Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

स्पेक्ट्रल प्रवाह cytometry द्वारा ठोस ऊतकों से पृथक सेल निलंबन का विश्लेषण

Published: May 5, 2017 doi: 10.3791/55578
Automatic Translation
1, 2,3,4,5, 2, 1
1Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, 2Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 3Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 5Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

Summary

यह लेख वर्णक्रमीय cytometry, फ्लो में एक नया दृष्टिकोण उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आकार का उपयोग करता है fluorochromes भेद करने के लिए वर्णन करता है। एक एल्गोरिथ्म मुआवजा बदल देता है और एक स्वतंत्र पैरामीटर के रूप में ऑटो प्रतिदीप्ति इलाज कर सकते हैं। ये नवीन दृष्टिकोण ठोस अंगों से अलग कोशिकाओं के समुचित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

Abstract

प्रवाह cytometry को परिभाषित करने और लसीकावत् और अन्य hematopoietic कोशिकाओं के phenotype विश्लेषण करने के लिए पिछले 40 वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। शुरू में कुछ fluorochromes के विश्लेषण के लिए प्रतिबंधित है, वर्तमान में वहाँ विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक के दर्जनों रहे हैं, और अप करने के लिए 14-18 अलग अलग रंगों में एक समय में जोड़ा जा सकता है। हालांकि, कई सीमाएं अभी भी विश्लेषणात्मक क्षमताओं ख़राब। फ्लोरोसेंट जांच की बहुलता के कारण, डेटा विश्लेषण बड़े, बहु पैरामीट्रिक मुआवजा मैट्रिक्स की जरूरत की वजह से जटिल हो गया है। इसके अलावा, उत्परिवर्ती माउस फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने और विभिन्न ऊतकों में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं का पता लगाने के ले जाने के मॉडल उपलब्ध हो गए हैं, इसलिए विश्लेषण ऑटो फ्लोरोसेंट सेल ठोस अंगों से प्राप्त निलंबन की (फ्लो द्वारा) की आवश्यकता है। वर्णक्रमीय प्रवाह cytometry, जो निरंतर तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के आकार अलग करती है, इनमें से कुछ समस्याएं संबोधित करते हैं। डेटा w विश्लेषण किया जाता हैएक एल्गोरिथ्म है कि मुआवजा मैट्रिक्स बदल देता है और एक स्वतंत्र पैरामीटर के रूप में ऑटो प्रतिदीप्ति व्यवहार करता है एक रबर। इस प्रकार, वर्णक्रमीय फ्लो समान उत्सर्जन चोटियों के साथ fluorochromes भेदभाव में सक्षम होना चाहिए और मुआवजा आवश्यकताओं के बिना एक बहु पैरामीट्रिक विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं।

यह प्रोटोकॉल cytometry विश्लेषण वर्णक्रमीय प्रवाह का वर्णन करता है, एक 21 पैरामीटर (19 फ्लोरोसेंट जांच) लक्षण वर्णन और एक स्वत: फ्लोरोसेंट संकेत के प्रबंधन के लिए अनुमति देता है, मामूली आबादी का पता लगाने में उच्च संकल्प प्रदान करते हैं। यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि वर्णक्रमीय फ्लो जैसे हृदय और आंत के रूप में cytometry पारंपरिक प्रवाह में चिह्नित करने के लिए मुश्किल ऊतकों, से सेल आबादी के विश्लेषण में लाभ प्रस्तुत करता है। cytometry इस प्रकार प्रवाह वर्णक्रमीय बेहतरीन प्रदर्शन करने वाले मुआवजे के लिए आवश्यकता के बिना cytometry पारंपरिक प्रवाह और सक्षम बनाता है ऑटो प्रतिदीप्ति प्रबंधन की बहु पैरामीट्रिक विश्लेषणात्मक क्षमता को दर्शाता है।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में, प्रवाह cytometry (FCM) एक व्यापक रूप से उपलब्ध विश्लेषणात्मक विधि सेल phenotyping के अध्ययन के लिए आवश्यक बन गया। उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंजक में पर्याप्त वृद्धि, विशेष रूप से बैंगनी लेजर (405 एनएम) (जैसे, शानदार वायलेट और नए क्यू डॉट रंजक) से उत्साहित fluorochromes हुई है। लेकिन, उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंजक के विकास उत्सर्जन ओवरलैपिंग का खतरा बढ़ जाता और श्रम प्रधान मुआवजा मैट्रिक्स की आवश्यकता है। FCM व्यापक रूप से ठोस ऊतकों से सेल निलंबन विश्लेषण किया गया, लेकिन ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की उपस्थिति विशेष रूप से लेबल आबादी के भेदभाव को सीमित करता है।

वर्णक्रमीय FCM के बुनियादी सिद्धांतों Futamura एट अल में विस्तार से रिपोर्ट कर रहे हैं। 1, 2। संक्षेप में, वर्णक्रमीय यहां इस्तेमाल किया FCM (सामग्री की तालिका देखें) 405, 488, और 638 एनएम लेज़रों के साथ सुसज्जित है। वर्णक्रमीय FCM कब्जा सभी उत्सर्जित च800 एनएम 500 एनएम और 420 एनएम 440 एनएम एनएम क्रमशः के लिए और 450 एनएम 469, के लिए 2 स्वतंत्र PMTs, जो पारंपरिक बैंड-पास फिल्टर की जगह के लिए एक 32-चैनल रैखिक सरणी पीएमटी (32ch पीएमटी) में स्पेक्ट्रा के रूप में luorescence। 488 और 405/638 एनएम लेजर स्पॉट स्थानिक, अलग, जबकि 405 एनएम और 638 एनएम लेजर स्पॉट सह-रैखिक कर रहे हैं। प्रत्येक व्यक्ति के कण के लिए, 405 एनएम से उत्साहित प्रतिदीप्ति डेटा के 66 चैनल और 488 एनएम लेज़रों अप करने के लिए वर्णक्रमीय FCM उपाय। कोशिकाओं 638 एनएम लेजर से उत्साहित कर रहे हैं, वर्णक्रमीय FCM प्रतिदीप्ति डेटा के 58 चैनलों को मापता है क्योंकि एक मुखौटा पीएमटी में चमक से 638 एनएम लेजर को रोकने के लिए डाला जाता है। स्पेक्ट्रल FCM एक एल्गोरिथ्म भारित न्यूनतम वर्ग विधि (WLSM) है, जो फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रा ओवरलैपिंग की जुदाई में सक्षम बनाता है के आधार पर के साथ प्राप्त पूर्ण स्पेक्ट्रम डेटा का विश्लेषण। स्पेक्ट्रा एकल दाग और बेदाग नमूने से प्राप्त बुनियादी संदर्भ स्पेक्ट्रा के रूप में पहचाने जाते हैं। बहु रंगीन नमूने गणितीय लगे हैं एकnd अमिश्रित, और मिश्रित फ्लोरोसेंट लेबल के साथ एक नमूना के स्पेक्ट्रम उसके घटक स्पेक्ट्रा का एक संग्रह में विघटित किया जाता है। Unmixing, वर्णक्रमीय प्रौद्योगिकी 3, 4 में, मुआवजा है कि एक एक दिया डाई को मापने के अलावा सभी डिटेक्टरों से संकेत को हटा बदल देता है।

