBacillus 종에서 유전자 산물의 결정적인 역할. 이러한 유전자 클러스터에서의 위치 때문에, ba1554 는 추정 전사 조절 자로 오인되었다. 그러나 ba1554 산물의 아미노산 서열 분석은 MazG family에 속하는 것으로 나타 났는데, 이는 nucleotide pyrophosphohydrolase 활성을 가지고 있으며 전사 인자 활성과 관련이 없다 4 , 5 . MazG 계열에 속하는 단백질은 전체 서열과 길이가 다양하지만 EXXE 12-28 EXXD 모티프로 특징 지워지는 ~ 100 잔기의 MazG 도메인을 공유합니다 ( "X"는 아미노산 잔기를 의미하고 번호 X 잔기의 수를 나타낸다).
MazG 도메인은 특정 촉매 활동을 직접적으로 설명하지는 않습니다. Escherichia coli (EcMazG)의 MazG 구성원은 2 개의 MazG 도메인을 보유하고 있지만C 말단 MazG 도메인은 효소 적으로 활성이다 6 . 또한, MazG 효소의 기질 특이성은 비특이적 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (EcMazG의 경우)에서 특정 dCTP / dATP (인테그린 관련 MazG의 경우) 및 dUTP (dUTPases의 경우) 6 , 7 , 8 , 9로 다양합니다. 따라서 BA1554 단백질의 생물 물리 화학적 분석은 NTPase 활성을 확인하고 기질 특이성을 해독하기 위해 필요하다.
여기에 BSL-3 시설이없는 대부분의 실험실이 분자 수준에서 B. anthracis ba1554 의 ortholog 인 B. cereus bc1531 유전자의 단백질 생성물을 특성화하기 위해 따라갈 수있는 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 간단히, 재조합 BC1531 (rBC1531)을 대장균 에서 발현 시키고 친 화성 태그를 사용하여 정제 하였다. X 선 결정학 실험에서 결정rBC1531 단백질의 zation 조건을 스크리닝하고 최적화 하였다. rBC1531의 효소 활성을 평가하기 위해, NTPase 활성을 비색계로 모니터링하여 통상적으로 사용 된 방사성 표지 된 뉴클레오타이드를 회피 하였다. 마지막으로, 얻어진 생 물리 화학적 데이터의 분석은 rBC1531 결정으로부터 X- 선 회절 데이터를 얻는 것뿐만 아니라 rBC1531의 올리고머 화 상태 및 촉매 매개 변수를 결정할 수있게했다.
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Protocol
1. rBC1531의 재조합 단백질 생산 및 정제
- 재조합 BC1531 단백질 (rBC1531) - 발현 플라스미드
- B. cereus 10 의 게놈 DNA를 준비합니다.
- Bam HI 및 Sal I 제한 효소 부위를 각각 생성하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머 (물질 목록 참조)를 사용하여 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 B. cereus 게놈 DNA의 템플레이트로부터 bc1531 유전자를 증폭시킨다.
- PCR 제품과 수정 된 pET49b 벡터 (pET49bm)를 BamHI 및 Sal I을 사용하여 분해하고 11 .
- 설명 된대로 10 μL 반응에서 T4 DNA 리가 제를 사용하여 1.1.3 단계에서 소화 PCR 제품과 벡터 (3 : 1 비율)를 섞는다. 18 ° C에서 30 분 동안 품어 라.
- chemica 50 μL에 연결 반응 3 μL 피펫유능한 E. coli DH5α 세포를 튜브에 넣습니다. 피펫 팅을 위아래로 부드럽게 혼합하고 얼음에 30 분 동안 두십시오. 42 ° C에서 45 초 동안 열충격. Luria - Bertani (LB) 배지 1 ML을 추가하고 격렬하게 (250 rpm, 37 ° C, 45 분) 떨고있는 동안 세포를 성장.
