Summary
Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.
Abstract
A citometria de fluxo foi usada para os últimos 40 anos, para definir e analisar o fenótipo da linfóide e outras células hematopoiéticas. Inicialmente restrita à análise de alguns fluorocromos, atualmente, existem dezenas de diferentes corantes fluorescentes, e até 14-18 corantes diferentes podem ser combinados em um momento. No entanto, várias limitações ainda prejudicar as capacidades analíticas. Devido à multiplicidade de sondas fluorescentes, análise de dados tornou-se cada vez mais complexa devido à necessidade de grandes, matrizes de compensação multi-paramétricos. Além disso, modelos de murganhos mutantes transportando proteínas fluorescentes para detectar e oligo tipos de células específicas em diferentes tecidos tornaram-se disponíveis, por isso, é necessária a análise (por citometria de fluxo) de suspensões celulares de auto-fluorescentes obtidas a partir de órgãos sólidos. Espectrais citometria de fluxo, que distingue as formas de espectros de emissão ao longo de uma ampla gama de comprimentos de onda contínuos, resolve alguns destes problemas. Os dados são analisados wom um algoritmo que substitui matrizes de compensação e trata auto-fluorescência como um parâmetro independente. Assim, citometria de fluxo espectral deve ser capaz de discriminar fluorocromos com picos de emissão semelhantes e pode fornecer uma análise multi-paramétrico, sem exigências de compensação.
Este protocolo descreve o fluxo de citometria espectral análise, permitindo um 21 parâmetro (19 sondas fluorescentes) caracterização e a gestão de um sinal auto-fluorescente, proporcionar alta resolução na detecção população menor. Os resultados aqui apresentados mostram que o fluxo de citometria espectral apresenta vantagens na análise de populações de células a partir de tecidos difíceis de caracterizar em citometria de fluxo convencional, tal como o coração e o intestino. Espectrais citometria de fluxo, assim, demonstra a capacidade de análise multi-paramétrico de gestão de alto desempenho citometria de fluxo convencional, sem a exigência de compensação e permite auto-fluorescência.
Introduction
Nas últimas décadas, a citometria de fluxo (FCM) tornou-se um método analítico amplamente disponível, essencial para estudos de fenótipos celulares. Houve um aumento substancial nos corantes fluorescentes disponíveis, particularmente fluorocromos excitados pelo laser violeta (405 nm) ( por exemplo, Brilliant Violet e novos corantes Q-dot). No entanto, o crescimento de corantes fluorescentes disponíveis aumenta o risco de sobreposição de emissões e requer matrizes de compensação de mão-de-obra intensiva. A FCM tornou-se amplamente utilizada para analisar suspensões de células de tecido sólido, mas a presença de células auto-fluorescentes limita a discriminação de populações especificamente marcadas.
Os princípios básicos da FCM espectral são relatados em detalhe em Futamura et al. 1 , 2 . Resumidamente, o FCM espectral utilizado aqui (ver tabela de materiais) está equipado com lasers 405, 488 e 638 nm. O FCM espectral captura todas as emissões de fluorescence como espectros em um de 32 canais matriz PMT linear (PMT 32CH) para 500 nm a 800 nm e 2 PMT independentes para 420 nm a 440 nm e 450 nm a 469 nm, respectivamente, que substituem os filtros passa-banda convencionais. Os 488 e os pontos de laser 405/638 nm são espacialmente separadas, enquanto que os pontos de laser 405 nm e 638 nm são co-linear. Para cada partícula individual, as medidas espectrais FCM até 66 canais de dados de fluorescência são excitadas pela 405 nm e 488 nm lasers. Quando as células são excitados pelo laser de 638 nm, a FCM espectral mede 58 canais de dados de fluorescência por uma máscara é inserida para impedir que o laser de 638 nm a partir de brilho no PMT. Espectral FCM analisa os dados de espectro completo adquiridos com um algoritmo baseado no método dos mínimos quadrados ponderada (WLSM), que permite a separação de sobreposição de espectros de fluorescência. Os espectros derivada a partir de amostras individuais coradas e não coradas são reconhecidos como os espectros de referência de base. multi-amostras manchadas são matematicamente montado umnd não misturados, e o espectro de uma amostra com marcadores fluorescentes mistos é decomposto em um conjunto de seus espectros de constituinte. A desmistura, em tecnologia espectral 3, 4, substitui a compensação que remove o sinal de todos os detectores, excepto a uma medição de uma dada corante.