इस अध्ययन में, हम संयुक्त और एक एकल, 21 पैरामीटर विश्लेषण है कि माउस तिल्ली में पाया प्रमुख hematopoietic सबसेट विशेषता में 19 fluorochromes का परीक्षण किया। साथ ही, हम वर्णक्रमीय cytometry ऑटो फ्लोरोसेंट संकेत प्रबंधन कर सकते हैं, इस प्रकार आंतों के भीतर उपकला लिम्फोसाइट के और भ्रूण दिल के लक्षण वर्णन में सुधार का प्रदर्शन किया। दरअसल, इन ऊतकों में, ऑटो प्रतिदीप्ति प्रबंधन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति का काम है कि पारंपरिक FCM में विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा के लिए अनुमति दी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगों पाश्चर संस्थान एथिक चार्टर और यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और फ्रेंच कृषि मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

एडल्ट माउस अंगों से 1. सेल निलंबन की तैयारी

  1. Splenocytes की अलगाव
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से वयस्क चूहों euthanize। पेट मध्य रेखा पर एक चीरा बनाने और कैंची से त्वचा को खोलें। संदंश के साथ तिल्ली जल को संचित करें।
    2. क्रश 2 गिलास खुर्दबीन के बीच तिल्ली कोशिकाओं अलग कर देना और उन्हें हांक के बैलेंस्ड नमकीन समाधान के 5 एमएल (HbSS) 1% भ्रूण बछड़ा सीरम युक्त (FCS) में पतला करने के लिए स्लाइड।
    3. 120 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. HBSS 1% FCS 5 एमएल में गोली Resuspend। एक Trypan नीले महत्वपूर्ण दाग का उपयोग कर एक Neubauer चैम्बर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: 80 करोड़ कोशिकाओं एक वयस्क तिल्ली से प्राप्त किया जाना चाहिए।
  2. Isolatiछोटी आंत से कोशिकाओं के पर
    1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से वयस्क चूहों euthanize। कैंची का प्रयोग, पेट मध्य रेखा पर त्वचा में एक चीरा बनाते हैं। एक हाथ में संदंश के साथ छोटी आंत समझ और कैंची का उपयोग दोनों सिरों पर यह कटौती करने के लिए: पहला, सही पेट के बाद और फिर छोटी आंत के अंत में, बस बड़ी आंत से पहले। 1x Dulbecco फास्फेट buffered खारा (DPBS) के साथ छोटी आंत फ्लश एक सुई के साथ एक 2 एमएल सिरिंज का उपयोग कर।
    2. एक कागज तौलिया पर छोटी आंत रखो और ध्यान से तेज कैंची की एक जोड़ी के साथ Peyer पैच को हटा दें।
    3. कैंची का प्रयोग करें आंत के अंदर कैंची की एक शाखा डालने से अपने लंबे पक्ष पर आंत खोलने के लिए। तेज कैंची का उपयोग कर 1 सेमी टुकड़ों में खोला आंत काटें।
    4. 30 10% FCS साथ HBSS के 30 एमएल में लगातार सरगर्मी के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर मिनट के लिए सेते हैं।
    5. शेष गैर अलग टुकड़े के साथ सेल निलंबन एक 50 एमएल में रखेंप्लास्टिक ट्यूब और उच्च गति से 5 मिनट के लिए भंवर। ध्यान दें: ऊतक के आगे कोई पृथक्करण नहीं है।
    6. बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं बड़े, गैर अलग टुकड़े गोली अनुमति देने के लिए।
    7. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और centrifugation द्वारा पर 120 x जी 7 मिनट के लिए यह ध्यान केंद्रित।
    8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1% FCS साथ HBSS के 10 एमएल में गोली resuspend। एक Trypan नीले महत्वपूर्ण दाग का उपयोग कर एक Neubauer चैम्बर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: ~ 60 लाख इंट्रा-उपकला कोशिकाओं (IELs) एक वयस्क छोटी आंत से प्राप्त किया जाना चाहिए।
  3. पैनल डिजाइन रणनीति
    1. सीधे fluorochromes के साथ मिलकर एंटीबॉडी के साथ पैनल तैयार करें।
      नोट: सभी एंटीबॉडी पहले सेल आबादी के इष्टतम परिभाषा प्राप्त करने के लिए titrated किया है (अनुमापन एंटीबॉडी बैच के साथ भिन्न हो सकते हैं)। 19-रंग पैनल में प्रयोग किया जाता splenocytes दाग एंटीबॉडी तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
    2. निर्माण बहु Colocytometry के लिए आर पैनलों। यह एक चुनौतीपूर्ण काम हो सकता है, पैनल अनुकूलन करने के लिए निम्नलिखित दिशा-निर्देशों का उपयोग करें:
      1. वर्णक्रमीय विन्यास और फ्लोरोसेंट रंजक है कि साधन पर इस्तेमाल किया जा सकता जाँच करें।
      2. निर्माता द्वारा प्रदान की चमक सूचकांक / धुंधला सूचकांक जानकारी का उपयोग करें।
        नोट: चमक सूचकांक / धुंधला सूचकांक प्रत्येक fluorochrome के लिए पृष्ठभूमि बनाम प्रतिदीप्ति तीव्रता के सापेक्ष सूचक है।
      3. नीचे दिए गए नियमों का पालन एंटीबॉडी चुनें:
        1. प्रोटीन है कि कमजोर व्यक्त कर रहे हैं के लिए प्रतिभाशाली fluorochromes और अधिक उच्च व्यक्त प्रोटीन के लिए सबसे हल्के fluorochromes चुनें।
          नोट: उदाहरण के लिए, CD45, सीडी 4, और CD8 अत्यधिक व्यक्त कर रहे हैं और मंद fluorochromes के साथ प्रयोग किया जा सकता है।
        2. पहले सबसे कम फ्लोरोसेंट डाई संभावनाओं के साथ एंटीबॉडी का चयन करके पैनल को डिजाइन करने की शुरुआत करें।
        3. यदि संभव हो, के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा च छोटी से छोटी ओवरलैप के साथ फ्लोरोसेंट रंजक चुनेंया मार्कर एक ही प्रकार की कोशिकाओं पर व्यक्त की है।
          नोट: tandems (जैसे, पीई Cy5, पीई-Cy7, और PerCP-Cy5.5) सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए के रूप में वे प्रकाश जोखिम से गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं।
  4. Cytometry विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के धुंधला
    1. 1 x 10 6 splenocytes और 1 x 10 6 आंतों की कोशिकाओं और के साथ एक 5 एमएल ट्यूब के साथ एक 5 एमएल ट्यूब तैयार उन्हें नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए बेदाग रखने के लिए।
    2. तैयार करें और तालिका 1 के अनुसार नमूना प्रति और प्रति पैनल एक 5 एमएल ट्यूब लेबल। एंटीबॉडी के मिश्रण HBSS 1% FCS में, तालिका 1 के अनुसार, तैयार करें।
    3. स्थानांतरण 1 x 10 6 कोशिकाओं - या तो splenocytes या आंतों की कोशिकाओं - प्रत्येक 5 एमएल ट्यूब में। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 120 x जी के लिए 2 HBSS के एमएल 1% FCS और अपकेंद्रित्र जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एंटीबॉडी मिश्रण के 50 μL में गोली resuspend।
    4. लेबल करें रों2 चरणों में plenocytes। सबसे पहले, एक 5 एमएल ट्यूब में पीई-जाती 5, PerCP-जाती 5.5, और PerCP के साथ लेबल एंटीबॉडी युक्त मिश्रण के 50 μL (एफसी रिसेप्टर अवरुद्ध के साथ) का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ऊष्मायन के 20 मिनट के बाद, एक 5 एमएल ट्यूब को अन्य सभी एंटीबॉडी युक्त मिश्रण के 50 μL जोड़ें।
      नोट: इस रणनीति को सीमित करता है steric बाधा।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट और 120 x जी के लिए 2 HBSS के एमएल 1% FCS और अपकेंद्रित्र जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई) साथ HBSS 1% FCS के 200 μL में गोली resuspend।