- 단계 1.1.6에서 형질 전환 한 세포 100 μL를 취해 100 μg / mL kanamycin (칸)이 들어있는 LB- 한천 플레이트에 뿌립니다. 37 ~ 18 시간 동안 ~ 18 시간 동안 품어 낸다.
- 멸균 팁을 사용하여 식민지를 선택하고 100 μg / ML 칸과 LB 미디어 3 ML의 세포를 성장; 격렬히 흔들어주세요 (250 rpm, 37 ° C, 18 h).
- 10 설명한대로 알칼리성 SDS의 lysis 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 준비합니다.
- DNA sequencing 12 를 사용하여 rBC1531 발현 구조의 염기 서열을 확인합니다.
- rBC1531 단백질의 과발현
- rBC1531-exp로 대장균 BL21 (DE3) 균주를 재조합과발현을 위해 단계 1.1.5-1.1.6에 기술 된대로 레 시온 플라스미드를 사용한다.
- 식민지를 선택하고 50 μg / ML 칸 (LB + 칸)을 포함하는 LB 매체의 10 ML에서 그것을 성장; 37 ° C에서 18 시간 동안 격렬히 흔든다.
- 1L의 LB + Kan 배지에 밤새 배양 10 mL를 접종하고 OD 600 (600 nm에서의 광학 밀도)이 ~ 0.7에이를 때까지 37 ℃에서 성장시킨다.
- 온도를 18 ° C로 낮추고 재조합 단백질 발현을 위해 1 mM의 최종 농도에서 배양 물에 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하기 위해 약 15 분 동안 얼음물에서 배양합니다. 18 ~ 18 ℃에서 16 ~ 18 시간 동안 배양하십시오.
- rBC1531의 정제
- 원심 분리 (5,000 xg, 4 ° C, 30 분)에 의해 세포를 수확. 세포를 방해하지 않도록주의 깊게 상등액을 버린다. 10 MM 이미 다졸이 들어있는 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액 50 mL에 세포를 재현 탁합니다.
- 세포 lysates (시간 : 2 분 30 초, 사이클 : 5 초, 사이클 오프 : 10 초, 진폭 : 38 %)의 과열을 방지하기 위해 얼음 sonication에 의해 세포를 두 번 Lyse.
- 원심 분리 (~ 25,000 xg, 4 ℃, 30 분)에 의해 세포 용 해물을 맑게한다.
- 10 ML 이미 다졸 및 중력 흐름을 포함하는 60 ML 니켈 비즈 3 ML을 섞어 여분의 버퍼 2.5 X 10cm 유리 크로마토 그래피 칼럼에 평형 니켈 구슬을 해결합니다.
- 피펫은 사전에 평형 니켈 구슬과 칼럼에 1.3.3에서 뜨는을 전송하고 저속 (~ 20 RPM)에서 회전 바퀴에 4 시간에 2 시간 품어.
- 뜨는를 중력에 의해 배수하고 10 MM 이미 다졸을 포함하는 PBS 100 ML로 열에있는 세 번 니켈 구슬을 씻어주십시오.
- 250 mM 이미 다졸을 함유 한 PBS 4 x 5 mL를 적용하여 rBC1531 단백질을 용출시켰다.
- 1.3.7 단계에서 15 μL의 용리액을 취해 15 % SDS-PAGE에서이를 수행하십시오. 단백질 밴드를 시각화합니다.Coomassie blue 염색법을 사용하여 젤 10 .
- 트롬빈 단백 분해에 의한 rBC1531 단백질의 친화력 태그 제거
- 분주를 투석 튜브 (분자량 차단 : 3 kDa)에 피펫과 트롬빈 절단 호환 버퍼 (20 MM HEPES, 산도 7.4, 150 MM NaCl 및 1.5 MM β - mercaptoethanol)의 4 L를 포함하는 비커에 튜브를 놓으십시오. 4 ° C에서 하룻밤.
- 분수를 피펫과 원뿔 튜브로 전송합니다.
