Summary
מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.
Abstract
Cytometry זרימה שמש במשך 40 השנים האחרונות כדי להגדיר ולנתח את הפנוטיפ של הלימפה ותא hematopoietic אחר. בתחילה מוגבל הניתוח של כמה fluorochromes, כיום ישנם עשרות צבעי ניאון שונים, ועד 14-18 צבעים שונים ניתן לשלב בכל פעם. עם זאת, מספר מגבלות עדיין לפגום ביכולות אנליטיות. בגלל ריבוי בדיקות ניאון, ניתוח נתונים הפך מורכב יותר ויותר בשל הצורך של מטריצות פיצוי גדול, רב-פרמטריים. יתר על כן, מודלי עכבר מוטצית נושאת חלבוני ניאון כדי לזהות ולאתר את סוגי תאים ספציפיים ברקמות שונות הפכו זמינים, כך הניתוח (על ידי cytometry זרימה) של השעיות תא-ניאון אוטומטי המתקבלות איברים מוצקים נדרש. Spectral cytometry זרימה, אשר מבדיל את הצורות של ספקטרום פליטה יחד מגוון רחב של אורכי גל מתמשך, כמה כתובות של בעיות אלה. הנתונים נותחו wה- i אלגוריתם המחליפה מטריצות פיצוי ומטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. לפיכך, cytometry הזרימה ספקטרלי צריך להיות מסוגל להפלות fluorochromes עם פסגות פליטה דומה והוא יכול לספק ניתוח רב-פרמטרי ללא דרישות פיצוי.
פרוטוקול זה מתאר את זרימת ספקטרלי ניתוח cytometry, המאפשר אפיון 21-פרמטר (19 בדיקות ניאון) לבין הנהלת אות אוטומטית פלורסנט, מתן ברזולוציה גבוהה לגילוי אוכלוסיית קטין. התוצאות המוצגות כאן מראות כי זרימת ספקטרלי cytometry מציגה יתרונות בניתוח של אוכלוסיות תאים מרקמות קשות לאפיין בזרימה קונבנציונלית cytometry, כגון לב והמעי. Spectral cytometry זרימה ובכך מדגים את יכולת אנליטית רבה-פרמטרית של זרימה קונבנציונלית בעלות ביצועים גבוהה cytometry ללא דרישה לפיצוי ומאפשר ניהול האוטומטי פלואורסצנטי.
Introduction
בעשורים האחרונים, cytometry הזרימה (FCM) הפכתי שיטה אנליטית נפוצה חיונית ללימודי phenotyping התא. יש כבר עלייה משמעותית צבעי ניאון זמין, במיוחד fluorochromes נרגש לייזר סגול (405 ננומטר) (למשל, ויולט מבריק וצבעים Q-נקודה חדשה). עם זאת, הצמיחה של צבעי ניאון זמינים מגבירה את הסיכון של פליטה חופפת ודורשת מטריצות פיצוי עתירת עבודה. FCM הפך בשימוש נרחב כדי לנתח השעיות תא מרקמה מוצקה, אבל הנוכחות של תאי-ניאון אוטומטי מגבילה את האפליה של אוכלוסיות מוגדרות מפורש.
העקרונות הבסיסיים של ספקטרלי FCM מדווחים בהרחבת Futamura ואח. 1, 2. בקצרה, FCM ספקטרלי משמש כאן (ראו טבלה של חומרים) מצוידת 405, 488, ו 638 nm לייזרים. ה- FCM ספקטרלי לוכד את כל f הנפלטluorescence כמו ספקטרום בתוך (PMT 32ch) PMT מערך ליניארי 32 ערוצים עבור 500 ננומטר ל 800 ננומטר ו 2 PMTs עצמאית עבור 420 ננומטר ל 440 ננומטר ו 450 ננומטר ל 469 ננומטר, בהתאמה, אשר תחליף את מסנני להקה עוברת הקונבנציונליים. 488 ואת המקומות לייזר 405/638 ננומטר מופרדים מרחבית, ואילו כתמים לייזר 405 ננומטר ו 638 ננומטר הם שיתוף ליניארי. עבור כל חלקיק בודד, אמצעי FCM ספקטרלי עד 66 ערוצים של נתוני קרינה נרגש 405 ננומטר ו 488 ננומטר לייזרים. כאשר תאים שמחים על לייזר 638 ננומטר, ה- FCM ספקטרלי מודד 58 ערוצי נתוני הקרינה בגלל מסכה מוכנס למנוע לייזר 638 ננומטר מן שהאירו את PMT. Spectral FCM מנתחת את נתוני מלוא הספקטרום רכשו עם אלגוריתם המבוסס על שיטת הריבועים הפחותה המשוקללת (WLSM), אשר מאפשרת הפרדה של חופפי ספקטרום ניאון. ספקטרה נגזרה דגימות יחידות מוכתמות unstained מוכרת כמו ספקטרום ההתייחסות הבסיסי. דגימות Multi-צבעוניות מותקנות באופן מתמטיnd צרוף, ואת הספקטרום של מדגם עם תוויות ניאון מעורבות מפורק לתוך אוסף של ספקטרה המרכיב אותה. Unmixing, בטכנולוגיה רפאים 3, 4, מחליף את הפיצוי אשר מסיר את האות מכל גלאי פרט אחד למדידת צבע נתון.
