Summary
Denne artikel beskriver spektrale cytometri, en ny tilgang i flowcytometri, der bruger figurer af emission spektre til at skelne fluorokromer. En algoritme erstatter kompensationer og kan behandle auto-fluorescens som en selvstændig parameter. Denne nye tilgang giver mulighed for en korrekt analyse af celler isoleret fra faste organer.
Abstract
Flowcytometri har været brugt i de sidste 40 år til at definere og analysere fænotypen af lymfoide og andre hæmatopoietiske celler. Oprindeligt begrænset til analysen af et par fluorochromer, der i øjeblikket er der snesevis af forskellige fluorescerende farvestoffer, og op til 14-18 forskellige farvestoffer kan kombineres på et tidspunkt. Men flere begrænsninger stadig forringe de analytiske evner. På grund af mangfoldigheden af fluorescerende prober, er dataanalyse blevet mere komplekse på grund af behovet for store, multi-parametriske kompensation matricer. Desuden har mutante musemodeller bærer fluorescerende proteiner til at afsløre og spore specifikke celletyper i forskellige væv bliver tilgængelige, så kræves analysen (ved flowcytometri) af auto-fluorescerende cellesuspensioner opnået fra faste organer. Spectral flowcytometri, hvilket adskiller formerne af emissionsspektre langs en lang række kontinuerte bølgelængder, løser nogle af disse problemer. Dataene analyseres wed en algoritme, der erstatter kompensation matricer og behandler automatisk fluorescens som en selvstændig parameter. Således bør spektral flowcytometri være stand til at skelne fluorochromer med lignende toppe emissions- og kan tilvejebringe en multi-parametrisk analyse uden kompensation krav.
Denne protokol beskriver den spektrale flowcytometrianalyse, giver mulighed for en 21-parameter (19 fluorescerende prober) karakterisering og forvaltningen af en auto-fluorescerende signal, der giver høj opløsning i mindre population detektion. Resultaterne præsenteret her viser, at spektral flowcytometri viser fordele i analysen af cellepopulationer fra væv vanskelige at karakterisere på konventionel flowcytometri, såsom hjertet og tarmen. Spectral flowcytometri således demonstrerer den multi-parametrisk analytiske kapacitet højtydende konventionel flowcytometri uden kravet om erstatning og muliggør automatisk fluorescens forvaltning.
Introduction
I de sidste par årtier, flowcytometri (FCM) blev en alment tilgængelig analysemetode afgørende for celle Fænotypebestemmelse undersøgelser. Der har været en betydelig stigning i de tilgængelige fluorescerende farvestoffer, især fluorochromer ophidset af violet laser (405 nm) (fx Brilliant Violet og nye Q-prik farvestoffer). Men væksten af tilgængelige fluorescerende farvestoffer øger risikoen for overlappende emissioner, og kræver arbejdskraftintensive kompensation matricer. FCM blev udbredt at analysere cellesuspensioner fra fast væv, men tilstedeværelsen af auto-fluorescerende celler begrænser diskrimination af specifikt mærkede populationer.
De grundlæggende principper for spektral FCM er rapporteret i detaljer i Futamura et al. 1, 2. Kort fortalt er den spektrale FCM anvendt her (se tabellen af materialer) udstyret med 405, 488, og 638 nm lasere. Den spektrale FCM indfanger alle den udsendte fluorescence som spektre i en 32-kanals lineær opstilling PMT (32ch PMT) til 500 nm til 800 nm og 2 uafhængige PMT'er til 420 nm til 440 nm og 450 nm til 469 nm, som erstatter de konventionelle båndpasfiltre. De 488 og 405/638 nm laser spots er rumligt adskilt, mens de 405 nm og 638 nm laser pletter er co-lineære. For hver enkelt partikel, de spektrale FCM måler op til 66 kanaler af fluorescensdata exciteres af den 405 nm og 488 nm lasere. Når celler ophidset ved 638 nm laser, den spektrale FCM måler 58 kanaler af fluorescensdata fordi en maske er indsat for at forhindre 638 nm laser fra skinner ind PMT. Spectral FCM analyserer de erhvervede hele spektret data med en algoritme baseret på den vægtede mindste kvadraters metode (WLSM), som muliggør adskillelse af overlappende fluorescerende spektre. Spectra afledt fra enkelt-farvede og ufarvede prøver anerkendt som den grundlæggende referencespektrer. Multi-farvede prøver matematisk monteret ennd ublandet, og spektret af en prøve med blandede fluorescerende mærker nedbrydes til en samling af det konstituerende spektre. Den unmixing, i spektral teknologi 3, 4, erstatter den kompensation, fjerner signalet fra alle detektorer undtagen den måle en given farvestof.