- 280 nm에서 흡광도를 측정하고 설명 된 바와 같이 rBC1531 단백질 농도를 추정.
- 0.5 mL 튜브에서 rBC1531 50 μg을 채취하고 다양한 양의 트롬빈 ( 즉, 2, 1, 0.6 및 0.3 단위)을 첨가하십시오. rBC1531과 트롬빈 반응을 20 ℃에서 ~ 3 시간 동안 배양하여 N- 말단 친 화성 태그를 절단하는데 필요한 트롬빈의 최소량을 결정한다.
- rBC1531 및 트롬빈 반응을 15 %SDS-PAGE로 확인하고 N 말단 친화력 태그를 완전히 소화하고 태그가없는 rBC1531을 생산하는 트롬빈의 최소량 ( 예 : rBC1531 50 μg 당 0.3 단위의 트롬빈)을 결정합니다.
- 10mg의 rBC1531 단백질과 60 단위의 트롬빈을 15 mL 튜브에 넣고 20 ℃에서 3 시간 동안 트롬빈 - 단백질 분해 반응을 일으킨다.
- 설명 된대로 분자량 및 용출 부피의 표준 곡선을 만들기 위해 크기 - 제외 크로마토 그래피 (SEC) 칼럼에 겔 여과 표준을 적용하십시오.
- 원심 분리 필터 튜브 (분자량 차단 : 3 kDa)에 1.4.6 단계의 트롬빈 소화 rBC1531 단백질을 넣고 4,000 ml에서 3,000 g으로 원심 분리하여 5 mL 미만의 부피로 줄입니다.
- 농도가 rBC1531 단백질을 SEC 칼럼에 적용하고 튜브 당 0.5 mL로 60 개의 용출 분획물을 수집하십시오 13 .
- 각 분획물 15 μL를 취하여 15 % SDS-PAGE에서 실행하고,Coomassie 염색 용액 (0.15 % (w / v) Coomassie 브릴리언트 블루, 40 % (v / v) 메탄올 및 10 % (v / v) 빙초산)을 사용하여 겔을 만들었다.
- rBC1531을 포함하는 분수를 피펫 씩 하나의 튜브에 모으십시오.
2. 결정화 스크리닝 및 rBC1531의 최적화
- rBC1531 단백질 결정화를위한 스크리닝 조건
- 1.4.8에서 설명한대로 원심 분리 필터 튜브를 사용하여 단계 1.4.11에서 rBC1531를 ~ 18.5 mg / mL까지 농축합니다.
- 96- 웰 앉아 드롭 결정화 플레이트의 웰에 각 결정화 스크리닝 용액 (섹션 2.2 참조 ) 을 50 μL 씩 첨가한다. 앉아있는 침대에 18.5 mg / mL rBC1531 단백질 용액 0.5 μL를 놓습니다. 용액 전체 0.5 μL와 단백질 용액을 섞어서 전체 플레이트에 대한 과정을 반복하십시오.
- 깨끗한 접착 필름으로 판을 덮으십시오.18 ° C에 96 - 웰 플레이트를 놓고 증기 확산을 허용합니다.
- 광학 현미경을 사용하여 20 ~ 40 배율로 방울을 스캔하여 2-3 주 동안 매일 크리스탈 형성을 모니터링하십시오.
- 얻은 rBC1531 단백질 결정을 사용하여 X- 선 회절 데이터 12 을 수집하십시오.
- rBC1531 결정화 조건의 최적화
- 선택한 초기 결정화 조건 용액 ( 예 : 0.1 M sodium cacodylate, pH 6.5 및 1.0 M sodium citrate) 500 μL를 준비하고 앉은 방울을 위해 24-well crystallization plate를 채 웁니다.
- 앉아있는 침대에 18.5 mg / mL rBC1531 단백질 용액 0.5 μL를 넣고 잘 용액 0.5 μL와 섞은 다음 즉시 투명 필름으로 판을 덮습니다. 플레이트를 18 ° C에 놓습니다.