Neste estudo, foram combinados e testados 19 fluorocromos em uma única, a análise de 21 parâmetro que caracteriza os principais subconjuntos hematopoiéticas encontrados no baço de ratinho. Além disso, demonstramos que a citometria espectral pode gerenciar sinal de auto-fluorescente, melhorando, assim, a caracterização de linfócitos intra-epiteliais do intestino e do coração embrionário. Na verdade, nestes tecidos, gerenciamento auto-fluorescência permitiu a atribuição de fluorescência específica para as células que seriam excluídos da análise no FCM convencional.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Instituto Pasteur de Ética Carta e as orientações da UE e foram aprovados pelo Ministério da Agricultura francês.
1. células em suspensão Preparação de rato adulto Órgãos
- Isolamento de esplenócitos
- Eutanásia ratos adultos por deslocamento cervical. Faça uma incisão na linha média do abdômen e abra a pele com uma tesoura. Colheita do baço com uma pinça.
- Esmagar o baço entre duas lâminas de vidro de microscópio para dissociar as células e dilui-los em 5 ml de solução salgada equilibrada de Hank (HBSS) contendo 1% de soro fetal de vitelo (FCS).
- Centrifugar durante 10 minutos a 120 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 5 ml de HBSS a 1% de FCS. Contar as células com uma câmara de Neubauer usando um corante vital azul de Tripano.
NOTA: 80 milhões de células deve ser obtido a partir de um baço adulto.
- isolatina de células a partir do intestino delgado
- Eutanásia ratos adultos por deslocamento cervical. Com uma tesoura, fazer uma incisão na pele na linha média do abdômen. Segure o intestino delgado com uma pinça em uma mão e use uma tesoura para cortá-la em ambas as extremidades: primeiro, logo após o estômago e, em seguida, no final do intestino delgado, pouco antes do intestino grosso. Lavar o intestino delgado com 1x de Dulbecco Tamponado com Fosfato Salino (DPBS) usando uma seringa de 2 mL com uma agulha.
- Coloque o intestino delgado em uma toalha de papel e remova cuidadosamente placas de Peyer com um par de tesouras afiadas.
- Utilize uma tesoura para abrir o intestino sobre o seu lado comprido através da inserção de um ramo da tesoura para dentro do intestino. Cortar o intestino aberto em pedaços de 1 cm usando uma tesoura afiada.
- Incubar durante 30 min a 37 ° C sob agitação constante, em 30 mL de HBSS com 10% de FCS.
- Colocar a suspensão de células com os restantes fragmentos de não-dissociada em um 50 mltubo de plástico e de vtice durante 5 minutos, a alta velocidade. NOTA: Não há mais dissociação do tecido.
- Incubar durante 10 min em gelo para permitir que os fragmentos grandes, não-dissociada para sedimentar.
- Recolhe-se o sobrenadante e concentrá-la por centrifugação durante 7 minutos a 120 x g.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de HBSS com 1% de FCS. Contar as células com uma câmara de Neubauer usando um corante vital azul de Tripano.
NOTA: ~ 60 milhões de células intra-epitelial (IELS) deve ser obtido a partir de um adulto intestino delgado.
- Estratégia de design do painel
- Prepare os painéis com anticorpos acoplados directamente com fluorocromos.
NOTA: Todos os anticorpos são previamente titulado para obter a definição óptima das populações de células (a titulação pode variar de acordo com o lote de anticorpo). Os anticorpos utilizados no painel de 19 cores para corar os esplenócitos são listadas na Tabela 1. - Construir multi-color painéis para citometria. Como este pode ser uma tarefa difícil, utilizar as seguintes orientações para optimizar os painéis:
- Verifique a configuração espectral e os corantes fluorescentes que podem ser usados no instrumento.
- Use as informações Índice Brilho / Índice de Coloração fornecido pelo fabricante.
NOTA: O Índice / Index Coloração Brilho é o indicador relativo de intensidade de fluorescência contra o pano de fundo para cada fluorocromo. - Escolha os anticorpos seguindo as regras abaixo:
- Escolha os fluorocromos mais brilhantes para proteínas que são fracamente expressas e os fluorocromos mais escuras para proteínas mais altamente expressos.
NOTA: Por exemplo, CD45, CD4, CD8 e são altamente expressas e podem ser usadas com fluorocromos dim. - Começar a desenhar o painel escolhendo primeiro os anticorpos com o menor número de possibilidades de corantes fluorescentes.
- Se possível, escolha corantes fluorescentes, com menor sobreposição de emissão de espectros fou marcadores expressos nos mesmos tipos de células.
NOTA: Tandem (por exemplo, PE-Cy5, Cy7-PE, PerCP-Cy5.5 e) deve ser usado com cuidado, uma vez que são mais susceptíveis à degradação por exposição à luz.
