Summary
Este artículo describe espectral citometría, un nuevo enfoque en la citometría de flujo que utiliza las formas de los espectros de emisión para distinguir fluorocromos. Un algoritmo reemplaza compensaciones y puede tratar autofluorescencia como un parámetro independiente. Este nuevo enfoque permite el análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos.
Abstract
La citometría de flujo se ha utilizado durante los últimos 40 años para definir y analizar el fenotipo de linfoide y otras células hematopoyéticas. Inicialmente restringida al análisis de unos fluorocromos, actualmente hay de diferentes colorantes fluorescentes decenas, y hasta 14-18 colorantes diferentes se pueden combinar a la vez. Sin embargo, varias limitaciones todavía en menoscabo de las capacidades analíticas. Debido a la multiplicidad de sondas fluorescentes, análisis de datos se ha vuelto cada vez más compleja debido a la necesidad de matrices, de compensación multi-paramétricos grandes. Además, los modelos de ratones mutantes que llevan las proteínas fluorescentes para detectar y rastrear tipos específicos de células en diferentes tejidos han estén disponibles, así se requiere el análisis (por citometría de flujo) de las suspensiones celulares de auto-fluorescente obtenidos a partir de órganos sólidos. Espectral citometría de flujo, que distingue las formas de los espectros de emisión a lo largo de una amplia gama de longitudes de onda continuas, aborda algunos de estos problemas. Los datos se analizan wITH un algoritmo que reemplaza matrices de compensación y trata la auto-fluorescencia como un parámetro independiente. Por lo tanto, espectral citometría de flujo debe ser capaz de discriminar fluorocromos con picos de emisión similares y puede proporcionar un análisis multi-paramétrico sin requisitos de compensación.
Este protocolo describe el flujo espectral citometría de análisis, lo que permite un parámetro 21 (19 sondas fluorescentes) caracterización y la gestión de una señal de auto-fluorescente, proporcionando alta resolución en la detección de la población menor. Los resultados presentados aquí muestran que el flujo espectral presenta citometría de ventajas en el análisis de las poblaciones de células a partir de tejidos difíciles de caracterizar en citometría de flujo convencional, tales como el corazón y el intestino. Espectral citometría de flujo por lo tanto demuestra la capacidad de análisis multi-paramétrico de gestión de alto rendimiento citometría de flujo convencional sin el requisito para la compensación y permite auto-fluorescencia.
Introduction
En las últimas décadas, la citometría de flujo (FCM) se convirtió en un método analítico ampliamente disponible esencial para los estudios de fenotipo celular. Ha habido un aumento sustancial en los colorantes fluorescentes disponibles, particularmente fluorocromos excitada por el láser violeta (405 nm) (por ejemplo, violeta brillante y nuevos colorantes Q-punto). Sin embargo, el crecimiento de colorantes fluorescentes disponibles aumenta el riesgo de emisiones superpuestas y requiere matrices de compensación de trabajo intensivo. FCM se hizo ampliamente utilizados para analizar las suspensiones de células a partir de tejido sólido, pero la presencia de células de auto-fluorescente limita la discriminación de las poblaciones marcadas específicamente.
Los principios básicos de la FCM espectral se presentan en detalle en Futamura et al. 1, 2. Brevemente, el FCM espectral utilizado aquí (ver la tabla de materiales) está equipado con 405, 488, y 638 láseres nm. El FCM espectral captura toda la f emitidaluorescence como espectros en un 32-canal de matriz lineal PMT (PMT 32ch) para 500 nm a 800 nm y 2 PMTs independientes para 420 nm a 440 nm y 450 nm a 469 nm, respectivamente, que sustituyen a los filtros de paso de banda convencionales. Los y los puntos de láser 488 405/638 nm están espacialmente separados, mientras que los puntos de láser 405 nm y 638 nm son co-lineal. Para cada partícula individual, las medidas espectrales FCM hasta 66 canales de datos de fluorescencia excitadas por la 405 nm y 488 nm láser. Cuando las células son excitados por el láser 638 nm, la espectral FCM mide 58 canales de datos de fluorescencia debido a una máscara se inserta para evitar que el láser 638 nm penetren en el PMT. Espectral FCM analiza los datos de espectro completo adquiridos con un algoritmo basado en el método de mínimos cuadrados ponderada (WLSM), que permite la separación de la superposición de los espectros de fluorescencia. Spectra derivadas de muestras de un solo teñidas y no teñidas son reconocidos como los espectros de referencia básica. muestras de múltiples manchas son matemáticamente dotados de unand sin mezclar, y el espectro de una muestra con marcadores fluorescentes mixtos se descompone en una colección de sus espectros de constituyente. La desmezcla, en la tecnología espectral 3, 4, sustituyendo la compensación que elimina la señal de todos los detectores excepto la medición de un colorante dado.