- 가벼운 현미경으로 1 주일 동안 결정 성장을 관찰하십시오.
- pH를 변화시켜 다양한 결정화 조건을 최적화하십시오 ( 즉,., pH 5.5-6.8)를 사용하고 구연산 나트륨의 염농도 ( 즉, 0.9-1.2 M)를 변경하여 단핵 결정을 얻는다. 1 주일 동안 결정 성장을 모니터하고 X 선 회절 데이터를 수집하십시오. 12 .
3. rBC1531의 뉴 클레오 시드 트리 포스파타제 (NTPase) 활성의 특성 규명
- 무기 인산염 비례 검정의 검증
- 피로 인산염 (100 MM)의 주식을 준비하고 반응 버퍼 (20 MM HEPES, 산도 7.4, 150 μl)에 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100 및 250 μm의 최종 농도로 희석 mM NaCl 및 2 mM MgCl 2 )로 2 번 96- 웰 플레이트에서 배양 하였다. 첫번째 판을 대조군으로 사용하십시오 (이것은 피로 포스파타제를 포함하지 않습니다). 두 번째 플레이트에 3.1.2 절에서 설명한대로 작업 플레이트로 pyrophosphatase가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- Saccharomyces cerevisiae 무기 p 0.01 단위 첨가Yrophosphatase (1 μL)를 작용 플레이트의 웰에 넣고 20 ° C에서 30-60 분 동안 배양합니다.
- 몰리브덴 산 암모늄 (0.86 % v / v)과 아스코르브 산 (14 % v / v)을 7 : 3의 비율로 혼합하여 몰리브덴 산 용액을 제조한다. 몰리브덴 산 용액 16 μL를 작업 및 대조 우물에 모두 넣고 15 분 동안 기다린다.
- 690 nm (OD 690 nm)에서 광학 밀도를 읽습니다.
- 비색 NTPase 분석
- 100 mM 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 (NTP) 기질을 준비하고 검정 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.4) 중 180 μL에서 원하는 농도 ( 예 : 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88, 132 μM) pH 7.4, 150 mM NaCl 및 2 mM MgCl 2 )에 용해시켰다.
- 96- 웰 플레이트에서 반응 당 200 μL까지 단계 3.2.1에서 rBC1531 (1.5 mM) 및 NTP 기질 20 μg을 첨가하고 잘 혼합하기 위해 위아래로 피펫 팅하십시오. 뚜껑을하여 플레이트를 덮고 30 분 동안 37 ° C 배양기에 두십시오기질 가수 분해 반응을 수행한다.
- 플레이트를 70 ° C의 수 욕조에 옮기고 15 분 동안 방치하여 rBC1531 매개 촉매 반응을 중지시킵니다.
- S. cerevisiae 무기 pyrophosphatase (1 μL) 0.01 단위를 반응 판 (단계 3.2.3)의 각 웰에 첨가하고 20 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 몰리브덴 산 용액 16 μL를 반응 판에 첨가하여 색상을 만듭니다 (~ 15 분). OD 690nm 에서 읽으십시오.
- 12 에서 설명한대로 Michaelis-Menten 방정식을 사용하여 분석하십시오.
