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Biology

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

doi: 10.3791/55578 Published: May 5, 2017

Summary

Questo articolo descrive spettrale citometria, un nuovo approccio per citometria di flusso che utilizza le forme di spettri di emissione per distinguere fluorocromi. Un algoritmo sostituisce compensazioni e può trattare auto-fluorescenza come parametro indipendente. Questo nuovo approccio permette la corretta analisi delle cellule isolate da organi solidi.

Abstract

Citometria a flusso è stato utilizzato negli ultimi 40 anni per definire e analizzare il fenotipo di linfoide e di altre cellule ematopoietiche. Inizialmente limitata all'analisi di alcuni fluorocromi, attualmente esistono diverse decine di coloranti fluorescenti, e fino a 14-18 diversi coloranti possono essere combinati in un momento. Tuttavia, alcune limitazioni ancora alterino le capacità analitiche. A causa della molteplicità di sonde fluorescenti, analisi dei dati è diventata sempre più complessa a causa della necessità di grandi matrici compensazione multiparametriche. Inoltre, i modelli di topo mutante che trasportano proteine ​​fluorescenti per rilevare e tracciare specifici tipi cellulari nei diversi tessuti sono diventati disponibili, quindi è necessaria l'analisi (mediante citometria di flusso) di sospensioni cellulari auto-fluorescenza ottenute da organi solidi. Spectral citometria a flusso, che distingue le forme di spettri di emissione lungo un ampio intervallo di lunghezze d'onda continue, affronta alcuni di questi problemi. I dati vengono analizzati with un algoritmo che sostituisce matrici di compensazione e tratta autofluorescenza come parametro indipendente. Così, spettrale citometria di flusso dovrebbe essere in grado di discriminare fluorocromi con picchi di emissione simili e può fornire un'analisi multiparametrica senza esigenze di compensazione.

Questo protocollo descrive il flusso spettrale analisi di citometria, consentendo un 21-parametro di caratterizzazione (19 sonde fluorescenti) e la gestione di un segnale di auto-fluorescente, fornendo alta risoluzione nel rilevamento popolazione minore. I risultati qui presentati indicano che il flusso spettrale presenta citometria vantaggi nell'analisi delle popolazioni cellulari da tessuti difficili da caratterizzare in flusso convenzionale citometria, come il cuore e l'intestino. Spectral citofluorimetria così dimostra la capacità di analisi multi-parametrica di gestione performante flusso convenzionale citometria senza obbligo di compensazione e consente auto-fluorescenza.

Introduction

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Negli ultimi decenni, Citometria a flusso (FCM) è diventato un metodo analitico ampiamente disponibile essenziale per gli studi di fenotipizzazione delle cellule. V'è stato un aumento sostanziale nei coloranti fluorescenti disponibili, in particolare fluorocromi eccitati dal laser viola (405 nm) (ad esempio, viola brillante e nuovi coloranti Q-dot). Tuttavia, la crescita di coloranti fluorescenti disponibili aumenta il rischio di emissioni sovrappongono e richiede matrici compensazione intensità di lavoro. FCM diventato ampiamente utilizzato per analizzare sospensioni di cellule da tessuto solido, ma la presenza di cellule auto-fluorescente limita la discriminazione delle popolazioni specificamente etichettati.

I principi fondamentali della spettrale FCM sono riportati in dettaglio nel Futamura et al. 1, 2. Brevemente, la FCM spettrale qui utilizzato (vedere la tabella dei materiali) è dotato di 405, 488 e 638 nm laser. La spettrale FCM cattura tutto il f emessaLuorescenza come spettro in un array lineare a 32 canali PMT (32ch PMT) per 500 nm a 800 nm e 2 PMT indipendenti per 420 nm a 440 nm e rispettivamente da 450 a 469 nm che sostituiscono i tradizionali filtri passa-banda. I punti laser 488 e 405/638 nm sono separati spatialmente, mentre i punti laser 405 nm e 638 nm sono co-lineari. Per ogni singola particella, l'FCM spettrale misura fino a 66 canali di dati di fluorescenza eccitati dai laser da 405 nm e 488 nm. Quando le cellule sono eccitate dal laser da 638 nm, l'FCM spettrale misura 58 canali di dati di fluorescenza, perché viene inserita una maschera per impedire che il laser da 638 nm brilla nel PMT. FCM Spectral analizza i dati dello spettro completo acquisito con un algoritmo basato sul metodo Ponderato dei minimi quadrati (WLSM), che consente la separazione di spettri fluorescenti sovrapposti. Spectra derivata da campioni singoli macchiati e non colorati sono riconosciuti come gli spettri di base di riferimento. I campioni multi-colorati sono dotati di matematica and miscelati, e lo spettro di un campione con etichette fluorescenti misti viene scomposto in una raccolta dei suoi spettri costituente. L'unmixing, nella tecnologia spettrale 3, 4, sostituisce la compensazione che rimuove il segnale da tutti i rivelatori tranne quella che misura un determinato colorante.