En este estudio, se combinaron y probamos 19 fluorocromos en una sola 21-parámetro de análisis, que caracteriza las principales subconjuntos hematopoyéticas se encuentran en el bazo de ratón. Además, hemos demostrado que la citometría espectral puede gestionar señal de auto-fluorescente, mejorando así la caracterización de linfocitos intra-epiteliales intestinales y del corazón embrionario. De hecho, en estos tejidos, la gestión de auto-fluorescencia permitió la asignación de la fluorescencia específica de las células que se excluyó del análisis en FCM convencional.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Instituto Pasteur Carta ética y las directrices de la CEE y fueron aprobados por el Ministerio de Agricultura de Francia.
1. Cell Suspension Preparación a partir de ratón adulto Órganos
- Aislamiento de esplenocitos
- La eutanasia a los ratones adultos por dislocación cervical. Hacer una incisión en la línea media del abdomen y abrir la piel con unas tijeras. Se recoge el bazo con fórceps.
- Crush el bazo entre 2 microscopio de vidrio se desliza para disociar las células y diluirlas en 5 ml de solución Salado equilibrada de Hank (HBSS) que contenía suero de ternera fetal al 1% (FCS).
- Centrifugar durante 10 min a 120 xg y 4 ° C. Descartar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 5 ml de HBSS 1% de FCS. Contar las células con una cámara de Neubauer utilizando un colorante vital azul de tripano.
NOTA: 80 millones de células se debe obtener de un bazo adulto.
- isolatien las células del intestino delgado
- La eutanasia a los ratones adultos por dislocación cervical. Con unas tijeras, hacer una incisión en la piel en la línea media del abdomen. Agarre el intestino delgado con unas pinzas en una mano y usar las tijeras para cortar en ambos extremos: en primer lugar, justo después del estómago y luego, al final del intestino delgado, justo antes del intestino grueso. Enjuague el intestino delgado con de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) usando una jeringa de 2 ml con una aguja.
- Ponga el intestino delgado en una toalla de papel y retire con cuidado las placas de Peyer con un par de tijeras afiladas.
- Use las tijeras para abrir el intestino en su lado largo mediante la inserción de una rama de la tijera en el interior del intestino. Cortar el intestino abierto en trozos de 1 cm con unas tijeras afiladas.
- Incubar durante 30 min a 37 ° C bajo agitación constante en 30 ml de HBSS con 10% de FCS.
- Coloque la suspensión celular con los restantes fragmentos no disociado en un 50 mltubo de plástico y agitar durante 5 min a alta velocidad. NOTA: No hay aún más la disociación del tejido.
- Incubar durante 10 minutos en hielo para permitir que los fragmentos grandes, de no disociado para sedimentar.
- Recoger el sobrenadante y se concentra por centrifugación durante 7 minutos a 120 x g.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de HBSS con 1% de FCS. Contar las células con una cámara de Neubauer utilizando un colorante vital azul de tripano.
NOTA: ~ 60 millones de células intra-epitelial (IELS) deben obtenerse a partir de un adulto intestino delgado.
- Estrategia de diseño Panel
- Preparar los paneles con anticuerpos acoplados directamente con fluorocromos.
NOTA: Todos los anticuerpos se titulan previamente para obtener la definición óptima de las poblaciones de células (la titulación puede variar con el lote de anticuerpo). Los anticuerpos utilizados en el panel 19 color para teñir esplenocitos se enumeran en la Tabla 1. - Construir multi-colopaneles R para citometría. Ya que esto puede ser una tarea difícil, utilice las siguientes directrices para optimizar los paneles:
- Compruebe la configuración espectral y los colorantes fluorescentes que pueden ser utilizados en el instrumento.
- Utilice la información de brillo / Índice Índice de tinción proporcionado por el fabricante.
NOTA: El / La tinción Índice Índice de Brillo es el indicador relativo de la intensidad de fluorescencia frente de fondo para cada fluorocromo. - Elija los anticuerpos siguientes las reglas siguientes:
- Elija los fluorocromos más brillantes para las proteínas que se expresan débilmente y los fluorocromos más débiles para las proteínas más altamente expresados.
NOTA: Por ejemplo, CD45, CD4, y CD8 están altamente expresados y se pueden utilizar con fluorocromos tenues. - Empezar a diseñar el panel eligiendo primero los anticuerpos con las posibilidades de tinte fluorescente menor cantidad.
- Si es posible, elegir los colorantes fluorescentes con la superposición más pequeño de espectros de emisión fo marcadores expresados en los mismos tipos de células.
NOTA: Tandems (por ejemplo, PE-Cy5, PE-Cy7, y PerCP-Cy5.5) se debe utilizar con precaución, ya que son más susceptibles a la degradación por exposición a la luz.