2. पर वाणिज्यिक मुआवजा मनके microspheres प्रत्येक fluorochrome (जैसे, UltraComp eBeads) के लिए एकल धुंधला की तैयारी, इसके बाद मोती के रूप में संदर्भित

  1. तैयार करें और एंटीबॉडी कि पैनल में उपयोग किया जाता है की संख्या के रूप में लेबल के रूप में कई 5 एमएल ट्यूबों। मोती की 1 बूंद प्रत्येक ट्यूब में रखें और 1 & # जोड़ने181; ट्यूब प्रति एंटीबॉडी के एल।
    नोट: मोती यहां इस्तेमाल किया (सामग्री की तालिका देखें) दाग (सकारात्मक) और बेदाग (नकारात्मक) मोती होते हैं। एंटीबॉडी प्रत्येक डाई के लिए मोती पर अधिक में डाल रहे हैं एक उज्ज्वल संकेत सुनिश्चित करने के लिए और इस तरह एक स्पष्ट वर्णक्रमीय हस्ताक्षर। इस सॉफ्टवेयर के लिए आवश्यक है एक सटीक unmixing बनाने के लिए सक्षम होने के लिए।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. 120 पर 5 मिनट के लिए HBSS 1% FCS और अपकेंद्रित्र के 2 एमएल जोड़ें एक्स जी। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और HBSS 1% FCS के 100 μL में गोली resuspend।

