Summary
Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.
Abstract
Flowcytometrie is gebruikt voor de afgelopen 40 jaar te definiëren en analyseren van het fenotype van lymfe en andere hematopoietische cellen. Aanvankelijk beperkt tot de analyse van enkele fluorochromen, momenteel zijn er tientallen verschillende fluorescente kleurstoffen en tot 14-18 verschillende kleurstoffen kunnen worden gecombineerd tegelijk. Echter, een aantal beperkingen belemmeren nog steeds de analytische mogelijkheden. Door de veelheid van fluorescerende probes is gegevensanalyse steeds complexer geworden vanwege de noodzaak van grote multi-parametrische compensatie matrices. Bovendien hebben mutante muismodellen uitvoering fluorescerende eiwitten op te sporen en sporen specifieke celtypen in verschillende weefsels beschikbaar komen, zodat de analyse (met flowcytometrie) van auto-fluorescentie celsuspensies verkregen vaste organen nodig. Spectraal flowcytometrie, die het vormen van emissiespectra onderscheidt langs een groot aantal continue golflengten, wordt een aantal van deze problemen. De gegevens worden geanalyseerd wMet een algoritme dat compensatiematrices vervangt en automatisch fluorescentie behandelt als een onafhankelijke parameter. Derhalve zou spectrale stromingscytometrie in staat zijn om fluorkromen te onderscheiden met vergelijkbare emissietoppen en kan een multi-parametrische analyse bieden zonder compensatievereisten.
Dit protocol beschrijft de spectrale flowcytometrie analyse, waardoor een 21-parameter (19 fluorescerende probes) karakterisering en het beheer van een auto-fluorescerend signaal, die hoge resolutie bieden bij kleine populatie detectie. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat spectraal stromingscytometrie voordelen biedt in de analyse van celpopulaties uit weefsels die moeilijk zijn om te karakteriseren in conventionele stromingscytometrie, zoals het hart en de darm. Spectrale stromingscytometrie demonstreert aldus de multi-parametrische analytische capaciteit van conventionele stromingscytometrie met hoge prestaties zonder de vereiste compensatie en maakt het mogelijk om fluorescentie te beheersen.
Introduction
In de afgelopen decennia, flowcytometrie (FCM) werd op grote schaal beschikbaar analytische methode van essentieel belang voor mobiele phenotyping studies. Er is een aanzienlijke verhoging van de beschikbare fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen bijzonder aangeslagen door de violette laser (405 nm) (bijvoorbeeld Brilliant Violet en nieuwe Q-dot kleurstoffen) zijn. Echter, de groei van de beschikbare fluorescerende kleurstoffen verhoogt het risico van overlappende emissies en vergt arbeidsintensieve compensatie matrices. FCM werd op grote schaal gebruikt om celsuspensies van vast weefsel te analyseren, maar de aanwezigheid van auto-fluorescerende cellen beperkt de discriminatie van specifiek gelabeld populaties.
De basisprincipes van spectrale FCM worden in detail Futamura et al. 1, 2. In het kort wordt de spectrale FCM hier gebruikt (zie de tabel van materialen) voorzien van 405, 488 en 638 nm lasers. De spectrale FCM vangt de uitgezonden fluorescence spectra als een 32-kanaals lineaire reeks PMT (32ch PMT) van 500 nm tot 800 nm en 2 onafhankelijke PMT van 420 nm tot 440 nm en 450 nm tot 469 nm, respectievelijk, die de gebruikelijke bandfilters vervangen. De 488 en 405/638 nm laserspots ruimtelijk gescheiden, terwijl de 405 nm en 638 nm laserspots co-lineair. Voor elk individueel deeltje, de spectrale FCM meet tot 66 kanalen van fluorescentie data opgewekt door de 405 nm en 488 nm lasers. Wanneer cellen worden geëxciteerd door de 638 nm laser, spectrale FCM van 58 kanalen van fluorescentie gegevens omdat een masker wordt geplaatst om te voorkomen dat de 638 nm laser schijnen in de PMT. Spectrale FCM analyseert het volledige spectrum verkregen data met een algoritme op basis van de gewogen kleinste kwadraten methode (WLSM), waarbij de scheiding van overlappende fluorescentiespectra mogelijk maakt. Spectra verkregen uit één gekleurde en ongekleurde monsters worden als de basis referentiespectra. Multi-gekleurd monsters mathematisch aangebracht eennd onvermengd, en het spectrum van een monster met gemengde fluorescerende labels wordt ontleed in een verzameling van de samenstellende spectra. De ontmenging, spectrale techniek 3, 4, vervangt de vergoeding die het signaal van alle detectoren behalve het meten van een bepaalde kleurstof verwijderd.