- Escolha os fluorocromos mais brilhantes para proteínas que são fracamente expressas e os fluorocromos mais escuras para proteínas mais altamente expressos.
- Prepare os painéis com anticorpos acoplados directamente com fluorocromos.
- A coloração das células para a análise de citometria
- Preparar um tubo de 5 mL com 1 x 10 6 esplenócitos e um tubo de 5 mL com 1 x 10 6 culas intestinais e mantê-los sem manchas para uso como controlos negativos.
- Preparar e rotular um tubo de 5 ml por amostra e pelo painel de acordo com a Tabela 1. Preparar a mistura de anticorpos, de acordo com a Tabela 1, em HBSS a 1% de FCS.
- Transferência de 1 x 10 6 culas - quer esplenócitos ou células intestinais - em cada tubo de 5 ml. Adicionar 2 ml de HBSS FCS a 1% e centrifuga-se durante 5 min a 4 ° C e 120 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 mL de mistura de anticorpo.
- Rotular os splenocytes em 2 passos. Em primeiro lugar, usar 50 uL da mistura contendo os anticorpos marcados com PE-Cianina 5, PerCP-Cianina 5,5, e PerCP (com o bloqueio do receptor de Fc) em um tubo de 5 ml. Após 20 minutos de incubação no escuro a 4 ° C, adicionam-se 50 uL da mistura contendo todos os outros anticorpos para um tubo de 5 ml.
NOTA: Esta estratégia limita impedimento estérico. - Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
- Adicionar 2 ml de HBSS FCS a 1% e centrifuga-se durante 5 min a 4 ° C e 120 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de HBSS a 1% de FCS, com 0,5 ug / iodeto de propídio mL (PI).
2. Preparação de mancha individual para cada fluorocromo em comerciais de compensação Bead microesferas (por exemplo, UltraComp eBeads), daqui em diante referido como grânulos
- Preparar e rotular como diversos tubos de 5 ml, como o número de anticorpos que são utilizados nos painéis. Coloque 1 gota de contas em cada tubo e adicionar 1 & #181; L de anticorpo por tubo.
NOTA: As contas utilizadas aqui (consulte a tabela de materiais) contêm manchado (positivo) e pérolas não coradas (negativo). Os anticorpos são colocados em excesso nas contas para garantir um sinal luminoso e, portanto, uma assinatura espectral clara para cada corante. Isto é exigido pelo software para ser capaz de fazer uma desmistura preciso. - Incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
- Adicionar 2 ml de HBSS FCS a 1% e centrifuga-se durante 5 min a 120 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de HBSS a 1% de FCS.
3. células em suspensão Preparação de Embrionárias rato Corações
- Dissecções de embriões
- Plano para obter fêmeas cronometrado-grávidas em avanço por meio de cruzamentos 2 fêmeas com um macho (sempre na gaiola do macho) no fim do dia (entre 17 e 19 h). Na manhã seguinte, as fêmeas com tampões vaginais são considerados a 0,5 dias pós-coitum.
- Eutanásia do femi grávida E17.5es por deslocamento cervical. Certifique-se de que o animal não responder pressionando firmemente por sobre a pata do rato (dedo do pé-pitada de reflexo). Molhar o abdómen com 70% de etanol para esterilizar e para evitar a propagação de pele de ratinho.
- Faça uma incisão na pele, no meio do abdome utilizando tesoura e puxar a pele distante com os dedos.
- Abrir a cavidade abdominal, puxando e fazer incisões no músculo abdominal, do centro para os dois lados do abdómen utilizando fórceps e tesouras brutas.
NOTA: Tenha cuidado para não danificar o intestino delgado, que é imediatamente abaixo do músculo peritoneal. - Recolher as trompas uterinas (com os embriões) cortando tanto ao nível do corpo do útero e dos ovários. Mergulhe-os em um prato de 90 x 15 mm 2 de Petri com 50 mL de DPBS.
- Isolar cada embrião por corte entre cada decidua, seguido pela parede muscular do útero e do saco vitelino visceral com uma pinça fina e tesoura. Retire o int embriõesAja. Finalmente, o corte do cordão umbilical.
- Cortar a cabeça dos embriões E17.5 com tesoura (decapitação) antes de iniciar a dissecção.
- Coleção de corações
- Embeber os embriões decapitados em um prato de 90 x 15 mm 2 de Petri contendo uma cama de papel toalha molhada no fundo da placa e 50 mL de HBSS com 1% de FCS.
- Sob um microscópio estereoscópico, segurar cada embrião com fórceps brutos de modo a que o lado ventral está virada para cima.