In questo studio, abbiamo combinato e testati 19 fluorocromi in una singola analisi 21-parametro che caratterizza i principali sottoinsiemi ematopoietiche presenti nella milza mouse. Inoltre, abbiamo dimostrato che la citometria spettrale può gestire segnale auto-fluorescente, migliorando così la caratterizzazione intestinale linfociti intra-epiteliali e del cuore embrionale. Infatti, in questi tessuti, gestione auto-fluorescenza consentito per l'assegnazione di fluorescenza specifica per le cellule che sarebbero esclusi dall'analisi in FCM convenzionale.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo l'Istituto Pasteur etica Carta e gli orientamenti dell'Unione europea e sono stati approvati dal Ministero dell'Agricoltura francese.

1. Preparazione di cellule in sospensione da topo adulto Organi

  1. Isolamento di splenociti
    1. Euthanize topi adulti per dislocazione cervicale. Fare un'incisione sulla linea mediana dell'addome e aprire la pelle con le forbici. Raccolto la milza con una pinza.
    2. Schiacciare la milza tra 2 microscopio vetrini dissociare le cellule e diluire in 5 mL di soluzione equilibrata salate di Hank (HBSS) contenente 1% di siero di vitello fetale (FCS).
    3. Centrifugare per 10 min a 120 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante.
    4. Risospendere il pellet in 5 ml di HBSS 1% FCS. Contare le cellule con una camera di Neubauer utilizzando un Trypan blu colorazione vitale.
      NOTA: 80 milioni di cellule dovrebbe essere ottenuto da uno spleen adulto.
  2. isolatisu cellule dall'intestino tenue
    1. Euthanize topi adulti per dislocazione cervicale. Utilizzando le forbici, fare un'incisione nella pelle sulla linea mediana dell'addome. Afferrare il piccolo intestino con una pinza in una mano e usare le forbici per tagliare ad entrambe le estremità: primo, subito dopo lo stomaco e poi alla fine del piccolo intestino, appena prima l'intestino crasso. Lavare l'intestino tenue con 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) utilizzando una siringa da 2 ml con un ago.
    2. Mettere il piccolo intestino su un tovagliolo di carta e con attenzione rimuovere placche di Peyer con un paio di forbici affilate.
    3. Usare le forbici per aprire l'intestino sul suo lato lungo inserendo un ramo delle forbici all'interno dell'intestino. Tagliare l'intestino aperto in pezzi 1 cm usando forbici affilate.
    4. Incubare per 30 minuti a 37 ° C sotto costante agitazione in 30 ml di HBSS con 10% FCS.
    5. Posizionare la sospensione cellulare con i frammenti non dissociati rimanenti in 50 mLtubo di plastica e vortex per 5 min a velocità elevata. NOTA: Non v'è più la dissociazione del tessuto.
    6. Incubare per 10 min in ghiaccio per consentire ai grandi frammenti non dissociati a pellet.
    7. Raccogliere il surnatante e concentrarlo per centrifugazione per 7 minuti a 120 x g.
    8. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di HBSS con 1% FCS. Contare le cellule con una camera di Neubauer utilizzando un Trypan blu colorazione vitale.
      NOTA: ~ 60 milioni di cellule intraepiteliali (IELS) dovrebbero essere ottenuti da un adulto piccolo intestino.
  3. Strategia di progettazione Panel
    1. Preparare i pannelli con anticorpi direttamente accoppiati con fluorocromi.
      NOTA: Tutti gli anticorpi sono già titolati per ottenere la definizione ottimale delle popolazioni cellulari (titolazione può variare con il lotto anticorpo). Gli anticorpi utilizzati nel pannello 19 colori per macchiare splenociti sono elencati nella Tabella 1.
    2. Costruire multi-coloPannelli r per citometria. Dato che questo può essere un compito impegnativo, utilizzare le seguenti linee guida per ottimizzare i pannelli:
      1. Controllare la configurazione spettrale e i coloranti fluorescenti che possono essere utilizzati sullo strumento.
      2. Utilizzare le informazioni di luminosità Index / Indice colorazione fornito dal produttore.
        NOTA: La luminosità Index / Indice di colorazione è l'indicatore relativo di intensità di fluorescenza contro sfondo per ogni fluorocromo.
      3. Scegli gli anticorpi seguendo le regole di seguito:
        1. Scegliere le fluorocromi più brillanti per le proteine ​​che vengono espresse debolmente e fluorocromi più debole per le proteine ​​più altamente espresse.
          NOTA: Per esempio, CD45, CD4, CD8 e sono altamente espresse e possono essere utilizzati con fluorocromi dim.
        2. Iniziare a progettare il pannello prima di scegliere gli anticorpi con il minor numero di possibilità colorante fluorescente.
        3. Se possibile, scegliere coloranti fluorescenti con la più piccola sovrapposizione di emissione spettri fo marcatori espressi sugli stessi tipi cellulari.
          NOTA: Tandem (es, PE-Cy5, PE-Cy7 e PerCP-Cy5.5) deve essere usato con cautela, in quanto sono più suscettibili alla degradazione da esposizione alla luce.
  4. Colorazione di cellule per l'analisi di citometria
    1. Preparare una provetta 5 ml di 1 x 10 6 splenociti e una provetta 5 ml di 1 x 10 6 cellule intestinali e tenerli non colorato per uso come controlli negativi.
    2. Preparare ed etichettare una provetta 5 ml per campione e per pannello secondo la Tabella 1. Preparare la miscela di anticorpi, secondo la Tabella 1, in HBSS 1% FCS.
    3. Trasferire 1 x 10 6 cellule - o splenociti o cellule intestinali - in ogni provetta 5 ml. Aggiungere 2 ml di HBSS 1% FCS e centrifugare per 5 minuti a 4 ° C e 120 x g. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 50 ml di mix di anticorpi.
    4. Etichetta le splenocytes in 2 fasi. In primo luogo, utilizzare 50 microlitri della miscela contenente gli anticorpi marcati con PE-Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5.5, e PerCP (con Fc recettore bloccante) in una provetta da 5 mL. Dopo 20 min di incubazione al buio a 4 ° C, aggiungere 50 microlitri della miscela contenente tutti gli altri anticorpi in una provetta da 5 mL.
      NOTA: Questa strategia limita sterico.
    5. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C.
    6. Aggiungere 2 ml di HBSS 1% FCS e centrifugare per 5 minuti a 4 ° C e 120 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 200 ml di HBSS 1% FCS con 0,5 ug / ml di ioduro di propidio (PI).