In deze studie hebben we gecombineerd en getest 19 fluorochromen in één 21-parameteranalyse dat het grootste hematopoietische subsets in de muis milt kenmerk. Daarnaast hebben we aangetoond dat de spectrale cytometrie auto-fluorescerende signaal kan beheren, waardoor de karakterisering van intestinale intra-epitheliale lymfocyten en van het embryonale hart te verbeteren. Inderdaad, in deze weefsels, auto-fluorescentie beheer toegestaan voor de toewijzing van specifieke fluorescentie om cellen die uit de analyse in conventionele FCM zouden worden uitgesloten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens het Ethische Handvest van het Pasteur Instituut en de EU-richtlijnen en werden goedgekeurd door het Franse ministerie van Landbouw.
1. Cell Suspension Preparatie van volwassen muisorganen
- Isolatie van splenocyten
- Euthanize volwassen muizen door cervicale dislocatie. Maak een incisie op de buik van de buik en open de huid met een schaar. Oes de milt met pincet.
- Kruip de milt tussen 2 glasmicroscoopschuiven om de cellen te dissociëren en verdunnen ze in 5 mL Hank's Balanced Salted Solution (HBSS) die 1% foetaal kalfserum (FCS) bevat.
- Centrifuge gedurende 10 minuten bij 120 xg en 4 ° C. Gooi de supernatant weg.
- Resulteer de pellet in 5 ml HBSS 1% FCS. Tel de cellen met een Neubauer kamer met behulp van een Trypan blauwe vitale vlek.
OPMERKING: 80 miljoen cellen moeten worden verkregen uit één volwassen milt.
- Isolatiop cellen van de dunne darm
- Euthanaseren volwassen muizen door cervicale dislocatie. Met een schaar, een insnijding in de huid op de buik middellijn. Pak de dunne darm met een pincet in de ene hand en met een schaar te knippen aan beide uiteinden: ten eerste direct na de maag en aan het einde van de dunne darm, net voor de dikke darm. Spoel de dunne darm met 1x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met een 2 ml spuit met een naald.
- Zet de dunne darm op een papieren handdoek en verwijder voorzichtig de plaques van Peyer met een scherpe schaar.
- Knip met een schaar de darmen beginnen over de lange zijde door één tak van de schaar in de darm. Snijd de geopende darm in 1 cm stukjes met een scherpe schaar.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder constant roeren in 30 ml HBSS met 10% FCS.
- Leg de celsuspensie met de resterende niet-gesplitste fragmenten in een 50 mLplastic buis en vortex gedurende 5 minuten bij hoge snelheid. NB: Er is geen verdere dissociatie van het weefsel.
- Incubeer gedurende 10 minuten op ijs om de grote, niet-gesplitste fragmenten te pelleteren.
- Verzamel de supernatant en concentreer door centrifugatie gedurende 7 min bij 120 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml HBSS met 1% FCS. Tellen cellen met een Neubauer kamer met behulp van een trypan blauw vitale vlek.
OPMERKING: ~ 60 miljoen intra-epitheliale cellen (IELs) moet worden verkregen van een volwassene dunne darm.
- Panel design strategie
- Bereid de panelen met antilichamen direct gekoppeld aan fluorochromen.
Opmerking: Alle antilichamen vooraf getitreerd om de optimale definitie van de celpopulaties te verkrijgen (de titratie kan variëren met het antilichaam batch). De antilichamen die in de 19-color paneel splenocyten vlekken zijn in tabel 1. - Construct multi-color panelen voor cytometrie. Aangezien dit een uitdagende taak zijn, gebruik dan de volgende richtlijnen om de panelen te optimaliseren:
- Controleer de spectrale configuratie en de fluorescerende kleurstoffen die gebruikt kunnen worden op het instrument.
- Gebruik de helderheid Index / kleuringsindex informatie die door de fabrikant.
OPMERKING: De helderheid Index / kleuring Index is de relatieve indicator van de fluorescentie-intensiteit versus achtergrond voor elke fluorochroom. - Kies de antilichamen volgens de regels hieronder:
- Kies de helderste fluorochromen voor eiwitten die zwak zijn uitgedrukt en de zwakste fluorochromen naar hoger eiwitten.
Opmerking: Zo worden CD45, CD4 en CD8 sterk tot expressie en kan worden gebruikt met dim fluorochromen. - Gaat ontwerpen het paneel door eerst de antilichamen met de minste fluorescente kleurstof mogelijkheden te kiezen.
- Kies zo mogelijk fluorescerende kleurstoffen met de kleinste overlap van emissiespectra fOf markers uitgedrukt op dezelfde celtypes.
OPMERKING: Tandems ( bijv. PE-Cy5, PE-Cy7, en PerCP-Cy5.5) dienen met voorzichtigheid te worden gebruikt, omdat ze gevoeliger zijn voor afbraak door blootstelling aan licht.
- Kies de helderste fluorochromen voor eiwitten die zwak zijn uitgedrukt en de zwakste fluorochromen naar hoger eiwitten.
