Summary
توضح هذه المقالة الطيفية الخلوي، نهجا جديدا في التدفق الخلوي يستخدم الأشكال من أطياف الانبعاث للتمييز fluorochromes. خوارزمية استبدال التعويضات ويمكن علاج لصناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. يسمح هذا النهج الجديد لتحليل سليم للخلايا معزولة من الأعضاء الصلبة.
Abstract
التدفق الخلوي قد استخدمت على مدى السنوات ال 40 الماضية لتحديد وتحليل النمط الظاهري للاللمفاوية والخلايا المكونة للدم الأخرى. يقتصر في البداية على تحليل عدد قليل من fluorochromes، وحاليا هناك العشرات من الأصباغ الفلورية مختلفة، وتصل إلى 14-18 الأصباغ المختلفة يمكن الجمع في وقت واحد. ومع ذلك، لا يزال العديد من القيود يضعف القدرات التحليلية. ونظرا لتعدد تحقيقات الفلورسنت، أصبح تحليل البيانات تزداد تعقيدا بسبب حاجة كبيرة، المصفوفات تعويضات متعددة حدودي. وعلاوة على ذلك، أصبحت نماذج الماوس متحولة تحمل البروتينات الفلورية لكشف وتتبع أنواع معينة من الخلايا في الأنسجة المختلفة المتاحة، لذلك مطلوب تحليل (عن طريق التدفق الخلوي) من تعليق خلية لصناعة السيارات الفلورسنت تم الحصول عليها من الأعضاء الصلبة. الطيفي التدفق الخلوي، والذي يميز الأشكال الأطياف الانبعاثات على مجموعة واسعة من موجات مستمرة، يعالج بعض من هذه المشاكل. ويتم تحليل البيانات ثإيث خوارزمية الذي يحل محل المصفوفات التعويض ويعامل صناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. وبالتالي، يجب أن يكون الطيفي التدفق الخلوي قادرة على التمييز fluorochromes مع قمم الانبعاثات مماثلة، ويمكن أن توفر تحليل متعدد حدودي دون متطلبات التعويض.
يصف هذا البروتوكول تدفق الطيفي الخلوي التحليل، والسماح لمعلمة 21 (19 تحقيقات الفلورسنت) توصيف وإدارة إشارة لصناعة السيارات الفلورسنت، وتوفير عالية الدقة في كشف سكان القصر. أظهرت النتائج المعروضة هنا أن تدفق الطيفي يعرض الخلوي المزايا في تحليل للسكان الخلية من الأنسجة يصعب تميز في التدفق التقليدي الخلوي، مثل القلب والأمعاء. الطيفي التدفق الخلوي وبالتالي يدل على القدرة التحليلية متعددة حدودي من إدارة التدفق التقليدي الخلوي دون الحاجة للحصول على تعويضات عالية الأداء ويمكن لصناعة السيارات في مضان.
Introduction
في العقود القليلة الماضية، التدفق الخلوي (FCM) أصبحت وسيلة تحليلية على نطاق واسع أساسيا للدراسات خلية phenotyping. كان هناك زيادة كبيرة في الأصباغ الفلورية المتاحة، وخاصة fluorochromes ولع الليزر البنفسجي (405 نانومتر) (على سبيل المثال، البنفسج الرائعة والأصباغ الجديدة-Q نقطة). ومع ذلك، فإن نمو الأصباغ الفلورية المتاحة يزيد من خطر الانبعاثات المتداخلة ويتطلب المصفوفات تعويض كثيفة العمالة. أصبح FCM المستخدمة على نطاق واسع لتحليل تعليق خلية من الأنسجة الصلبة، ولكن وجود خلايا لصناعة السيارات الفلورسنت يحد من التمييز ضد السكان المسمى على وجه التحديد.
ويقال إن المبادئ الأساسية للالطيفي FCM بالتفصيل في Futamura وآخرون. 1، 2. لفترة وجيزة، وقد تم تجهيز FCM الطيفية المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد) مع 405، 488، و 638 ليزر نانومتر. وFCM الطيفي يلتقط جميع و المنبعثluorescence كما الأطياف في 32 قناة خطي مجموعة PMT (32CH PMT) مقابل 500 نانومتر إلى 800 نانومتر و 2 هذه الفرق المستقلة عن 420 نانومتر إلى 440 نانومتر و 450 نانومتر إلى 469 نانومتر، على التوالي، والتي تحل محل مرشحات الفرقة تمرير التقليدية. يتم فصل وبقع الليزر 488 نانومتر 405/638 مكانيا، في حين أن البقع الليزر 405 نانومتر و 638 نانومتر هي شارك في الخطية. لكل الجسيمات الفردية، والتدابير FCM الطيفية ما يصل الى 66 قنوات من البيانات مضان متحمس من قبل نانومتر 405 و 488 نانومتر الليزر. عندما متحمس الخلايا عن طريق نانومتر الليزر 638، وFCM الطيفي يقيس 58 قنوات من البيانات مضان لإدخال قناع لمنع الليزر 638 نانومتر من ساطع في PMT. الطيفية FCM يحلل البيانات الطيف الكامل المكتسبة مع خوارزمية على أساس مرجح طريقة المربعات الصغرى (WLSM)، والتي تمكن فصل تداخل الأطياف الفلورسنت. يتم التعرف على أطياف مستمدة من عينات واحدة الملطخة وغير ملوثين كما أطياف المرجع الأساسي. تم تركيب عينات متعددة الملون رياضيا لوتتحلل الثانية غير مخلوطة، وطيف من عينة مع تسميات فلوري مختلطة إلى مجموعة من الأطياف المكونة لها. وunmixing، في التكنولوجيا الطيفية 3، 4، محل التعويض التي تزيل إشارة من جميع أجهزة كشف ما عدا واحدة قياس صبغة معينة.