- abra cuidadosamente a grade torácica, cortando o lado direito do peito com uma tesoura, a fim de evitar danos ao coração.
- Expor o coração, segurando a caixa torácica com fórceps brutas.
- Separar o coração (ainda montado com os pulmões e o timo), segurando os grandes vasos (contendo os grandes vasos de entrada e saída de fluxo do coração) e colocá-los em um 35 x 15 mm 2 placa de Petri com 2 ml de HBSS 1% com FCS.
- Isolar os corações dos órgãos circundantes etecido conjuntivo com uma pinça fina e um bisturi.
- Lavam-se os corações em um novo 35 x 15 mm placa de Petri com 2 ml de HBSS a 1% de FCS e mantê-los em gelo durante 20 min para permitir que o coração de bombear o sangue no interior das câmaras.
- Preparação de suspensões de células do coração
- Pré-aquecer a 200 ug / mL de colagenase em HBSS + / + (daqui em diante referida como solução enzimática) a 37 ° C.
NOTA: Dilui-se a colagenase-se em HBSS + / + (com Ca 2+ e Mg 2+ catiões) para maximizar a actividade da enzima; a actividade da colagenase é estável entre os lotes. - Substituir a solução de lavagem de imersão os corações (HBSS 1% de FCS) com 1 ml de solução enzimática pré-aquecido.
- Sob um microscópio estereoscópico, mediu os corações em 1 mm 3 pedaços usando uma pinça fina e um bisturi. Adicione outro 1 ml de solução enzimática pré-aquecido e transferir o tecido moído para um tubo de 5 mL com uma tampa.
NOTA: Para uma melhor digestão, coloque ummáximo de 5 E17.5 corações por 2 ml de solução enzimática. Se mais corações são digeridos, ao mesmo tempo, dividi-las em diferentes tubos de 5 mL. - Incubar os corações triturada por 15 min a 37 ° C.
NOTA: Estabelecer os tubos de 5 mL (devidamente fechados) na incubadora para espalhar o tecido ao longo da solução.- No final da incubação, o tecido homogeneizar na mesma solução enzimática por pipetagem para cima e para baixo cerca de 20 vezes com a pipeta P1000. Colocar o tubo de 5 ml, na posição vertical e deixar o restante sedimento fragmento de tecido (cerca de 3 min).
- Recolhe-se o sobrenadante (contendo as células digeridos em suspensão) em um tubo de 50 mL, adiciona-se 2 ml de HBSS FCS a 10% (o mesmo volume que o volume da solução enzimática adicionados aos fragmentos de tecido), e mantê-los em gelo, continuando a processo de digestão.
NOTA: A solução de FCS a 10% HBSS e o gelo é importante para inactivar a enzima de acção, enquanto o restante tecido édigestão. - Adicionar 2 ml de solução enzimática pré-aquecido para os tubos de 5 ml com os restantes fragmentos de tecido e continuar a digestão por repetição do passo 3.3.4 até não se observar mais tecido.
NOTA: Cerca de quatro ciclos de digestão são o suficiente para dissociar completamente o tecido do coração (5 E17.5 corações em 2 ml de solução enzimática).
- Centrifugar os tubos de 50 ml com células em suspensão durante 10 minutos a 300 x g e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular, adicionar 1 ml de HBSS - / - 1% de FCS, e filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon de 70? M. Contar as células com uma câmara de Neubauer usando um corante vital azul de Tripano.
NOTA: Ressuspender as células com HBSS - / - agregação de células (sem Ca 2+ e Mg 2+) catiões para minimizar. Entre 800.000 e 1.000.000 células são obtidas a partir de um só coração E17.5.
- Pré-aquecer a 200 ug / mL de colagenase em HBSS + / + (daqui em diante referida como solução enzimática) a 37 ° C.
- Coloração de células cardíacas com anticorpos fluorescentes
NOTA: Todos Antibods são previamente titulado para obter definição óptima das populações de células (a titulação pode variar de acordo com o lote de anticorpo) .Os anticorpos utilizados no painel de coração são listadas na Tabela 1.- Distribuir as células cardíacas em suspensão através de uma placa de 96 pos (fundo redondo). Distribuí-los uniformemente ao longo de todos os poços necessários (200 uL por cavidade), de curta rotação centrífuga a placa de 96 poços durante 1 minuto a 480 xg, e desprezar o sobrenadante.