I denne undersøgelse har vi kombineret og testet 19 fluorochromer i en enkelt, 21-parameter analyse, kendetegnet de store hæmatopoietiske delmængder fundet i musemilt. Derudover demonstrerede vi, at den spektrale cytometri kan administrere auto-fluorescerende signal og dermed forbedre karakterisering af intestinale intra-epitheliale lymfocytter og af den embryoniske hjerte. Faktisk, i disse væv, auto-fluorescens forvaltning tillod tildelingen af specifik fluorescens til celler, der ville blive udelukket fra analysen på konventionel FCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Pasteur Instituttet Etik charter og EU-retningslinjerne og blev godkendt af det franske landbrugsministerium.
1. Celle Suspension Forberedelse fra voksne mus Organs
- Isolering af splenocytter
- Euthanize voksne mus ved cervikal dislokation. Lav et snit på maven midterlinjen og åbn huden med en saks. Høst milten med pincet.
- Knuse milten mellem 2 mikroskopglasplader at dissociere cellerne og fortynde dem i 5 ml Hanks balancerede Saltet Solution (HBSS) indeholdende 1% føtalt kalveserum (FCS).
- Centrifuger i 10 minutter ved 120 xg og 4 ° C. Supernatanten kasseres.
- Pellet resuspenderes i 5 ml HBSS 1% FCS. Tæl cellerne med en Neubauer kammer under anvendelse af en trypanblåt vital plet.
BEMÆRK: 80 millioner celler bør indhentes fra en voksen milt.
- isolatipå celler fra tyndtarmen
- Euthanize voksne mus ved cervikal dislokation. Ved hjælp af en saks, foretage et snit i huden på maven midterlinjen. Fatte tyndtarmen med pincet i den ene hånd og bruge saks til at klippe det i begge ender: første, lige efter maven og derefter i slutningen af tyndtarmen, lige før tyktarmen. Skylle tyndtarmen med 1x Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) anvendelse af en 2 ml sprøjte med en nål.
- Sæt tyndtarmen på et stykke køkkenrulle og fjern forsigtigt Peyerske plaques med en skarp saks.
- Brug en saks til at åbne tarmen på sin lange side ved at indsætte en gren af saksen inde i tarmen. Skær den åbnede tarmen ind 1-cm stykker under anvendelse skarp saks.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C under konstant omrøring i 30 ml HBSS med 10% FCS.
- Placer cellesuspensionen med de resterende ikke-opdelte fragmenter i en 50 mlplastrør og vortex i 5 minutter ved høj hastighed. BEMÆRK: Der er ingen yderligere dissociation af vævet.
- Der inkuberes i 10 min på is for at tillade de store, ikke-opdelte fragmenter at pelletere.
- Indsamle supernatanten og koncentrere det ved centrifugering i 7 minutter ved 120 x g.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 10 ml HBSS med 1% FCS. Tæl cellerne med en Neubauer kammer under anvendelse af en trypanblåt vital plet.
BEMÆRK: ~ 60 millioner intra-epitheliale celler (IELs) bør opnås fra en voksen tyndtarmen.
- Panel designstrategi
- Forberede panelerne med antistoffer direkte koblede med fluorokromer.
BEMÆRK: Alle antistoffer tidligere titreret at opnå den optimale definition af cellepopulationer (titreringen kan variere med antistoffet batch). De anvendes i 19-farve panel til farvning splenocytter antistoffer er anført i tabel 1. - Konstruere multi-farvr paneler til cytometri. Da dette kan være en udfordrende opgave, skal du bruge følgende retningslinjer for at optimere panelerne:
- Tjek den spektrale konfiguration og de fluorescerende farver, der kan bruges på instrumentet.
- Brug af lysstyrke Index / Farvning Indeks oplysninger fra producenten.
BEMÆRK: Brightness Index / Farvning Index er den relative indikator for fluorescensintensitet versus baggrunden for hvert fluorochrom. - Vælg antistofferne efter nedenstående regler:
- Vælg de lyseste fluorochromer for proteiner, som svagt udtrykt og selv meget svagt fluorochromer for mere højt udtrykte proteiner.
BEMÆRK: For eksempel er CD45, CD4 og CD8 højt udtrykt og kan anvendes med dim fluorochromer. - Start designe panelet ved først at vælge antistofferne med færrest fluorescerende farvestof muligheder.
- Hvis det er muligt, skal du vælge fluorescerende farvestoffer med den mindste overlapning af emission spektre feller markører udtrykt på samme celletyper.