- Elija los fluorocromos más brillantes para las proteínas que se expresan débilmente y los fluorocromos más débiles para las proteínas más altamente expresados.
- Preparar los paneles con anticuerpos acoplados directamente con fluorocromos.
- La tinción de las células para el análisis de citometría de
- Preparar un 5 tubo ml con 1 x 10 6 esplenocitos y un 5 tubo ml con 1 x 10 6 células intestinales y mantenerlos sin teñir para su uso como controles negativos.
- Preparar y etiquetar un 5 tubo ml por muestra y por panel de acuerdo con la Tabla 1. Preparar la mezcla de anticuerpos, de acuerdo con la Tabla 1, en HBSS 1% de FCS.
- De transferencia 1 x 10 6 células - ya sea esplenocitos o células intestinales - en cada tubo de 5 ml. Añadir 2 ml de HBSS 1% de FCS y se centrifuga durante 5 min a 4 ° C y 120 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 l de mezcla de anticuerpos.
- Etiquetar los splenocytes en 2 pasos. En primer lugar, utilizar 50 l de la mezcla que contiene los anticuerpos marcados con PE-Cianina 5, PerCP-Cianina 5.5, y PerCP (con el bloqueo del receptor de Fc) en un tubo de 5 ml. Después de 20 min de incubación en la oscuridad a 4 ° C, se añaden 50 l de la mezcla que contiene todos los otros anticuerpos a un tubo de 5 ml.
NOTA: Esta estrategia limita el impedimento estérico. - Incubar durante 20 min en la oscuridad a 4 ° C.
- Añadir 2 ml de HBSS 1% de FCS y se centrifuga durante 5 min a 4 ° C y 120 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l de HBSS 1% de FCS con 0,5 g / ml de yoduro de propidio (PI).
2. Preparación de Single-tinción para cada fluorocromo en comerciales de compensación del grano de microesferas (por ejemplo, Ultracomp eBeads), denominado en lo sucesivo Beads
- Preparar y etiquetar como muchos 5 tubos mL como el número de anticuerpos que se utilizan en los paneles. Colocar 1 gota de cuentas en cada tubo y añadir 1 y #181; L de anticuerpo por tubo.
NOTA: Las cuentas utilizadas aquí (véase la tabla de materiales) contienen manchada (positivo) y perlas no teñidas (negativos). Los anticuerpos se ponen en exceso sobre las perlas para asegurar una señal brillante y por lo tanto una firma espectral clara para cada colorante. Esto es requerido por el software para poder hacer una desmezcla precisa. - Incubar durante 20 min en la oscuridad a 4 ° C.
- Añadir 2 ml de HBSS 1% de FCS y se centrifuga durante 5 min a 120 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 100 l de HBSS 1% de FCS.
3. Suspensión de la Celda Preparación a partir de embriones de ratón de los corazones
- Las disecciones de embriones
- Plan para obtener hembras temporizada embarazadas de antelación en el apareamiento 2 hembras con un macho (siempre en la jaula del macho) al final del día (entre 17 y 19 h). A la mañana siguiente, las hembras con tapones vaginales se considera que está en 0,5 días post-coito.
- La eutanasia a la femal embarazada E17.5es por dislocación cervical. Asegúrese de que el animal no responde presionando firmemente en la pata del ratón (toe-pinch reflex). Mojar el abdomen con etanol al 70% para esterilizar y para evitar la propagación de la piel de ratón.
- Hacer una incisión en la piel en el medio de las tijeras que utilizan abdomen y tire de la piel con los dedos separados.
- Abra la cavidad abdominal tirando y haciendo incisiones en el músculo abdominal desde el centro hacia los dos lados del abdomen usando fórceps brutos y tijeras.
NOTA: Tenga cuidado de no dañar el intestino delgado, que se encuentra inmediatamente debajo del músculo peritoneal. - Recoger los cuernos uterinos (con los embriones) cortando tanto en el nivel del cuerpo del útero y de los ovarios. Remojar en un plato de 90 x 15 mm 2 Petri con 50 ml de DPBS.
- Aislar cada embrión mediante el corte entre cada decidua, seguido de la pared muscular útero y el saco vitelino visceral con unas pinzas finas y tijeras. Tire de la int embrionesacto. Por último, cortar el cordón umbilical.
- Cortar las cabezas de los embriones E17.5 con unas tijeras (decapitación) antes de comenzar la disección.
- Colección de corazones
- Remojar los embriones decapitados en una placa de 90 x 15 mm 2 Petri que contiene una ropa de cama de toalla de papel húmeda en el fondo del plato y 50 ml de HBSS con 1% de FCS.
- Bajo un microscopio estereoscópico, mantenga cada embrión con fórceps brutos manera que el lado ventral hacia arriba.