भ्रूण माउस दिल से 3. सेल निलंबन की तैयारी

  1. भ्रूण के विच्छेदन
    1. 2 महिलाओं दिन के अंत में एक पुरुष (हमेशा पुरुष के पिंजरे में) के साथ संभोग (17 और 19 घंटे के बीच) द्वारा पहले से समय-गर्भवती मादाओं प्राप्त करने के लिए योजना है। अगली सुबह, योनि प्लग के साथ महिलाओं 0.5 दिनों के बाद coitum में माना जाता है।
    2. E17.5 गर्भवती femal Euthanizeगर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा तों। सुनिश्चित करें कि पशु मजबूती से माउस पंजा (पैर की अंगुली-चुटकी पलटा) पर दबाकर अनुत्तरदायी है। 70% इथेनॉल के साथ पेट को गीला करें नसबंदी और माउस फर के प्रसार को रोकने के लिए।
    3. पेट कैंची का उपयोग कर के बीच में त्वचा में एक चीरा बनाने और उंगलियों के साथ अलग त्वचा खींच।
    4. केंद्र से पेट की मांसपेशियों में खींच रहा है और बनाने चीरों की ओर पेट के दो पहलू सकल संदंश और कैंची का उपयोग करके उदर गुहा खोलें।
      ध्यान दें: छोटी आंत, जो पेरिटोनियल मांसपेशी तुरंत नीचे है नुकसान के प्रति सावधान रहें।
    5. दोनों गर्भाशय शरीर के स्तर पर और अंडाशय की कटौती करके (भ्रूण के साथ) गर्भाशय सींग इकट्ठा। उन्हें DPBS के 50 एमएल के साथ एक 90 x 15 मिमी 2 पेट्री डिश में भिगोएँ।
    6. प्रत्येक पत्या, और एक ठीक संदंश और कैंची से आंत की जर्दी थैली गर्भाशय पेशी दीवार के बाद के बीच कटौती करके प्रत्येक भ्रूण को अलग। भ्रूण पूर्णांक बाहर खींचकाम करते हैं। अंत में, गर्भनाल काट दिया।
    7. विच्छेदन शुरू करने से पहले साथ कैंची (कत्ल) E17.5 भ्रूण के सिर काट लें।
  2. दिल का संग्रह
    1. पकवान तल में एक गीला कागज तौलिया बिस्तर और 1% FCS साथ HBSS के 50 एमएल युक्त एक 90 x 15 मिमी 2 पेट्री डिश में सिर धड से अलग भ्रूण भिगोएँ।
    2. एक stereomicroscope के तहत, सकल संदंश के साथ प्रत्येक भ्रूण पकड़ ताकि उदर की ओर का सामना करना पड़ रहा है।
    3. ध्यान से आदेश दिल को नुकसान को रोकने के लिए कैंची के साथ छाती के दाईं ओर कटौती करके वक्ष ग्रिड खोलें।
    4. सकल संदंश के साथ रिब पिंजरे पकड़ कर दिल को बेनकाब।
    5. महान वाहिकाओं पकड़े (in- की और बाहर प्रवाह दिल के बड़े जहाजों से युक्त) द्वारा दिल (अभी भी फेफड़े और थाइमस साथ इकट्ठे) अलग खींचने और HBSS के 2 एमएल के साथ एक 35 x 15 मिमी 2 पेट्री डिश में उन्हें जगह साथ FCS 1%।
    6. आस-पास के अंगों से दिलों को अलग करने औरठीक संदंश और एक छुरी के साथ संयोजी ऊतक।
    7. HBSS 1% FCS के 2 एमएल के साथ एक नया 35 x 15 म पेट्रि डिश में दिल धो लें और 20 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें रखना दिल कक्षों के अंदर खून बाहर पंप करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  3. दिल सेल निलंबन की तैयारी
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए HBSS + / + (इसके बाद एंजाइमी समाधान के रूप में जाना जाता है) में 200 माइक्रोग्राम / एमएल कोलैजिनेज़ पूर्व गर्म।
      नोट: HBSS में कोलैजिनेज़ पतला + / + एंजाइम गतिविधि को अधिकतम करने के (सीए 2 + और मिलीग्राम 2 + फैटायनों साथ); कोलैजिनेज़ गतिविधि बैचों के बीच स्थिर है।
    2. धोने समाधान पूर्व गर्म एंजाइमी समाधान के 1 एमएल के साथ दिल (HbSS 1% FCS) भिगोने बदलें।
    3. एक stereomicroscope के तहत, ठीक संदंश और एक छुरी का उपयोग कर 3 टुकड़े 1-मिमी में दिल कीमा। पूर्व गरम एंजाइमी समाधान का एक और 1 एमएल जोड़ें और एक ढक्कन के साथ एक 5 एमएल ट्यूब कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण।
      नोट: एक इष्टतम पाचन के लिए, एक जगहएंजाइमी समाधान के 2 एमएल प्रति 5 E17.5 दिल की अधिकतम। अधिक दिल एक ही समय में पचा रहे हैं, तो उन्हें अलग 5 एमएल ट्यूबों में विभाजित।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कीमा बनाया हुआ दिल सेते हैं।
      नोट: इनक्यूबेटर में 5 एमएल ट्यूब (ठीक से बंद) नीचे निर्धारित करना समाधान के साथ ऊतक प्रसार करने के लिए।
      1. ऊष्मायन के अंत में, ऊपर P1000 विंदुक के साथ नीचे लगभग 20 बार pipetting द्वारा एक ही एंजाइमी समाधान में ऊतक homogenize। ऊर्ध्वाधर स्थिति में 5 एमएल ट्यूब रखो और शेष ऊतक टुकड़ा तलछट (लगभग 3 मिनट) करते हैं।
      2. सतह पर तैरनेवाला एक 50 एमएल ट्यूब में (निलंबन में पच कोशिकाओं से युक्त) इकट्ठा जोड़ने 2 एमएल HBSS के 10% FCS (एंजाइमी समाधान की मात्रा के रूप में ही मात्रा ऊतकों के टुकड़े को जोड़ा गया), और उन्हें बर्फ पर रखने, जबकि जारी पाचन प्रक्रिया।
        नोट: HBSS 10% FCS समाधान और बर्फ एंजाइम कार्रवाई निष्क्रिय करने के लिए है, जबकि शेष ऊतक है महत्वपूर्ण हैंपचा।
      3. शेष ऊतकों के टुकड़े के साथ 5 एमएल ट्यूबों को पूर्व गर्म एंजाइमी समाधान के 2 एमएल जोड़ें और कदम 3.3.4 दोहरा जब तक कोई और अधिक ऊतक मनाया जाता है से पाचन जारी है।
        नोट: पाचन की लगभग 4 चक्र पूरी तरह से हृदय के ऊतकों (एंजाइमी समाधान के 2 एमएल में 5 E17.5 दिल) अलग कर देना करने के लिए पर्याप्त हैं।
    5. 300 XG पर 10 मिनट के लिए निलंबन में कोशिकाओं के साथ 50 एमएल ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने।
    6. सेल गोली Resuspend, HBSS के 1 एमएल जोड़ने - / - 1% FCS, और यद्यपि एक 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल सेल निलंबन फ़िल्टर करें। एक Trypan नीले महत्वपूर्ण दाग का उपयोग कर एक Neubauer चैम्बर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: - / - (सीए 2 + और मिलीग्राम 2 + फैटायनों के बिना) को कम करने के सेल एकत्रीकरण HBSS के साथ कोशिकाओं Resuspend। 800000 के बीच और 1,000,000 कोशिकाओं एक E17.5 दिल से प्राप्त कर रहे हैं।
  4. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ हृदय कोशिकाओं धुंधला
    नोट: सभी antibodएँ पहले सेल आबादी (अनुमापन एंटीबॉडी बैच के साथ भिन्न हो सकते हैं) दिल पैनल में प्रयोग किया जाता व्याप्ति एंटीबॉडी तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं के इष्टतम परिभाषा प्राप्त करने के लिए titrated कर रहे हैं।
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली (दौर नीचे) के माध्यम से निलंबन में हृदय कोशिकाओं को वितरित करें। उन्हें समान रूप से वितरित करें सभी आवश्यक कुओं (अच्छी तरह से प्रति 200 μL) के दौरान, लघु स्पिन अपकेंद्रित्र 480 XG पर 1 मिनट के लिए 96-अच्छी तरह थाली, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने।
      नोट: 96-अच्छी तरह प्लेट (दौर नीचे) के सभी कुओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. गोली Resuspend और एंटीबॉडी के कॉकटेल के 100 μL (यानी, CD45-PE, TER119-पीई, CD31-एलेक्सा 647, और Sca-1-पीई-Cyanine5 के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए हृदय की कोशिकाओं को सेते ) HBSS में पतला - / - 1% FCS।
    3. HBSS के 200 μL जोड़कर एंटीबॉडी से अधिक से हृदय कोशिकाओं को धो लें - / - 1% FCS और छोटी स्पिन पर 480 x जी 1 मिनट के लिए कोशिकाओं centrifuging।
    4. सतह पर तैरनेवाला और दोहराने त्यागेंशॉर्ट स्पिन सेंट्रीफ्यूगेशन (चरण 3.4.3)।
    5. 200 μL एचबीएसएस - / - 1% एफसीएस में कोशिकाओं को फिर से खोलें और उन्हें पहले से ही 200 एमएल एचबीएसएस - / - 1% एफसीएस युक्त 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. अधिग्रहण करने से पहले, 0.5 μg / mL PI के साथ 400 μL एचबीएसएस - / - 1% एफसीएस जोड़ें और 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के साथ सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।

4. स्पेक्ट्राल फ्लो साइटोमीटर के साथ लेबल वाले स्पलेनिक, आंतों और कार्डिएक सेल का अधिग्रहण