BEMÆRK: Tandems (fx PE-Cy5, PE-Cy7, og PerCP-Cy5.5) bør anvendes med forsigtighed, da de er mere modtagelige for nedbrydning af lys eksponering.
- Vælg de lyseste fluorochromer for proteiner, som svagt udtrykt og selv meget svagt fluorochromer for mere højt udtrykte proteiner.
- Forberede panelerne med antistoffer direkte koblede med fluorokromer.
- Farvning af celler til cytometrianalyse
- Forberede en 5 ml rør med 1 x 10 6 splenocytter og en 5 ml rør med 1 x 10 6 tarmceller og holde dem ufarvede til anvendelse som negative kontroller.
- Forberede og mærke et 5 ml rør per prøve og per panel ifølge tabel 1. Forberede den blanding af antistoffer, ifølge tabel 1, i HBSS 1% FCS.
- Overfør 1 x 10 6 celler - enten splenocytter eller tarmceller - i hvert 5 ml rør. Tilsæt 2 ml HBSS 1% FCS og centrifugeres i 5 minutter ved 4 ° C og 120 x g. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 50 pi af antistof mix.
- Mærk splenocytes i 2 trin. Brug først 50 pi af blandingen indeholdende antistoffer mærket med PE-Cyanin 5, PerCP-Cyanin 5,5 og PerCP (med Fc-receptor blokerende) i et 5 ml rør. Efter 20 minutters inkubation i mørke ved 4 ° C, tilsættes 50 pi af blandingen indeholdende alle de andre antistoffer til et 5 ml rør.
BEMÆRK: Denne strategi begrænser sterisk hindring. - Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Tilsæt 2 ml HBSS 1% FCS og centrifugeres i 5 minutter ved 4 ° C og 120 x g. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 200 pi HBSS 1% FCS med 0,5 pg / ml propidiumiodid (PI).
2. Udarbejdelse af Single-farvning for Hver Fluorokrom om kommerciel Erstatning Bead mikrosfærer (fx UltraComp eBeads), i det følgende benævnt perler
- Forberede og mærke så mange 5 ml-rør som antallet af antistoffer, der anvendes i panelerne. Placer en dråbe af perler i hvert rør og tilsæt 1 & #181; L antistof pr. Rør.
BEMÆRK: De perler, der bruges her (se materialebordet) indeholder farvede (positive) og ufarvede (negative) perler. Antistoffer overføres på perlerne for at sikre et lyst signal og dermed en klar spektral signatur for hvert farvestof. Dette kræves af softwaren for at kunne præcisere unmixing. - Inkubér i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Tilsæt 2 ml HBSS 1% FCS og centrifuge i 5 minutter ved 120 x g. Kassér supernatanten og resuspender pelleten i 100 μl HBSS 1% FCS.
3. Cell Suspension Preparation fra Embryonic Mouse Hearts
- Doseringer af embryoner
- Planlægger at få timed-pregnant kvinder på forhånd ved at parre 2 kvinder med en mand (altid i hannens bur) ved slutningen af dagen (mellem 17 og 19 timer). Næste morgen anses kvinder med vaginale stik til at være 0,5 dage efter coitum.
- Euthanize E17.5 gravide females ved cervikal dislokation. Sørg for, at dyret ikke reagerer ved et hårdt tryk på musen pote (toe-knivspids refleks). Fugt maven med 70% ethanol for at sterilisere og at forhindre spredningen af muse pels.
- Lav et snit i huden på midten af maven ved hjælp af en saks og trække huden fra hinanden med fingrene.
- Åbne bughulen ved at trække og gøre indsnit i den abdominale muskel fra midten ud mod de to sider af maven ved anvendelse af grove pincet og saks.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige tyndtarmen, som er umiddelbart under peritoneal muskel. - Indsamle livmoderhornene (med embryoner) ved at skære både på niveauet for livmoderen og æggestokkene. Suge dem i en 90 x 15 mm 2 petriskål med 50 ml DPBS.
- Isoler hver embryo ved at skære mellem hver decidua, efterfulgt af livmoderen muskelkraft væg og den viscerale blommesækken med en fin pincet og saks. Træk embryoner inthandling. Endelig klippe navlestrengen.
- Skær E17.5 embryoner hoveder med en saks (halshugning), før du starter dissektion.
- Indsamling af hjerter
- Suge halshuggede embryoner i et 90 x 15 mm 2 petriskål indeholdende et vådt køkkenrulle strøelse i skålen bunden og 50 ml HBSS med 1% FCS.
- Under et stereomikroskop, holde hver embryo med grove pincet, så den ventrale side vender opad.