في هذه الدراسة، ونحن معا واختبار 19 fluorochromes في واحد، وتحليل 21 المعلمة التي اتسمت بها مجموعات فرعية للدم الرئيسية الموجودة في الطحال الماوس. بالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن الخلوي الطيفي يمكن إدارة إشارة لصناعة السيارات الفلورسنت، وبالتالي تحسين خصائص الخلايا الليمفاوية المعوية داخل الظهارية ومن القلب الجنينية. في الواقع، في هذه الأنسجة، وإدارة صناعة السيارات في مضان سمحت لهذه المهمة من مضان محددة للخلايا التي ستستبعد من التحليل في FCM التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب وفقا لمعهد باستور ميثاق أخلاقيات والمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة من قبل وزارة الزراعة الفرنسية.
1. خلية التحضير تعليق من أجهزة الماوس الكبار
- عزل splenocytes
- الموت ببطء الفئران الكبار خلع عنق الرحم. إجراء شق في خط الوسط البطن وفتح الجلد مع مقص. حصاد الطحال بالملقط.
- سحق الطحال بين 2 ميكروسكوب الشرائح لفصل الخلايا وتمييع لهم في 5 مل من مملحة الحل المتوازن هانك (HBSS) التي تحتوي على 1٪ مصل العجل الجنين (FCS).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 120 x ج و 4 ° C. تجاهل طاف.
- إعادة تعليق بيليه في 5 مل من HBSS 1٪ FCS. عدد الخلايا مع غرفة نويباور باستخدام التريبان الأزرق وصمة عار الحيوية.
ملاحظة: 80000000 خلايا يجب الحصول عليها من الطحال شخص بالغ واحد.
- Isolatiعلى الخلايا من الأمعاء الدقيقة
- الموت ببطء الفئران الكبار خلع عنق الرحم. باستخدام مقص، وجعل شق في الجلد في خط الوسط البطن. فهم الأمعاء الدقيقة مع ملقط في يد واحدة واستخدام المقص لقطع عليه عند كلا الطرفين: أولا، مباشرة بعد المعدة ومن ثم في نهاية الأمعاء الدقيقة، قبل الأمعاء الغليظة. تدفق الأمعاء الدقيقة مع 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) باستخدام حقنة مل 2 بإبرة.
- وضع الأمعاء الدقيقة على منشفة ورقية وإزالة بعناية البقع باير مع زوج من مقص حاد.
- استخدام المقص لفتح الأمعاء على جانبها طويلة عن طريق إدراج فرع واحد من مقص داخل الأمعاء. قطع الأمعاء فتح الى قطع 1 سم باستخدام مقص حاد.
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر منذ 30 مل من HBSS مع 10٪ FCS.
- ضع تعليق الخلية التي تحتوي على شظايا غير فصلها المتبقية في 50 ملأنبوب بلاستيكي ودوامة لمدة 5 دقائق بسرعة عالية. ملاحظة: لا توجد أية التفكك مزيد من الأنسجة.
- احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد للسماح للشظايا كبيرة، وعدم فصلها لتكوير.
- جمع طاف والتركيز من قبل الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 120 × ز.
- تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من HBSS مع 1٪ FCS. عد الخلايا مع غرفة نويباور باستخدام التريبان الأزرق وصمة عار الحيوية.
ينبغي الحصول على ~ 60 مليون الخلايا داخل الظهارية (IELs) من شخص بالغ واحد الأمعاء الدقيقة: ملاحظة.
- استراتيجية تصميم لوحة
- إعداد لوحات مع الأجسام المضادة إلى جانب مباشرة مع fluorochromes.
ملاحظة: يتم معاير جميع الأجسام المضادة في السابق للحصول على تعريف الأمثل للسكان الخلية (المعايرة يمكن أن تختلف مع الدفعة الضد). يتم سرد الأجسام المضادة المستخدمة في لوحة 19 لون وصمة عار splenocytes في الجدول 1. - بناء متعدد كولولوحات ص لالخلوي. وهذا يمكن أن يكون مهمة صعبة، استخدم الإرشادات التالية لتحسين وحات:
- تحقق من تكوين الطيفي والأصباغ الفلورية التي يمكن استخدامها على الصك.
- استخدام المعلومات السطوع مؤشر / مؤشر تلطيخ المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: مؤشر / مؤشر تلطيخ السطوع هو المؤشر النسبي للكثافة مضان مقابل خلفية لكل تألقي. - اختيار الأجسام المضادة اتباع القواعد التالية:
- اختيار ألمع fluorochromes للبروتينات التي يتم التعبير عنها ضعيف والأكثر خفوت fluorochromes للبروتينات أكثر أعرب للغاية.
ملاحظة: على سبيل المثال، يتم التعبير عن CD45، CD4، وCD8 للغاية ويمكن استخدامها مع fluorochromes قاتمة. - البدء في تصميم لوحة عن طريق اختيار أول الأجسام المضادة مع أقل عدد من الاحتمالات صبغة الفلورسنت.
- إذا كان ذلك ممكنا، واختيار الأصباغ الفلورية مع أصغر تداخل الانبعاثات الأطياف وأو علامات أعربت على أنواع الخلايا نفسها.
ملاحظة: المقعدين (على سبيل المثال، PE-Cy5، PE-Cy7، وPerCP-Cy5.5) يجب أن تستخدم بحذر، لأنها أكثر عرضة للتدهور من التعرض للضوء.
- اختيار ألمع fluorochromes للبروتينات التي يتم التعبير عنها ضعيف والأكثر خفوت fluorochromes للبروتينات أكثر أعرب للغاية.