- Bereid de panelen met antilichamen direct gekoppeld aan fluorochromen.
- Kleuring van cellen voor cytometrie analyse
- Bereid een 5 ml buis met 1 x 10 6 splenocyten en een 5 ml buis met 1 x 10 6 darmcellen en houd ze onbeschadigd voor gebruik als negatieve controles.
- Bereid en label een 5 ml buis per monster en per paneel volgens tabel 1 . Bereid de mengeling van antilichamen volgens tabel 1 in HBSS 1% FCS op.
- Plaats 1 x 10 6 cellen - ofwel splenocyten of darmcellen - in elke 5 ml buis. Voeg 2 ml HBSS 1% FCS toe en centrifuge gedurende 5 minuten bij 4 ° C en 120 x g. Gooi de supernatant weg en verwijder de pellet in 50 μl antilichamenmix.
- Benoem de splenocytes in 2 stappen. Gebruik eerst 50 pi van het mengsel dat de antilichamen gemerkt met PE-Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5.5 en PerCP (met Fc receptor blokkerende) in een 5 ml buis. Na 20 minuten incubatie in het donker bij 4 ° C, voeg 50 ul van het mengsel dat alle andere antilichamen tegen een 5 ml buis.
LET OP: Deze strategie beperkt sterische hindering. - Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Voeg 2 ml HBSS 1% FCS en centrifugeer 5 min bij 4 ° C en 120 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 ul HBSS 1% FCS met 0,5 ug / ml propidiumjodide (PI).
2. Bereiding van Single-kleuring voor elk fluorochroom op commerciële Compensation Bead microsferen (bijvoorbeeld Ultracomp eBeads), hierna Beads
- Bereiden en label zoveel 5 ml buisjes als het aantal antilichamen die worden gebruikt in de panelen. Plaats 1 druppel kralen in elke buis en voeg 1 & #181, L antilichaam per buisje.
LET OP: De kralen hier gebruikt (zie de tabel van materialen) bevatten gekleurd (positief) en ongekleurde (negatief) kralen. Antilichamen worden gezet boven op de parels om een helder signaal wordt afgelegd, en een duidelijke spectrale signatuur voor elke kleurstof. Dit is nodig door de software in staat zijn om een nauwkeurige ontmenging te maken. - Incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Voeg 2 ml HBSS 1% FCS en centrifugeer 5 min bij 120 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 ul HBSS 1% FCS.
3. Cell Suspension Bereiden uit embryonale Mouse Hearts
- Dissecties van embryo
- Plan getimede-zwangere vrouwtjes vooraf te nemen door paring 2 vrouwen met een mannetje (altijd in kooi mannetje) aan het eind van de dag (tussen 17 en 19 uur). De volgende ochtend, vrouwen met vaginale pluggen worden geacht te zijn op 0,5 dagen na coïtus.
- Euthanaseren de E17.5 zwangere vrouwees door cervicale dislocatie. Zorg ervoor dat het dier niet reageert door stevig te drukken op de muis poot (teen-snuifje reflex). Bevochtig de buik met 70% ethanol te steriliseren en om de verspreiding van de muis bont te voorkomen.
- Maak een insnijding in de huid in het midden van de buik met een schaar en trek de huid uit elkaar met de vingers.
- Open de buikholte van de buikspier van het centrum trekken en ervoor insnijdingen aan beide zijden van de buik op bruto pincet en schaar.
LET OP: Wees voorzichtig met de dunne darm, die direct onder de peritoneale spier niet te beschadigen. - Verzamel de baarmoederhoorns (met embryo) door te snijden, zowel op het niveau van het baarmoederlichaam en de eierstokken. Laten weken in een 90 x 15 mm2 Petrischaal met 50 ml van DPBS.
- Isoleer elk embryo door te snijden tussen de decidua, gevolgd door de baarmoeder spierwand en de viscerale dooierzak met een fijne pincet en schaar. Trek de embryo's inthandelen. Tot slot, knip de navelstreng.
- Snijd de hoofden van de E17.5 embryo's met een schaar (onthoofding) voor aanvang van de dissectie.
- Het verzamelen van harten
- Week de onthoofde embryo in een 90 x 15 mm petrischaal 2 een natte papieren handdoek beddengoed op de schaalbodem en 50 ml HBSS met 1% FCS bevat.
- Onder een stereomicroscoop, houdt elk embryo uit grove forceps zodat de ventrale zijde naar boven.
- Open de thoracale rooster voorzichtig door het snijden van de rechterkant van de borst met een schaar, om schade aan het hart te voorkomen.
- Expose het hart door te oordelen de ribbenkast bruto tang.
- Uit elkaar trekken het hart (nog gemonteerd met longen en thymus) vast aan de grote vaten (met de grote vaten van de inkomende en de uitgaande stroming van het hart) en plaats ze in een 35 x 15 mm2 Petrischaal met 2 ml HBSS 1% met FCS.