- Abra cuidadosamente la red dorsal cortando el lado derecho del pecho con unas tijeras con el fin de evitar daños en el corazón.
- Exponer el corazón mediante la celebración de la caja torácica con el fórceps brutos.
- Separar el corazón (todavía ensamblado con pulmones y timo) manteniendo los grandes vasos (que contiene los grandes vasos de dentro y fuera del flujo del corazón) y colocarlos en un x 15 placa de 35 mm 2 Petri con 2 ml de HBSS 1% con FCS.
- Aislar los corazones de los órganos circundantes ytejido conectivo con unas pinzas finas y un bisturí.
- Lavar los corazones en un nuevo 35 x 15 mm placa de Petri con 2 ml de HBSS 1% de FCS y mantenerlos en hielo durante 20 min para permitir que el corazón para bombear la sangre dentro de las cámaras.
- Preparación de suspensiones de células del corazón
- Pre-calentar la 200 mg / ml de colagenasa en HBSS + / + (en adelante como solución enzimática) a 37 ° C.
NOTA: Se diluye la colagenasa en HBSS + / + (con Ca 2 + y 2 + cationes Mg) para maximizar la actividad de la enzima; actividad de la colagenasa es estable entre lotes. - Reemplazar la solución de lavado remojo de los corazones (HBSS 1% de FCS) con 1 ml de solución enzimática pre-calentado.
- Bajo un microscopio estereoscópico, picar los corazones en 1-mm 3 piezas utilizando unas pinzas finas y un bisturí. Añadir otro 1 ml de solución enzimática pre-calentado y transferir el tejido picado a un tubo de 5 ml con una tapa.
NOTA: Para una digestión óptima, coloque unamáximo de 5 E17.5 corazones por 2 ml de solución enzimática. Si más corazones se digieren, al mismo tiempo, ellos dividido en diferentes tubos de 5 ml. - Incubar los corazones picados durante 15 min a 37 ° C.
NOTA: Establecer las 5 tubos ml (correctamente cerradas) en la incubadora para extender el tejido a lo largo de la solución.- Al final de la incubación, homogeneizar el tejido en la misma solución enzimática pipeteando arriba y abajo aproximadamente 20 veces con la pipeta P1000. Poner el tubo de 5 ml en la posición vertical y dejar que el sedimento fragmento de tejido restante (aproximadamente 3 min).
- Recoger el sobrenadante (que contiene las células digeridas en suspensión) en un tubo de 50 ml, añadir 2 ml de HBSS 10% de FCS (el mismo volumen que el volumen de solución enzimática añadido a los fragmentos de tejido), y mantenerlos en hielo mientras se continúa la proceso de la digestión.
NOTA: El 10% de solución de FCS HBSS y el hielo son importantes para inactivar la acción de la enzima mientras que el tejido restante esdigestión. - Añadir 2 ml de solución enzimática pre-calentado a los tubos de 5 ml con los fragmentos de tejido restantes y continuar la digestión repitiendo el paso 3.3.4 hasta que no se observa más tejido.
NOTA: Alrededor de 4 ciclos de digestión son suficientes para disociar completamente el tejido del corazón (5 E17.5 corazones en 2 ml de solución enzimática).
- Centrifugar los tubos de 50 ml con células en suspensión durante 10 min a 300 xg y descartar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento de células, añadir 1 ml de HBSS - / - 1% de FCS, y se filtra la suspensión celular a través de una malla de nylon 70 m. Contar las células con una cámara de Neubauer utilizando un colorante vital azul de tripano.
NOTA: resuspender las células con HBSS - / - la agregación de células (sin Ca2 + y Mg2 + cationes) para reducir al mínimo. Entre 800.000 y 1.000.000 células se obtienen de un corazón E17.5.
- Pre-calentar la 200 mg / ml de colagenasa en HBSS + / + (en adelante como solución enzimática) a 37 ° C.
- Tinción de las células cardíacas con anticuerpos fluorescentes
NOTA: Todos los AntibodIES se titulan previamente para obtener óptima definición de las poblaciones de células (la titulación puede variar con el lote de anticuerpo) .Los anticuerpos utilizados en el panel de corazón se enumeran en la Tabla 1.- Distribuir las células cardíacas en suspensión a través de una placa de 96 pocillos (fondo redondo). Distribuirlos uniformemente a través de todos los pocillos necesarios (200 l por pocillo), a corto giro centrifugar la placa de 96 pocillos durante 1 min a 480 xg, y descartar el sobrenadante.
NOTA: Todos los pocillos de la placa de 96 pocillos (de fondo redondo) se puede utilizar. - Resuspender el precipitado y se incuban las células cardíacas para 20 min en la oscuridad a 4 ° C con 100 l de la mezcla de anticuerpos (es decir, CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647, y Sca-1-PE-Cyanine5 ) diluido en HBSS - / - 1% de FCS.