2. Preparazione di Single-colorazione per ogni Fluorocromo su terziari compensazione branello Microsfere (ad esempio, UltraComp eBeads), nel seguito indicato come Beads

  1. Preparare ed etichettare come molti tubi 5 mL come il numero di anticorpi che vengono utilizzati nei pannelli. Mettere 1 goccia di perle in ogni provetta e aggiungere 1 & #181; L di anticorpo per provetta.
    NOTA: Le perle usate qui (vedere la tabella dei materiali) contengono macchiato (positivo) e perline non colorati (negative). Gli anticorpi sono messi in eccesso sulle perline per garantire un segnale luminoso e quindi una chiara firma spettrale per ogni colorante. Questo è richiesto dal software per essere in grado di fare un unmixing preciso.
  2. Incubare per 20 minuti al buio a 4 ° C.
  3. Aggiungere 2 ml di HBSS 1% FCS e centrifugare per 5 min a 120 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 100 ml di HBSS 1% FCS.

3. Sospensione cellulare Preparazione da cuori embrionali di topo

  1. Dissezioni di embrioni
    1. Pianificare avere femmine gravide scaduta di anticipo accoppiando 2 femmine con un maschio (sempre nella gabbia del maschio) alla fine della giornata (tra 17 e 19 h). La mattina dopo, le femmine con i tappi vaginali sono considerati a 0,5 giorni post-coitum.
    2. Eutanasia il femal incinta E17.5es per dislocazione cervicale. Assicurarsi che l'animale non risponde premendolo fermamente sulla zampa mouse (toe-pinch riflesso). Bagnare l'addome con 70% etanolo per sterilizzare e per prevenire la diffusione della pelliccia mouse.
    3. Fare un'incisione nella pelle al centro dell'addome con le forbici e tirare la pelle a parte con le dita.
    4. Aprire la cavità addominale tirando e facendo incisioni nel muscolo addominale dal centro verso i due lati dell'addome con pinze e forbici lordi.
      NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l'intestino tenue, che è immediatamente sotto il muscolo peritoneale.
    5. Raccogliere le corna uterine (con gli embrioni) tagliando sia a livello del corpo uterino e delle ovaie. Ammollo in 90 x 15 mm 2 piastra di Petri con 50 ml di DPBS.
    6. Isolare ogni embrione tagliando tra ogni decidua, seguita dalla parete muscolare dell'utero e il sacco vitellino viscerale con una pinza sottile e forbici. Estrarre l'int embrioniatto. Infine, tagliare il cordone ombelicale.
    7. Tagliare teste degli embrioni E17.5 con le forbici (decapitazione) prima di iniziare la dissezione.
  2. Raccolta di cuori
    1. Immergere gli embrioni decapitati in 90 x 15 mm 2 Petri contenente un umido biancheria tovagliolo di carta sul fondo piatto e 50 ml di HBSS con 1% FCS.
    2. Sotto uno stereomicroscopio, tenere ogni embrione con una pinza lordi modo che il lato ventrale rivolto verso l'alto.
    3. Aprire con cautela la griglia toracica tagliando il lato destro del petto con forbici per evitare danni al cuore.
    4. Esporre il cuore tenendo la gabbia toracica con una pinza lordi.
    5. Separare cuore (ancora assemblato con polmoni e timo) tenendo grossi vasi (che contiene grandi vasi di in- e fuori flusso del cuore) e metterli in un x 15 mm 2 Petri piatto 35 con 2 ml di HBSS 1% con FCS.
    6. Isolare i cuori dagli organi circostanti etessuto connettivo con una pinza sottile e un bisturi.
    7. Lavare il cuore in un nuovo 35 x 15 mm capsula Petri con 2 mL di HBSS 1% FCS e tenerli in ghiaccio per 20 min per permettere il cuore di pompare il sangue all'interno delle camere.
  3. Preparazione di sospensioni di cellule cardiache
    1. Pre-riscaldare la collagenasi 200 pg / mL in HBSS + / + (di seguito indicato come soluzione enzimatica) a 37 ° C.
      NOTA: Diluire la collagenasi in HBSS + / + (con Ca 2+ e Mg 2+ cationi) per massimizzare l'attività enzimatica; attività collagenasi è stabile tra i lotti.