במחקר זה, אנו בשילוב ונבדקנו 19 fluorochromes בניתוח יחיד, 21-פרמטר שאפיין את תת hematopoietic הגדולה נמצאת טחול העכבר. בנוסף, הראינו כי cytometry ספקטרלי יכול לנהל אות אוטומטית פלורסנט, ובכך לשפר את האפיון של לימפוציטים תוך האפיתל במעי ואת הלב העוברי. ואכן, ברקמות אלה, ניהול אוטומטי קרינה מוותר המשימה של קרינה ספציפית לתאים כי יהיו מהאנליזה ב קונבנציונלי FCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו על פי אמנת אתיקה במכון פסטר ואת הנחיות האיחוד האירופי אושרו על ידי משרד החקלאות הצרפתי.
1. הכנת תרחיף תא מאיברי עכבר למבוגרים
- בידוד של splenocytes
- להרדים עכברים בוגרים נקע בצוואר הרחם. עושה חתך על קו אמצע הבטן ולפתוח את העור עם מספריים. קציר הטחול עם מלקחיים.
- מרסק את הטחול בין מיקרוסקופ זכוכית 2 שקופיות לנתק את התאים ואת לדלל אותם 5 מיליליטר של הפתרון המלוח המאוזן של האנק (HBSS) המכיל נסיוב עגל עוברי 1% (FCS).
- צנטריפוגה 10 דקות ב 120 XG ו 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
- Resuspend גלולה 5 מ"ל של HBSS 1% FCS. ספירת התאים עם תא נויבאואר באמצעות כתם חיוני כחול Trypan.
הערה: 80 מיליון תאים יש לקבל טחול מבוגר אחד.
- Isolatiעל תאים מהמעי הדק
- להרדים עכברים בוגרים נקע בצוואר הרחם. בעזרת מספריים, עושה חתך בעור על קו אמצע הבטן. תפוס את המעי הדק עם מלקחיים ביד אחת ולהשתמש מספריים לחתוך אותו בשני קצותיו: הראשון, מיד אחרי הקיבה ואז בסוף המעי הדק, ממש לפני המעי הגס. לרוקן את המעי הדק עם בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) באמצעות מזרק מ"ל 2 עם מחט.
- שים את המעי דק על מגבת נייר ובזהירות להסיר את המדבקות של Peyer עם זוג מספריים חדים.
- השתמש במספריים כדי לפתוח את המעי בצד הארוך שלה על ידי הוספת סניף אחד של המספריים בתוך המעי. חותכים את המעי פתחה לחתיכות 1 ס"מ בעזרת מספריים חדים.
- דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת ערבוב מתמיד ב 30 מ"ל של HBSS עם 10% FCS.
- מניחים את ההשעיה תא עם שברי הלא ניתק הנותרים בתוך 50 מ"לצינור מערבולת פלסטיק עבור 5 דקות במהירות גבוהה. הערה: אין ניתוק נוסף של הרקמה.
- דגירה של 10 דקות על הקרח כדי לאפשר בשברים גדולים, שאינם ניתק גלולה.
- איסוף supernatant ולרכז אותו על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב g x 120.
- בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 10 מ"ל של HBSS עם 1% FCS. ספירת תאים עם תא נויבאואר באמצעות כתם חיוני כחול Trypan.
הערה: ~ 60 מיליון תאי תוך האפיתל (IELs) יש לקבל מעי דק מבוגר אחד.
- אסטרטגיית עיצוב לוח
- הכן את הלוחות עם נוגדנים מצמידים ישירות עם fluorochromes.
הערה: כל הנוגדנים טיטרציה בעבר לקבל את ההגדרה האופטימלית של אוכלוסיות תאים (טיטרציה יכול להשתנות עם יצווה נוגדנים). הנוגדנים בשימוש בלוח 19-צבע להכתים splenocytes מפורטים בטבלה 1. - Construct-קולורדו רבלוחות r עבור cytometry. כמו זו יכולה להיות משימה מאתגרת, פעל בהתאם להנחיות הבאות כדי לייעל את לוחות:
- בדוק את תצורת ספקטרלי ואת צבעי ניאון שיכול לשמש על המכשיר.
- השתמש במידע הבהיר אינדקס / מכתים האינדקס שמספק יצרן.
הערה: בהירות האינדקס / מכתים האינדקס הוא האינדיקטור היחסי של עוצמת קרינה לעומת רקע לכל fluorochrome. - בחר את הנוגדנים הבאים הכללים שלהלן:
- בחר את fluorochromes המבריקים עבור חלבונים אשר מתבטאים בחולשה ואת fluorochromes הקלוש ביותר עבור חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה יותר.
הערה: לדוגמה, CD45, CD4, CD8 ו מבוטאים מאוד וניתן להשתמש בו עם fluorochromes עמום. - התחל בעיצוב בלוח הידות הראשונה בבחירת הנוגדנים עם אפשרויות צבע פלואורסצנטי הקטנות ביותר.
- במידת האפשר, לבחור צבעי ניאון עם חפיפה הקטן של f ספקטרום פליטהאו סמנים הביעו באותו סוגי התאים.
הערה: tandems (למשל, PE-Cy5, PE-Cy7, ו PerCP-Cy5.5) יש להשתמש בזהירות, כפי שהם רגישים יותר השפלה ידי חשיפה לאור.
- בחר את fluorochromes המבריקים עבור חלבונים אשר מתבטאים בחולשה ואת fluorochromes הקלוש ביותר עבור חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה יותר.
- הכן את הלוחות עם נוגדנים מצמידים ישירות עם fluorochromes.