- Se lavan las células cardíacas desde el exceso de anticuerpos mediante la adición de 200 l de HBSS - / - 1% de FCS y corto-spin centrifugación de las células durante 1 min a 480 x g.
- Descartar el sobrenadante y repetirla centrifugación a corto giro (paso 3.4.3).
- Resuspender las células en 200 l de HBSS - / - 1% de FCS y transferirlos a un tubo de 5 ml que ya contiene 200 l de HBSS - / - 1% de FCS.
- Antes de la adquisición, añadir 400 l de HBSS - / - 1% de FCS con 0,5 g / ml PI y filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon 70 m.
- Distribuir las células cardíacas en suspensión a través de una placa de 96 pocillos (fondo redondo). Distribuirlos uniformemente a través de todos los pocillos necesarios (200 l por pocillo), a corto giro centrifugar la placa de 96 pocillos durante 1 min a 480 xg, y descartar el sobrenadante.
4. Adquisición de Etiquetada células esplénicas, intestinal y cardíaca con el citómetro de flujo espectral
- Antes de la adquisición de los datos, calibrar automáticamente el citómetro espectral siguiendo las instrucciones del fabricante. Realizar el control de los procedimientos mensuales de calidad todos los días y cada día del experimento.
- Cuando el citómetro está listo, iniciar la vista previa de las muestras que contenían las suspensiones de células marcadas con todos los anticuerpos.
NOTA: No adquirir. - Asegúrese de que todos los láseres son en si es necesario. Ajustar la ganancia de FSC de tal manera que todas las células son visibles en la respectivaparcelas. Puerta de la población de células y aplicar esta puerta a las dos parcelas espectrales correspondientes a la 488-nm y a los láseres de 638/405 nm.
NOTA: Cuando fluorocromos son excitados por el láser 638-nm (es decir, cuando el láser 638-nm está encendido), hay una máscara que protectores de luz de 617-662 nm para evitar que el láser 638 nm penetren en el PMT. Esto induce la pérdida de una parte del espectro y por lo tanto provoca una separación inferior de cierre colorantes que emiten en estas longitudes de onda. Sin embargo, toda la señal puede ser recogido mediante la desconexión del láser 638-nm si no se requiere para la adquisición. - Ajuste el fotomultiplicador 32 canales (PMT) de voltaje (%) de tal manera que todos los fluorocromos están dentro del rango de la intensidad se muestra en el eje y (1-10 6) en las dos parcelas espectrales diferentes se presentan 488 nm y 405/638 excitaciones nm.
La formación es necesaria para reconocer los espectros de todos los fluorocromos utilizados: NOTA. - Comenzar a adquirir las muestras. Haga clic en "; Vista previa" para visualizar las células en la pantalla y luego haga clic en 'Adquirir' para grabar una muestra Ahorra hasta 2 x 10 6 eventos de cada muestra..
- Después de la adquisición de las muestras teñidas, adquirir la muestra teñida con el colorante vital y, a continuación las perlas de compensación manchados individualmente con todos los anticuerpos utilizados. Haga clic en “Vista previa” para visualizar las células en la pantalla y luego en “Adquirir” para registrar las muestras.
NOTA: Mantenga el mismo voltaje PMT para todas las muestras y controles (es decir, perlas y las muestras no teñidas); 5.000 eventos son ampliamente suficientes. - Finalmente, adquirir los datos de las suspensiones de células no teñidas. Haga clic en "Vista previa" para visualizar las células en la pantalla y luego en "Adquirir" para registrar las muestras.
NOTA: La adquisición de las muestras no teñidas en el final del experimento minimiza el arrastre de células fluorescentes. - Limpiar el citómetro siguiendo las instrucciones del fabricante de unad Cierre el experimento en la carpeta de adquisición.
NOTA: Sólo después de cerrar el experimento va a ser guardado y disponible para el análisis.
5. Análisis de los datos con el software FCM espectral
- En la ventana de "paleta de colores" de la pestaña "Análisis", registrar todos los parámetros presentes en el panel mediante la adición de cada fluorocromo utilizado y el marcador correspondiente (seleccionar de la lista disponible o agregar un nuevo parámetro). También, incluya los parámetros de autofluorescencia y viabilidad; todos los parámetros seleccionados aparecerán en la ventana "desmezcla".
- Seleccione la primera muestra teñida única (hecho con cuentas de compensación) en la ventana "Control" en la "Lista de tubo" de este experimento en la pestaña “Análisis”. En la hoja de cálculo, haga clic en la "herramienta de diseño polígono" y diseñar una puerta en la población de bolas en la trama FSC / SSC. Haga doble clic en la parte superior de la puerta para abrir un diagrama espectral o de puntopara visualizar las cuentas bloqueadas en una parcela hija.