  1. डेटा के अधिग्रहण से पहले, निर्माता के निर्देशों के बाद वर्णक्रमीय साइटोमीटर स्वचालित रूप से जांचें। प्रयोग के हर दिन दैनिक और मासिक गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाएं करें
  2. जब साइटोमीटर तैयार हो जाता है, तब सभी एंटीबॉडीज़ के लेबल वाले सेल निलंबन वाले नमूने का पूर्वावलोकन शुरू करें।
    नोट: अधिग्रहण न करें।
  3. सुनिश्चित करें कि सभी पराबैंगनीकिरण आवश्यकतानुसार हैं FSC लाभ को समायोजित करें जैसे कि सभी सेल संबंधित में दिखाई देते हैंभूखंडों। गेट सेल आबादी और दो वर्णक्रमीय 488 एनएम के लिए और 638/405-एनएम लेज़रों के लिए इसी भूखंडों को यह गेट लागू होते हैं।
    नोट: fluorochromes 638 एनएम लेजर से उत्साहित कर रहे हैं (यानी, जब 638 एनएम लेजर पर है), वहाँ एक मुखौटा है कि ढाल 617-662 एनएम से प्रकाश पीएमटी में चमक से 638 एनएम लेजर को रोकने के लिए है। यह स्पेक्ट्रम के एक हिस्से के नुकसान को प्रेरित करता है और इसलिए इन तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जन करीब रंगों की एक कम जुदाई का कारण बनता है। हालांकि, पूरे सिग्नल 638 एनएम लेजर बंद अगर यह अधिग्रहण के लिए आवश्यक नहीं है द्वारा एकत्र किया जा सकता है।
  4. 32-चैनल तस्वीर गुणक समायोजित (पीएमटी) वोल्टेज (%) ऐसा है कि सभी fluorochromes 488 एनएम और 405/638 प्रदर्शित तीव्रता दो अलग वर्णक्रमीय भूखंडों में (1-10 6) y- अक्ष में दिखाया गया है की सीमा के भीतर कर रहे हैं एनएम excitations।
    नोट: प्रशिक्षण उपयोग किए गए सभी fluorochromes की स्पेक्ट्रा पहचान करने के लिए आवश्यक है।
  5. नमूने प्राप्त करने के लिए शुरू करो। पर क्लिक करें "; पूर्वावलोकन "स्क्रीन पर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए और फिर पर क्लिक करें" प्राप्त "नमूना रिकॉर्ड करने के लिए प्रत्येक नमूने से 2 एक्स 10 6 घटनाओं तक की बचत करें।।
  6. रंगीन नमूने प्राप्त करने के बाद, नमूना महत्वपूर्ण डाई और उसके बाद मुआवजा मोतियों को व्यक्तिगत रूप से उपयोग किए गए सभी एंटीबॉडी के साथ दाग के साथ दाग प्राप्त। "पूर्वावलोकन" पर क्लिक करें स्क्रीन पर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए और उसके बाद "प्राप्त" पर नमूने रिकॉर्ड करने के लिए।
    नोट: सभी नमूनों और नियंत्रण (यानी, माला और बेदाग नमूने) के लिए एक ही पीएमटी वोल्टेज रखें; 5000 की घटनाओं में काफी हद तक पर्याप्त हैं।
  7. अंत में, बेदाग सेल निलंबन से डेटा प्राप्त। "पूर्वावलोकन" पर क्लिक करें स्क्रीन पर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए और उसके बाद "प्राप्त" पर नमूने रिकॉर्ड करने के लिए।
    नोट: प्रयोग के अंत में बेदाग नमूने हासिल करना फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का भार कम करता है।
  8. कोशिकामापी साफ निर्माता के निर्देशों एक निम्नलिखितd अधिग्रहण फ़ोल्डर में प्रयोग बंद कर दें।
    ध्यान दें: केवल प्रयोग बंद करने के बाद यह बचाया और विश्लेषण के लिए उपलब्ध हो जाएगा।

स्पेक्ट्रल FCM सॉफ्टवेयर के साथ डेटा की 5. विश्लेषण

  1. "विश्लेषण" टैब के "रंग पटल" विंडो में, प्रत्येक fluorochrome इस्तेमाल किया और इसी मार्कर जोड़कर पैनल में मौजूद सभी मापदंडों रजिस्टर (उपलब्ध सूची में से चुनें या एक नया पैरामीटर जोड़ने)। इसके अलावा, ऑटो प्रतिदीप्ति और व्यवहार्यता पैरामीटर शामिल हैं; सभी चयनित पैरामीटर "unmixing" विंडो में दिखाई देगा।
  2. "विश्लेषण" टैब पर इस प्रयोग के "ट्यूब सूची" के तहत "नियंत्रण" विंडो में पहली एकल रंगीन नमूने (मुआवजा मोतियों के साथ किया) का चयन करें। कार्यपत्रक में, "बहुभुज डिजाइन उपकरण" पर क्लिक करें और एफएससी / एसएससी साजिश में मनका आबादी पर एक गेट डिजाइन। एक वर्णक्रमीय या डॉट साजिश खोलने के लिए गेट के शीर्ष पर डबल क्लिक करेंएक बेटी की साजिश में गेटेड मोती कल्पना करने के लिए।
    1. सकारात्मक के लिए एक गेट और या तो स्पेक्ट्रम पर या डॉट भूखंड पर नकारात्मक मोती के लिए एक गेट डिज़ाइन करें। पूरे स्पेक्ट्रा प्रत्येक सकारात्मक और नकारात्मक अंश के लिए दो लेजर सेट करने के लिए इसी की जाँच करें और क्रमिक gating और बेटी आबादी सत्यापित करने के लिए गेट पर क्लिक करके बाहरी कारकों के कारण को समाप्त। "Unmixing" विंडो में नकारात्मक और सकारात्मक फाटक दर्ज करें।
    2. प्रत्येक एकल दाग नमूने के लिए दोहराएँ कदम 5.2।
      नोट: ध्यान रखें सकारात्मक और नकारात्मक gating रणनीति नमूना है कि विश्लेषण किया जा रहा से मेल खाती है कि हो सकता है, हालांकि कार्यक्रम के लिए यह किसी भी नमूने में रखा जा सकता है। प्रत्येक एकल दाग नमूना के लिए एक नकारात्मक अंश का निर्धारण करने के बजाय, एक सार्वभौमिक नकारात्मक सेट करने के लिए एक अस्थिर मनका नमूना का उपयोग करें।
  3. "ट्यूब सूची" और autofluorescent के लिए डिजाइन फाटकों में और गैर autofluorescent कोशिकाओं के लिए बेदाग सेल नमूना का चयन करें।
    4. <li> ऑटो प्रतिदीप्ति और व्यवहार्यता सहित सभी मापदंडों के लिए सभी नकारात्मक और सकारात्मक फाटक, "unmixing" विंडो में चयनित कर रहे हैं, पर क्लिक करें "की गणना।" नमूने के लिए unmixing लागू विश्लेषण किया जाए।
  4. फाटकों डिजाइन और दो पैरामीटर भूखंडों बनाने के द्वारा डेटा का विश्लेषण।
    1. सबसे पहले, एसएससी एफएससी बनाम के लिए एक गेट डिजाइन और उसके बाद सभी कोशिकाओं व्यवहार्यता मार्कर (CD45 बनाम पीआई) के साथ लेबल को बाहर निकालकर मृत कोशिकाओं को हटा दें। कोशिकाओं के बाकी पर, रणनीति प्रत्येक कोशिका निलंबन के लिए वर्णित निम्न ब्याज के सभी आबादी के लिए डिजाइन फाटकों (आंकड़े 1-3)।
      ध्यान दें: यदि आवश्यक हो, में मुआवजा समायोजित "संदर्भ स्पेक्ट्रम समायोजक।" यह एक उपकरण है, तो एल्गोरिथ्म यह पूरी नहीं कर सका कि unmixing के बाद इस्तेमाल किया जा सकता प्रत्येक fluorochrome के लिए सकारात्मक आबादी की औसत फिर से समायोजित करने के लिए है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