- Åbn forsigtigt thorax gitter ved at skære den højre side af brystet med en saks for at forhindre skader på hjertet.
- Blotlægge hjertet ved at holde brystkassen med grove pincet.
- Træk fra hinanden hjertet (stadig samlet med lunger og thymus) ved at holde de store kar (med de store fartøjer fra ind- og ud-strømning af hjertet) og placere dem i en 35 x 15 mm 2 petriskål med 2 ml HBSS 1% med FCS.
- Isoler hjerter fra de omkringliggende organer ogbindevæv med fine pincet og en skalpel.
- Vask hjerterne i en ny 35 x 15 mm petriskål med 2 ml HBSS 1% FCS og holde dem på is i 20 minutter for at tillade hjertet at pumpe blodet inde i kamrene.
- Fremstilling af hjerte cellesuspensioner
- Pre-varme 200 ug / ml collagenase i HBSS + / + (i det følgende benævnt enzymatisk opløsning) til 37 ° C.
BEMÆRK: Fortynd collagenase i HBSS + / + (med Ca2 + og Mg2 + kationer) for at maksimere enzymaktiviteten; collagenaseaktivitet er stabil mellem batcher. - Erstatte vaskeopløsningen neddypning hjerter (HBSS 1% FCS) med 1 ml forvarmet enzymatisk opløsning.
- Under et stereomikroskop, hakkekød hjerterne i 1 mm 3 stykker under anvendelse af fine tænger og en skalpel. Tilføje endnu 1 ml forvarmet enzymatisk opløsning og overføre det hakkede væv til et 5 ml rør med låg.
BEMÆRK: For optimal fordøjelse, placere enhøjst 5 E17.5 hjerter per 2 ml enzymatisk opløsning. Hvis flere hjerter fordøjes samtidigt, opdele dem i forskellige 5 ml-rør. - Inkubér hakket hjerter til 15 minutter ved 37 ° C.
BEMÆRK: At fastlægge 5 ml rør (korrekt lukkede) i inkubatoren til at sprede vævet langs opløsning.- Ved afslutningen af inkubationen, homogenisere vævet i samme enzymatiske opløsning ved at pipettere op og ned ca. 20 gange med P1000 pipette. Sæt 5 ml rør i lodret stilling og lad den resterende vævsfragment sediment (ca. 3 minutter).
- Opsaml supernatanten (indeholdende de fordøjede celler i suspension) i et 50 ml rør, der tilsættes 2 ml HBSS 10% FCS (det samme volumen som volumenet af enzymatisk opløsning til vævsfragmenterne), og holde dem på is under fortsat fordøjelsesprocessen.
BEMÆRK: HBSS 10% FCS opløsning og isen er vigtige for at inaktivere enzymet aktion, mens det resterende væv erfordøje. - Tilsæt 2 ml forvarmet enzymatisk opløsning til 5 ml rør med de resterende vævsfragmenter og fortsætte fordøjelse ved at gentage trin 3.3.4, indtil der observeres ikke mere væv.
BEMÆRK: Ca. 4 cyklusser af fordøjelse er nok til helt dissociere hjertevævet (5 E17.5 hjerter i 2 ml enzymatisk opløsning).
- Centrifuger 50-ml rør med celler i suspension i 10 minutter ved 300 xg, og kassér supernatanten.
- Resuspender cellepelleten tilsættes 1 ml HBSS - / - 1% FCS, og foretage cellesuspensionen selvom en 70 um nylon mesh. Tæl cellerne med en Neubauer kammer under anvendelse af en trypanblåt vital plet.
BEMÆRK: Resuspender cellerne med HBSS - / - (uden Ca2 + og Mg2 + kationer) for at minimere celleaggregation. Mellem 800.000 og 1.000.000 celler opnås fra en E17.5 hjerte.
- Pre-varme 200 ug / ml collagenase i HBSS + / + (i det følgende benævnt enzymatisk opløsning) til 37 ° C.
- Farvning hjerteceller med fluorescerende antistoffer
BEMÆRK: Alle Antiboderne er tidligere titreret til opnåelse af optimal definition af cellepopulationer (titreringen kan variere med antistoffet batch) .De anvendte antistoffer i hjertet panel er angivet i tabel 1.- Fordel hjerteceller i suspension gennem en 96-brønds plade (rundbundet). Distribuere dem jævnt gennem alle nødvendige brønde (200 pi per brønd), kort- spin centrifuge 96-brønds plade i 1 min ved 480 xg, og kassér supernatanten.