- Diseño de una sola puerta para el positivo y una puerta para las perlas negativas ya sea en el espectro o en el gráfico de puntos. Verificar todo el espectro correspondiente a los dos conjuntos de láser para cada fracción positiva y negativa y eliminar valores atípicos por gating y haciendo clic en la puerta para verificar la población hija sucesivamente. Entrar en las puertas negativos y positivos en la ventana "desmezcla".
- Repita el paso 5.2 para cada muestra manchada sola.
NOTA: Tenga en cuenta que la estrategia de compuerta positivo y negativo corresponde a la muestra que se está analizando, aunque el programa permite que sea colocado en cualquier muestra. En lugar de determinar una fracción negativa para cada muestra manchada sola, utilice una muestra de perlas sin teñir para establecer un negativo universal.
- Seleccionar la muestra de células sin teñir en la "Lista Tube" y puertas de diseño para autofluorescent y para células no autofluorescentes. <li> Cuando todas las puertas negativos y positivos para todos los parámetros, incluida la autofluorescencia y viabilidad, se seleccionan en la ventana "desmezcla", haga clic en "Calcular". Aplicar la desmezcla de las muestras a analizar.
- Analizar los datos mediante el diseño de puertas y la creación de parcelas de dos parámetros.
- En primer lugar, el diseño de una puerta para SSC frente a FSC y luego eliminar las células muertas mediante la exclusión de todas las células marcadas con el marcador de viabilidad (PI frente a CD45). En el resto de las células, puertas de diseño para todas las poblaciones de interés siguiendo la estrategia descrita para cada suspensión de células (Figuras 1-3).
NOTA: Si es necesario, ajustar la compensación en el "ajustador del espectro de referencia." Esta es una herramienta que se puede utilizar después de desmezcla para volver a ajustar la mediana de las poblaciones positivas para cada fluorocromo si el algoritmo no podía hacerlo perfectamente.
- En primer lugar, el diseño de una puerta para SSC frente a FSC y luego eliminar las células muertas mediante la exclusión de todas las células marcadas con el marcador de viabilidad (PI frente a CD45). En el resto de las células, puertas de diseño para todas las poblaciones de interés siguiendo la estrategia descrita para cada suspensión de células (Figuras 1-3).
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Representative Results
21-parámetro panel de FCM espectral para analizar esplenocitos
La Figura 1 muestra los resultados obtenidos con el panel 19 fluorescente-anticuerpo aplicado a células esplénicas que comprenden diferentes anticuerpos que reconocen subconjuntos de T, B, NK, dendríticas, y células mieloides, mientras que CD45 etiquetas de todas las células nucleadas hematopoyéticas. El panel también incluye un colorante de viabilidad (PI), así como los parámetros del tamaño (FSC) y la granularidad (SSC). La Figura 1A muestra los espectros de fluorocromo de referencia. Después de la eliminación de células muertas en el CD45 + puerta (Figura 1B), el análisis muestra que las células T CD3 + expresar la cadena TCR y tienen la distribución esperada CD4 / CD8 y la proporción de células CD25 + en las células T CD4. células T CD8 muestran una distribución normal de CD44- y células Ly49D expresan. Células CD19 + B co-expresar una B220d MHCII, así como IgM e IgD, típico de las células B esplénicas maduros. Un subconjunto de células NK1.1 + NK representa un pequeño subconjunto de los linfocitos esplénicos que co-expresan Ly49D. Las células restantes comprenden un pequeño subconjunto de células CD11c + dendríticas con altos niveles de MHC II, algunos de los cuales también eran CD11b +. F4 / 80 + células característica de los macrófagos del tejido residente co-expresan CD11b y los más altos niveles de CD44 se encuentran en el bazo. Las células restantes (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) podrían ser subdivididos por la expresión de CD11b y Gr1, donde el pequeño subconjunto de células doble positivas también expresan altos niveles de CD44, probablemente correspondiente a progenitores sabe que está presente en las frecuencias bajas en el bazo. Una fracción grande fue negativo para los tres marcadores. La figura 2 muestra el mismo análisis antes de ajustar la compensación.
Figura 1: Un panel de anticuerpos 19-color para el Análisis de células murinas de bazo. Esplenocitos (A) de ratón se tiñeron con la combinación de anticuerpo anterior, a la que evolucionan-CD45 se añadió 655. se muestran los espectros de referencia de todos los fluorocromos. CD45 marcado con fluoróforo está marcada por una flecha roja. Los fluorocromos se enumeran en la Tabla 1. (B) Las gráficas de contorno muestran la capacidad de discriminación de este análisis multi-paramétrico para separar las diferentes poblaciones de B, T, células NK, dendríticas, o mieloides. El análisis se realiza en el software FCM convencional después de desmezcla de deconvolución.