- إعداد لوحات مع الأجسام المضادة إلى جانب مباشرة مع fluorochromes.
- تلطيخ الخلايا لتحليلها الخلوي
- إعداد واحد 5 مل أنبوب مع 1 × 10 6 splenocytes واحد 5 مل أنبوب مع 1 × 10 6 الخلايا المعوية والاحتفاظ بها غير ملوثين لاستخدامها ضوابط السلبية.
- تحضير تسمية واحدة أنبوب 5 مل لكل عينة ولكل لوحة وفقا للجدول 1. تحضير مزيج الأجسام المضادة، وفقا للجدول 1، في HBSS 1٪ FCS.
- نقل 1 × 10 6 خلايا - إما splenocytes أو الخلايا المعوية - في كل أنبوب 5 مل. إضافة 2 مل من HBSS 1٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و 120 ز س. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة.
- تسمية الصورةplenocytes في 2 الخطوات. أولا، استخدام 50 ميكرولتر من مزيج يحتوي على الأجسام المضادة المسمى مع PE-Cyanine 5، PerCP-Cyanine 5.5، وPerCP (مع نادي مستقبلات الحجب) في أنبوب 5 مل. بعد 20 دقيقة من الحضانة في الظلام في 4 درجات مئوية، إضافة 50 ميكرولتر من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة الأخرى إلى أنبوب 5 مل.
ملاحظة: تحد هذه الاستراتيجية عائق الفراغية. - احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- إضافة 2 مل من HBSS 1٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و 120 ز س. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 200 ميليلتر من HBSS 1٪ FCS مع 0.5 ميكروغرام / مل يوديد propidium (PI).
2. إعداد وحيد تلطيخ عن كل تألقي على التعويض التجاري الخرزة الجزئي (على سبيل المثال، UltraComp eBeads)، يشار إليها فيما الخرز
- تحضير تسمية العديد من 5 مل أنابيب حيث بلغ عدد الأجسام المضادة التي تستخدم في لوحات. وضع 1 قطرة من الخرز في كل أنبوب وإضافة 1 & #181؛ L من الأجسام المضادة في أنبوب.
ملاحظة: الخرز المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد) تحتوي على الملون (إيجابي) وغير ملوثين الخرز (السلبية). يتم وضع الأجسام المضادة التي تزيد على حبات لضمان إشارة مشرقة وبالتالي البصمة الطيفية واضحا لكل الصبغة. هذا مطلوب من قبل البرنامج لتكون قادرة على تقديم unmixing دقيقة. - احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- إضافة 2 مل من HBSS 1٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 120 × ز. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 100 ميليلتر من HBSS 1٪ FCS.
3. خلية إعداد تعليق من الجنينية قلوب ماوس
- تشريح الأجنة
- التخطيط للحصول على الإناث الحوامل توقيتها في وقت مبكر عن طريق التزاوج 2 إناث مع ذكر واحد (دائما في قفص الذكر) في نهاية اليوم (بين 17 و 19 ساعة). في صباح اليوم التالي، وتعتبر الإناث مع المقابس المهبلية لتكون على 0.5 يوما بعد coitum.
- الموت ببطء E17.5 femal حاملوفاق خلع عنق الرحم. التأكد من أن الحيوان لا يستجيب عن طريق الضغط بقوة على مخلب الماوس (أخمص القدمين قرصة رد الفعل). الرطب البطن مع الايثانول 70٪ لتعقيم ومنع انتشار الفراء الماوس.
- إجراء شق في الجلد في منتصف مقص باستخدام البطن وسحب الجلد بعيدا مع الأصابع.
- فتح تجويف البطن عن طريق سحب وجعل شقوق في عضلات البطن من مركز نحو الجانبين من البطن باستخدام ملقط ومقص الجسيمة.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم تلف الأمعاء الدقيقة، وهو أقل من العضلات البريتوني فورا. - جمع قرون الرحم (مع الأجنة) عن طريق خفض سواء على مستوى جسم الرحم والمبايض. نقع عليها في 90 × 15 مم 2 طبق بيتري مع 50 مل من DPBS.
- عزل كل جنين عن طريق قطع بين كل الساقط، تليها الجدار العضلي الرحم والكيس المحي الحشوية مع ملقط غرامة ومقص. سحب كثافة الأجنةفعل. وأخيرا، وقطع الحبل السري.
- قطع رؤوس الأجنة E17.5 "مع مقص (قطع الرأس) قبل البدء في تشريح.
- جمع القلوب
- نقع الأجنة مقطوعة الرأس في 90 × 15 مم 2 طبق بتري تحتوي على الرطب الفراش منشفة ورقية في قاع الطبق و 50 مل من HBSS مع 1٪ FCS.
- تحت مجهر تشريحي، عقد كل جنين مع ملقط جسيمة بحيث الجانب البطني هو مواجهة.
- بعناية فتح شبكة الصدري عن طريق خفض الجانب الأيمن من الصدر مع مقص لمنع الأضرار التي لحقت القلب.
- كشف القلب من خلال عقد القفص الصدري مع ملقط الإجمالية.
- مزق قلب (لا يزال تجميعها مع الرئتين والغدة الصعترية) من خلال عقد الأوعية الدموية الكبرى (التي تحتوي على الأوعية الكبيرة الخارجي والداخلي تدفق القلب) ووضعها في 35 × 15 مم طبق بيتري 2 مع 2 مل من HBSS 1٪ مع FCS.
- عزل قلوب من الأجهزة المحيطة والنسيج الضام مع ملقط غرامة ومشرط.
- غسل القلوب في الجديد 35 × 15 مم طبق بيتري مع 2 مل من HBSS 1٪ FCS والاحتفاظ بها على الجليد لمدة 20 دقيقة للسماح القلب إلى ضخ الدم داخل الغرف.