BEMÆRK: Alle brønde i 96-brønds plade (rundbundet) kan anvendes. - Resuspender pelleten og inkuber hjerteceller i 20 minutter i mørke ved 4 ° C med 100 pi af cocktailen af antistoffer (dvs. CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647, og Sca-1-PE-Cyanine5 ) fortyndet i HBSS - / - 1% FCS.
- Vask de hjerteceller fra overskud af antistoffer ved tilsætning af 200 pi HBSS - / - 1% FCS og korte centrifugering centrifugering af cellerne i 1 minut ved 480 x g.
- Supernatanten fjernes, og gentagkort centrifugering centrifugering (trin 3.4.3).
- Cellerne resuspenderes i 200 pi HBSS - / - 1% FCS og overføre dem til et 5 ml rør, der allerede indeholder 200 pi HBSS - / - 1% FCS.
- Før købet, tilsættes 400 pi HBSS - / - 1% FCS med 0,5 ug / ml PI og foretage cellesuspensionen selvom en 70 um nylon mesh.
- Fordel hjerteceller i suspension gennem en 96-brønds plade (rundbundet). Distribuere dem jævnt gennem alle nødvendige brønde (200 pi per brønd), kort- spin centrifuge 96-brønds plade i 1 min ved 480 xg, og kassér supernatanten.
4. Erhvervelse af Mærkede Milt, Intestinal, og Hjerte Celler med Spectral flowcytometer
- Før købet af dataene, automatisk kalibrere spektrale cytometer efter fabrikantens anvisninger. Udfør den daglige og de månedlige kontrolprocedurer kvalitet hver dag i eksperimentet.
- Når cytometeret er klar, startes preview af prøverne indeholdende cellesuspensionerne mærket med alle antistoffer.
BEMÆRK: Du må ikke erhverve. - Sørg for, at alle lasere er på efter behov. Juster FSC gain, således at alle celler er synlige i den respektiveplots. Gate cellepopulationen og anvende denne port til de to spektrale afsætninger svarende til 488-nm og de 638/405-nm lasere.
BEMÆRK: Når fluorokromer er begejstrede for den 638-nm laser (dvs. når 638-nm laser er tændt), der er en maske, der skjolde lys fra 617-662 nm for at forhindre 638 nm laser fra skinner ind PMT. Dette inducerer tabet af en del af spektret, og derfor forårsager en lavere adskillelse af nære farvestoffer udsender i disse bølgelængder. Imidlertid kan hele signalet opsamles ved frakobling af 638-nm-laser, hvis det ikke er påkrævet for erhvervelsen. - Justere 32-kanals fotomultiplikator (PMT) spænding (%), således at alle fluorokromer er inden for området af intensiteten vist i y-aksen de (1-10 6) i de to forskellige spektrale plots viser 488 nm og 405/638 nm excitationer.
BEMÆRK: Træning er forpligtet til at anerkende den spektre af alle fluorokromer brugt. - Start med at erhverve prøverne. Klik på "; Preview" for at visualisere cellerne på skærmen, og klik derefter på 'Acquire' for at optage prøven Spar op til 2 x 10 6 hændelser fra hver prøve..
- Efter at erhverve de farvede prøver, erhverve prøven farvet med vitalfarvestoffet og derefter kompensation perler individuelt farvet med alle anvendte antistoffer. Klik på ”Preview” for at visualisere cellerne på skærmen og derefter på ”Hent” for at optage prøverne.
BEMÆRK: Hold den samme PMT spænding på alle prøver og kontroller (dvs. perler og ufarvede prøver); 5.000 arrangementer er stort set tilstrækkeligt. - Endelig erhverve data fra ufarvede cellesuspensioner. Klik på "preview" for at visualisere cellerne på skærmen og derefter på "Hent" for at optage prøverne.
BEMÆRK: Erhvervelse de ufarvede prøver ved slutningen af eksperimentet minimerer overførsel af fluorescerende celler. - Rengør cytometret efter fabrikantens anvisninger end lukke eksperimentet i købet mappen.
BEMÆRK: Kun efter lukning af forsøget vil det blive gemt og tilgængelig for analyse.
5. Analyse af data med Spectral FCM Software
- I "Color Palette" vindue i "Analyse" fanen, registrere alle parametre til stede i panelet ved at tilføje hver fluorokrom anvendt, og den tilsvarende markør (vælg fra den tilgængelige liste eller tilføje en ny parameter). Også omfatte auto-fluorescens- og levedygtighed parametre; alle valgte parametre vises i "unmixing" vinduet.