- Isoleer de harten van de omringende organen enbindweefsel met fijne pincet en een scalpel.
- Was de harten in een nieuw 35 x 15 mm petrischaal met 2 ml HBSS 1% FCS en bewaar ze op ijs gedurende 20 minuten om het hart te pompen uit het bloed in de kamers.
- Bereiding van celsuspensies hart
- Voorverwarmen van 200 ug / ml collagenase in HBSS + / + (hierna enzymatische oplossing) tot 37 ° C.
OPMERKING: Verdun de collagenase in HBSS + / + (met Ca2 + en Mg2 + kationen) om de enzymactiviteit te maximaliseren; collagenase activiteit stabiel tussen batches. - Vervang de wasoplossing weken de harten (HBSS 1% FCS) met 1 ml voorverwarmde enzymoplossing.
- Onder een stereomicroscoop, gehakt de harten in 1 mm3 stukken met behulp van fijne pincet en een scalpel. Voeg nog 1 ml voorverwarmde enzymoplossing en gehakt weefsel overbrengen naar een 5 ml buis met een deksel.
LET OP: Voor een optimale vertering, plaats eenmaximaal 5 E17.5 harten per 2 ml enzymoplossing. Indien meer harten verteerd tegelijkertijd, splitsen in verschillende 5 ml buizen. - Incubeer het gehakte harten gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
OPMERKING: Leg de 5 mL buizen (goed gesloten) in de incubator om het weefsel verspreid over de oplossing.- Na afloop van de incubatie, het weefsel te homogeniseren in dezelfde enzymoplossing door op en neer pipetteren ongeveer 20 maal de P1000 pipet. En de 5 ml buis in verticale positie en laat de resterende weefselfragment sediment (ongeveer 3 minuten).
- Verzamel de bovenstaande vloeistof (die de gedigereerde cellen in suspensie) in een 50 ml buis, voeg 2 ml HBSS 10% FCS (hetzelfde volume als het volume van de enzymoplossing toegevoegd aan de weefselfragmenten) en bewaar ze op ijs onder voortdurende verteringsproces.
Opmerking: Het HBSS 10% FCS-oplossing en ijs zijn belangrijk voor de enzymwerking inactief terwijl de resterende weefselverteren. - Voeg 2 ml voorverwarmde enzymatische oplossing voor 5 ml buizen met de resterende weefselfragmenten en de digestie voort te zetten door het herhalen van stap 3.3.4 tot geen weefsel waargenomen.
OPMERKING: Ongeveer 4 cycli van digestie voldoende om volledig dissociëren het hartweefsel (5 E17.5 harten in 2 ml enzymoplossing).
- Centrifugeer de 50 ml buizen met cellen in suspensie gedurende 10 minuten bij 300 xg en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet, voeg 1 ml HBSS - / - 1% FCS en filter de celsuspensie hoewel een 70 urn nylon mesh. Tel de cellen met een Neubauer kamer met behulp van een trypan blauw vitale vlek.
OPMERKING: Resuspendeer de cellen met HBSS - / - (zonder Ca 2+ en Mg 2+ kationen) te minimaliseren cel aggregatie. Tussen 800.000 en 1.000.000 cellen zijn uit een E17.5 hart.
- Voorverwarmen van 200 ug / ml collagenase in HBSS + / + (hierna enzymatische oplossing) tot 37 ° C.
- Kleuring hartcellen met fluorescerende antistoffen
LET OP: Alle Antibodven worden vooraf getitreerde optimale bepaling van de celpopulaties (de titratie kan variëren met het antilichaam batch) .De antilichamen die in het hart venster worden in tabel 1 te verkrijgen.- Verdeel de cardiale cellen in suspensie door een 96-well plaat (rondbodem). Verdeel ze gelijkmatig over alle benodigde putjes (200 ul per putje), short-spin centrifuge de plaat met 96 putjes gedurende 1 min bij 480 xg en gooi het supernatant.
Opmerking: Alle putjes van de 96-well plaat (rondbodem) kunnen worden gebruikt. - Resuspendeer de pellet en incubeer de hartcellen gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C met 100 pi van de cocktail van antilichamen (dat wil zeggen, CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647 en Sca-1-PE-Cyanine5 ) verdund in HBSS - / - 1% FCS.
- Was de hartcellen van de overmaat antilichamen door toevoeging van 200 pi HBSS - / - 1% FCS en kort centrifugeren centrifugeren van de cellen gedurende 1 minuut bij 480 x g.
- Verwijder het supernatant en herhaalkorte centrifugatie centrifugeren (stap 3.4.3).
- Resuspendeer de cellen in 200 pi HBSS - / - 1% FCS en overbrengen naar een 5 ml buisje al die 200 ui HBSS - / - 1% FCS.