NOTA: Todos os poços da placa de 96 poços (fundo redondo) pode ser utilizado. - Ressuspender o sedimento e incuba-se as células cardíacas durante 20 min no escuro a 4 ° C com 100 ul da mistura de anticorpos (isto é, CD45-PE, Ter119-PE, CD31-Alexa 647, e Sca-1-PE-Cyanine5 ) diluída em HBSS - / - 1% FCS.
- Lavam-se as células cardíacas do excesso de anticorpos por adição de 200 uL de HBSS - / - 1% FCS e por rotação curta centrifugação das células durante 1 min a 480 x g.
- Descartar o sobrenadante e repetira centrifugação por rotação curto (passo 3.4.3).
- Ressuspender as culas em 200? L de HBSS - / - 1% FCS e transferi-los para um tubo de 5 ml contendo já 200 uL de HBSS - / - 1% FCS.
- Antes de aquisição, adicionar 400 uL de HBSS - / - 1% de FCS, com 0,5 ug / ml de PI e filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon de 70? M.
- Distribuir as células cardíacas em suspensão através de uma placa de 96 pos (fundo redondo). Distribuí-los uniformemente ao longo de todos os poços necessários (200 uL por cavidade), de curta rotação centrífuga a placa de 96 poços durante 1 minuto a 480 xg, e desprezar o sobrenadante.
4. A aquisição de células marcadas com Esplênica, intestinais, e cardíaca com o Citómetro de Fluxo espectral
- Antes de aquisição dos dados, calibrar automaticamente o espectro citômetro seguindo as instruções do fabricante. Execute o diário e os procedimentos de controlo de qualidade mensais cada dia de experimento.
- Quando o citómetro está pronto, iniciar a visualização das amostras que continham as suspensões de células marcadas com todos os anticorpos.
Nota: não adquirir. - Certifique-se de que todos os lasers estão em conforme necessário. Ajuste o ganho FSC tal que todas as células são visíveis no respectivoparcelas. Porta da população de células e aplicar esta porta para as duas parcelas espectrais correspondentes para o 488-nm e para os lasers de 638/405 nm.
NOTA: Quando fluorocromos são excitados pelo laser de 638 nm (ou seja, quando o laser de 638 nm é ligado), existe uma máscara que escudos acender 617-662 nm para evitar que o laser de 638 nm a partir de brilho no PMT. Isto induz a perda de uma parte do espectro e, portanto, provoca uma separação de corantes inferior perto emissores de luz em comprimentos de onda. No entanto, a totalidade do sinal pode ser recolhido por desligar o laser de 638 nm, se não for necessário para a aquisição. - Ajustar o multiplicador foto de 32 canais (PMT) tensão (%), de modo que todos os fluorocromos estão dentro da gama da intensidade exibidos no eixo y (1-10 6) em duas parcelas espectrais diferentes exibindo 488 nm e 405/638 excitações nm.
NOTA: O treinamento é necessário para reconhecer os espectros de todos os fluorocromos utilizados. - Começam a adquirir as amostras. Clique em "; Preview" para visualizar as células na tela e, em seguida, clique em 'Adquirir' para gravar a amostra Economize até 2 x 10 6 eventos de cada amostra..
- Depois de adquirir as amostras manchadas, adquirir a amostra corada com o corante vital e, em seguida, as esferas de compensação individualmente coradas com todos os anticorpos utilizados. Clique em “Preview” para visualizar as células na tela e, em seguida, em “Adquirir” para gravar as amostras.
NOTA: Mantenha a mesma tensão PMT para todas as amostras e controles (ou seja, contas e amostras não coradas); 5.000 eventos são amplamente suficientes. - Finalmente, adquirir os dados a partir de suspensões de células não coradas. Clique em "Preview" para visualizar as células na tela e, em seguida, em "Adquirir" para gravar as amostras.
NOTA: Adquirir as amostras não coradas no final da experiência minimiza o arrastamento de células fluorescentes. - Limpe o citômetro seguindo as instruções de um do fabricanteD fechar a experiência na pasta de aquisição.
NOTA: Só depois de fechar a experiência será guardado e disponível para análise.
5. Análise dos Dados com o Software Spectral FCM
- Na janela "Paleta de cores" da guia "Análise", registre todos os parâmetros presentes no painel, adicionando cada fluorochrome usado eo marcador correspondente (selecione na lista disponível ou adicione um novo parâmetro). Além disso, incluem os parâmetros de auto-fluorescência e viabilidade; Todos os parâmetros selecionados aparecerão na janela "unmixing".
- Selecione a primeira amostra única manchada (feita com contas de compensação) na janela "Controle" sob a "Lista de tubos" desta experiência na guia "Análise". Na planilha, clique na "ferramenta de projeto de polígonos" e crie um portão sobre a população de grânulos no gráfico FSC / SSC. Clique duas vezes no topo do portão para abrir um gráfico espectral ou de pontospara visualizar as contas bloqueadas em uma trama filha.