- צביעת תאים לניתוח cytometry
- כן אחד 5 צינור מיליליטר עם 1 x 10 6 splenocytes ואחד 5 צינור מיליליטר עם 1 x 10 6 תאים במעי ולשמור אותם בלא כתם לשימוש שולט שלילי.
- הכין מתווה אחת 5 מיליליטר צינור לדגימה לכל חלונית לפי טבלת 1. מכינים את תערובת של נוגדנים, לפי טבלה 1, ב FCS HBSS 1%.
- העברת 1 x 10 6 תאים - או splenocytes או תאי המעי - לתוך צינור אחד מ"ל 5. להוסיף 2 מ"ל של HBSS 1% FCS צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 4 ° C ו- G x 120. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 50 μL של תערובת נוגדנים.
- תווית שלפלנוציטים ב 2 שלבים. ראשית, השתמש 50 μL של תערובת המכילה את הנוגדנים שכותרתו עם PE-Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5.5, ו PerCP (עם חסימת קולטן FC) בצינור 5 מ"ל. לאחר 20 דקות הדגירה בחושך על 4 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 μL של תערובת המכילה את כל הנוגדנים האחרים לצינור 5 מ"ל.
הערה: אסטרטגיה זו מגבילה מכשול סטרי. - דגירה במשך 20 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 2 מ"ל של HBSS 1% FCS ו צנטריפוגות 5 דקות ב 4 ° C ו 120 x גרם. מחק supernatant ו resuspend גלולה μL 200 של FCS 1% HBSS עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל propidium יודיד (PI).
2. הכנת מכתים בודדים עבור כל Fluorochrome על פיצוי מסחרי מיקרוסקופים חרוז ( למשל, UltraComp eBeads), מכאן ואילך המכונה חרוזים
- הכן תווית כמו צינורות 5 מ"ל רבים כמספר נוגדנים המשמשים לוחות. מקום 1 טיפה של חרוזים בצינור אחד ולהוסיף 1 & #181; L של נוגדן לכל צינור.
הערה: החרוזים משמשים כאן (ראה הטבלה של חומרים) מכילה צבעונית (חיובית) ו unstained חרוזים (שליליים). נוגדנים הם לשים העולה על החרוזים כדי להבטיח אות בהירה ולכן חתימה הספקטרלית ברורה לכל צבע. זה נדרש על ידי התוכנה כדי להיות מסוגל לבצע unmixing מדויק. - דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C..
- להוסיף 2 מ"ל של HBSS 1% FCS צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 120 x גרם. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 100 μL של FCS HBSS 1%.
3. הכנת תרחיף תא מ לבבות עכבר עובריים
- וניתוחים של עוברת
- תכננו להשיג נקבות מתוזמן בהריון מראש על ידי הזדווגות 2 נקבות עם זכר אחד (תמיד בכלוב-הזכרים של) בסוף היום (בין 17 ו 19 ח). למחרת בבוקר, נקבות עם אטמי נרתיקית נחשבים על 0.5 ימים שלאחר coitum.
- להרדים את femal E17.5 בהריוןes נקע בצוואר הרחם. להבטיח כי בעל החיים אינו מגיב על ידי לחיצה חזקה על כף העכבר (רפלקס בוהן קמצוץ). להרטיב את הבטן עם אתנול 70% לעקר ולמנוע את התפשטות פרוות עכבר.
- עושים חתך בעור בחלק האמצעי של המספריים באמצעות הבטן ולמשוך את העור באצבעותיך.
- פתח את חלל הבטן על ידי משיכת ועשו לעצמם חתכים שריר הבטן ממרכז כלפי שני הצדדים של הבטן באמצעות מלקחיים ומספריים ברוטו.
הערה: היזהר שלא לפגוע במעי הדק, המהווה מייד מתחת לשריר הצפק. - אסוף את קרן הרחם (עם העוברים) על ידי חיתוך הוא ברמת גוף הרחם של השחלות. משרים אותם בצלחת 90 x 15 מ"מ 2 פטרי עם 50 מ"ל של DPBS.
- לבודד את כל העובר על ידי חיתוך בין כל decidua, ואחריו הקיר שרירי הרחם ואת שק החלמון הקרביים עם מלקחיים ומספריים בסדר. משוך את int עוברפעולה. לבסוף, לחתוך את חבל הטבור.
- חותכים את ראשי עוברים E17.5 עם מספריים (עריפת ראש) לפני תחילת לנתיחה.
- אוסף של לבבות
- משרה את העוברים הערופים בצלחת 90 x 15 מ"מ 2 פטר המכילה מצע מגבת נייר רטוב בתחתית הצלחת ו 50 מיליליטר של HBSS עם 1% FCS.
- תחת סטראו, להחזיק כל עובר עם מלקחי ברוטו כך שאזור הבטן פונה כלפי מעלה.
- בזהירות לפתוח את הרשת החזה על ידי חיתוך בצד ימין של החזה עם מספריים כדי למנוע נזק ללב.
- לחשוף את הלב על ידי החזקת החזה עם מלקחי ברוטו.
- משוך לגזרים את הלב (עדיין התאספו עם הריאות התימוס) על ידי החזקת כלי נהדר (המכיל כלי גדול של מגשי דואר נכנס ויוצא זרימה של הלב) ומניחים אותם בצלחת 35 x 15 מ"מ 2 פטרי עם 2 מ"ל של HBSS 1% עם FCS.