- Voor acquisities, voeg 400 ul HBSS - / - 1% FCS met 0,5 ug / ml PI en filter de celsuspensie hoewel een 70 urn nylon mesh.
- Verdeel de cardiale cellen in suspensie door een 96-well plaat (rondbodem). Verdeel ze gelijkmatig over alle benodigde putjes (200 ul per putje), short-spin centrifuge de plaat met 96 putjes gedurende 1 min bij 480 xg en gooi het supernatant.
4. Overname van gelabelde milt, Intestinal, en Cardiac Cellen met de Spectral cytometer
- Voor het verkrijgen van de gegevens, automatisch de spectrale kalibreren cytometer volgens de instructies van de fabrikant. Voer de dagelijkse en de maandelijkse procedures voor kwaliteitscontrole elke dag van het experiment.
- Wanneer de cytometer klaar is, start het voorbeeld van de monsters die de celsuspensies gelabeld met antilichamen.
NB: Niet te verwerven. - Zorg ervoor dat alle lasers zijn als nodig is. Stel de FSC versterking zodat alle cellen zichtbaar in de respectievepercelen. Poort de celpopulatie en breng deze poort op beide spectrale plots overeenkomen met de 488-nm en de 638/405-nm lasers.
Opmerking: Wanneer fluorochromen worden geëxciteerd door de 638-nm laser (wanneer de 638 nm laser is), is er een masker dat beschermt licht 617-662 nm te voorkomen dat de 638 nm laser schijnen in de PMT. Dit leidt tot het verlies van een deel van het spectrum en veroorzaakt daardoor een lagere afscheiding van nauwe kleurstoffen emitteren bij deze golflengten. Echter, het gehele signaal wordt verzameld door het uitschakelen van de 638-nm laser als het niet nodig is voor verkrijgen. - Stel de 32-kanaals fotovermenigvuldiger (PMT) spanning (%) zodat alle fluorochromen zijn binnen het bereik van de intensiteitsverdeling weergegeven in de y-as (1-10 6) in de twee verschillende spectrale plots tonen van 488 nm en 405/638 nm excitaties.
OPMERKING: Training is vereist om de spectra van alle fluorochromen gebruikt te herkennen. - Start om de monsters te verwerven. Klik op ", Voorbeeld" om de cellen zichtbaar op het scherm en vervolgens op 'Ophalen' om het monster te nemen Save up to 2 x 10 6 gebeurtenissen uit elk monster..
- Na het verkrijgen van de monsters gekleurd verwerven het monster gekleurd met de vitale kleurstof en de compensatie kralen afzonderlijk gekleurd met antilichamen gebruikt. Klik op “Preview” om de cellen op het scherm te visualiseren en vervolgens op “Acquire” om de monsters te nemen.
LET OP: Houd dezelfde PMT voltage voor alle monsters en controles (dat wil zeggen, kralen en ongekleurde monsters); 5.000 evenementen zijn ruimschoots voldoende. - Tenslotte krijgen de gegevens van de ongekleurde celsuspensies. Klik op "Preview" om de cellen op het scherm te visualiseren en vervolgens op "Acquire" om de monsters te nemen.
OPMERKING: verwerven van de niet gekleurde monsters aan het eind van het experiment minimaliseert de overdracht van fluorescerende cellen. - Maak de cytometer volgens de fabrikant instructies van eend het experiment te sluiten in de map overname.
LET OP: Pas na het sluiten van het experiment zal het worden opgeslagen en beschikbaar voor analyse.
5. Analyse van de gegevens met de Spectral FCM Software
- In het venster "Kleurenpalet" van het tabblad "Analysis", alle parameters in het paneel aanwezige registreren door toevoegen van elk gebruikte fluorochroom en de bijbehorende markering (keuze maken uit de beschikbare lijst of voeg een nieuwe parameter). Ook onder meer de auto-fluorescentie en viabiliteitsparameters; alle geselecteerde parameters zal verschijnen in het venster "ontmenging".
- Selecteer de eerste single gebrandschilderde monster (gedaan met compensatie kralen) in het venster "Control" onder de "Tube List" van dit experiment op het tabblad “Analysis”. In het werkblad, klikt u op de "polygoon design tool" en het ontwerpen van een poort op de kraal bevolking in de FSC / SSC plot. Dubbelklik op de top van poort naar een spectrale of dot plot openende gated korrels te kunnen visualiseren in een dochter plot.
- Het ontwerpen van een poort voor de positieve en één poort voor de negatieve kralen, hetzij op het spectrum of op de dot plot. Controleer de gehele spectra overeenkomen met de twee laserbundels sets voor elke positieve en negatieve fractie en elimineren uitschieters door achtereenvolgens gating en te klikken op de poort naar de dochter populatie controleren. Voer de negatieve en positieve poorten in het venster "componenten voor elke pixel".