Figura 2: Un panel de anticuerpos 19-color para el Análisis de células murinas de bazo. El mismo análisis como en la Figura 1 se realizó antes de la adjustment de la compensación con el ajustador de espectros de referencia.
linfocitos intraepiteliales Intestino delgado
Varias poblaciones de células T se encuentran en el intestino dentro de la capa de células epiteliales de 5, 6. aislamiento convencional de estos subconjuntos incluye un gradiente de densidad que separa los linfocitos de las células epiteliales. Sin embargo, esta preparación es delicado, requiere mucho tiempo y resulta en la pérdida de células. Para mejorar la cuantificación y para facilitar el procedimiento experimental, se puso a prueba el potencial de las espectral FCM para discriminar poblaciones de linfocitos intestinales dentro de una gran fracción de células epiteliales. Después de la rotura mecánica del tejido epitelial, suspensiones de células se tiñeron con anticuerpos que etiquetan subconjuntos de αβ y delta gamma células T que normalmente se encuentran en el epitelio intestinal. loslas células se analizaron en dos citómetros convencionales y en FCM espectral.
La Figura 3 muestra los resultados después de seguir una estrategia gating similar, con la eliminación de las células muertas de activación periódica en las células PI-negativas. La presencia de células de auto-fluorescente es evidente en todos los citómetros convencionales y en citometría espectral cuando el gestor de auto-fluorescencia se inactiva (paneles superiores, flechas rojas), resultando en una pobre discriminación de las células vivas. En todas las parcelas, las células dentro de la FSC-A / SSC-A puerta de linfocitos se muestran en azul y las células con dispersa más grandes (de compuerta de células epiteliales) se muestran en rojo. Ambos instrumentos convencionales eran incapaces de resolver el subconjunto de células T CD3 + (en azul) (turquesa flecha) de las células restantes. Por lo tanto, TCR - células (flecha verde) contaminado el CD3 + TcRγδ - población, un subconjunto biológicamente improbable no detectado después de la separatien de los linfocitos de las células epiteliales. En contraste, en espectral FCM después de gestión auto-fluorescencia, el análisis de los diferentes subconjuntos de células T no fue afectada por la presencia de células epiteliales, las poblaciones fueron bien separados, y no hubo células TcR-negativos en el CD3 + portón.
Figura 3: La presencia de células Auto-fluorescentes no perjudica la detección de linfocitos intraepiteliales en espectral FCM. células intestinales pequeñas, incluyendo las células epiteliales y linfocitos, se tiñeron con anticuerpos que reconocen TcRδ, PI, TCR Cy7-APC CD3 (paneles B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (paneles C), y CD8 FITC (paneles D). PI se añadió en el tampón FACS antes del análisis. La adquisición de los datos se realiza de forma secuencial en los tres instrumentos después de que el control de calidad apropiado. Dobletes fueron Eliminated en FSC-H / FSC-W. El análisis se realiza en el software FCM convencional. Gráficas muestran los diferentes pasos de la estrategia de compuerta. Las células dentro de la FSC-A / SSC-A puerta de linfocitos se marcan en azul, mientras que las células dentro de la puerta de las células epiteliales intestinal están etiquetados en rojo. Las flechas apuntan a diferentes distorsiones de población y auto-fluorescencia. Parcelas en C muestran el análisis de los datos obtenidos en FCM espectral sin gestión de autofluorescencia en la desmezcla, mientras que D muestra los mismos datos después de desmezcla con la gestión de la autofluorescencia.
corazón embrionario
Convencional FCM mostró una población importante de células auto-fluorescente (flecha negro) que se excluyó del análisis porque fluoresced en el CD45 y TER119 canal volcado (PE), marcando las células hematopoyéticas. En contraste, esta población auto-fluorescente no estaba presente como tal en FCM espectral y estaba compuesta en el CD45
Figura 4: auto-fluorescente Las células en E17.5 cardiacos suspensiones de células están correctamente incluidos en la fracción celular negativa en espectral FCM. (A) Las suspensiones celulares de los corazones fetales se tiñeron con anticuerpos y secuencialmente adquiridas en los tres instrumentos anti-TER119 y CD45-PE, Sca-1-PECy5, y CD31-APC. Las flechas negras muestran células auto-fluorescente en los dos convecitómetros Ntional, mientras que estas células no son detectados como auto-fluorescente en citometría espectral y por lo tanto se pueden analizar para la tinción fluorescente específica. (B) células auto-fluorescente (dentro de la puerta elíptica en verde), pero no CD31 + células (puerta rectangular en azul control, negativo), mostraron la expresión de troponina cardíaca (TNNT2) 7 y fibrilación luz de la cadena-2 (MYL7) 8 transcripciones. au - unidades arbitrarias en relación con la casa de mantenimiento de GAPDH transcripción. Los datos presentados como el valor medio ± SEM.
| láser de excitación | fluorocromo | especificidad | Clon | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | EDUCACIÓN FÍSICA | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | Yoduro de propidio | Viabilidad | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | evolucionan 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | purificada | CD16 / CD32 | 2.4G2 | bloque receptor Fc |
| Lista de los anticuerpos utilizados en cardisuspensión de células ac | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | EDUCACIÓN FÍSICA | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | EDUCACIÓN FÍSICA | Ter119 | TER-119 | |
Tabla 1: Lista de los anticuerpos usados en el Panel de 19 color y en Cardiaca suspensión celular.