    2. Sostituire la soluzione di lavaggio ammollo i cuori (HBSS 1% FCS) con 1 ml di soluzione enzimatica pre-riscaldato.
    3. Sotto uno stereomicroscopio, tritate i cuori in 1-mm 3 pezzi con una pinza sottile e un bisturi. Aggiungere un altro 1 mL di soluzione enzimatica pre-riscaldato e trasferire il tessuto tritato in una provetta da 5 ml con un coperchio.
      NOTA: Per una digestione ottimale, posizionare unmassimo di 5 E17.5 cuori per 2 ml di soluzione enzimatica. Se più cuori sono digeriti, allo stesso tempo, dividerle in differenti 5 tubi mL.
    4. Incubare i cuori tritati per 15 minuti a 37 ° C.
      NOTA: stabiliscono le provette 5 mL (correttamente chiuso) nell'incubatore per diffondere il tessuto lungo la soluzione.
      1. Al termine dell'incubazione, omogeneizzare il tessuto nella stessa soluzione enzimatica pipettando su e giù circa 20 volte con la pipetta P1000. Inserire il tubo 5 ml in posizione verticale e lasciare che il rimanente frammento di tessuto sedimento (circa 3 min).
      2. Raccogliere il surnatante (contenente le cellule digerite in sospensione) in un tubo da 50 ml, si aggiungono 2 ml di HBSS 10% FCS (lo stesso volume come il volume di soluzione enzimatica aggiungere ai frammenti di tessuto), e tenerli su ghiaccio mentre continua la processo di digestione.
        NOTA: La soluzione FCS 10% HBSS e il ghiaccio sono importanti per inattivare l'azione dell'enzima mentre il tessuto rimanente èdigerire.
      3. Aggiungere 2 mL di soluzione enzimatica pre-riscaldato ai tubi 5 mL con i frammenti di tessuto rimanenti e continuare la digestione ripetendo il passaggio 3.3.4 finché non si osserva più tessuto.
        NOTA: Circa 4 cicli di digestione sono sufficienti per dissociarsi completamente il tessuto cardiaco (5 E17.5 cuori in 2 mL di soluzione enzimatica).
    5. Centrifugare le provette da 50 ml con cellule in sospensione per 10 min a 300 xg ed eliminare il surnatante.
    6. Risospendere il pellet cellulare, aggiungere 1 ml di HBSS - / - 1% FCS, e filtrare la sospensione cellulare se una rete di nylon 70 um. Contare le cellule con una camera di Neubauer utilizzando un Trypan blu colorazione vitale.
      NOTA: Risospendere le cellule con HBSS - / - aggregazione cellulare (senza Ca2 + e Mg2 + cationi) per ridurre al minimo. Tra 800.000 e 1.000.000 di cellule sono ottenute da un cuore E17.5.
  4. Colorazione delle cellule cardiache con anticorpi fluorescenti
    NOTA: Tutte antibodi vengono preventivamente titolati per ottenere definizione ottimale delle popolazioni cellulari (titolazione può variare con il lotto anticorpo) .I anticorpi utilizzati nel pannello cuore sono elencati nella Tabella 1.
    1. Distribuire le cellule cardiache in sospensione attraverso una piastra a 96 pozzetti (fondo tondo). Distribuire uniformemente in tutti i pozzetti necessari (200 microlitri per pozzetto), a breve centrifuga centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 1 min a 480 xg, e scartare il surnatante.
      NOTA: tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti (fondo tondo) può essere utilizzato.
    2. Risospendere il pellet e incubare le cellule cardiache per 20 minuti al buio a 4 ° C con 100 ml di cocktail di anticorpi (cioè, CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647, e Sca-1-PE-Cyanine5 ) diluito in HBSS - / - 1% FCS.
    3. Lavare le cellule cardiache dall'eccesso di anticorpi aggiungendo 200 ml di HBSS - / - 1% FCS e corto centrifuga centrifugazione le cellule per 1 min a 480 x g.
    4. Eliminare il surnatante e ripeterebreve centrifuga centrifugazione (fase 3.4.3).
    5. Risospendere le cellule in 200 ml di HBSS - / - 1% FCS e trasferirli in una provetta ml 5 già contenente 200 ml di HBSS - / - 1% FCS.
    6. Prima acquisizione, aggiungere 400 ml di HBSS - / - 1% FCS con 0,5 ug / mL PI e filtrare la sospensione cellulare se una rete di nylon 70 um.