21 पैरामीटर splenocytes का विश्लेषण करने के वर्णक्रमीय FCM पैनल

CD45 सभी hematopoietic केन्द्रक कोशिकाओं लेबल, जबकि चित्रा 1, टी, बी, एन.के., वृक्ष के समान है, और माइलॉयड कोशिकाओं के सबसेट को पहचानने अलग एंटीबॉडी शामिल प्लीहा कोशिकाओं के लिए लागू 19 फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी पैनल के साथ प्राप्त परिणामों को दर्शाता है। पैनल भी एक व्यवहार्यता डाई (पीआई), और साथ ही आकार (एफएससी) स्पष्टता (एसएससी) पैरामीटर शामिल हैं। चित्रा 1 ए संदर्भ fluorochrome स्पेक्ट्रा को दर्शाता है। CD45 + गेट (चित्रा 1 बी) में मृत कोशिकाओं के उन्मूलन के बाद, विश्लेषण दर्शाता है कि CD3 + टी कोशिकाओं TcRβ श्रृंखला व्यक्त करने और उम्मीद सीडी 4 / CD8 वितरण और सीडी 4 टी कोशिकाओं में CD25 + कोशिकाओं के अनुपात में है। CD8 टी कोशिकाओं CD44- और Ly49D-व्यक्त कोशिकाओं की एक सामान्य वितरण दिखा। CD19 + बी कोशिकाओं सह एक्सप्रेस B220 एकघ MHCII, साथ ही आईजीएम और आईजीडी, परिपक्व प्लीहा बी कोशिकाओं की खासियत। NK1.1 + एन के कोशिकाओं के एक उप समूह प्लीहा लिम्फोसाइटों कि सह एक्सप्रेस Ly49D के एक छोटे सबसेट का प्रतिनिधित्व करता है। शेष कोशिकाओं MHC द्वितीय, जिनमें से कुछ भी थे CD11b + के उच्च स्तर के साथ CD11c + वृक्ष के समान कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट शामिल। F4 / 80 + ऊतक निवासी मैक्रोफेज सह एक्सप्रेस CD11b और तिल्ली में पाया CD44 के उच्चतम स्तर की विशेषता कोशिकाओं। शेष कोशिकाओं (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) CD11b और Gr1, जहां डबल सकारात्मक कोशिकाओं के छोटे सबसेट भी CD44 के उच्च स्तर को अभिव्यक्त करते हैं, संभावना पूर्वज के लिए इसी की अभिव्यक्ति द्वारा विभाजित किया जा सकता है तिल्ली में कम आवृत्तियों पर उपस्थित माने जाते। एक बड़े समूह का तीन मार्करों के लिए नकारात्मक था। चित्र 2 मुआवजा समायोजित करने से पहले ही विश्लेषण से पता चलता।


चित्र 1: म्यूरीन प्लीहा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक 19 रंग एंटीबॉडी कक्ष। (ए) माउस splenocytes, पिछले एंटीबॉडी संयोजन के साथ दाग रहे थे जो CD45-विकसित 655 जोड़ दिया गया है। सभी fluorochromes की संदर्भ स्पेक्ट्रा दिखाए जाते हैं। फ्लोरोफोरे लेबल CD45 एक लाल तीर द्वारा चिह्नित है। Fluorochromes तालिका 1. (बी) में सूचीबद्ध हैं समोच्च भूखंडों बी के, टी, एन.के., वृक्ष के समान है, या माइलॉयड कोशिकाओं अलग अलग आबादी को अलग करने के इस बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषण के विवेकशील क्षमता दिखा। विश्लेषण deconvolution unmixing के बाद पारंपरिक FCM सॉफ्टवेयर में किया गया था।

चित्र 2
चित्र 2: म्यूरीन प्लीहा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक 19 रंग एंटीबॉडी कक्ष। चित्र 1 में के रूप में ही विश्लेषण adjus से पहले किया गया थासंदर्भ स्पेक्ट्रा समायोजक के साथ मुआवजे की tment।

छोटी आंत के भीतर उपकला लिम्फोसाइटों

कई टी सेल आबादी उपकला कोशिका परत 5, 6 के भीतर आंत में पाए जाते हैं। इन उप-समूहों के परंपरागत अलगाव एक घनत्व ढाल कि उपकला कोशिकाओं से लिम्फोसाइटों अलग करती है भी शामिल है। हालांकि, इस तैयारी नाजुक है, समय लेने वाली है, और सेल नुकसान में परिणाम है। मात्रात्मक सुधार करने के लिए और प्रयोगात्मक प्रक्रिया की सुविधा के लिए, वर्णक्रमीय FCM के संभावित उपकला कोशिकाओं के एक बड़े अंश के भीतर आंतों लिम्फोसाइटों की आबादी भेदभाव करने के लिए परीक्षण किया गया था। उपकला ऊतक के यांत्रिक विघटन के बाद, सेल निलंबन एंटीबॉडी कि αβ के सबसेट लेबल और टी कोशिकाओं आमतौर पर आंतों उपकला में पाया γδ साथ दाग रहे थे।कोशिकाओं दो पारंपरिक cytometers में और वर्णक्रमीय FCM में विश्लेषण किया गया।

चित्रा 3 एक ऐसी ही gating रणनीति निम्नलिखित, पीआई नकारात्मक कोशिकाओं पर gating मृत कोशिकाओं के उन्मूलन के साथ के बाद परिणाम दिखाता है। ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की उपस्थिति सभी पारंपरिक cytometers में और वर्णक्रमीय cytometry में स्पष्ट जब ऑटो प्रतिदीप्ति प्रबंधक, (शीर्ष पैनल, लाल तीर) निष्क्रिय है जीवित कोशिकाओं की एक गरीब भेदभाव में जिसके परिणामस्वरूप है। सभी भूखंडों में, FSC-ए / एसएससी-ए लिम्फोसाइट फाटक के भीतर कोशिकाओं नीले और बड़ा scatters (उपकला कोशिका गेट) के साथ कोशिकाओं में दिखाया जाता है लाल रंग में दिखाया गया है। दोनों पारंपरिक वाद्ययंत्र शेष कोशिकाओं से CD3 + टी सेल सबसेट (नीले रंग में) (फ़िरोज़ा तीर) को हल करने में असमर्थ थे। इसलिए, TcRβ - कोशिकाओं (हरा तीर) दूषित CD3 + TcRγδ - जनसंख्या, एक जैविक रूप से असंभव सबसेट separati के बाद पता चला कभी नहींउपकला कोशिकाओं से लिम्फोसाइट के पर। इसके विपरीत, वर्णक्रमीय FCM में ऑटो-प्रतिदीप्ति प्रबंधन के बाद, विभिन्न टी सेल सबसेट के विश्लेषण उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति से प्रभावित नहीं कर रहा था, आबादी अच्छी तरह से अलग हो गए थे, और वहाँ में CD3 + कोई TCR नकारात्मक कोशिकाओं थे द्वार।