- إعداد تعليق خلية القلب
- قبل تدفئة 200 ميكروغرام / مل كولاجيناز في HBSS + / + (يشار إليها فيما حل الأنزيمية) إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تمييع كولاجيناز في HBSS + / + (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ الكاتيونات) لتحقيق أقصى قدر من نشاط انزيم. النشاط كولاجيناز مستقرة بين دفعات. - استبدال حل غسل تمرغ قلوب (HBSS 1٪ FCS) مع 1 مل من محلول الأنزيمية قبل تحسنت.
- تحت مجهر تشريحي، تخطر على قلوب في 1 ملم 3 قطع باستخدام ملقط وغرامة مشرط. إضافة 1 مل من محلول آخر الأنزيمية قبل تحسنت ونقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب 5 مل مع غطاء.
ملاحظة: للحصول على الهضم الأمثل، ووضعأقصى 5 E17.5 قلوب في 2 مل من محلول الأنزيمية. إذا يتم هضمها المزيد من قلوب في نفس الوقت، تقسيمها إلى مختلف 5 مل أنابيب. - احتضان قلوب المفروم لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: وضع 5 مل أنابيب (مغلقة بشكل صحيح) في الحاضنة لنشر الأنسجة على طول الحل.- في نهاية الحضانة، وتجانس الأنسجة في نفس الحل الأنزيمي من قبل pipetting صعودا وهبوطا نحو 20 مرات مع ماصة P1000. وضع أنبوب 5 مل في الوضع الرأسي والسماح للجزء الأنسجة الرواسب المتبقية (حوالي 3 دقائق).
- جمع طاف (التي تحتوي على خلايا هضمها في تعليق) في أنبوب 50 مل، إضافة 2 مل من HBSS 10٪ FCS (نفس الحجم، حيث بلغ حجم حل الأنزيمية تضاف إلى شظايا الأنسجة)، والاحتفاظ بها على الجليد مع الاستمرار في عملية الهضم.
ملاحظة: HBSS 10٪ محلول FCS والثلج والمهم الخاملة عمل الانزيم في حين أن الأنسجة المتبقيةهضم. - إضافة 2 مل من محلول الأنزيمية قبل تحسنت إلى الأنابيب 5 مل من الكسر الأنسجة المتبقية ومواصلة عملية الهضم بتكرار الخطوة 3.3.4 حتى يتم ملاحظة أي الأنسجة أكثر.
ملاحظة: حوالي 4 دورات الهضم كافية لفصل تماما أنسجة القلب (5 E17.5 قلوب في 2 مل من محلول الأنزيمية).
- أنابيب الطرد المركزي 50 مل مع الخلايا في تعليق لمدة 10 دقيقة في 300 x ج وتجاهل طاف.
- إعادة تعليق بيليه الخلية، إضافة 1 مل من HBSS - / - 1٪ FCS، وتصفية تعليق الخلية على الرغم من شبكة من النايلون 70 ميكرون. عدد الخلايا مع غرفة نويباور باستخدام التريبان الأزرق وصمة عار الحيوية.
ملاحظة: إعادة تعليق الخلايا مع HBSS - / - (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ الكاتيونات) للحد خلية التجميع. ويتم الحصول على ما بين 800،000 و 1،000،000 الخلايا من واحد E17.5 القلب.
- قبل تدفئة 200 ميكروغرام / مل كولاجيناز في HBSS + / + (يشار إليها فيما حل الأنزيمية) إلى 37 درجة مئوية.
- تلطيخ خلايا القلب مع الأجسام المضادة الفلورسنت
ملاحظة: جميع antibodومعاير المنشأ سابقا للحصول على تعريف الأمثل للسكان الخلية (المعايرة يمكن أن تختلف مع الدفعة الضد) وترد. والأجسام المضادة المستخدمة في لوحة القلب في الجدول 1.- توزيع خلايا القلب في تعليق من خلال لوحة 96-جيدا (جولة القاع). توزيعها بالتساوي في جميع الآبار اللازمة (200 ميكرولتر لكل بئر)، قصيرة تدور أجهزة الطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 1 دقيقة في 480 x ج، وتجاهل طاف.
ملاحظة: جميع الآبار ال 96 جيدا لوحة (القاع جولة) يمكن استخدامها. - إعادة تعليق بيليه واحتضان خلايا القلب لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية مع 100 ميكرولتر من مزيج من الأجسام المضادة (أي CD45-PE، TER119-PE، CD31-اليكسا 647، وهيئة السلع التموينية-1-PE-Cyanine5 ) المخفف في HBSS - / - 1٪ FCS.
- غسل خلايا القلب عن زيادة الأجسام المضادة من خلال إضافة 200 ميكرولتر من HBSS - / - 1٪ FCS وقصيرة تدور الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 دقيقة في 480 × ز.
- تجاهل طاف وتكرارالطرد المركزي القصير تدور (الخطوة 3.4.3).
- Resuspend الخلايا في 200 ميليلتر من HBSS - / - 1٪ FCS ونقلها إلى أنبوب 5 مل تحتوي بالفعل 200 ميكرولتر من HBSS - / - 1٪ FCS.
- قبل الشراء، إضافة 400 ميكرولتر من HBSS - / - 1٪ FCS مع 0.5 ميكروغرام / مل PI وتصفية تعليق الخلية على الرغم من شبكة من النايلون 70 ميكرون.
- توزيع خلايا القلب في تعليق من خلال لوحة 96-جيدا (جولة القاع). توزيعها بالتساوي في جميع الآبار اللازمة (200 ميكرولتر لكل بئر)، قصيرة تدور أجهزة الطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 1 دقيقة في 480 x ج، وتجاهل طاف.