4. Acquisizione di etichettati cellule della milza, intestinali e cardiaci con la spettrale citofluorimetro

  1. Prima di acquisizione dei dati, calibrare automaticamente la spettrale citometro seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire la ogni giorno dell'esperimento delle procedure di controllo di qualità mensili quotidiana e.
  2. Quando il citometro è pronto, avviare l'anteprima dei campioni contenenti le sospensioni cellulari marcati con tutti gli anticorpi.
    NOTA: Non acquisire.
  3. Assicurarsi che tutti i laser sono come richiesto. Regolare il guadagno FSC tale che tutte le cellule sono visibili nella rispettivatrame. Cancello popolazione cellulare e diffusa questa porta ai due trame spettrali corrispondenti ai 488 nm ed a laser 638/405 nm.
    NOTA: Quando fluorocromi sono eccitati dal laser 638 nm (cioè, quando il laser 638 nm è acceso), v'è una maschera che scudi luce da 617-662 nm per evitare il laser 638 nm da lucidare in PMT. Questo induce la perdita di una parte dello spettro e quindi provoca una separazione inferiore chiudi coloranti che emettono a queste lunghezze d'onda. Tuttavia, l'intero segnale può essere raccolto spegnendo il laser 638 nm se non è necessario per l'acquisizione.
  4. Regolare il fotomoltiplicatore 32 canali (PMT) tensione (%) in modo tale che tutti i fluorocromi sono all'interno della gamma di intensità visualizzato nel y (1-10 6) nelle due diverse trame spettrali visualizzazione 488 nm e 405/638 eccitazioni nm.
    NOTA: La formazione è tenuto a riconoscere gli spettri di tutti fluorocromi utilizzati.
  5. Inizia ad acquistare i campioni. Clicca su "; Anteprima" per visualizzare le celle sullo schermo e poi clicca su 'Acquisisci' per registrare il campione Risparmia fino a 2 x 10 6 eventi da ciascun campione..
  6. Dopo aver acquisito i campioni macchiati, acquisire il campione colorato con il colorante vitale e quindi le sfere di compensazione macchiate individualmente con tutti gli anticorpi utilizzati. Clicca su “Anteprima” per visualizzare le cellule sullo schermo e poi su “Acquisisci” per registrare i campioni.
    NOTA: tenere la stessa tensione PMT per tutti i campioni ed i controlli (ad esempio, perline e campioni non colorati); 5.000 eventi sono ampiamente sufficienti.
  7. Infine, acquisire i dati delle sospensioni di cellule non marcate. Clicca su "Anteprima" per visualizzare le cellule sullo schermo e poi su "Acquisisci" per registrare i campioni.
    NOTA: L'acquisizione dei campioni senza macchia alla fine dell'esperimento minimizza il riporto di cellule fluorescenti.
  8. Pulire il citometro seguendo le istruzioni di un del produttored chiudere l'esperimento nella cartella di acquisizione.
    NOTA: Solo dopo aver chiuso l'esperimento è salvato ed è disponibile per l'analisi.

5. Analisi dei dati con il software spettrale FCM

  1. Nella finestra "Color Palette" della scheda "Analysis", registrare tutti i parametri presenti nel pannello aggiungendo ogni fluorocromo utilizzato e sull'indicatore corrispondente (seleziona dall'elenco disponibile o aggiungere un nuovo parametro). Inoltre, includere i parametri di auto-fluorescenza e vitalità; tutti i parametri selezionati verranno visualizzati nella finestra "unmixing".
  2. Selezionare il primo campione macchiata singolo (fatto con sfere di compensazione) nella finestra "controllo" sotto la "Lista Tube" di questo esperimento sulla scheda “Analysis”. Nel foglio di lavoro, fare clic sul "strumento di progettazione del poligono" e la progettazione di un cancello sulla popolazione di sfere nel plot FSC / SSC. Fare doppio clic sulla parte superiore della porta per aprire un diagramma spettrale o dotla visualizzazione delle sfere gated in una trama figlia.
    1. Progettare una porta per il positivo e una porta per le perline negativi sia sullo spettro o sul dot-plot. Controllare l'intero spettro corrispondente ai due insiemi laser per ogni frazione positiva e negativa ed eliminare valori anomali in successione gating e cliccando sul cancello per verificare popolazione figlia. Inserire le porte negativi e positivi nella finestra "unmixing".
    2. Ripetere il passaggio 5.2 per ogni singolo campione macchiato.
      NOTA: Tenere presente che la strategia di gating positivo e negativo corrisponde al campione che si sta analizzando, anche se il programma permette di essere collocato in qualsiasi campione. Invece di determinare una frazione negativo per ciascun singolo campione macchiato, utilizzare un campione tallone macchia per impostare un negativo universale.
  3. Selezionare il campione di cellule senza macchia nella "Lista Tube" e cancelli di progettazione per autofluorescenti e per le cellule non-autofluorescenti.
  4. <li> Quando tutte le porte negativi e positivi per tutti i parametri, tra cui l'auto-fluorescenza e la vitalità, vengono selezionate nella finestra "unmixing", cliccare su "Calcola". Applicare l'unmixing ai campioni da analizzare.
  5. Analizzare i dati con la progettazione e la creazione di porte trame a due parametri.
    1. In primo luogo, la progettazione di un cancello per SSC contro FSC e quindi rimuovere le cellule morte, escludendo tutte le cellule marcate con il marcatore viabilità (PI contro CD45). Sul resto delle celle, cancelli progettazione per tutte le popolazioni di interesse seguito la strategia descritta per ciascuna sospensione cellulare (Figure 1-3).
      NOTA: Se necessario, regolare la compensazione nel "spettro di regolazione di riferimento." Questo è uno strumento che può essere utilizzato dopo unmixing di ri-regolare la mediana delle popolazioni positive per ogni fluorocromo se l'algoritmo non poteva farlo perfettamente.