- Vælg den første single farvede prøve (udført med kompensation perler) i "Control" vinduet under "Tube List" med dette eksperiment på ”Analyse” fanen. I regnearket, skal du klikke på "polygon design værktøj", og designe en port på perlen befolkning i FSC / SSC plot. Dobbeltklik på toppen af porten til at åbne en spektral eller punktdiagramAt visualisere gated perler i en datter plot.
- Design en port til den positive og en port for de negative perler enten på spektret eller på prikken. Kontroller hele spektret svarende til de to lasersæt for hver positiv og negativ fraktion og fjern eliminatorer ved successivt gating og klik på porten for at bekræfte datterpopulationen. Indtast de negative og positive porte i vinduet "Unmixing".
- Gentag trin 5.2 for hver enkeltfarvede prøve.
BEMÆRK: Vær opmærksom på, at den positive og negative gatingstrategi svarer til den prøve, der analyseres, selvom programmet tillader, at det placeres i en prøve. I stedet for at bestemme en negativ fraktion for hver enkeltfarvet prøve, brug en ufarvet perleprøve til at indstille et universelt negativt.
- Vælg den ufarvede celleprøve i "Tube List" og design porte til auto-fluorescerende og til ikke-autofluorescerende celler. <li> Når alle de negative og positive porte til alle parametre, herunder auto-fluorescens og levedygtighed, er valgt i "Unmixing" vinduet, klik på "Beregn". Påfør unmixing til prøverne, der skal analyseres.
- Analysere data ved at designe porte og skabe to-parameter plots.
- Først designe en gate for SSC versus FSC og derefter fjerne døde celler ved at udelukke alle celler mærket med levedygtigheden markør (PI versus CD45). På resten af cellerne, design porte til alle populationer af interesse efter den strategi beskrevet for hver cellesuspension (Figur 1-3).
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, justeres kompensation i "referencespektret justeringsanordningen." Dette er et værktøj, der kan bruges efter unmixing at re-justere medianen af de positive befolkninger for hver fluorokrom hvis algoritmen ikke kunne gøre det perfekt.
- Først designe en gate for SSC versus FSC og derefter fjerne døde celler ved at udelukke alle celler mærket med levedygtigheden markør (PI versus CD45). På resten af cellerne, design porte til alle populationer af interesse efter den strategi beskrevet for hver cellesuspension (Figur 1-3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21-parameter spektral FCM panel til at analysere splenocytter
Figur 1 viser resultaterne opnået med den 19-fluorescerende-antistofpanel påført på miltceller omfatter forskellige antistoffer, der genkender undergrupper af T, B, NK, dendritiske og myeloide celler, mens CD45 etiketter alle hæmatopoietiske celler med kerne. Panelet indbefatter også en levedygtighed farvestof (PI), samt størrelsen (FSC) og granularitetskravene (SSC) parametre. Figur 1A viser referencen fluorochrom spektre. Efter eliminering af døde celler i CD45 + gate (figur 1B), viser analysen, at CD3 + T-celler udtrykker TCRp kæden og har den forventede CD4 / CD8 distribution og andelen af CD25 + -celler i CD4 T-celler. CD8 T-celler udviser en normal fordeling af CD44- og Ly49D-udtrykkende celler. CD19 + B-celler co-udtrykker B220 end MHCII samt IgM og IgD, typisk for modne milt-B-celler. En undergruppe af NK1.1 + NK-celler udgør en lille delmængde af de miltlymfocytter, som co-udtrykker Ly49D. De resterende celler omfatter en lille delmængde af CD11c + dendritceller med høje niveauer af MHC II, hvoraf nogle var også CD11b +. F4 / 80 + -celler er karakteristiske for vævs-hjemmehørende makrofager co-udtrykker CD11b og de højeste niveauer af CD44 fundet i milten. De resterende celler (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) kunne opdelt ved ekspressionen af CD11b og Gr1, hvor den lille delmængde af dobbelt-positive celler også udtrykker høje niveauer af CD44, sandsynligvis svarer til progenitorer vides at være til stede ved lave frekvenser i milten. En stor fraktion var negativ for de tre markører. Figur 2 viser den samme analyse før justering kompensationen.
Figur 1: En 19-farve antistofpanel for analyse af murine miltceller. (A) musesplenocytter blev farvet med den tidligere antistof kombination, hvortil CD45-udvikler sig 655 blev tilsat. Referencespektrer af alle fluorokromer er vist. Fluorophor-mærket CD45 er markeret med en rød pil. Fluorochromerne er anført i tabel 1. (B) de kontur plots viser diskriminerende kapacitet for denne multi-parametrisk analyse til at adskille de forskellige populationer af B, T, NK, dendritiske eller myeloide celler. Analysen blev udført i traditionel FCM-software efter unmixing udfoldning.