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Discussion
FCM convencional se basa en la detección de fotones emitidos después de la excitación de las sondas fluorescentes. La emisión de fluorescencia de uno fluorocromo detectado en un detector diseñado para medir la señal de otro fluorocromo induce solapamiento físico. Este desbordamiento entre los espectros de emisión debe ser corregido por compensaciones.
FCM espectral y de procesamiento de datos por el algoritmo de desmezcla deconvolución permite la combinación de fluorocromos con picos de emisión estrechos sin compensación adicional, siempre que tengan diferentes formas espectrales. El algoritmo utilizado para el análisis trata a auto-fluorescencia como un parámetro independiente, restando la fluorescencia no específica de suspensiones de células de tejido sólido.
Un panel de 19 fluorocromos fue montado para analizar las células inmunes utilizando sólo dos láseres (488 nm y 405 nm). De hecho, cuando el láser 638 nm estaba en, una sección de la PMT de 32 de canal correspondientesa la longitud de onda de excitación de este láser no estaba disponible. Para obtener la máxima capacidad de detección del PMT, el láser rojo se apagó. se analizaron las células esplénicas de ratón, lo que permite la detección de más de 12 poblaciones de células diferentes, algunas de las cuales comprendía 1% o menos de las células hematopoyéticas.
Para probar la capacidad de las espectral FCM para gestionar auto-fluorescencia, se probaron dos situaciones diferentes que pueden afectar el análisis: uno donde los linfocitos estaban contaminados con células epiteliales, y uno que se analizaron las células cardíacas auto-fluorescente. En contraste con la FCM convencional, citometría espectral permite la discriminación de todos los subconjuntos de linfocitos, aun cuando representan subconjuntos de menor importancia.
La controversia en torno a la capacidad de regeneración de cardiomiocitos adultos 9, 10, 11 se debe en parte a la ausencia de una estrategia para discriminate y aislar distintos subconjuntos de células viables en el corazón. Un análisis multi-paramétrico definir combinaciones únicas de marcadores para discriminar los diferentes subconjuntos cardíacos podría permitir la detección de subconjuntos raras a causa de un gran número de células que pueden ser analizados. Se analizaron los corazones fetales (E17.5), y una gran fracción de células auto-fluorescente, lo que habría escapado a la detección en FCM convencional, se integró en el compartimiento de célula cardíaca viable no hematopoyético en espectral FCM.
Un problema recurrente de este método es la necesidad de anticuerpos marcados fluorescentes de buena calidad. Esto es particularmente crítico cuando se utilizan colorantes en tándem, donde un componente del tándem es dominante. Por ejemplo, BV786 y Cy7-PE pueden ser difíciles de distinguir de BV421 y PE, respectivamente.
FCM basado en espectrometría proporciona poder analítico mayor que la obtenida con FCM convencional, sin la necesidad de compensación matrices. Este manuscrito proporciona evidencia de que hay un enfoque alternativo que demuestra una alta capacidad analítica, la ausencia de matrices de compensación complejas, la discriminación irreprochable de subconjuntos de células debido a la auto-fluorescencia, y no hay compromisos financieros adicionales que aún requieren para FCM espectrometría de masas. así espectral FCM parece ser un método de elección para el análisis de células obtenidas a partir de una amplia variedad de tejidos sólidos generalmente no susceptibles de FCM convencional y pueden ser utilizados en el tumor, de desarrollo y biología de células madre.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos las contribuciones técnicas y teóricas en citometría espectral de K. Futamura, que también revisión crítica del manuscrito. También estamos en deuda con C-Ait Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, y P. Pereira para la lectura crítica del manuscrito y de asesoramiento técnico y el apoyo sin fin. Agradecemos también a P. Pereira por el don de las Vγ7-APC y Vδ4-Biotina anticuerpos anti etiquetados. Nos aknowledge el Centre d'Enseignements del Instituto Pasteur de la acogida y el apoyo a la logística de filmación. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); la Fundación Ciencia y Pasteur Bolsa Roux (SS) Nacional de Suiza; Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); y la Université Paris Diderot, la Agencia Nacional de la Investigación (ANR) Twothyme proyecto, la ANR, y el Programa REVIVE (Inversión para el Futuro) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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