- Herhaal stap 5.2 voor elke single-gekleurde monster.
OPMERKING: Let erop dat de positieve en negatieve gating strategie overeenkomt met het monster dat wordt geanalyseerd, maar het programma maakt het in elk monster te plaatsen. In plaats van het bepalen van een negatieve fractie bij elke afzonderlijke gekleurde monster, gebruik een ongekleurde monster kraal een universele negatieve ingesteld.
- Selecteer de ongekleurde cel monster in de "Tube List" en het ontwerp hekken voor autofluorescente en voor niet-autofluorescente cellen. <li> Wanneer alle negatieve en positieve poorten voor alle parameters, met inbegrip van auto-fluorescentie en levensvatbaarheid, zijn geselecteerd in het venster "componenten voor elke pixel", klik op "Bereken." Breng de ontmenging om de monsters te analyseren.
- Analyseer de gegevens door het ontwerpen van poorten en het creëren van twee-parameter plots.
- Ten eerste, het ontwerpen van een poort voor SSC versus FSC en vervolgens het verwijderen van dode cellen door uitsluiting van alle cellen gelabeld met de levensvatbaarheid marker (PI versus CD45). Op de rest van de cellen, ontwerp poorten voor populaties van belang Volgens de voor elke celsuspensie strategie (figuren 1-3).
OPMERKING: Indien nodig de compensatie in de "referentie spectrum regelaar." Dit is een instrument dat kan worden gebruikt na unmixing om opnieuw aan te passen de mediaan van de positieve populatie voor elke fluorochroom als het algoritme dat het niet goed zou kunnen doen.
- Ten eerste, het ontwerpen van een poort voor SSC versus FSC en vervolgens het verwijderen van dode cellen door uitsluiting van alle cellen gelabeld met de levensvatbaarheid marker (PI versus CD45). Op de rest van de cellen, ontwerp poorten voor populaties van belang Volgens de voor elke celsuspensie strategie (figuren 1-3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21-spectrale parameter FCM paneel splenocyten analyseren
Figuur 1 toont de resultaten verkregen met de 19-fluorescerend antilichaampanel aangebracht op miltcellen die verschillende antilichamen die subsets van T, B, NK, dendritisch en myeloïde cellen, terwijl CD45 labels alle hematopoietische cellen met kernen. Het paneel omvat ook een levensvatbaarheidkleurstof (PI), en de grootte (FSC) en de granulariteit (SSC) parameters. Figuur 1A toont de referentie fluorochroom spectra. Na verwijdering van dode cellen in de CD45 + poort (Figuur 1B) toont de analyse CD3 + T-cellen het TcR keten en het verwachte CD4 / CD8 verdeling en hoeveelheid CD25 + cellen in CD4 T-cellen. CD8 T-cellen vertonen een normale verdeling van CD44- en Ly49D expressie cellen. CD19 + B-cellen co-express een B220d MHCII, en IgM en IgD, typisch rijpe milt B-cellen. Een subgroep van NK1.1 + NK-cellen vormt een klein deel van de milt lymfocyten die co-express Ly49D. De resterende cellen een klein deel van CD11c + dendritische cellen met hoge niveaus van MHC II, waarvan sommige ook waren CD11b +. F4 / 80 + cellen kenmerkend weefselspecifieke macrofagen co-express CD11b en de hoogste CD44 gevonden in de milt. De resterende cellen (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) worden verdeeld door de expressie van CD11b en Gr1, waar de kleine subset van dubbel-positieve cellen ook hoge niveaus van CD44 tot expressie, waarschijnlijk overeenkomend met voorlopers bekend in geringe frequenties in de milt zijn. Een grote fractie was negatief voor de drie merkers. Figuur 2 toont dezelfde analyse voor het aanpassen van de compensatie.
Figuur 1: Een 19-color antilichaampanel voor de analyse van murine miltcellen. (A) muis splenocyten werden gekleurd met het antilichaam vorige combinatie waaraan CD45-evolueren 655 toegevoegd. De referentiespectra alle fluorochromen weergegeven. Fluorofoor-gelabelde CD45 wordt gekenmerkt door een rode pijl. De fluorochromen zijn vermeld in tabel 1. (B) De contour plots tonen het onderscheidend vermogen van deze multi-parametrische analyse om de verschillende populaties van B, T, NK, dendritisch of myeloïde cellen te scheiden. De analyse werd uitgevoerd in conventionele FCM software na ontmenging deconvolutie.
Figuur 2: Een 19-color antilichaampanel voor de analyse van murine miltcellen. Dezelfde analyse als in figuur 1 werd uitgevoerd voordat het de rtment van de compensatie met referentiespectra regelaar.