Figur 2: En 19-farve antistofpanel for analyse af murine miltceller. Den samme analyse som i figur 1 blev gjort før den adjustment af kompensationen med referencespektrer justeringsanordningen.
Tyndtarm intra-epitheliale lymfocytter
Adskillige T-cellepopulationer findes i tarmen inden epithelcellelaget 5, 6. Konventionel isolering af disse undergrupper omfatter en densitetsgradient, der adskiller lymfocytter fra epitelceller. Men dette præparat er delikat, tidskrævende og resulterer i celletab. At forbedre kvantificering og lette den eksperimentelle procedure blev potentialet af spektral FCM til at diskriminere populationer af intestinale lymfocytter inden for en stor fraktion af epitelceller testet. Efter mekanisk ødelæggelse af epitelvævet blev cellesuspensioner farvet med antistoffer, som mærker undergrupper af αβ og γδ T-celler normalt findes i tarmepitelet. Detceller blev analyseret i to konventionelle cytometre og i spektral FCM.
Figur 3 viser resultaterne efter efter en lignende gating strategi, med eliminering af døde celler gating på PI-negative celler. Tilstedeværelsen af auto-fluorescerende celler er indlysende i alle konventionelle cytometre og i spektral cytometri hvis auto-fluorescens leder inaktiveres (toppaneler, røde pile), hvilket resulterer i en dårlig diskrimination af de levende celler. I alle jordlodder, er celler i FSC-A / SSC-A lymfocytgaten vist i blå, og celler med større scatters (epitelcelle gate) er vist med rødt. Både konventionelle instrumenter ikke kunne løse CD3 + T-celle delmængde (med blåt) (turkis pil) fra de resterende celler. Derfor TCRp - celler (grøn pil) forurenet CD3 + TcRγδ - befolkning, en biologisk usandsynlig delmængde aldrig opdaget efter separator;på af de lymfocytter fra epitelceller. I modsætning hertil spektral FCM efter auto-fluorescens forvaltning, analysen af de forskellige T-celle-undergrupper blev ikke forringet ved tilstedeværelsen af epitelceller, blev populationerne godt adskilt, og der var ingen TcR-negative celler i CD3 + Port.
Figur 3: Tilstedeværelse af Auto-fluorescerende celler ikke forringer Påvisning af Intra-epiteliale Lymfocytter i Spectral FCM. Tyndtarmens celler, herunder epitelceller og lymfocytter blev farvet med antistoffer, der genkender TcRδ, PI, TCRp Cy7-APC CD3 (panel B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (panel C) og CD8 FITC (panel D). PI blev tilsat i FACS-buffer før analyse. Købet af de data, der blev udført sekventielt i de tre instrumenter efter passende kvalitetskontrol. Dubletter var elimineringted i FSC-H / FSC-W. Analysen blev udført i traditionel FCM-software. Plots viser de forskellige trin i gating-strategi. Celler i FSC-A / SSC-A lymfocytgaten er mærket i blå, mens celler i de intestinale epithelceller gate er mærket med rødt. Pile peger på forskellige befolkningsgrupper forvridninger og auto-fluorescens. Parceller i C viser analysen af data opnået i spektral FCM uden autofluorescens management i unmixing, hvorimod D viser de samme data efter unmixing med autofluorescens management.
embryonale hjerte
Konventionel FCM viste en større population af auto-fluorescerende celler (sort pil), der blev udelukket fra analysen, fordi det fluorescerede i CD45 og TER119 dump kanal (PE), mærkning hæmatopoietiske celler. Derimod denne auto-fluorescerende population ikke var til stede som sådanne i spektral FCM og bestod i CD45
Figur 4: Auto-fluorescerende celler i E17.5 Hjerte Cellesuspensioner Korrekt Inkluderet i Negativ cellefraktion i Spectral FCM. (A) Cellesuspensioner fra føtale hjerter blev farvet med anti-TER119 og CD45-PE, Sca-1-PECy5, og CD31-APC antistoffer og sekventielt erhvervet i de tre instrumenter. Sorte pile viser auto-fluorescerende celler i to conventional cytometre, mens disse celler ikke er detekteret som auto-fluorescerende i spektral cytometri og kan således analyseres for specifik fluorescerende farvning. (B) Auto-fluorescerende celler (inden den elliptiske gate med grønt), men ikke CD31 + celler (rektangulær port i blå, negativ kontrol) viste ekspressionen af kardial troponin (TNNT2) 7 og atrial let kæde-2 (MYL7) 8 udskrifter. au - arbitrære enheder i forhold til GAPDH hus-holde udskrift. Data præsenteret som middelværdi ± SEM.