4. اكتساب إعتبر خلايا الطحال، الأمعاء، والقلب مع الطيفي تدفق عداد الكريات
- قبل الحصول على البيانات، تلقائيا معايرة عداد الكريات الطيفية باتباع إرشادات الشركة المصنعة. أداء اليومي وإجراءات مراقبة الجودة الشهرية كل يوم من التجربة.
- عندما عداد الكريات جاهز، تبدأ المعاينة من العينات التي تحتوي على تعليق خلية المسمى مع جميع الأجسام المضادة.
ملاحظة: لا عليه. - تأكد من أن جميع الليزر هي على النحو المطلوب. ضبط الربح FSC مثل أن جميع الخلايا واضحة في فيما يخصهالمؤامرات. بوابة سكان الخلية وتطبيق هذه البوابة لاثنين من المؤامرات الطيفية المقابلة لنانومتر 488 والليزر 638/405 نانومتر.
ملاحظة: عندما يتم متحمس fluorochromes بواسطة الليزر 638 نانومتر (أي عندما ليزر 638 نانومتر على)، وهناك قناع الدروع الخفيفة 617-662 نانومتر لمنع الليزر 638 نانومتر من ساطع في PMT. هذا يدفع إلى فقدان جزء من الطيف، وبالتالي يؤدي إلى فصل أقل من الأصباغ وثيقة تنبعث منها في هذه الموجات. ومع ذلك، فإن إشارة كامل يمكن جمعها من خلال إطفاء الليزر 638 نانومتر إن لم يكن هو مطلوب منها لاقتناء. - ضبط 32 قناة الصورة المضاعف (PMT) الجهد (٪) بحيث كل fluorochromes هي ضمن مجموعة من شدة المعروضة في المحور الصادي (01-10 يونيو) في قطعتي الأرض الطيفية المختلفة عرض 488 نانومتر و 405/638 الإثارات نانومتر.
مطلوب التدريب على التعرف على أطياف جميع fluorochromes المستخدمة: ملاحظة. - البدء في الحصول على عينات. انقر على "؛ معاينة "لتصور الخلايا على الشاشة، ثم انقر على" الحصول على "لتسجيل عينة انقاذ ما يصل الى 2 × 10 6 أحداث من كل عينة.
- بعد الحصول على عينات الملون، الحصول على عينة ملطخة الصبغة الحيوي ومن ثم الخرز الملون تعويض فردي مع كل الأجسام المضادة المستخدمة. انقر على "معاينة" لتصور الخلايا على الشاشة وبعد ذلك على "اكتساب" لتسجيل العينات.
ملاحظة: حافظ على نفس PMT الجهد لجميع العينات والضوابط (أي والخرز وعينات غير ملوثين)؛ 5000 أحداث كافية إلى حد كبير. - وأخيرا، والحصول على البيانات من الايقاف الخلية غير ملوثين. انقر على "معاينة" لتصور الخلايا على الشاشة وبعد ذلك على "اكتساب" لتسجيل العينات.
ملاحظة: الحصول على عينات غير ملوثين في نهاية التجربة يقلل من المرحل الخلايا الفلورسنت. - تنظيف عداد الكريات التالية الشركة المصنعة تعليمات لد إغلاق التجربة في المجلد الاستحواذ.
ملاحظة: فقط بعد إغلاق التجربة سوف يتم حفظها والمتاحة للتحليل.
5. تحليل البيانات مع البرامج الطيفي FCM
- في إطار "لوحة الألوان" من علامة التبويب "تحليل"، تسجيل جميع المعلمات الحالية في لوحة بإضافة كل تألقي المستخدمة وعلامة المقابلة (اختر من القائمة المتاحة أو إضافة معلمة جديدة). أيضا، وتشمل المعلمات لصناعة السيارات في مضان وقدرتها على البقاء. سوف تظهر جميع المعلمات المحدد في إطار "unmixing".
- حدد أول عينة الملون واحدة (فعلت مع حبات التعويض) في إطار "مراقبة" تحت عنوان "قائمة أنبوب" من هذه التجربة على علامة التبويب "تحليل". في ورقة العمل، انقر على "تصميم أداة المضلع" وتصميم بوابة على السكان حبة في FSC / مؤامرة محكمة أمن الدولة. انقر نقرا مزدوجا على الجزء العلوي من بوابة لفتح مؤامرة الطيفية أو نقطةلتصور حبات بوابات في مؤامرة ابنة.
- تصميم بوابة واحدة للالإيجابية وبوابة واحدة لحبات السلبية سواء على الطيف أو على مؤامرة نقطة. تحقق أطياف كله المقابلة لمجموعات الليزر اثنين لكل جزء الإيجابية والسلبية، والقضاء على القيم المتطرفة التي تبوب على التوالي والنقر على البوابة للتحقق من سكان ابنة. أدخل بوابات السلبية والإيجابية في إطار "Unmixing".
- كرر الخطوة 5.2 لكل عينة واحدة الملطخة.
ملاحظة: كن على علم بأن استراتيجية الإيجابية والسلبية النابضة يتوافق مع العينة التي يتم تحليلها، على الرغم من أن البرنامج يسمح لها أن توضع في أي عينة. بدلا من تحديد جزء السلبي لكل عينة واحدة الملطخة، استخدم عينة حبة غير ملوثين لوضع سلبي العالمية.
- حدد عينة الخلايا غير ملوثين في "قائمة أنبوب" وبوابات لتصميم autofluorescent وللخلايا غير autofluorescent. <لى> عندما يتم تحديد كافة بوابات السلبية والإيجابية لجميع المعلمات، بما في ذلك السيارات ومضان وقدرتها على البقاء، في إطار "Unmixing"، انقر على "حساب". تطبيق unmixing للعينات لتحليلها.