Dunne darm intra-epitheliale lymfocyten
Verscheidene T-celpopulaties in de darm in de epitheliale cellaag 5, 6. Gebruikelijke isolatie van deze deelverzamelingen omvat een dichtheidsgradiënt die lymfocyten van epitheelcellen scheidt. Echter, deze voorbereiding is delicaat, tijdrovend en resulteert in cel verlies. Kwantificatie vergroten en de experimentele procedure te vergemakkelijken, het potentieel van spectrale FCM populaties van lymfocyten intestinale discrimineren een groot deel van de epitheelcellen werd getest. Na het mechanisch afbreken van het epitheelweefsel werden celsuspensies gekleurd met antilichamen die subsets van αβ label en yö T-cellen gewoonlijk in het darmepitheel. Decellen werden geanalyseerd twee conventionele cytometers en spectrale FCM.
Figuur 3 toont de resultaten na het volgen van een soortgelijke gating strategie, onder afsplitsing van dode cellen gating op PI-negatieve cellen. De aanwezigheid van auto-fluorescerende cellen in alle conventionele cytometers en spectrale cytometrie duidelijk wanneer de auto-fluorescentie manager geïnactiveerd (bovenpanelen, rode pijlen), hetgeen resulteert in een slechte discriminatie van de levende cellen. In alle percelen worden cellen binnen de FSC-A / SSC-A lymfocytpoort in blauw en cellen met grotere verstrooit (epitheelcel poort) getoond in rood. Zowel conventionele instrumenten waren niet in staat om de CD3 + T-cel subgroep (in het blauw) (turquoise pijl) oplossen van de resterende cellen. Daarom TcR - cellen (groene pijl) verontreinigde de CD3 + TcRγδ - bevolking, een biologisch onwaarschijnlijk deelverzameling nooit geconstateerd nadat de separatieen van de lymfocyten uit epitheelcellen. Daarentegen spectrale FCM na auto-fluorescentie beheer, de analyse van de verschillende T-cel subsets werd niet nadelig beïnvloed door de aanwezigheid van epitheliale cellen, werden de populaties goed gescheiden, en er waren geen TcR-negatieve cellen in de CD3 + poort.
Figuur 3: De aanwezigheid van auto-fluorescerende cellen Vindt de detectie van intra-epitheliale lymfocyten Spectral FCM niet aantasten. Kleine intestinale cellen, waaronder epitheelcellen en lymfocyten werden gekleurd met antilichamen die TcRδ, PI, TcR Cy7 APC-CD3 (kaders B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (kaders C) en CD8 FITC (kaders D). PI is in de FACS buffer voor analyse toegevoegd. De overname van de gegevens werd achtereenvolgens gedaan in de drie instrumenten na passende kwaliteitscontrole. Doublets waren Eliminated FSC-H / FSC-W. De analyse werd uitgevoerd in conventionele FCM software. Plots tonen de verschillende stappen van de gating strategie. Cellen binnen de FSC-A / SSC-A lymfocytpoort beschermde blauw, terwijl cellen in de intestinale epitheelcel gate gelabeld rood. Pijlen wijzen naar verschillende bevolkingsgroepen vervormingen en auto-fluorescentie. Percelen C tonen de analyse van gegevens verkregen spectrale FCM zonder autofluorescentie management in de ontmenging, terwijl D toont dezelfde gegevens na ontmenging met autofluorescentie management.
embryonale hart
Conventionele FCM toonde een grote populatie van auto-fluorescente cellen (zwarte pijl) die werd uitgesloten van het onderzoek omdat fluoresceerden de CD45 en TER119 dump kanaal (PE), markering hematopoietische cellen. Daarentegen deze auto-fluorescerende populatie niet als zodanig aanwezig spectrale FCM en is omvat in de CD45
Figuur 4: Auto-fluorescerende cellen in E17.5 Cardiac Cell Suspensies worden Goed Inbegrepen in de negatieve celfractie in Spectral FCM. (A) celsuspensies uit foetale hart werden gekleurd met anti-TER119 en CD45-PE, Sca-1-PECy5 en CD31-APC antilichamen en sequentieel verworven drie instrumenten. Zwarte pijlen tonen auto-fluorescerende cellen in de twee conveNtional cytometers, terwijl deze cellen niet als auto-fluorescentie spectrale cytometrie gedetecteerd en kan dus worden geanalyseerd op specifieke fluorescente kleuring. (B) Auto-fluorescerende cellen (in de elliptische poort in groen), maar niet CD31 + cellen (rechthoekige poort in blauw, negatieve controle) toonde de expressie van cardiaal troponine (TNNT2) 7 en atriale lichte keten-2 (MYL7) 8 transcripties. au - willekeurige eenheden ten opzichte van de GAPDH-huis te houden transcript. De gegevens weergegeven als gemiddelde waarde ± SEM.
| excitatie laser | fluorochrome | specificiteit | Clone | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | propidiumjodide | levensvatbaarheid | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRB | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | EVOLVE 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | gezuiverde | CD16 / CD32 | 2.4G2 | Fc-receptor blokkeren |
| Lijst van antilichamen gebruikt in Cardiac celsuspensie | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
Tabel 1: Lijst van de antilichamen die in de 19-kleuren Panel en in Cardiac Cell Suspension.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebruikelijke FCM is gebaseerd op de detectie van fotonen uitgezonden na excitatie van fluorescerende probes. De fluorescentie emissie van één fluorochroom gedetecteerd in een detector ontworpen om het signaal van een andere fluorochroom meten induceert fysische overlap. Dit spillover onder emissiespectra moet worden gecorrigeerd door compensaties.