- Projetar um portão para o lado positivo e um portão para as contas negativas tanto no espectro ou no gráfico de pontos. Verifique todo o espectro correspondente aos dois conjuntos de laser para cada fração positivo e negativo e eliminar os outliers sucessivamente gating e clicando no portão para verificar a população filha. Digite as portas negativos e positivos na janela "desmistura".
- Repetir o passo 5.2 para cada amostra single-coradas.
NOTA: Esteja ciente de que a estratégia de gating positivo e negativo corresponde à amostra que está sendo analisado, embora o programa permite que ele seja colocado em nenhuma amostra. Em vez de determinar uma fracção negativa para cada amostra individual coradas, utilizar uma amostra de grânulo não corado para definir um negativo universal.
- Selecione a amostra de células imaculado na "Lista Tube" e portões de design para autofluorescente e para células não-autofluorescentes. <li> Quando todas as portas negativos e positivos para todos os parâmetros, incluindo auto-fluorescência e viabilidade, são selecionados na janela "desmistura", clique em "Calcular". Aplicar a desmistura para as amostras a serem analisadas.
- Analisar os dados através da concepção de portas e criando parcelas de dois parâmetros.
- Em primeiro lugar, criar um portão para SSC contra FSC e, em seguida, remover as células mortas por excluindo todas as células marcadas com o marcador de viabilidade (PI contra CD45). No resto das células, portas de design para todas as populações de interesse seguindo a estratégia descrita para cada suspensão de células (Figuras 1-3).
NOTA: Se necessário, ajuste a compensação no "ajustador espectro de referência." Esta é uma ferramenta que pode ser usada depois de desmistura de reajustar a mediana das populações positivas para cada fluorocromo se o algoritmo não poderia fazê-lo perfeitamente.
- Em primeiro lugar, criar um portão para SSC contra FSC e, em seguida, remover as células mortas por excluindo todas as células marcadas com o marcador de viabilidade (PI contra CD45). No resto das células, portas de design para todas as populações de interesse seguindo a estratégia descrita para cada suspensão de células (Figuras 1-3).
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Representative Results
21 parâmetros painel FCM espectral para analisar esplenócitos
A Figura 1 mostra os resultados obtidos com o painel 19-fluorescente-anticorpo aplicado a células esplénicas compreendendo anticorpos que reconhecem diferentes subconjuntos de T, B, NK, dendríticas e células mielóides, enquanto CD45 etiquetas todas as células nucleadas hematopoiéticas. O painel também inclui um corante de viabilidade (PI), assim como o tamanho (FSC) e granularidade (SSC) parâmetros. A Figura 1A mostra os espectros de fluorocromo referência. Após a eliminação de células mortas no CD45 + portão (Figura 1B), a análise mostra que as células T CD3 + de expressar a cadeia de TCR? E têm a distribuição esperada de CD4 / CD8 e proporção de células CD25 + em células T CD4. células T CD8 mostram uma distribuição normal de CD44- e células Ly49D-expressam. Células B CD19 + co-expressa uma B220D MHCII, bem como IgM e IgD, típicas de células B esplênicas maduras. Um subconjunto de células NK1.1 + NK representa um pequeno subconjunto dos linfócitos esplénicos que co-expressam Ly49D. As células restantes compreendem um pequeno subconjunto de células dendríticas CD11c + com níveis elevados de MHC II, algumas das quais também foram CD11b + . As células F4 / 80 + características dos macrófagos residentes no tecido co-expressam CD11b e os níveis mais elevados de CD44 encontrados no baço. As células restantes (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c - ) podem ser subdivididas pela expressão de CD11b e Gr1, onde o pequeno subconjunto de células duplamente positivas também expressa níveis elevados de CD44, provavelmente correspondendo a progenitores Conhecida por estar presente em baixas frequências no baço. Uma grande fração foi negativa para os três marcadores. A Figura 2 mostra a mesma análise antes de ajustar a compensação.
Figura 1: A 19-cor painel de anticorpos para a análise de células do baço de murino. Esplenócitos (A) de ratinho foram coradas com a combinação de anticorpos anterior, para que evoluem a CD45 655 foi adicionado. Os espectros de referência de todos os fluorocromos são mostrados. CD45 marcado com fluoróforo é marcado por uma seta vermelha. Os fluorocromos são listados na Tabela 1. (B) Os gráficos de contorno mostrar a capacidade discriminativa desta análise multi-paramétrica para separar as diferentes populações de B, T, células NK, dendríticas, ou mielóides. A análise foi feita no software FCM convencional após desmistura deconvolução.