- تحليل البيانات من خلال تصميم البوابات وخلق المؤامرات يومين المعلمة.
- أولا، تصميم بوابة للSSC مقابل FSC ثم قم بإزالة الخلايا الميتة من خلال استبعاد جميع الخلايا المسمى مع علامة الجدوى (PI مقابل CD45). على بقية الخلايا، والبوابات تصميم لجميع السكان من الفائدة في أعقاب استراتيجية وصفها لكل تعليق الخلية (أرقام 1-3).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، وضبط التعويض في "الضابط الطيف المرجعية." هذا هو أداة التي يمكن استخدامها بعد unmixing لإعادة ضبط الوسيط للسكان الإيجابية لكل تألقي إذا خوارزمية لا يمكن أن يفعل ذلك تماما.
- أولا، تصميم بوابة للSSC مقابل FSC ثم قم بإزالة الخلايا الميتة من خلال استبعاد جميع الخلايا المسمى مع علامة الجدوى (PI مقابل CD45). على بقية الخلايا، والبوابات تصميم لجميع السكان من الفائدة في أعقاب استراتيجية وصفها لكل تعليق الخلية (أرقام 1-3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21-المعلمة الطيفية فم لوحة لتحليل سبلينوسيتس
ويبين الشكل 1 النتائج التي تم الحصول عليها مع لوحة 19-الفلورسنت الأجسام المضادة المطبقة على الخلايا الطحال تضم الأجسام المضادة المختلفة التعرف على مجموعات فرعية من T، B، نك، شجيري، والخلايا النخاعية، في حين CD45 تسميات جميع الخلايا النوى المكونة للدم. كما تتضمن اللوحة أيضا صبغية الجدوى (بي)، فضلا عن معلمات الحجم (فسك) والتفاصيل (سك). ويبين الشكل 1A أطياف فلوري المرجعية. بعد القضاء على الخلايا الميتة في بوابة CD45 + ( الشكل 1B )، ويظهر التحليل أن الخلايا CD3 + T تعبر عن سلسلة TcR and ويكون توزيع CD4 / CD8 المتوقع ونسبة الخلايا CD25 + في خلايا T4 CD4. خلايا CD8 T تظهر التوزيع الطبيعي للخلايا CD44- و L49D معربا عن. خلايا CD19 + B شارك في التعبير عن B220 أ د MHCII، وكذلك الغلوبولين المناعي والجمعية الإسلامية، نموذجية من خلايا B الطحال ناضجة. مجموعة فرعية من الخلايا NK1.1 + NK تمثل مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا الليمفاوية الطحال التي شاركت اكسبريس Ly49D. تتكون الخلايا المتبقية مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا CD11c و+ شجيري مع مستويات عالية من MHC II، والتي كان بعضها أيضا CD11b +. F4 / 80 + خلايا من سمات الضامة الأنسجة المقيمين التعاون التعبير CD11b وأعلى مستويات CD44 الموجودة في الطحال. الخلايا المتبقية (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c و-) يمكن تقسيمها عن طريق التعبير عن CD11b وGR1، حيث فرعية صغيرة من الخلايا المزدوج إيجابية أيضا التعبير عن مستويات عالية من CD44، من المحتمل الموافق الأسلاف المعروف أن يكون حاضرا في الترددات المنخفضة في الطحال. وكان جزء كبير سلبية للعلامات الثلاث. ويبين الشكل 2 نفس التحليل قبل تعديل التعويض.
ه = "1"> 
الشكل 1: A لوحة الأجسام المضادة 19 لون لتحليل خلايا الفئران الطحال. كانت ملطخة splenocytes (A) الفأر مع مزيج الأجسام المضادة السابق، والتي تتطور-CD45 655 أضيفت. وتظهر أطياف مرجعية كل fluorochromes. ويتميز CD45 المسمى Fluorophore التي كتبها السهم الأحمر. يتم سرد fluorochromes في الجدول رقم 1. (B) المؤامرات كفاف إظهار القدرة التمييزية من هذا التحليل متعدد حدودي للفصل بين مجموعات مختلفة من B، T، خلايا NK، شجيري، أو الدم النخاعي. ويقوم هذا التحليل في برنامج FCM التقليدي بعد unmixing إزالة التفاف.
الشكل 2: لوحة الأجسام المضادة 19 لون لتحليل خلايا الفئران الطحال. وقد تم في نفس التحليل كما في الشكل 1 قبل موقف قابل للتعديلtment التعويض مع الضابط إشارة الأطياف.
الأمعاء الدقيقة الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري
تم العثور على العديد من السكان T-خلية في الأمعاء داخل طبقة الخلايا الظهارية 5، 6. وتشمل العزلة التقليدية من هذه المجموعات الفرعية التدرج الكثافة التي تفصل الخلايا الليمفاوية من الخلايا الظهارية. ومع ذلك، هذا الإعداد هو دقيق، مضيعة للوقت، والنتائج في فقدان الخلية. لتحسين الكمي وتسهيل إجراء التجارب، تم اختبار إمكانات الطيفي FCM للتمييز السكان من الخلايا الليمفاوية المعوية خلال جزء كبير من الخلايا الظهارية. بعد تعطل الميكانيكية من الأنسجة الطلائية، كانت ملطخة تعليق خلية مع الأجسام المضادة التي تسمية مجموعات فرعية من αβ وγδ خلايا T وعادة ما توجد في ظهارة الأمعاء. الوقد تم تحليل الخلايا في اثنين cytometers التقليدية وفي FCM الطيفي.