- לבודד את ליבם מן האיברים שמסביברקמת חיבור עם מלקחיים בסדר ומנתח.
- לשטוף את ליבם חדש 35 x 15 מ"מ צלחת פטרי עם 2 מ"ל של HBSS 1% FCS ולשמור אותם על קרח במשך 20 דקות כדי לאפשר את הלב לשאוב את הדם בתוך התאים.
- הכנת תרחיפי תא לב
- מראש לחמם את 200 μg / collagenase מ"ל ב HBSS + / + (להלן נקרא פתרון אנזימטי) ל 37 מעלות צלזיוס.
הערה: לדלל את collagenase ב HBSS + / + (עם Ca 2 + ו Mg 2 + cations) כדי למקסם את פעילות האנזים; פעילות קולגן הוא יציב בין קבוצות. - החלף את תמיסת הכביסה השריה את הלב (HBSS 1% FCS) עם 1 מ"ל של תמיסה אנזימטית מראש מראש.
- תחת stereomicroscope, למחות את הלבבות לתוך 1 מ"מ 3 חתיכות באמצעות מלקחיים בסדר אזמל. הוסף עוד 1 מ"ל של פתרון מראש אנזימטית מראש ולהעביר את הרקמה טחון לצינור 5 מ"ל עם מכסה.
הערה: לקבלת עיכול אופטימלי, אמקסימום של 5 לבבות E17.5 לכל 2 מ"ל של תמיסה אנזימטית. אם יותר לבבות מתעכלים בו זמנית, לפצל אותם צינורות 5 מ"ל שונים. - דגירה לבבות טחון במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: הניח את 5 צינורות מ"ל (סגור היטב) בחממה כדי להפיץ את הרקמה לאורך הפתרון.- בסוף הדגירה, homogenize הרקמה באותו פתרון אנזימטי על ידי pipetting למעלה ולמטה כ 20 פעמים עם פיפטה P1000. שים את צינור 5 מ"ל במצב אנכי ולתת את יתרת משקע רקמה (כ 3 דקות).
- לאסוף את supernatant (המכיל את התאים מתעכל ההשעיה) בצינור 50 מ"ל, להוסיף 2 מ"ל של HBSS 10% HBSS (נפח זהה נפח הפתרון האנזימטית הוסיף את שברי הרקמה), ולשמור אותם על הקרח תוך כדי המשך תהליך העיכול.
הערה: פתרון ה- FCS 10% של HBSS והקרח חשובים לפעולת האנזים הפעילה בעוד שהרקמה הנותרת היאלעכל. - להוסיף 2 מ"ל של פתרון אנזימטי מחומם מראש ל צינורות מ"ל 5 עם שברי הרקמה הנותרת וממשיכים לעיכול על ידי חזרה על צעד 3.3.4 עד אין רקמת יותר הוא ציין.
הערה: בסביבות 4 מחזורים של עיכול הם מספיק כדי לנתק את הרקמה בלב לחלוטין (5 E17.5 לבבות ב 2 מ"ל של תמיסת אנזימטי).
- צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות עם התאים בתרחיף עבור 10 דקות ב 300 XG וזורקים supernatant.
- Resuspend התא גלולה, להוסיף 1 מ"ל של HBSS - / - 1% FCS, ולסנן את ההשעיה התא אף רשת ניילון 70 מיקרומטר. ספירת התאים עם תא נויבאואר באמצעות כתם חיוני כחול Trypan.
הערה: Resuspend התאים עם HBSS - / - (ללא Ca 2+ ו Mg 2+ קטיונים) המאפשרים איסוף תאים למזער. בין 800,000 ו 1,000,000 תאים מתקבלים מלב E17.5 אחד.
- מראש לחמם את 200 μg / collagenase מ"ל ב HBSS + / + (להלן נקרא פתרון אנזימטי) ל 37 מעלות צלזיוס.
- מכתים תאי לב עם נוגדנים ניאון
הערה: כל antibodies הם טיטרציה בעבר להשיג הגדרה אופטימלית של אוכלוסיות תאים (טיטרציה יכול להשתנות עם אצווה נוגדן) .the נוגדנים המשמשים בלוח לב מפורטים בטבלה 1.- פזר את תאי הלב ההשעיה דרך צלחת 96-היטב (תחתית עגולה). לפזר אותם באופן שווה את כל בארות הצורך (200 μL לכל היטב), צנטריפוגה קצר-ספין הצלחת 96-היטב עבור 1 דקות ב 480 XG, וזורקים supernatant.
הערה: כל בארות הצלחת 96-היטב (תחתית עגולה) יכול לשמש. - Resuspend גלולה דגירה תאי לב עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C עם 100 μL של קוקטייל של נוגדנים (כלומר, CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647, ו SCA-1-PE-Cyanine5 מדולל) ב HBSS - / - 1% FCS.
- שוטף את תאי לב מן העודף של נוגדנים על ידי הוספת 200 μL של HBSS - / - FCS 1% ו-ספין קצר צנטריפוגה התאים עבור 1 דקות ב g 480 x.
- בטל supernatant וחזורצנטריפוגה קצר-ספין (שלב 3.4.3).
- Resuspend התאים 200 μL של HBSS - / - 1% FCS ולהעבירם צינור מ"ל 5 כבר המכיל 200 μL של HBSS - / - 1% FCS.
- לפני הרכישה, להוסיף 400 μL של HBSS - / - 1% FCS עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל PI ולסנן את ההשעיה התא אף רשת ניילון 70 מיקרומטר.