Figura 2: A 19-cor painel de anticorpos para a análise de células do baço de murino. A mesma análise que na Figura 1 foi feito antes de o Adjustamento da compensação com o ajustador de espectros de referência.
linfócitos intra-epiteliais do intestino delgado
Várias populações de células T são encontradas no intestino no interior da camada de células epiteliais 5, 6. isolamento convencional destes subconjuntos inclui um gradiente de densidade que separa os linfócitos a partir de células epiteliais. No entanto, esta preparação é delicado, demorado, e resulta em perda de células. Para melhorar a quantificação e para facilitar o procedimento experimental, o potencial de FCM espectral para discriminar populações de linfócitos intestinal dentro de uma grande fracção de células epiteliais foi testado. Após a disrupção mecânica do tecido epitelial, as suspensões de células foram coradas com anticorpos que rotulam subconjuntos de αβ e yô células T normalmente encontrados no epitélio intestinal. oas células foram analisadas em dois citómetros convencionais e em FCM espectral.
A Figura 3 mostra os resultados depois de seguir uma estratégia de intermitcia semelhante, com a eliminação de células mortas gating em células PI-negativas. A presença de células auto-fluorescente é evidente em todos os citómetros convencionais e em citometria espectral quando o gestor de auto-fluorescência é inactivada (painéis superior, setas vermelhas), resultando numa fraca discriminação das células vivas. Em todos os lotes, as células dentro da-A FSC / SSC-A porta de linfócitos são mostrados a azul e as células com maiores dispersa (de porta de células epiteliais) são mostrados no vermelho. Ambos os instrumentos convencionais, eram incapazes de resolver o subconjunto de células T CD3 + (em azul) (seta turquesa) a partir das células remanescentes. Portanto, TCR? - células (seta verde) contaminado o CD3 + TcRγδ - população, um subconjunto biologicamente improvável não detectado após o separatino dos linfócitos a partir de células epiteliais. Em contraste, em FCM espectral após a gestão automática da fluorescência, a análise dos diferentes subconjuntos de células T não foi prejudicada pela presença de células epiteliais, as populações foram bem separados, e não havia células TcR-negativos no CD3 + portão.
Figura 3: A presença de células auto-fluorescentes não prejudique a detecção de linfócitos intra-epiteliais nos espectral FCM. células do intestino delgado, incluindo as células epiteliais e linfócitos, foram corados com anticorpos que reconhecem TcRδ, PI, TCR? Cy7-APC CD3 (painéis B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (painéis C), e CD8 FITC (painéis D). PI foi adicionado no tampão FACS antes da análise. A aquisição dos dados foi feito sequencialmente nos três instrumentos após o controle de qualidade apropriado. Doublets foram Eliminated no FSC-H / FSC-W. A análise foi feita no software FCM convencional. Gráficos mostram as diferentes etapas da estratégia de gating. As células dentro do FSC-A / SSC-A porta de linfócitos são rotulados em azul, enquanto que as células dentro da porta da célula epitelial intestinal são marcados a vermelho. Setas apontam para diferentes distorções da população e auto-fluorescência. Lotes em C mostram a análise de dados obtidos em FCM espectral sem a administração autofluorescência no desmistura, ao passo que D mostra os mesmos dados depois de desmistura com gestão autofluorescência.
cardíaco embrionário
FCM convencional apresentou uma grande população de células auto-fluorescente (seta preta) que foi excluídos da análise porque fluorescência no CD45 e Ter119 canal de descarga (PE), marcação de células hematopoiéticas. Em contraste, esta população auto-fluorescente não estava presente como tal em FCM espectral e foi compreendido na CD45
Figura 4: Auto-fluorescente células em suspensões de células E17.5 cardíacas estão devidamente incluído na fração celular negativa em Spectral FCM. (A) As suspensões de células de coração fetal, foram corados com anticorpos e sequencialmente adquiridos nos três instrumentos anti-Ter119 e CD45-PE, Sca-1-PECy5, e CD31-APC. setas pretas mostram as células auto-fluorescente em dois convecitómetros ntional, enquanto estas células não são detectados como auto-fluorescente em citometria espectral e pode, assim, ser analisados por coloração fluorescente específico. (B) as células auto-fluorescente (dentro da porta elíptica em verde), mas não de CD31 + células (porta rectangular de controlo azul, negativo), mostrou a expressão de troponina (TNNT2) 7 e fibrilação cadeia leve-2 (MYL7) 8 transcrições. au - unidades arbitrárias em relação ao GAPDH transcrição de manutenção de casa. Dados apresentados como valor médio ± SEM.
| laser de excitação | fluorocromo | especificidade | Clone | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | Iodeto de propídio | Viabilidade | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | Evolve 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / D | purificado | CD16 / CD32 | 2.4G2 | bloco-receptor de Fc |
| Lista de anticorpos usados em cardisuspensão de células ac | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
Tabela 1: Lista de anticorpos utilizados no Painel de 19 cores e em suspensão de células cardíacas.