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Representative Results
본 연구에서 목적 단백질의 특성화는 충분한 양의 재조합 B. cereus bc1531 (rBC1531) 단백질을, 바람직하게는 수 밀리그램 이상으로 제조함으로써 시작되었다. BC1531 단백질을 코딩하는 DNA 단편은 B. cereus 의 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR 법으로 ba1554와 동일한 orthologous gene을 포함하고 있으므로 준비 하였다. rBC1531은 대장균 에서 가용성 단백질로 과발현되었다. rBC1531 단백질은 6x- 히스티딘 태그 및 그의 N- 말단 12 에서 트롬빈 절단 부위로 발현되었다. 정제의 첫 번째 단계로서 rBC1531을 니켈 친 화성 크로마토 그래피 ( 그림 1A )로 정제했습니다. 다음으로 트롬빈 소화 시험을 수행하여 rBC1531 ( 도 1A )로부터 친 화성 태그의 완전한 소화에 필요한 트롬빈의 최저량을 결정 하였다. 우리 손에는 0.3 단위의 트롬빈이 들어있었습니다.rBC1531에서 친 화성 태그를 완전히 제거하기에 적합합니다. 따라서, 스케일링시 rBC1531 10mg을 태그 제거 용 트롬빈 60 단위로 처리 하였다. 트롬빈 소화 후, tag-free rBC1531을 SEC 칼럼에 적용하여 용해성 응집체 및 고 분자량 또는 저 분자량 오염물을 제거했습니다. rBC1531 분획을 SDS-PAGE로 분석 한 결과, rBC1531은 ~ 99 % 순수한 것으로 나타났다 ( 도 1A ). 전체적으로 1L의 배양액에서 8mg의 rBC1531 단백질이 생성되었다.
rBC1531의 올리고머 상태를 평가하기 위해 SEC가 수행되었다. 시료의 분자량 로그 값과 해당 용리 부피를 연관시키는 표준 선형 곡선을 단백질 표준 ( 그림 1B )의 피크를 사용하여 플롯했습니다. rBC1531는 ~ 84 mL의 용출 부피에서 용리되었으며, 겉보기 분자량은 ~ 55 kDa로 추정되었다. 주어진 분자량rBC1531 모노머의 ight는 ~ 13 kDa이며,이 결과는 rBC1531이 테트라 머로 조립됨을 나타냅니다.
정화 된 rBC1531을 시팅 드롭 증기 확산법에서 ~ 400 조건을 사용하여 결정화를 위해 스크리닝 하였다. rBC1531 결정은 조건 -A, 0.1M 시트르산 나트륨 (pH 5.5) 및 20 % PEG 3000 ( 도 2A ) 및 조건 -B, 0.1M 나트륨 카코 딜 레이트 (pH 6.5) 및 1.0M 나트륨 citrate ( 그림 2B ). 결정화 조건은 조건 A로부터의 pH (0.1 M 시트르산 나트륨, pH 5.0-6.0) 및 PEG 3000 (18-21 % PEG 3000)의 농도를 변화시키고 pH (0.1 M 나트륨 카코 딜 레이트, pH 5.5-6.8) 및 조건 B의 염농도 (0.9-1.2 M 시트르산 나트륨). 회절에 적합한 결정은 조건 B에 대해서만 얻어졌지만 조건 A의 결정은 단수보다는 상호 성장하는 경향이 있었다. 조건 B 결정체회절 X 선을 2.74Å의 분해능으로 분해하고 ( 도 2C ), rBC1531 구조 결정에 사용 하였다.
BA1554 단백질 서열에서 보존 된 MazG 도메인의 관찰은 NTP를 가수 분해 할 수있는 NTPase 활성의 존재를 암시한다. NTP 가수 분해는 일반적으로 뉴 클레오 사이드 디 포스페이트 (NDP) 및 무기 포스페이트 (Pi) 또는 뉴 클레오 사이드 모노 포스페이트 (NMP) 및 피로 포스페이트 (PPi)를 생성한다. PPi는 Pi를 생성하기 위해 추가적인 피로 포스파타제 활성을 필요로한다. Pi의 수준은 690 nm의 파장 (OD 690 nm)에서 광학 밀도를 사용하여 모니터 할 수있는 Pi (molybdate-Pi)와 청색 착색 된 복합체를 형성하는 몰리브덴 산염을 사용하여 직접 측정 할 수 있습니다 ( 그림 3A ). 우리 연구에서, rBC1531에 의한 NTP 가수 분해 후, 몰리브덴 산염 첨가 후 가시적 인 청색은 생성되지 않았다 ( 도 3B ). 그러나, 피로 포스파타제가 rBC1531- 매개 NTP 가수 분해에 첨가 될 때반응이 진한 파란색으로 바뀌었고 ( 그림 3B ) rBC1531에는 NTP pyrophosphohydrolase 활성이 있음을 나타냅니다. OD 690nm 와 NTP 농도의 플롯을 비선형 회귀 분석법을 사용하여 rBC1531 효소 ( 도 3C )에 대한 운동 파라미터 ( Vmax 는 0.75, Km는 10μM)를 결정 하였다.