ويبين الشكل 3 النتائج بعد اتباع استراتيجية النابضة مماثلة، مع القضاء على الخلايا الميتة النابضة على الخلايا PI سلبي. وجود خلايا لصناعة السيارات الفلورسنت واضح في جميع cytometers التقليدية وفي الخلوي الطيفي عند المعطل مدير صناعة السيارات في مضان (لوحات أعلى، السهام الحمراء)، مما أدى إلى التمييز الفقراء من الخلايا الحية. في كل المؤامرات، وتظهر الخلايا داخل A FSC / SSC-A بوابة اللمفاويات باللون الأزرق والخلايا مع يفرق أكبر (بوابة الخلايا الظهارية) وتظهر باللون الأحمر. لم تتمكن من حل CD3 + T فرعية خلايا (باللون الأزرق) (الفيروز السهم) من الخلايا المتبقية على حد سواء الأدوات التقليدية. ولذلك، TcRβ - خلايا (السهم الأخضر) تلوث CD3 + TcRγδ - السكان، مجموعة فرعية واردا من الناحية البيولوجية أبدا الكشف عن بعد separatiعلى من الخلايا الليمفاوية من الخلايا الظهارية. في المقابل، في الطيفي FCM بعد إدارة صناعة السيارات في مضان، لم يكن ينقص تحليل مختلف مجموعات فرعية T-الخلية من خلال وجود الخلايا الظهارية، والسكان مفصولة بشكل جيد، وكانت هناك أي خلايا TCR سلبية في CD3 + بوابة.
الشكل (3): وجود خلايا السيارات الفلورسنت أمر لا ينتقص من الكشف عن الخلايا اللمفاوية البينية الظهارية في الطيفي FCM. الخلايا المعوية الصغيرة، بما في ذلك الخلايا الظهارية والخلايا الليمفاوية، وكانت ملطخة مع الأجسام المضادة الاعتراف TcRδ، PI، TcRβ Cy7-APC CD3 (لوحات B)، Vγ7 APC، Vδ4 Cy7-PE (لوحات C)، وCD8 FITC (لوحات D). وأضاف PI في المنطقة العازلة FACS قبل التحليل. وقد تم الحصول على البيانات بالتتابع في الصكوك الثلاثة بعد مراقبة الجودة المناسبة. كانت الحلل eliminaتيد في FSC-H / FSC-W. وقد أجري التحليل في مجال البرمجيات FCM التقليدية. تظهر المؤامرات الخطوات المختلفة لاستراتيجية المحاصرة. وصفت الخلايا داخل FSC-A / SSC-A بوابة لمفاوية في الزرقاء، في حين وصفت الخلايا داخل بوابة الخلايا الظهارية في الأمعاء باللون الأحمر. تشير الأسهم إلى تشوهات مختلفة من السكان والسيارات ومضان. تظهر المؤامرات في C تحليل البيانات التي تم الحصول عليها في FCM الطيفي بدون إدارة تألق ذاتي في unmixing، في حين يظهر D نفس البيانات بعد unmixing مع إدارة تألق ذاتي.
القلب الجنينية
أظهرت FCM التقليدي يبلغ عدد سكانها كبير من الخلايا السيارات فلوري (السهم الأسود) التي تم استبعادها من التحليل لأنه fluoresced في CD45 وTER119 قناة تفريغ (PE)، بمناسبة الخلايا المكونة للدم. في المقابل، كان هؤلاء السكان لصناعة السيارات في فلوري غير موجود على هذا النحو في FCM الطيفية وكان يتألف في CD45
الشكل 4: تلقائي الفلورسنت خلايا في تعليق خلية E17.5 القلب وبشكل صحيح وشملت في جزء الخلية سلبي في الطيفي FCM. (A) كانت ملطخة تعليق خلية من قلوب الأجنة مع الأجسام المضادة وبالتتابع المكتسبة في الصكوك الثلاثة مكافحة TER119 وCD45-PE، هيئة السلع التموينية-1-PECy5، وCD31-APC. السهام السوداء تظهر الخلايا السيارات الفلورسنت في conve اثنينcytometers ntional، في حين لم يتم الكشف عن هذه الخلايا كما لصناعة السيارات في فلوري في الخلوي الطيفي وبالتالي يمكن تحليلها لتلطيخ الفلورسنت معين. (B) السيارات الفلورسنت الخلايا (داخل بوابة بيضاوي الشكل باللون الأخضر)، ولكن ليس CD31 + الخلايا (بوابة مستطيلة في الزرقاء، المراقبة السلبية)، أظهر التعبير عن التروبونين القلبي (TNNT2) 7 و الأذيني ضوء سلسلة 2 (MYL7) 8 محاضر. الاتحاد الافريقي - وحدات التعسفي بالنسبة إلى GAPDH نص حفظ المنزل. عرض البيانات القيمة المتوسطة كما ± SEM.
| الإثارة ليزر | تألقي | النوعية | استنساخ | |
| 488 نانومتر | BB515 | CD8 | 53-6،7 | |
| 488 نانومتر FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 نانومتر | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 نانومتر | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 نانومتر | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 نانومتر | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 نانومتر | PerCP-Cy5.5 | الغلوبولين المناعي | R6-60.2 | |
| 488 نانومتر | PerCP | غرام-1 | RB6-8CS | |
| 488 نانومتر | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 نانومتر | التأيد Propidium | بقاء | ||
| 405 نانومتر | V450 | الجمعية الإسلامية | 11-26c.2a | 405 نانومتر | BV421 | CD11c و | HL3 |
| 405 نانومتر | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 نانومتر | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 نانومتر | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 نانومتر | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 نانومتر | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 نانومتر | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 نانومتر | تتطور 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | مهذب | CD16 / CD32 | 2.4G2 | كتلة FC-مستقبلات |
| قائمة الأجسام المضادة المستخدمة في كارداتتعليق خلية ميلان | ||||
| 638 نانومتر | فلور اليكسا 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 نانومتر | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 نانومتر | PE-Cy5 | هيئة السلع التموينية-1 | D7 | |
| 488 نانومتر | PE | Ter119 | TER-119 | |
TABLE1: قائمة الأجسام المضادة المستخدمة في لوحة 19 لون وفي تعليق خلية القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند FCM التقليدية للكشف عن الفوتونات المنبعثة بعد إثارة تحقيقات الفلورسنت. انبعاث مضان من تألقي واحدة في الكشف عن جهاز كشف لقياس إشارة من تألقي آخر يدفع التداخل المادي. هذا امتداد بين أطياف الانبعاث يحتاج إلى تصحيحها عن طريق التعويضات.