- פזר את תאי הלב ההשעיה דרך צלחת 96-היטב (תחתית עגולה). לפזר אותם באופן שווה את כל בארות הצורך (200 μL לכל היטב), צנטריפוגה קצר-ספין הצלחת 96-היטב עבור 1 דקות ב 480 XG, וזורקים supernatant.
4. רכישת תווית הטחול, המעי, ואת הלב תאים עם Cytometer תזרים ספקטרלי
- לפני רכישת הנתונים, אוטומטית לכייל את ספקטרלי cytometer בעקבות הוראות היצרן. בצע את היומי ואת נהלי בקרת איכות החודשיות בכל יום של ניסוי.
- כאשר cytometer מוכן, להתחיל את התצוגה המקדימה של הדגימות המכילות את מתלי התא שכותרתו עם כל הנוגדנים.
הערה: אין לרכוש. - ודא כי כל הלייזרים נמצאים כנדרש. התאם את הרווח FSC כזה שכל התאים נראים בהתאמהחלקות. שער לאוכלוסיית התא ולהחיל השער הזה לשני מגרשי הרפאים המתאימים 488 ננומטר ל הלייזרים 638/405 ננומטר.
הערה: כאשר fluorochromes שמחים על לייזר 638 ננומטר (כלומר, כאשר לייזר 638 ננומטר הוא על), יש מסכה כי מגינים להדליק מ 617-662 ננומטר למנוע לייזר 638 ננומטר מן שהאירו את PMT. זה גורם לאובדן חלק של הספקטרום ולכן גורם פרדה תחתונה של צבעים קרובים פולטים באורכי גל אלה. עם זאת, את האות כולו ניתן לאסוף על ידי כיבוי לייזר 638 ננומטר אם זה אינו נדרש עבור הרכישה. - התאם את מכפיל תמונת 32 ערוצים (PMT) מתח (%) כך שלכל fluorochromes הוא בטווח של העוצמת מוצגת ציר y (1-10 6) בשני המגרשים השונים של הספקטרום מוצג 488 ננומטר ו 405/638 את הריגושים ננומטר.
הערה: הדרכה נדרשת להכיר את הספקטרום של כל fluorochromes המשמש. - התחל לרכוש את הדגימות. לחץ על "; תצוגה מקדימה" כדי להמחיש את התאים על המסך ולאחר מכן לחץ על 'לרכוש' להקליט המדגם חסוך עד 2 x 10 6 אירועים מכל מדגם..
- לאחר שרכש את הדגימות הצבעוניות, לרכוש במדגם מוכתם החיוני לצבוע ואז חרוזי הפיצוי בנפרד מוכתמים כל הנוגדנים המשמשים. לחץ על "תצוגה מקדימה" כדי להמחיש את התאים על המסך ולאחר מכן על "לרכוש" כדי להקליט דגימות.
הערה: שמור אותו מתח PMT עבור כל דגימות בקרות (כלומר, חרוזים ודוגמאות רבב); 5000 אירועים מספיקים במידה רבה. - לבסוף, לרכוש את נתוני השעיות תא רבב. לחץ על "תצוגה מקדימה" כדי להמחיש את התאים על המסך ולאחר מכן על "לרכוש" כדי להקליט דגימות.
הערה: רכישת דגימות unstained בסוף הניסוי ממזערת את השפעת הלוואי של תאי ניאון. - נקה את cytometer בעקבות הוראות היצרןd לסגור את הניסוי בתיקיית הרכישה.
הערה: רק לאחר סגירת הניסוי יהיה זה יישמר וזמין עבור ניתוח.
ניתוח 5. של נתונים עם תוכנת ספקטרלי FCM
- ב "לוח הצבעים" החלון בכרטיסייה "הניתוח", לרשום את כל הפרמטרים הנוכחיים בלוח ידי הוספה כל fluorochrome בשימוש בסמן המקביל (לבחור מהרשימה הזמינה או להוסיף פרמטר חדש). כמו כן, כוללים את אוטומטי הקרינה ואת כדאיות פרמטרים; כל הפרמטרים שנבחרו יופיעו בחלון "unmixing".
- בחר המדגם הצבעוני הסינגל הראשון (נעשה עם חרוזי פיצויים) בחלון "קונטרול" תחת "רשימת Tube" הניסוי הזה בכרטיסייה "הניתוח". בגיליון העבודה, לחץ על "כלי עיצוב פוליגון" ולעצב שער על אוכלוסיית החרוז בעלילת FSC / SSC. לחץ פעמים על החלק העליון של שער כדי לפתוח עלילת רפאים או נקודהכדי להמחיש את החרוזים המגודרים בתוך עלילה הבת.
- עיצוב שער אחד עבור שער החיובי ואחת שלילי החרוזים או על הספקטרום או על עלילת הנקודה. בדוק את הספקטרום השלם המתאים לשתי קבוצות הליזר לכל שבריר חיובי ושלילי ולחסל חריגים ידי gating ברציפות והלחיצה על השער כדי לאמת את האוכלוסייה הבת. הזן את השערים שלילי וחיובי בחלון "unmixing".
- חזור על שלב 5.2 עבור כל דגימה אחת מוכתמת.
הערה: שים לב כי אסטרטגית gating החיובית ושלילית מתאימה המדגם כי הוא נתח, למרות התכנית מאפשרת לה להיות ממוקמת בכל מדגם. במקום לקבוע שבר שלילי עבור כל דגימה אחת מוכתם, להשתמש מדגם חרוז unstained לקבוע שלילי אוניברסלית.