| excitation laser | fluorokrom | Specificitet | Klon | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | propidiumiodid | levedygtighed | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11 | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | udvikle sig 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | oprenset | CD16 / CD32 | 2,4G2 | Fc-receptor blok |
| Liste over antistoffer anvendes i cardiac cellesuspension | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | TER119 | TER-119 | |
Tabel 1: Liste over anvendte antistoffer i 19-farve panel og i Cardiac Cell Suspension.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionel FCM er baseret på påvisning af fotoner udsendt efter excitation af fluorescerende prober. Fluorescensemissionen af et fluorokrom detekteret i en detektor beregnet til at måle signalet fra en anden fluorokrom inducerer fysisk overlap. Denne spillover blandt emissionsspektre skal korrigeres ved kompensationer.
Spektral FCM og databehandling af unmixing deconvolution algoritme gør det muligt for kombinationen af fluorokromer med tætte emission toppe uden yderligere kompensation, forudsat at de har forskellige spektrale former. Den algoritme, der anvendes til analysen behandler auto-fluorescens som en uafhængig parameter, subtrahere ikke-specifik fluorescens fra faste væv cellesuspensioner.
Et panel på 19 fluorochromer blev samlet til analyse immune celler under anvendelse af kun to lasere (488 nm og 405 nm). Faktisk, når den 638 nm laser var på, en sektion af 32-kanals PMT tilsvarendetil excitationsbølgelængden af denne laser var ikke tilgængelig. For at få den maksimale afsløring kapacitet PMT, blev den røde laser slukket. Musemiltceller blev analyseret, hvilket tillader detektion af mere end 12 forskellige cellepopulationer, hvoraf nogle omfattede 1% eller mindre af de hæmatopoietiske celler.
For at teste kapaciteten af spektral FCM at styre auto-fluorescens blev to forskellige situationer, som kan forringe analysen testet: en hvor lymfocytter blev kontamineret med epitelceller, og en hvor auto-fluorescerende hjerteceller blev analyseret. I modsætning til konventionel FCM, spektral cytometri tillader diskrimination af alle lymfocytundergrupper, selv når de repræsenterer mindre delmængder.
Kontroversen omkring regenereringskapacitet voksne cardiomyocytter 9, 10, 11 er delvis på grund af fraværet af en strategi til discriminate og isolere distinkte undergrupper af levedygtige celler i hjertet. En multi-parametrisk analyse definerer unikke kombinationer af markører til at skelne de forskellige kardiale undersæt kunne muliggøre detektering af sjældne delmængder på grund af et stort antal celler, der kan analyseres. Føtale hearts (E17.5) blev analyseret, og en stor del af auto-fluorescerende celler, hvilket ville have opdaget, i konventionel FCM, blev integreret i den ikke-hæmatopoietisk levedygtige hjertecelle rum i spektral FCM.
Et tilbagevendende problem ved denne fremgangsmåde er kravet om god kvalitet fluorescerende mærkede antistoffer. Dette er især kritisk, når der anvendes tandem farvestoffer, hvis en bestanddel af tandem er dominerende. For eksempel kan BV786 og Cy7-PE være svært at skelne fra BV421 og PE hhv.
FCM baseret på spektrometri giver analytisk større effekt end den, der opnås med konventionel FCM, uden behov for kompensation matrices. Dette håndskrift dokumenterer, at der er en alternativ tilgang, der demonstrerer en høj analytisk kapacitet, fraværet af komplekse kompensation matricer, den usvækket diskrimination af celledelmængder følge auto-fluorescens, og ingen yderligere finansielle forpligtelser, der stadig kræves for massespektrometri FCM. Spectral FCM forekommer således at være en metode til analyse af celler opnået fra en lang række af faste væv sædvanligvis ikke modtagelige for konventionel FCM og kan anvendes i tumor, udviklingsmæssige og stamcelle biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender de tekniske og teoretiske bidrag i spektral cytometri af K. Futamura, som også kritisk revision manuskriptet. Vi er også i gæld til C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, og P. Pereira til kritisk læsning af manuskriptet og for endeløse teknisk rådgivning og støtte. Vi takker også P. Pereira for gaven af anti Vγ7-APC og Vδ4-biotin mærkede antistoffer. Vi akundskab Center d'Enseignements fra Pasteur Instituttet for indbydende og støtte filme logistik. Dette arbejde blev støttet af Pasteur Instituttet, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); den schweiziske National Science Foundation og Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para en Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); og Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) projekt Twothyme, ANR, og programmet REVIVE (investering i fremtiden) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