FCM الطيفي ومعالجة البيانات بواسطة خوارزمية unmixing إزالة التفاف يسمح لمجموعة من fluorochromes مع قمم الانبعاثات وثيقة دون تعويض إضافي، بشرط أن الأشكال الطيفية المختلفة. الخوارزمية المستخدمة لتحليل يعامل لصناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة، طرح مضان غير محددة من تعليق خلية الأنسجة الصلبة.
تم تجميع فريق من 19 fluorochromes لتحليل الخلايا المناعية باستخدام اثنين فقط ليزر (488 نانومتر و 405 نانومتر). في الواقع، عندما كان ليزر 638 نانومتر على، قسم من PMT 32 قناة المقابلةإلى الطول الموجي الإثارة من هذا الليزر لم تكن متاحة. للحصول على الحد الأقصى لقدرة الكشف عن PMT، وقد تحول الليزر الأحمر قبالة. وقد تم تحليل خلايا الطحال الماوس، والسماح للكشف عن أكثر من 12 السكان خلية مختلفة، وبعضها يتألف 1٪ أو أقل من الخلايا المكونة للدم.
لاختبار قدرة الطيفي FCM لإدارة صناعة السيارات في مضان، تم اختبار حالتين المختلفة التي يمكن أن تنال من التحليل: واحد حيث كانت ملوثة الخلايا الليمفاوية مع الخلايا الظهارية، واحد حيث تم تحليل خلايا القلب لصناعة السيارات الفلورسنت. وعلى النقيض من FCM التقليدية، الخلوي الطيفية يسمح للتمييز من جميع مجموعات فرعية لمفاوية، حتى عندما تمثل مجموعات فرعية طفيفة.
الجدل حول القدرة التجديدية للالعضلية الكبار 9 و 10 و 11 ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود استراتيجية لديسcriminate وعزل مجموعات فرعية متميزة من خلايا قابلة للحياة في القلب. تحليل متعدد حدودي تحديد مجموعات فريدة من علامات لتمييز مجموعات فرعية مختلفة القلب قد تمكن من الكشف عن مجموعات فرعية نادرة لأعداد كبيرة من الخلايا التي يمكن تحليلها. وقد تم تحليل قلوب الأجنة (E17.5)، وجزء كبير من الخلايا لصناعة السيارات الفلورسنت، والتي من شأنها أن هربوا كشف في FCM التقليدية، تم دمج في حجرة غير قابلة للحياة للدم خلية القلب في الطيفي FCM.
وهناك مشكلة متكررة من هذا الأسلوب هو شرط لفلوري المسمى الأجسام المضادة ذات نوعية جيدة. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما عند استخدام الأصباغ جنبا إلى جنب، حيث من عناصر جنبا إلى جنب هو المهيمن. على سبيل المثال، BV786 وCy7-PE يمكن أن يكون من الصعب تمييزها عن BV421 وPE، على التوالي.
FCM على أساس قياس الطيف يوفر قوة التحليلية أعلى من تلك التي حصلت مع FCM التقليدية، دون الحاجة للحصول على تعويضات مatrices. توفر هذه المخطوطة دليل على أن هناك نهجا بديلا الذي يوضح قدرة عالية التحليلية، وغياب المصفوفات تعويض المعقدة، والتمييز ايتأثر من مجموعات فرعية خلية نظرا لصناعة السيارات في مضان، وأي التزامات مالية إضافية لا تزال هناك حاجة لFCM مطياف الكتلة. هكذا يبدو الطيفية FCM أن يكون الأسلوب المفضل لتحليل الخلايا التي تم الحصول عليها من مجموعة واسعة من الأنسجة الصلبة عادة لا قابلة للFCM التقليدية، ويمكن استخدامها في الورم والتنموية، وبيولوجيا الخلايا الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونحن نعترف المساهمات التقنية والنظرية في الخلوي الطيفي للK فوتامورا، الذي أيضا مراجعة نقدية للمخطوطة. ونحن أيضا مدينون لC. آيت منصور، P.-H. Commere، A. بانديرا، وP. بيريرا لقراءة نقدية للمخطوطة وللحصول على المشورة التقنية التي لا نهاية لها والدعم. كما نشكر P. بيريرا لهبة المضادة Vγ7-APC وVδ4-البيوتين الأجسام المضادة المسمى. نحن يعترفون والمركز Enseignements من معهد باستور للترحيب ودعم الخدمات اللوجستية التصوير. وأيد هذا العمل من قبل معهد باستور، المعهد الوطني للسانتيه آخرون للبحوث ميديكال (INSERM)؛ مؤسسة العلوم وباستور بورصة رو (SS) الوطني السويسري. فونداساو الفقرة على عصام Ciência بحوث والتكنولوجيا - SFRH / BD / 74218/2010 (MV)؛ وجامعة باريس ديدرو، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR) مشروع Twothyme، وكالة الاستخبارات الوطنية، وبرنامج إعادة إحياء (الاستثمار من أجل المستقبل) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