그림 1 : SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 분석. ( A ) rBC1531의 SDS - 페이지 분석. (왼쪽) 니켈 친화도 크로마토 그래피 (레인 2, Ni) 및 SEC (레인 3)로부터의 rBC1531 용출 피크를 단백질 표준 (레인 1, kDa로 표시)과 함께 분석 하였다. (오른쪽) 친화력 태그 제거를위한 rBC1531의 트롬빈 소화 분석. 다른 반응에서 rBC1531의 50 μg에 첨가 된 트롬빈의 양은 ind겔 위의 단위로 희석. ( B ) rBC1531 및 단백질 표준의 크기 - 배제 크로마토 그래피 (SEC) 분석. (왼쪽) rBC1531 (파란색) 및 표준 (빨간색)의 용출 프로필. 표준 단백질의 분자량은 kDa 단위로 각 피크 위에 표시됩니다. 수직 (y) 및 수평 (x) 축은 밀리 - 흡수 단위 (280 nm에서의 mAU) 및 보유 부피 (mL)를 각각 나타낸다. (오른쪽) rBC1531의 겉보기 분자 크기는 분자량, 로그 스케일 및 단백질 표준의 용출 부피 (R2 = 0.9934)에 대한 선형 플롯을 사용하여 추정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 결정화 및 X- 선 회절. condit에 ( A ) rBC1531 결정0.1M 나트륨 시트 레이트 (pH 5.5) 및 20 % PEG 3000. ( B ) 조건 B의 rBC1531 결정, 0.1M 나트륨 카코 딜 레이트 (pH 6.5) 및 1.0M 시트르산 나트륨. 초기 (왼쪽) 및 최적화 (중간 및 오른쪽) 결정이 표시됩니다. X 선 회절에 최적화 된 rBC1531 결정 (오른쪽, ~ 0.35 mm x ~ 0.35 mm x ~ 0.20 mm)을 사용했습니다. 스케일 바 = 100 μm. ( C ) PAL 빔라인 BL-7A 12 에서 얻은 rBC1531 결정의 X- 선 회절 이미지. 화살표는 고해상도 지점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : NTPase 활동. ( A ) 몰리브덴 -Pi 착체의 형성은 Pi 농도에 의존한다. 690 nm에서의 광학 밀도는 dipi 수준의 증가와 직결된다. Y 축과 X 축은 Pi의 OD 690nm 와 농도 (μM)를 각각 나타낸다. ( B ) 파이로 포스파타제 첨가시 색이 변한다. 우물의 첫 번째 열에서는 pyrophosphatase가 첨가되지 않았고 청색의 Pi-complex를 형성하지 않았다. 그러나, 두 번째 행은 rBC1531-NTP 반응이 파이로 포스파타제로 처리되고 청색을 나타내는 우물로 구성됩니다. OD 690nm 값은 NTP 농도의 증가에 따라 증가했다. ( C ) rBC1531-NTP 반응의 Michaelis-Menten 플롯. Y 축 및 X 축은 각각 NTP 기질의 OD 690nm 및 농도 (0-120μM)를 나타낸다. 오차 막대는 세 번의 실험에 대한 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
X 선 회절 데이터 세트는 포항 가속기 연구소 (한국)의 빔라인 7A에서 수집되었다. 이 연구는 과학 기술부, ICT 및 미래 계획 (2015R1A1A01057574, MH)이 자금을 지원하는 국립 과학 재단 (NRF)을 통해 관리되는 기초 과학 연구 프로그램의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μL (1 Unit per μL) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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- Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
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