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Representative Results

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21-parametro pannello FCM spettrale per analizzare splenociti

La Figura 1 mostra i risultati ottenuti con il pannello 19-fluorescente-anticorpo applicata alle cellule spleniche comprendenti diversi anticorpi che riconoscono sottoinsiemi di T, B, NK, dendritiche e cellule mieloidi, mentre CD45 etichette tutte le cellule nucleate ematopoietiche. Il pannello comprende inoltre un colorante vitalità (PI), nonché le dimensioni (FSC) e granularità parametri (SSC). La Figura 1A mostra gli spettri di riferimento fluorocromo. Dopo l'eliminazione delle cellule morte del CD45 + cancello (Figura 1B), l'analisi mostra che le cellule T CD3 + esprimono la catena TcRβ e hanno il CD4 / CD8 distribuzione prevista e percentuale di cellule CD25 + in cellule T CD4. cellule T CD8 mostrano una distribuzione normale dei CD44- e cellule Ly49D esprimono. Le cellule B CD19 + co-express B220 und MHCII, nonché IgM e IgD, tipico delle cellule B della milza mature. Un sottogruppo di cellule NK NK1.1 + rappresenta un piccolo sottoinsieme di linfociti splenici che co-express Ly49D. Le cellule rimanenti comprendono un piccolo sottoinsieme di cellule dendritiche CD11c + con alti livelli di MHC II, alcuni dei quali erano anche CD11b +. F4 / 80 + cellule caratteristica di macrofagi tissutali residenti co-espresso CD11b ei più alti livelli di CD44 presenti nella milza. Le cellule rimanenti (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) possono essere suddivise per l'espressione di CD11b e Gr1, dove il piccolo sottoinsieme di cellule doppio positive esprimono alti livelli di CD44, probabilmente corrispondente ad progenitori notoriamente presente alle basse frequenze nella milza. Una grande frazione è negativa per i tre marcatori. La figura 2 mostra la stessa analisi prima di regolare la compensazione.


Figura 1: Un Pannello anticorpo 19 colori per l'analisi di cellule murine milza. Splenociti (A) topo sono stati colorati con la combinazione di anticorpi precedente, alla quale evolvere-CD45 655 è stato aggiunto. Gli spettri di riferimento di tutti fluorocromi sono mostrati. CD45 fluoroforo-marcato viene contrassegnato da una freccia rossa. Fluorocromi sono elencati nella Tabella 1. (B) i grafici di contorno mostrano la capacità discriminante di questa analisi multi-parametrica per separare le diverse popolazioni di B, T, cellule NK, dendritiche, o mieloidi. L'analisi è stata fatta nel software convenzionale FCM dopo unmixing deconvoluzione.

figura 2
Figura 2: Un Pannello anticorpo 19 colori per l'analisi di cellule murine milza. La stessa analisi come in figura 1 è stata fatta prima della adjustment della compensazione con il regolatore spettri di riferimento.

Piccolo intestino linfociti intra-epiteliali

Diverse popolazioni di cellule T si trovano nell'intestino all'interno dello strato di cellule epiteliali 5, 6. isolamento convenzionale di questi sottoinsiemi comprende un gradiente di densità che separa linfociti da cellule epiteliali. Tuttavia, questa preparazione è delicata, che richiede tempo, e si traduce in perdita di cellule. Per migliorare la quantificazione e facilitare la procedura sperimentale, il potenziale di spettrale FCM discriminare popolazioni di linfociti intestinali all'interno di una grande frazione di cellule epiteliali è stato testato. Dopo la distruzione meccanica del tessuto epiteliale, sospensioni cellulari sono state colorate con anticorpi che etichetta sottoinsiemi di αβ e γδ cellule T solitamente presenti nell'epitelio intestinale. Ilcellule sono state analizzate in due citometri convenzionali e in FCM spettrale.

La Figura 3 mostra i risultati dopo seguendo una strategia di gating simile, con l'eliminazione delle cellule morte gating sulle cellule PI-negative. La presenza di cellule auto-fluorescente è evidente in tutti i citometri convenzionali e in citometria spettrale quando il manager auto-fluorescenza è inattivato (pannelli superiori, frecce rosse), con conseguente scarsa discriminazione delle cellule viventi. In tutti i grafici, le cellule all'interno della A-FSC / SSC-A gate linfocitario sono mostrati in blu e cellule con disperde più grandi (cancello cellule epiteliali) sono mostrati in rosso. Entrambi gli strumenti convenzionali erano in grado di risolvere il sottoinsieme di cellule T CD3 + (blu) (turchese freccia) dalle cellule rimanenti. Pertanto, TcRβ - cellule (freccia verde) contaminato il CD3 + TcRγδ - della popolazione, un sottoinsieme biologicamente improbabile mai rilevato dopo la Separatisui linfociti di cellule epiteliali. Al contrario, in spettrale FCM dopo gestione auto-fluorescenza, l'analisi dei diversi sottoinsiemi di cellule T non è stata compromessa dalla presenza di cellule epiteliali, le popolazioni erano ben separati, e non c'erano cellule TCR-negative del CD3 + cancello.