- בחר מדגם התא בלא הכתם על "רשימת Tube" ושערי עיצוב עבור autofluorescent ועל תאים שאינם autofluorescent. <li> כאשר כל השערים השליליים וחיוביים עבור כל הפרמטרים, כוללים אוטומט קרינה ואת הכדאיות, נבחרים בחלון "unmixing", לחץ על "חישוב". החל את unmixing אל דגימות להיות מנותח.
- לנתח את הנתונים על ידי עיצוב שערים ויצירת חלקות דו פרמטר.
- ראשית, לעצב שער SSC לעומת FSC ולאחר מכן להסיר תאים מתים על ידי למעט כל התאים שכותרתו עם הסמן הכדאי (PI לעומת CD45). על שאר התאים, שערי עיצוב עבור כל האוכלוסיות של עניין בעקבות האסטרטגיה שתוארה לכל ההשעיה תא (איורים 1-3).
הערה: אם יש צורך, להתאים את הפיצוי של "שמאי ספקטרום ההתייחסות." זהו כלי שניתן להשתמש לאחר unmixing להתאים מחדש את החציון של האוכלוסיות החיוביות עבור כל fluorochrome אם האלגוריתם לא יכול לעשות את זה בצורה מושלמת.
- ראשית, לעצב שער SSC לעומת FSC ולאחר מכן להסיר תאים מתים על ידי למעט כל התאים שכותרתו עם הסמן הכדאי (PI לעומת CD45). על שאר התאים, שערי עיצוב עבור כל האוכלוסיות של עניין בעקבות האסטרטגיה שתוארה לכל ההשעיה תא (איורים 1-3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21-פרמטר פאנל ספקטרלי FCM לנתח splenocytes
איור 1 מראה את התוצאות שהושגו עם הפנל 19-ניאון-הנוגדן להחיל תאי טחול הכוללים נוגדנים שונים הכרה תת של T, B, NK, דנדריטים, ותאי מיאלואידית, בעוד CD45 תוויות תאי בעלי גרעין hematopoietic. הפאנל כולל גם צבע הכדאיות (PI), כמו גם את הגודל (FSC) ו גרעיניות פרמטרים (SSC). איור 1A מראה את ספקטרום ההתייחסות fluorochrome. לאחר חיסול של תאים מתים CD45 + שער (איור 1B), הניתוח מראה כי CD3 + T תאים להביע את שרשרת TcRβ ויש חלוקת CD4 / CD8 צפוי ושיעור תאי CD25 + בתאי CD4 T. תאי CD8 T להראות התפלגות נורמלית של CD44- ותאי Ly49D להביע. תאי CD19 + B שיתוף אקספרס B220 ד MHCII, כמו גם IgM ו IGD, הטיפוסי של תאי B טחול בוגרים. תת קבוצה של תאי NK1.1 + NK מייצגת קבוצה קטנה של לימפוציטים הטחול כי שיתוף המפורש Ly49D. התאים הנותרים מהווים תת-קבוצה קטנה של תאי CD11c + דנדריטים עם רמות גבוהות של MHC II, שחלקם היו גם CD11b +. F4 / 80 + תאי מאפיין של מקרופאגים רקמות-תושב-השיתוף המפורש CD11b ואת הרמות הגבוהות ביותר של CD44 נמצאות הטחול. התאים הנותרים (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) ניתן היו לחלק על ידי הביטוי של CD11b ו Gr1, שבו המשנה הקטנה של תאים פעמים חיוביות גם להביע רמות גבוהות של CD44, מתאימה סביר אבות ידוע להיות נוכח בתדרים נמוכים בטחול. אחוז ניכר היה שלילי לשלושת הסמנים. איור 2 מראה את אותו ניתוח לפני התאמת הפיצוי.
e = "1"> 
איור 1: פנל נוגדן 19-צבע עבור הניתוח של תאי Murine טחול. (א) splenocytes העכבר הוכתמו שילוב הנוגדן הקודם, שבה CD45-להתפתח 655 נוספו. ספקטרום ההתייחסות של כל fluorochromes מוצג. CD45 Fluorophore שכותרתו מסומן בחץ אדום. Fluorochromes מפורט בטבלה 1. (ב) מגרש קונטור להראות את היכולת המפלה של ניתוח רב-פרמטרית זו להפריד בין האוכלוסיות השונות של B, T, NK, דנדריטים, או תאים מיאלואידית. הניתוח נעשה בתוכנה קונבנציונלית FCM אחרי שאינו מתרכך זה בזה פישוט.
איור 2: פנל נוגדן 19-צבע עבור הניתוח של תאי Murine טחול. אותו הניתוח כמו באיור 1 נעשה לפני adjustment הפיצויים עם שמאי ספקטרום ההתייחסות.
לימפוציטים תוך-אפיתל מעי דק
T-cell כמה אוכלוסיות נמצאות במעי בתוך שכבת תאי אפיתל 5, 6. בידוד קונבנציונלי של תת אלה כולל שיפוע צפיפות שמפריד לימפוציטים מתאי האפיתל. עם זאת, הכנה זו היא עדינה, זמן רב, וכתוצאה מכך אובדן תא. כדי לשפר כימות וכדי להקל על ההליך הניסיון, את הפוטנציאל של ספקטרלי FCM להפלות אוכלוסיות של לימפוציטים מעיים בתוך שבריר גדול של תאי האפיתל נבדק. לאחר הפרעה מכנית של רקמת האפיתל, השעיות תא הוכתמו נוגדנים כי תווית תת של αβ ו γδ בתאי T בדרך כלל נמצא אפיתל המעי. התאים נותחו בשני cytometers הקונבנציונלי והן FCM רפאים.