चित्र तीन
चित्र 3: ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की उपस्थिति स्पेक्ट्रल FCM में इंट्रा उपकला लिम्फोसाइट के जांच ख़राब नहीं करता है। उपकला कोशिकाओं और लिम्फोसाइटों सहित छोटे आंतों की कोशिकाओं,, TcRδ, पीआई, TcRβ Cy7-एपीसी CD3 (पैनल बी), Vγ7 एपीसी, Vδ4 Cy7-पीई (पैनल सी), और CD8 FITC (पैनल डी) को पहचानने एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। पीआई विश्लेषण से पहले FACS बफर में जोड़ा गया है। डेटा के अधिग्रहण उचित गुणवत्ता नियंत्रण के बाद तीन उपकरणों में क्रमिक रूप से किया गया था। दोहरी elimina थेएफएससी-एच / में टेड एफएससी-W। विश्लेषण पारंपरिक FCM सॉफ्टवेयर में किया गया था। भूखंड gating रणनीति के विभिन्न चरणों को दिखाते हैं। एफएससी-ए / एसएससी-ए लिम्फोसाइट फाटक के भीतर कोशिकाओं, नीले रंग में लेबल रहे हैं, जबकि आंतों उपकला कोशिका गेट के भीतर कोशिकाओं लाल रंग में लेबल रहे हैं। तीर विभिन्न जनसंख्या विकृतियों और ऑटो प्रतिदीप्ति को इंगित। सी में भूखंड, unmixing में autofluorescence प्रबंधन के बिना वर्णक्रमीय FCM में प्राप्त आंकड़ों के विश्लेषण दिखाने जबकि डी autofluorescence प्रबंधन के साथ unmixing के बाद एक ही डेटा को दर्शाता है।

भ्रूण दिल

परम्परागत FCM ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (काला तीर) कि विश्लेषण से बाहर रखा गया था क्योंकि यह CD45 और TER119 डंप चैनल (पीई) में fluoresced का एक प्रमुख जनसंख्या से पता चला है, hematopoietic कोशिकाओं अंकन। इसके विपरीत, यह स्वत: फ्लोरोसेंट आबादी वर्णक्रमीय FCM में इस तरह के रूप मौजूद नहीं थे और CD45 में शामिल थे - सबसेट (चित्रा 4)। पता चलता है कि इन कोशिकाओं को हृदय थे और endothelial या hematopoietic नहीं, CD45, TER119, या CD31, cardiomyocytes के लिए विशिष्ट टेप की अभिव्यक्ति के निम्न स्तर व्यक्त अनुसार क्रमबद्ध कोशिकाओं पर मात्रा निर्धारित किया गया था। हृदय की मांसपेशी ट्रोपोनिन टी (TNNT2) 7 और आलिंद हल्की श्रृंखला -2 (MYL7) के उच्च स्तर 8 टेप ऑटो फ्लोरोसेंट आबादी में पाए गए।

चित्रा 4
चित्र 4: E17.5 कार्डिएक सेल निलंबन में ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को ठीक स्पेक्ट्रल FCM में नकारात्मक सेल अंश में शामिल कर रहे हैं। (ए) भ्रूण दिल से सेल निलंबन विरोधी TER119 और CD45-PE, Sca-1-PECy5, और CD31-APC एंटीबॉडी और क्रमिक रूप से तीन उपकरणों में अधिग्रहण के साथ दाग रहे थे। काला तीर दो conve में ऑटो-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को दिखानेntional cytometers, जबकि इन कोशिकाओं वर्णक्रमीय cytometry में ऑटो-फ्लोरोसेंट के रूप में पता नहीं कर रहे हैं और इस प्रकार विशिष्ट फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए विश्लेषण किया जा सकता। (बी) ऑटो फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (हरे रंग में अण्डाकार गेट के अंदर), लेकिन नहीं CD31 + कोशिकाओं (नीले, नकारात्मक नियंत्रण में आयताकार गेट), हृदय ट्रोपोनिन की अभिव्यक्ति (TNNT2) 7 और आलिंद हल्की श्रृंखला -2 (MYL7) से पता चला 8 टेप। औ - GAPDH घर रखने प्रतिलिपि करने के लिए मनमाने ढंग से इकाइयों रिश्तेदार। डाटा SEM ± के रूप में औसत मान प्रस्तुत किया।

<tr>
उत्तेजना लेजर fluorochrome विशेषता क्लोन
488 एनएम BB515 CD8 53-6.7
488 एनएम FITC Ly49D 4E5
488 एनएम पीई F4 / 80 6F12
488 एनएम पीई-CF594 NK1.1 PK136
488 एनएम पीई Cy5 CD44 IM7
488 एनएम पीई-Cy7 CD11b एम 1/70
488 एनएम PerCP-Cy5.5 आईजीएम R6-60.2
488 एनएम PerCP जीआर -1 RB6-8CS
488 एनएम AF532 CD3 17A2
488 एनएम प्रोपीडियम आयोडाइड व्यवहार्यता
405 एनएम V450 आईजी डी 11-26c.2a
405 एनएम BV421 CD11c HL3
405 एनएम BV510 CD19 1D3
405 एनएम BV570 TCRb H57-597
405 एनएम BV605 सीडी 4 RM4-5
405 एनएम BV650 CD45R / B220 RA3-6B2
405 एनएम BV711 आइए / IE M5 / 114
405 एनएम BV786 CD25 PC61
405 एनएम विकसित 655 CD45 30 F11
एन / ए शुद्ध किया हुआ CD16 / CD32 2.4G2 एफसी रिसेप्टर ब्लॉक
एंटीबॉडी की सूची cardi में इस्तेमाल कियाएसी कोशिका निलंबन
638 एनएम एलेक्सा Fluor 647 CD31 MEC13.3
488 एनएम पीई CD45 30 F11
488 एनएम पीई Cy5 एससीए -1 D7
488 एनएम पीई Ter119 TER -119

Table1: 19 रंग कक्ष में और कार्डिएक सेल निलंबन में प्रयुक्त एंटीबॉडी की सूची।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

परम्परागत FCM फ्लोरोसेंट जांच की उत्तेजना के बाद उत्सर्जित फोटॉनों का पता लगाने पर आधारित है। एक fluorochrome एक और fluorochrome से संकेत को मापने के लिए तैयार किया गया एक डिटेक्टर में पाया की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन शारीरिक ओवरलैप प्रेरित करता है। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच यह spillover मुआवजा द्वारा सही करने की जरूरत।

स्पेक्ट्रल FCM और unmixing deconvolution एल्गोरिथ्म द्वारा डाटा प्रोसेसिंग, बशर्ते कि वे अलग वर्णक्रमीय आकार है कि अतिरिक्त मुआवजा के बिना पास उत्सर्जन चोटियों के साथ fluorochromes के संयोजन के लिए अनुमति देता है। विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म एक स्वतंत्र पैरामीटर के रूप में ऑटो प्रतिदीप्ति व्यवहार करता है, ठोस ऊतक सेल निलंबन से गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति घटाकर।