Figura 3
Figura 3: la presenza di cellule Auto-fluorescenti non compromette il rilevamento dei linfociti intra-epiteliali Spectral FCM. Piccole cellule intestinali, comprese le cellule epiteliali e linfociti, sono state colorate con anticorpi che riconoscono TcRδ, PI, TcRβ Cy7-APC CD3 (pannelli B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (pannelli C), e CD8 FITC (pannelli D). PI è stato aggiunto nel tampone FACS prima dell'analisi. L'acquisizione dei dati è stata fatta in modo sequenziale nei tre strumenti dopo il controllo di qualità appropriata. Doppiette erano eliminated in FSC-H / FSC-W. L'analisi è stata fatta nel software FCM convenzionale. Grafici mostrano le varie fasi della strategia di gating. Cellule all'interno della FSC-A / SSC-A gate linfocitario sono etichettati in blu, mentre le cellule all'interno della porta cellule epiteliali intestinali sono etichettati in rosso. Le frecce indicano diverse distorsioni della popolazione e auto-fluorescenza. Trame in C mostrano le analisi dei dati ottenuti in FCM spettrale senza gestione autofluorescenza nel unmixing, mentre D mostra gli stessi dati dopo unmixing con gestione autofluorescenza.

cuore embrionale

FCM convenzionale ha mostrato una grande popolazione di cellule auto-fluorescente (freccia nera), che è stato escluso dall'analisi perché fluoresced nel CD45 e TER119 canale di scarico (PE), che segna cellule ematopoietiche. Al contrario, questa popolazione auto-fluorescente non era presente come tale nella spettrale FCM e fu compreso nel CD45 - sottoinsieme (Figura 4). Per dimostrare che queste cellule erano cardiaca e non endoteliali o ematopoietiche, che esprime bassi livelli di CD45, TER119 o CD31, l'espressione dei trascritti specifici per cardiomiociti sono stati quantificati in cellule ordinati. Alti livelli di troponina cardiaca T muscolare (TNNT2) 7 e atriale luce a catena-2 (MYL7) 8 trascrizioni sono stati trovati nella popolazione di auto-fluorescente.

Figura 4
Figura 4: Auto-fluorescente celle a E17.5 cardiache sospensioni cellulari vengono correttamente compreso nel negativo cella Frazione in Spectral FCM. (A) Le sospensioni cellulari da cuori fetali sono state colorate con anticorpi e sequenzialmente acquisite nei tre strumenti anti-TER119 e CD45-PE, Sca-1-PECy5 e CD31-APC. frecce nere indicano cellule auto-fluorescente in due convecitometri Ntional, mentre queste cellule non sono rilevati come auto-fluorescente in citometria spettrale e possono quindi essere analizzati per la colorazione fluorescente specifico. (B) cellule auto-fluorescente (all'interno del cancello ellittica verde), ma non CD31 + cellule (cancello rettangolare blu, controllo negativo), hanno mostrato l'espressione di troponina cardiaca (TNNT2) 7 e atriale catena leggera-2 (MYL7) 8 trascrizioni. au - unità arbitrarie rispetto al GAPDH trascrizione house-keeping. I dati presentati valore come media ± SEM.

<tr>
eccitazione laser fluorocromo Specificità Clone
488 nm BB515 CD8 53-6,7
488 nm FITC Ly49D 4E5
488 nm PE F4 / 80 6F12
488 nm PE-CF594 NK1.1 PK136
488 nm PE-Cy5 CD44 IM7
488 nm PE-Cy7 CD11b M1 / 70
488 nm PerCP-Cy5.5 IgM R6-60.2
488 nm PerCP Gr-1 RB6-8CS
488 nm AF532 CD3 17A2
488 nm ioduro di propidio vitalità
405 nm V450 IG D 11-26c.2a
405 nm BV421 CD11c HL3
405 nm BV510 CD19 1D3
405 nm BV570 TCRB H57-597
405 nm BV605 CD4 RM4-5
405 nm BV650 CD45R / B220 RA3-6B2
405 nm BV711 IA / IE M5 / 114
405 nm BV786 CD25 PC61
405 nm Evolve 655 CD45 30-F11
N / A purificato CD16 / CD32 2.4G2 blocco Fc-recettore
Elenco degli anticorpi utilizzati in cardisospensione cellulare ac
638 nm Alexa Fluor 647 CD31 MEC13.3
488 nm PE CD45 30-F11
488 nm PE-Cy5 Sca-1 D7
488 nm PE Ter119 TER-119

Tabella 1: Elenco degli anticorpi utilizzati nel pannello di 19 a colori e in cardiaco di cellule in sospensione.

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Discussion

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FCM convenzionale si basa sulla rilevazione di fotoni emessi dopo l'eccitazione di sonde fluorescenti. L'emissione di fluorescenza di un fluorocromo rilevato in un rivelatore progettato per misurare il segnale da un altro fluorocromo induce sovrapposizione fisica. Questo ricaduta tra spettri di emissione deve essere corretto da compensazioni.

FCM spettrale e elaborazione dati dall'algoritmo unmixing deconvoluzione consente la combinazione di fluorocromi con stretti picchi di emissione senza ulteriore compenso, purché abbiano diverse forme spettrali. L'algoritmo utilizzato per l'analisi tratta autofluorescenza come parametro indipendente, sottraendo fluorescenza non specifica da sospensioni di cellule di tessuto solido.