איור 3 מראה את התוצאות לאחר ביצוע אסטרטגית gating דומה, עם חיסול של תאים מתים gating על תאי PI-שלילי. הנוכחות של תאי-ניאון אוטומטי ברורה בכל cytometers הקונבנציונלי והן cytometry ספקטרלי כשהמנהל אוטומטי הקרינה מומתת (לוחות עליונים, חיצים אדומים), וכתוצאה מכך אפליה עניה של תאי חיים. בכל המגרשים, תאים בתוך שער FSC-A / SSC-לימפוציטים מוצגים בכחול ותאים עם מחליקים גדולים (שער תא אפיתל) מוצגים באדום. שני המכשירים קונבנציונליים לא הצליחו לפתור את תת CD3 + T-cell (בכחול) (חץ טורקיז) מהתאים הנותרים. לכן, TcRβ - תאים (חץ ירוק) זיהמו את CD3 + TcRγδ - האוכלוסייה, משנה סביר מבחינה ביולוגית לא זוהה לאחר separatiעל של לימפוציטים מתאי האפיתל. לעומת זאת, ב ספקטרלי FCM לאחר וניהול אוטומטי קרינה, הניתוח של תת T-התאים השונים לא נפגע על ידי הנוכחות של תאי אפיתל, האוכלוסיות היו מופרדות היטב, ולא היו תאים tcr-שליליים CD3 + שַׁעַר.
איור 3: נוכחות של תאים-ניאון אוטומטי אינו פוגע איתור של לימפוציטים Intra-אפיתל ספקטרלי FCM. תאי המעי הדק, כולל תאים לימפוציטים האפיתל, הוכתמו נוגדנים הכרה TcRδ, PI, TcRβ Cy7-APC CD3 (לוחות B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (פאנלים C), ו CD8 FITC (לוחות ד). PI נוספה למאגר FACS לפני הניתוח. הרכישה של הנתונים נעשתה ברצף בשלושת המכשירים לאחר בקרת האיכות המתאימה. כפילויות היו eliminaטד ב FSC-H / FSC-W. הניתוח נעשה בתוכנת FCM קונבנציונלית. מגרשים להראות את השלבים השונים של האסטרטגיה gating. תאים בתוך FSC-A / SSC-שער הלימפוציטים מסומנים בכחול, ואילו התאים בתוך השער תא האפיתל במעי מסומנים באדום. חצים המצביעים על עיוותי אוכלוסייה שונות קרינה אוטומטית. מגרשי C להראות את ניתוח נתונים שהושגו FCM רפאים ללא ניהול autofluorescence ב unmixing, ואילו D מציג אותם הנתונים לאחר שאינו מתרכך זה בזה עם הנהלת autofluorescence.
לב עוברי
FCM הקונבנציונלי הראה אוכלוסייה עיקרית של תאי-ניאון אוטומטי (חץ שחור) כי הייתה מהאנליזה כי זה לא זרח ב CD45 וערוץ dump TER119 (PE), סימון תאי hematopoietic. לעומת זאת, האוכלוסייה אוטומטית פלורסנט זה לא היה נוכח ככזה FCM רפאים הורכב ב CD45
איור 4: תאים פלורסנט באופן אוטומטי ב- המתלים תא E17.5 לב כלולים כראוי בשבריר Cell שלילי ספקטרלי FCM. (א) השעיות Cell מלבבות עובריים הוכתמו אנטי TER119 ו CD45-PE, SCA-1-PECy5, ו CD31-APC נוגדנים ברצף רכשו בשלושת המכשירים. חיצים שחורים להראות תאים-ניאון אוטומטי בשני convecytometers ntional, בעוד תאים אלה אינם מזוהים כמו-ניאון אוטומטי cytometry רפאים ובכך ניתן לנתח מכתים פלורסנט ספציפי. (B) אוטומטי פלורסנט תאים (בתוך השער אליפטי בירוק), אבל לא CD31 + תאים (שער מלבני בשליטה כחולה, שלילי), הראה את הביטוי של טרופונין לבבי (TNNT2) 7 ואור פרוזדורים שרשרת-2 (MYL7) 8 תעתיקים. au - ביחס יחידות שרירותיות תמליל GAPDH שמירה-הבית. מנתונים שהוצגו ערך ממוצע כפי ± SEM.