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Discussion
FCM convencional baseia-se na detecção de fotões emitidos após a excitação de sondas fluorescentes. A emissão de fluorescência de um fluorocromo detectada num detector concebido para medir o sinal de outro fluorocromo induz sobreposição física. Este transbordamento entre os espectros de emissão precisa ser corrigido por compensações.
FCM espectral e o processamento de dados pelo algoritmo de desmistura desconvolução permite a combinação de fluorocromos com picos de emissão estreitos sem compensação adicional, desde que tenham diferentes formas espectrais. O algoritmo utilizado para a análise trata auto-fluorescência como um parâmetro independente, subtraindo a fluorescência não específica a partir de suspensões de células de tecidos sólidos.
Um painel de 19 fluorocromos foi montada para analisar as células imunitárias, utilizando apenas dois lasers (488 nm e 405 nm). Com efeito, quando o laser de 638 nm foi em, uma secção da PMT 32 canais correspondentesao comprimento de onda de excitação deste laser não estava disponível. Para obter a capacidade máxima de detecção da PMT, o laser vermelho foi desligado. as células esplénicas de rato foram analisados, permitindo a detecção de mais do que 12 populações de células diferentes, algumas das quais composta ou menos 1% das células hematopoiéticas.
Para testar a capacidade de FCM espectral para gerir auto-fluorescência, duas situações diferentes que podem prejudicar a análise foram testados: um onde os linfócitos foram contaminadas com células epiteliais, e uma em que foram analisadas células cardíacas auto-fluorescente. Em contraste com FCM convencional, citometria espectral permite a discriminação de todos os subconjuntos de linfócitos, mesmo quando eles representam subconjuntos menores.
A controvérsia em torno da capacidade de regeneração dos cardiomiócitos adultos 9, 10, 11 é, em parte devido à ausência de uma estratégia para disincriminar e isolar subconjuntos distintos de células viáveis no coração. Uma análise multi-paramétrico definindo combinações únicas de marcadores para discriminar os diferentes subconjuntos cardíacas pode permitir a detecção de subconjuntos raros por causa de um grande número de células que podem ser analisados. corações fetais (E17.5) foram analisados, e uma grande fracção de células auto-fluorescentes, o que teria escapado à detecção em FCM convencional, foi integrado no compartimento de células não-hematopoiéticas viável cardíaca em FCM espectral.
Um problema recorrente deste método é a exigência de anticorpos fluorescentes marcados com boa qualidade. Isto é particularmente crítico quando usando corantes em tandem, onde um componente do conjunto é dominante. Por exemplo, BV786 e Cy7-PE pode ser difícil de distinguir de BV421 e PE, respectivamente.
FCM baseado em espectrometria fornece energia analítico mais elevada do que a obtida com FCM convencional, sem a necessidade de compensação matrices. Este manuscrito fornece evidências de que existe uma abordagem alternativa que demonstra uma alta capacidade analítica, a ausência de matrizes de compensação complexos, a discriminação unimpaired de subpopulações de células devido a auto-fluorescência, e há compromissos financeiros adicionais que ainda necessários para a espectrometria de massa FCM. FCM espectral assim, parece ser um método de escolha para a análise de células obtidas a partir de uma ampla variedade de tecidos sólidos normalmente não susceptíveis de FCM convencional e podem ser utilizados em tumoral, desenvolvimento, e biologia das células estaminais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos as contribuições técnicas e teóricas em citometria espectral K. Futamura, que também revisou criticamente o manuscrito. Nós também estamos em dívida com C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira pela leitura crítica do manuscrito e para aconselhamento técnico interminável e apoio. Agradecemos também P. Pereira pelo dom dos anticorpos marcados anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina. Nós aknowledge do Centro d'Enseignements do Instituto Pasteur de boas-vindas e apoiar a logística de filmagem. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Science Foundation e Pasteur Bourse Roux (SS) Swiss National; Fundação para a Ciência e Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, a Agence Nationale de la Recherche (ANR) projeto Twothyme, a ANR, e Programa REVIVE (investimento para o futuro) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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