Un gruppo di 19 fluorocromi è stato assemblato per analizzare cellule immunitarie utilizzando solo due laser (488 nm e 405 nm). Infatti, quando il laser 638 nm era accesa, una sezione del PMT 32 canali corrispondentealla lunghezza d'onda di eccitazione di questo laser non era disponibile. Per ottenere la capacità di rilevamento massima della PMT, il laser rosso è stato spento. cellule spleniche di topo sono state analizzate, permettendo la rilevazione di più di 12 differenti popolazioni cellulari, alcuni dei quali comprendevano 1% o meno delle cellule ematopoietiche.

Per testare la capacità di spettrale FCM gestire auto-fluorescenza, sono stati testati due diverse situazioni che possono compromettere l'analisi: quello in cui i linfociti sono stati contaminati con cellule epiteliali, e quello in cui sono stati analizzati cellule cardiache auto-fluorescente. In contrasto con FCM convenzionale, citometria spettrale consente la discriminazione di tutti sottopopolazioni linfocitarie, anche quando rappresentano sottoinsiemi minori.

La controversia attorno alla capacità rigenerativa dei cardiomiociti adulti 9, 10, 11 è in parte dovuta alla mancanza di una strategia a discriminate e isolare sottogruppi distinti di cellule vitali nel cuore. Un'analisi multi-parametrica definendo combinazioni uniche di marcatori per discriminare i diversi sottoinsiemi cardiache potrebbe consentire di rilevare rare sottoinsiemi causa del gran numero di cellule che possono essere analizzati. cuori fetali (E17.5) sono stati analizzati, e una grande frazione di cellule auto-fluorescente, che sarebbero sfuggiti rilevamento FCM convenzionale, è stata integrata nel vano vitale cellula cardiaca non ematopoietiche in spettrale FCM.

Un problema ricorrente di questo metodo è la necessità di anticorpi fluorescenti etichettati buona qualità. Questo è particolarmente importante quando si utilizzano coloranti tandem, in cui un componente del tandem è dominante. Ad esempio, BV786 e Cy7-PE possono essere difficili da distinguere da BV421 e PE, rispettivamente.

FCM basato su spettrometria fornisce potenza analitica superiore a quella ottenuta con FCM convenzionali, senza la necessità di compensazione matrices. Questo manoscritto fornisce la prova che v'è un approccio alternativo che dimostra una grande capacità di analisi, l'assenza di matrici complesse di compensazione, la discriminazione inalterata di sottoinsiemi di cellule a causa di auto-fluorescenza, e senza impegni finanziari aggiuntivi che ancora necessari per FCM spettrometria di massa. Spettrale FCM appare quindi come un metodo di scelta per l'analisi di cellule ottenute da un'ampia varietà di tessuti solidi solito non suscettibili di FCM convenzionale e può essere utilizzato in tumore, dello sviluppo e biologia delle cellule staminali.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Riconosciamo i contributi tecnici e teorici in citometria spettrale di K. Futamura, che ha anche rivisto criticamente il manoscritto. Siamo anche in debito con C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira per la lettura critica del manoscritto e per la consulenza tecnica senza fine e sostegno. Ringraziamo anche P. Pereira per il dono degli anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina anticorpi marcati. Si ringraziano il Centre d'Enseignements da Pasteur per accogliere e sostenere la logistica di ripresa. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pasteur Institute, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); il Fondo nazionale svizzero e Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) del progetto Twothyme, l'ANR, e il Programma REVIVE (investimento per il futuro) (AC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Janvier Labs CD45.2 Source of cells
Ethanol 70% VWR 83801.36 Sterilization
DPBS (Ca2+, Mg2+) GIBCO ThermoFisher 14040-174 Embryos collection
Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) GIBCO Life ThermoFisher 14025092 Dissociation, digestion and staining solutions
Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) GIBCO Life ThermoFisher 14175095 Dissociation, digestion and staining solutions
Fetal calf serum (FCS) EUROBIO CVFSVF00-0U Dissociation, digestion and staining solutions
Collagenase Sigma C2139 Enzymatic solution
90 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.
TPP T93100 Embryos and hearts collection
35 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.
TPP T9340 Hearts collection
Fine iris scissor Fine Science Tools 14090-09 Dissection tools
Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) Fine Science Tools 11003-12 Dissection tools
Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) Fine Science Tools 11272-30 Dissection tools
Scalpel  VWR 21909-668 Dissection tools
LEICA MZ6 Dissection microscope LEICA MZ6 10445111 Sampling; Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source SCHOTT VWR KL1500 compact Sampling;
Two goose neck fibers adapted
FACS tubes VWR 60819-310 Digesting cells
96 well plate (round bottom) VWR 10861-564 Staining cells
Nylon mesh bolting cloth sterilized,
50/50 mm pieces.
SEFAR NITEX SEFAR NITEX Cell filtration
UltrasComp eBeads
Fluorescence labeled antibodies Biolegend Catalogue number see table below Staining cells

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References

  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87, (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11, (8), e0159961 (2016).
  3. Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
  4. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, (8), 648-655 (2004).
  5. Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169, (7), 3736-3743 (2002).
  6. Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210, (9), 1839-1854 (2013).
  7. Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25, (2), 115-123 (2004).
  8. Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141, (3), 585-593 (2014).
  9. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, (6), 763-776 (2003).
  10. Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116, (7), 1216-1230 (2015).
  11. Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23, (19), 2263-2273 (2014).
Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso
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Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (123), e55578, doi:10.3791/55578 (2017).More

Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (123), e55578, doi:10.3791/55578 (2017).

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