| לייזר עירור | fluorochrome | ספֵּצִיפִיוּת | Clone | |
| 488 ננומטר | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 ננומטר FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 ננומטר | פ | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 ננומטר | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 ננומטר | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 ננומטר | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 ננומטר | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 ננומטר | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 ננומטר | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 ננומטר | יודיד propidium | יכולת הקיום | ||
| 405 ננומטר | V450 | IGD | 11-26c.2a | 405 ננומטר | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 ננומטר | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 ננומטר | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 ננומטר | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 ננומטר | BV650 | הנוגדן CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 ננומטר | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 ננומטר | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 ננומטר | להתפתח 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | מְזוּכָּך | CD16 / CD32 | 2.4G2 | בלוק FC-קולטן |
| רשימת הנוגדנים המשמשת Cardiהשעית תא ac | ||||
| 638 ננומטר | אלקסה פלואוריד 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 ננומטר | פ | CD45 | 30-F11 | |
| 488 ננומטר | PE-Cy5 | SCA-1 | D7 | |
| 488 ננומטר | פ | Ter119 | TER-119 | |
טבלה 1: רשימת הנוגדנים המשמשים בלוח 19-צבע השעיה סלולרית לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FCM הקונבנציונלי מבוסס על זיהוי של פוטונים הנפלטים לאחר העירור של בדיקות ניאון. פליטת הקרינה של fluorochrome אחד זוהה גלאי שנועד למדוד את האות מ fluorochrome אחר גורמת חפיפה פיזית. זליגה זה בין ספקטרום פליטה צריכה להיות מתוקנת על ידי פיצויים.
FCM ספקטרלי ועיבוד נתונים על ידי אלגוריתם פישוט unmixing מאפשרים שילוב של fluorochromes עם פסגות פליטה קרובות ללא פיצוי נוסף, בתנאים שיש להם צורות רפאים שונות. האלגוריתם המשמש לניתוח מתייחס קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי, הפחתת קרינה הלא ספציפית השעיות תא רקמה מוצקות.
פאנל של 19 fluorochromes הורכב לנתח תאי מערכת החיסון באמצעות רק שני לייזרים (488 ננומטר ו 405 ננומטר). ואכן, כאשר לייזר 638 ננומטר היה על, קטע של PMT 32 ערוצים המתאיםאל גל עירור של הלייזר הזה לא היה זמין. כדי לקבל את יכולת האיתור מקסימלית של PMT, הליזר האדום היה כבוי. תאי טחול עכבר נותחו, המאפשרים זיהוי של יותר מ 12 אוכלוסיות תאים שונות, שחלקם מורכב 1% או פחות של תאי hematopoietic.
כדי לבחון את היכולת של ספקטרלי FCM לנהל קרינה אוטומטית, שני מצבים שונים שיכול לפגוע הניתוח נבדקו: אחד שבו לימפוציטים היו מזוהמים תאי האפיתל, ואחד שבו תאי לב-ניאון אוטומטי נותחו. בניגוד קונבנציונאלי FCM, cytometry ספקטרלי מאפשר אפליה מכל תת הלימפוציטים, גם כאשר הם מייצגים תת קטין.
המחלוקת סביב יכולת ההתחדשות של שריר הלב המבוגר 9, 10, 11, הוא בחלקו בשל היעדר אסטרטגיה דיסcriminate ולבודד תת ברור של תאי קיימא בלב. ניתוח רב-פרמטריים המגדירים שילובים ייחודיים של סמנים להפלות תת הלב שונים עשויה לאפשר זיהוי של תת נדיר בגלל מספר גדול של תאים כי ניתן לנתח. לבבות עובריים (E17.5) נותחו, וגם חלק גדול של תאים אוטומטיים ניאון, אשר היה חמקו מזיהוי ב קונבנציונלי FCM, שולב תא תא לב הקיימא שאינו hematopoietic ב ספקטרלי FCM.
בעיה חוזרת ונשנית של שיטה זו היא דרישת נוגדני שכותרתו פלורסנט באיכות טובה. זה קריטי במיוחד כאשר באמצעות צבעי טנדם, שבו מרכיב של טנדם הוא דומיננטי. לדוגמה, BV786 ו Cy7-PE יכול להיות קשה להבחין בין BV421 ו PE, בהתאמה.
FCM מבוסס על ספקטרומטריית מספק כוח אנליטי גבוה יותר מזה שהושג עם FCM קונבנציונלי, ללא צורך מטר פיצויatrices. כתב יד זה מספק ראיות כי קיימת גישה חלופית המדגימה קיבולת אנליטית גבוהה, בהעדר מטריצות פיצוי מורכבים, אפלית unimpaired של תת תאים עקב קרינה אוטומטית, ובלי התחייבויות פיננסיות נוספות שעדיין נדרשו עבור FCM ספקטרומטריית מסה. Spectral FCM ובכך נראה כי שיטת בחירה של הניתוח של תאים המתקבלים ממגוון רחב של רקמות מוצקות בדרך כלל לא מקובל FCM הקונבנציונלי והוא יכול לשמש גידול, התפתחותיים, גזע בביולוגיה של תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים את התרומות הטכניות תיאורטיות ב cytometry ספקטרלי של ק Futamura, שגם מתוקן באופן ביקורתי את כתב היד. אנחנו גם חבנו ג איט-מנצור, P.-H. Commere, א Bandeira, ו פ פרירה לקריאה ביקורתית את כתב היד ואת לקבלת ייעוץ טכני אינסופי ותמיכה. אנו מודים גם פ פרירה על המתנה של נוגדני Vγ7-APC ו Vδ4-ביוטין שכותרתו אנטי. אנחנו aknowledge המרכז d'Enseignements ממכון פסטר עבור מסבירת פנים בתמיכה לוגיסטית הצילומים. עבודה זו נתמכה על ידי מכון פסטר, Institut National de la Santé et de la משוכלל ונדיר Medicale (INSERM); קרן המדע הלאומי השוויצרי ו Roux Bourse פסטר (SS); Fundação para EA Ciencia Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); ו אוניברסיטת פריז דידרו, הפרויקט סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR) Twothyme, את ANR, ואת תוכנית להחיות (השקעה לעתיד) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