Spectrale FCM en gegevensverwerking door de ontmenging deconvolutie-algoritme maakt de combinatie van fluorochromen die nauwe emissiepieken zonder extra compensatie, mits zij verschillende spectrale vorm. Het algoritme voor de analyse behandelt auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter aftrekken van niet-specifieke fluorescentie van vast weefsel celsuspensies.
Een panel van 19 fluorochromen werd samengesteld om immuuncellen met slechts twee lasers (488 nm en 405 nm) geanalyseerd. Inderdaad, wanneer de 638 nm laser was een deel van de 32-kanaals PMT corresponderendde excitatiegolflengte van deze laser niet beschikbaar. Om de maximale detectie capaciteit van de PMT te krijgen, werd de rode laser uitgeschakeld. Muizen miltcellen geanalyseerd, waardoor de detectie van meer dan 12 verschillende celpopulaties, waarvan sommige omvatten 1% of minder van de hematopoïetische cellen.
De capaciteit van spectrale FCM getest op auto-fluorescentie beheren, werden twee verschillende situaties die de analyse kunnen beïnvloeden getest: één waarbij lymfocyten werden besmet met epitheelcellen, en één waarbij auto-fluorescerende cardiale cellen werden geanalyseerd. In tegenstelling tot conventionele FCM, spectrale cytometrie maakt de discriminatie van alle lymfocyten, zelfs wanneer ze vertegenwoordigen kleine subsets.
De controverse rond de regeneratieve capaciteit van de volwassen hartspiercellen 9, 10, 11 is gedeeltelijk te wijten aan het ontbreken van een strategie om disinkrimineren en isoleren van verschillende subsets van levensvatbare cellen in het hart. Een multi-parametrische analyse definiëren unieke combinaties van merkstoffen met verschillende subsets cardiale onderscheid zou de detectie van zeldzame subsets door grote aantallen cellen die kunnen worden geanalyseerd inschakelen. Foetaal hart (E17.5) geanalyseerd, en een groot deel van auto-fluorescerende cellen, die detectie zou zijn ontsnapt gebruikelijke FCM, geïntegreerd in de niet-levensvatbare hematopoïetische cellen cardiale compartiment spectrale FCM.
Een terugkerend probleem van deze methode is het vereiste van goede kwaliteit fluorescent gelabelde antilichamen. Dit is bijzonder kritisch bij het gebruik van tandem kleurstoffen, wanneer een bestanddeel van de tandem dominant. Zo kan BV786 en Cy7-PE moeilijk te onderscheiden van BV421 en PE, respectievelijk.
FCM basis van spectrometrie verschaft analytische kracht groter dan die verkregen met conventionele FCM, zonder dat hiervoor compensatie matrices. Dit manuscript geeft aan dat er een alternatieve aanpak is die een hoge analytische capaciteit aantoont, de afwezigheid van complexe compensatiematrices, de onbelemmerde discriminatie van cellonderdelen door automatische fluorescentie en geen extra financiële verplichtingen die nog steeds nodig zijn voor massaspectrometrie FCM. Spectral FCM lijkt derhalve een methode van keuze te zijn voor de analyse van cellen verkregen uit een grote verscheidenheid aan vaste weefsels die gewoonlijk niet toegankelijk zijn voor conventionele FCM en kunnen worden gebruikt in tumor-, ontwikkelings- en stamcelbiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen de technische en theoretische bijdragen in spectrale cytometrie van K. Futamura, die ook kritisch het manuscript herzien. We zijn ook dank verschuldigd aan C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, en P. Pereira voor het kritisch lezen van het manuscript en voor eindeloze technisch advies en ondersteuning. We danken ook P. Pereira voor de gave van de anti Vγ7-APC en Vδ4-biotine gelabelde antilichamen. We aknowledge het Centre d'Enseignements van Pasteur Instituut voor gastvrij en het ondersteunen van het filmen logistiek. Dit werk werd ondersteund door het Instituut Pasteur, het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); de Swiss National Science Foundation en Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); en Université Paris Diderot, het Agence Nationale de la Recherche (ANR) project Twothyme, de ANR, en Program REVIVE (investering voor de toekomst) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