19 fluorochromes के एक पैनल ने केवल दो लेज़रों (488 एनएम और 405 एनएम) का उपयोग करते हुए प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इकट्ठा किया गया था। वास्तव में, जब 638 एनएम लेजर पर था, 32-चैनल पीएमटी का एक वर्ग इसीइस लेजर की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए उपलब्ध नहीं था। पीएमटी की अधिकतम पता लगाने की क्षमता प्राप्त करने के लिए, लाल लेजर बंद किया गया था। माउस प्लीहा कोशिकाओं विश्लेषण किया गया, 12 से अधिक अलग सेल आबादी, जिनमें से कुछ 1% hematopoietic कोशिकाओं के कम या ज्यादा शामिल का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

ऑटो प्रतिदीप्ति का प्रबंधन करने के वर्णक्रमीय FCM की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, कि विश्लेषण शिथिल पड़ सकते हैं दो अलग अलग स्थितियों का परीक्षण किया गया: एक जहाँ लिम्फोसाइटों उपकला कोशिकाओं के साथ दूषित कर रहे थे, और वह है जहां ऑटो फ्लोरोसेंट हृदय कोशिकाओं विश्लेषण किया गया। पारंपरिक FCM साथ इसके विपरीत, वर्णक्रमीय cytometry सभी लिम्फोसाइट सबसेट के भेदभाव के लिए अनुमति देता है, तब भी जब वे नाबालिग सबसेट दिखाते हैं।

वयस्क cardiomyocytes 9, 10 के पुनर्योजी क्षमता के आसपास विवाद, 11 जिले के लिए एक रणनीति के अभाव के कारण भाग में हैcriminate और दिल में व्यवहार्य कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट को अलग। एक बहु पैरामीट्रिक विश्लेषण मार्करों के अद्वितीय संयोजन को परिभाषित विभिन्न हृदय सबसेट भेदभाव करने के लिए, क्योंकि कोशिकाओं की बड़ी संख्या है कि विश्लेषण किया जा सकता की दुर्लभ सबसेट का पता लगाने के सक्षम हो सकता है। भ्रूण दिल (E17.5) विश्लेषण किया गया, और स्वत: फ्लोरोसेंट कोशिकाओं है, जो पारंपरिक FCM में खोज से बच निकले हैं का एक बड़ा हिस्सा, वर्णक्रमीय FCM में गैर hematopoietic व्यवहार्य हृदय सेल डिब्बे में एकीकृत किया गया।

इस पद्धति की एक आवर्ती समस्या अच्छी गुणवत्ता फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के लिए आवश्यकता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब मिलकर रंगों का उपयोग कर, जहां मिलकर के एक घटक के प्रमुख है। उदाहरण के लिए, BV786 और Cy7-PE क्रमश: BV421 और पीई से भेद करना मुश्किल हो सकता है।

स्पेक्ट्रोमेट्री के आधार पर FCM मुआवजा मीटर की आवश्यकता के बिना, पारंपरिक FCM के साथ प्राप्त की है कि तुलना में विश्लेषणात्मक शक्ति अधिक प्रदान करता हैatrices। यह पांडुलिपि सबूत एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि एक उच्च विश्लेषणात्मक क्षमता, जटिल मुआवजा मैट्रिक्स के अभाव, ऑटो प्रतिदीप्ति की वजह से सेल सबसेट अछूता भेदभाव, और कोई अतिरिक्त वित्तीय प्रतिबद्धताओं है कि अभी भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री FCM के लिए आवश्यक दर्शाता है कि वहाँ प्रदान करता है। स्पेक्ट्रल FCM इस प्रकार ठोस ऊतकों आम तौर पर पारंपरिक FCM के लिए उत्तरदायी नहीं है और ट्यूमर, विकास में इस्तेमाल किया जा सकता की एक विस्तृत विविधता से प्राप्त कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए पसंद का एक तरीका हो, और कोशिका जीव विज्ञान स्टेम प्रतीत होता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम K फुटमुरा, जो भी गंभीर रूप से पांडुलिपि संशोधित के वर्णक्रम cytometry में तकनीकी और सैद्धांतिक योगदान को स्वीकार करते हैं। हम सी ईट-मंसूर, P.-H. को भी आभारी हैं Commere, ए Bandeira, और P पेरीरा समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए और अंतहीन तकनीकी सलाह और समर्थन के लिए। हम यह भी विरोधी Vγ7-एपीसी और Vδ4-बायोटिन लेबल एंटीबॉडी के उपहार के लिए P पेरीरा धन्यवाद। हम स्वागत करते हुए और फिल्मांकन रसद समर्थन करने के लिए पाश्चर संस्थान से केंद्र डी Enseignements aknowledge। इस काम पाश्चर संस्थान, Institut राष्ट्रीय डे ला Santé एट डी ला Recherche médicale (INSERM) द्वारा समर्थित किया गया था; स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और पाश्चर Bourse रॉक्स (एस एस); Fundação पैरा एक Ciencia ईए Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (एमवी); और Université पैरिस डिडेरोट, एजेंस नेशनल डे ला Recherche (ANR) परियोजना Twothyme, ANR, और कार्यक्रम पुनर्जीवित (भविष्य के लिए निवेश) (एसी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Janvier Labs CD45.2 Source of cells
Ethanol 70% VWR 83801.36 Sterilization
DPBS (Ca2+, Mg2+) GIBCO ThermoFisher 14040-174 Embryos collection
Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) GIBCO Life ThermoFisher 14025092 Dissociation, digestion and staining solutions
Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) GIBCO Life ThermoFisher 14175095 Dissociation, digestion and staining solutions
Fetal calf serum (FCS) EUROBIO CVFSVF00-0U Dissociation, digestion and staining solutions
Collagenase Sigma C2139 Enzymatic solution
90 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.		 TPP T93100 Embryos and hearts collection
35 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.		 TPP T9340 Hearts collection
Fine iris scissor Fine Science Tools 14090-09 Dissection tools
Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) Fine Science Tools 11003-12 Dissection tools
Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) Fine Science Tools 11272-30 Dissection tools
Scalpel  VWR 21909-668 Dissection tools
LEICA MZ6 Dissection microscope LEICA MZ6 10445111 Sampling; Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source SCHOTT VWR KL1500 compact Sampling;
Two goose neck fibers adapted
FACS tubes VWR 60819-310 Digesting cells
96 well plate (round bottom) VWR 10861-564 Staining cells
Nylon mesh bolting cloth sterilized,
50/50 mm pieces.		 SEFAR NITEX SEFAR NITEX Cell filtration
UltrasComp eBeads
Fluorescence labeled antibodies Biolegend Catalogue number see table below Staining cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
  3. Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
  4. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  5. Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
  6. Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
  7. Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
  8. Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
  9. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  10. Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
  11. Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 123 प्रवाह cytometry वर्णक्रमीय ऑटो प्रतिदीप्ति आंत भ्रूण हृदय बहु पैरामीट्रिक विश्लेषण
स्पेक्ट्रल प्रवाह cytometry द्वारा ठोस ऊतकों से पृथक सेल निलंबन का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmutz, S., Valente, M., Cumano,… More

Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (123), e55578, doi:10.3791/55578 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter