Summary
この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。
Abstract
フローサイトメトリーを定義し、リンパ系および他の造血細胞の表現型を解析するために、過去40年間使用されてきました。最初は少数の蛍光色素の分析に限定さ、現在、異なる蛍光色素の数十があり、最大14-18異なる色素を一度に組み合わせることができます。しかし、いくつかの制限は、まだ分析能力を損ないます。なぜなら蛍光プローブの多数のデータ解析は、大きな、マルチパラメトリック補償マトリックスの必要性にますます複雑になってきています。また、異なる組織における特定の細胞タイプを検出し、追跡するために蛍光タンパク質を担持する変異マウスモデルが利用可能になっているので、固形臓器から得られる自家蛍光細胞懸濁液の（フローサイトメトリーによる）分析が必要です。連続的な波長の広い範囲に沿って発光スペクトルの形状を区別するれ、フローサイトメトリースペクトル、これらの問題の一部に対処します。データはwが分析され補償行列を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うアルゴリズム番目。したがって、スペクトルフローサイトメトリーは、類似の発光ピークを有する蛍光色素を識別することが可能であるべきであり、補正要件なしに、マルチパラメトリック分析を提供することができます。
このプロトコルは、マイナーな集団検出における高い分解能を提供する、21パラメータ（19個の蛍光プローブ）特徴付けおよび自家蛍光信号の管理を可能にする、サイトメトリー分析スペクトルの流れを説明しています。ここに示す結果は、そのスペクトルフローサイトメトリーを示し、心臓および腸のように、従来のフローサイトメトリーで特徴付けることが困難な組織からの細胞集団の分析における利点を提供します。このように、フローサイトメトリースペクトルは補正を必要とすることなく高性能従来のフローサイトメトリーのマルチパラメトリック分析能力を実証し、自家蛍光の管理を可能に。
Introduction
過去数十年では、フローサイトメトリー（FCM）は、細胞の表現型の研究のために不可欠広く利用可能な分析方法になりました。特に青紫色レーザー（405 nm）を（ 例えば、ブリリアントバイオレット、新たなQ-ドット染料）により励起された蛍光色素、可能な蛍光色素が大幅に増加しています。しかし、利用可能な蛍光色素の成長が重複放出のリスクを増加させ、労働集約的補償行列を必要とします。 FCMは、固形組織から細胞懸濁液を分析に広く使用されるとなったが、自己蛍光細胞の存在は、特異的に標識された集団の識別を制限します。
スペクトルFCMの基本的な原理は、二村らに詳細に報告されています。 1、2。手短に言えば、ここで使用されるスペクトルFCMは（材料の表を参照）405、488、及び638 nmのレーザーを備えています。スペクトルFCMは全て放出されるFを取り込み800 nmの500 nmおよび従来のバンドパスフィルタを交換し、それぞれ440 nmおよび469 nmの450 nmの420 nmのための2つの独立したPMT、32チャネル線形アレイPMT（32CHのPMT）におけるスペクトルとしてluorescence。 405 nmおよび638 nmのレーザースポットが共線形でありながら、488と638分の405 nmのレーザースポットは、空間的に分離されています。各個々の粒子のために、スペクトルFCMは、405 nmおよび488のnmのレーザーによって励起された蛍光データの66チャネルまで測定します。細胞を、638 nmのレーザーによって励起されるときにマスクがPMTに輝くから638 nmのレーザーを防止するために挿入されているので、スペクトルFCMは、蛍光データの58個のチャネルを測定します。スペクトルFCMは、蛍光スペクトルを重複の分離を可能にする加重最小二乗法（WLSM）に基づくアルゴリズムを用いて取得されたフルスペクトルデータを分析します。単染色し、染色されていないサンプルに由来するスペクトルは、基本的な基準スペクトルとして認識されています。マルチ染色したサンプルは、数学的に取り付けられていますND混合されていない、と混合蛍光標識を有する試料のスペクトルは、その構成スペクトルの集合に分解されます。アンミキシングは、スペクトル技術3、4において、所定の染料を測定するものを除くすべての検出器からの信号を除去する補正を置き換えます。
本研究では、合わせて、マウス脾臓に見出される主要な造血サブセットを特徴単一、21パラメータ解析における19の蛍光色素を試験しました。また、我々は、スペクトルサイトメトリーは、このように、腸上皮内リンパ球および胚中心の特性を向上させる、自己蛍光シグナルを管理することができることを実証しました。実際、これらの組織では、自家蛍光の管理は、従来のFCMに分析から除外されることになる細胞に特異的な蛍光の割り当てを可能にしました。
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Protocol
すべての実験は、パスツール研究所倫理憲章およびEUのガイドラインに従って行われたとフランス農業省によって承認されました。
成体マウスの臓器から1細胞懸濁液の準備
- 脾細胞の単離
- 頚椎脱臼により成体マウスを安楽死させます。腹部正中線で切開部を作成し、ハサミで皮膚を開きます。ピンセットで脾臓を収穫。
- 2枚のガラス顕微鏡の間に脾臓を破砕して細胞を解離し、1％ウシ胎児血清（FCS）を含有するハンクス平衡塩漬け液（HBSS）5mLにそれらを希釈するスライド。
- 120×gで4℃で10分間遠心分離。上清を捨てます。
- HBSS 1％FCS 5mLにペレットを再懸濁します。トリパンブルー生体染色を使用してノイバウアー室で細胞をカウントします。
注80万個の細胞は、1個の成人の脾臓から得られるべきです。
- Isolati小腸からの細胞の上
- 頚椎脱臼により成体マウスを安楽死させます。はさみを使用して、腹部正中線に皮膚の切開部を作ります。片手で鉗子で小腸をつかみ、両端をカットするはさみを使用して：ちょうど大腸前、右胃後、次いで小腸の終わりに、最初。針を2 mLのシリンジを用いて1×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）と小腸を洗い流します。
- ペーパータオルの上に小腸を入れて、慎重に鋭いハサミでパイエル板を取り外します。
- 腸内のハサミの一方の分岐を挿入することによって、その長辺側の腸を開くためにハサミを使用してください。鋭いハサミを使用して1センチ片に開かれた腸をカット。
- 10％FCSを含むHBSSの30mlに一定攪拌しながら37℃で30分間インキュベートします。
- 50mLに残存する非解離断片と細胞懸濁液を置きプラスチックチューブと高速で5分間ボルテックス。注：組織のさらなる解離はありません。
- 大規模な、非解離断片をペレット化するためにできるように、氷上で10分間インキュベートします。
- 上清を収集し、120×gで7分間遠心分離することにより、それを濃縮します。
- 上清を捨て、1％FCSを含むHBSS 10mL中のペレットを再懸濁。トリパンブルー生体染色を使用してノイバウアー室で細胞をカウントします。
注：〜6000万内上皮細胞（IELs）は、大人一人小腸から取得する必要があります。
- パネルデザイン戦略
- 直接蛍光色素で結合された抗体を用いてパネルを準備します。
注：すべての抗体は、以前に細胞集団の最適な定義を取得するために滴定する（滴定は、抗体バッチと異なる場合があります）。脾細胞を染色する19色のパネルに使用される抗体は、表1に列挙されています。 - マルチCOLOを構築フローサイトメトリーのためのRパネル。これは困難な作業になるように、パネルを最適化するために、次のガイドラインに従ってください。
- スペクトル構成や機器で使用することができる蛍光色素を確認してください。
- メーカーが提供する明るインデックス/染色インデックス情報を使用してください。
注：明るインデックス/染色インデックスは、各蛍光色素のバックグラウンドに対する蛍光強度の相対的な指標です。 - 以下のルール以下の抗体を選択します。
- 弱く発現されるタンパク質の明るい蛍光およびより高度に発現されるタンパク質の最も暗い蛍光色素を選択します。
注：例えば、CD45、CD4、およびCD8は、高度に発現され、薄暗い蛍光色素で使用することができます。 - 最初の最も少ない蛍光色素の可能性を有する抗体を選択することで、パネルの設計を開始します。
- 可能な場合、発光スペクトルfの最小オーバーラップを有する蛍光色素を選択またはマーカーは、同じ細胞型上に発現します。
注：これらは、露光による劣化を受けやすいようにタンデム（ 例えば、PE-Cy5で、PE-Cy7を、およびPerCPを-Cy5.5の）は、注意して使用すべきです。
- 弱く発現されるタンパク質の明るい蛍光およびより高度に発現されるタンパク質の最も暗い蛍光色素を選択します。
- 直接蛍光色素で結合された抗体を用いてパネルを準備します。
- フローサイトメトリー分析のための細胞の染色
- 1×10 6腸細胞を1×10 6脾細胞と一つ5 mLチューブと、ワン5mLのチューブを準備し、陰性対照として使用するために染色されていないそれらを保ちます。
- 表1によれば、サンプル当たり、パネルごとに1本の5 mLのチューブを準備し、ラベル。 HBSS 1％FCS中で、 表1によれば、抗体の混合物を調製します。
- 転送1×10 6個の細胞-脾細胞又は腸細胞のいずれか-各5 mLチューブに。 4°Cで5分間、120×gでのために2mLのHBSSの1％FCSおよび遠心分離を追加。上清を廃棄し、抗体混合物の50μLにペレットを再懸濁。
- Sにラベルを付けます2つのステップでplenocytes。まず、5 mLチューブにPE-シアニン5、PerCPを-シアニン5.5、及びPerCPを用いて標識された抗体を含む混合物50μL（Fcレセプターブロッキング）を使用します。 4℃で暗所でのインキュベーションの20分後、5mLのチューブに、他のすべての抗体を含む混合物50μLを加えます。
注：この戦略は、立体障害を制限します。 - 4℃で暗所で20分間インキュベートします。
- 4°Cで5分間、120×gでのために2mLのHBSSの1％FCSおよび遠心分離を追加。上清を捨て、0.5 / mlのヨウ化プロピジウム（PI）で200μLのHBSSの1％FCS中にペレットを再懸濁。
（ 例えば、UltraComp eBeads）商業報酬ビーズミクロスフェアの各蛍光色素のための単一染色の調製は、以下ビーズと呼ばれます
- パネルで使用される抗体の数と同数の5 mLチューブを準備し、ラベル。各チューブ中のビーズの1滴を配置し、1＆＃を追加181;チューブ当たり抗体のL。
注：ここで使用されるビーズ（材料の表を参照）染色（正）含まれており、染色されていない（負の）ビーズ。抗体は、明るい信号及び従って各染料のための明確なスペクトル特性を確保するために、ビーズ上に過剰に置かれます。これは、正確なアンミキシングを行うことができるように、ソフトウェアによって必要とされます。 - 4℃で暗所で20分間インキュベートします。
- G×120で5分間HBSS、1％FCS及び遠心分離機の2ミリリットルを加えます。上清を捨て、HBSS 1％FCSの100μLにペレットを再懸濁。
マウス胎児心臓から3.細胞懸濁液の準備
- 胚の解剖
- （17と19時間の間に）一日の終わりに（常に男性のケージ内）1匹の雄と2匹の雌を交配することにより、事前に時限妊娠雌を得るために計画。翌朝は、膣のプラグとメスは交尾後0.5日であると考えられています。
- E17.5妊娠中femalを安楽死させます頸椎脱臼によってES。動物がしっかりとマウスの足（つま先ピンチ反射）を押して応答しないことを確認してください。滅菌すると、マウスの毛皮の拡散を防ぐために、70％エタノールで腹部を濡らし。
- はさみを使用して腹部の真ん中で皮膚の切開部を作成し、指で離れて皮膚を引っ張ります。
- 総ピンセットやハサミを使用して腹部の両側に向けて中心から腹筋に切開を引いて行うことで、腹腔を開きます。
注：すぐに腹膜筋肉の下にある小腸を傷つけないように注意してください。 - 子宮体のレベルと卵巣の両方切断することにより（胚有する）子宮角を集めます。 DPBS 50mlで90×15mmの2ペトリ皿でそれらを浸します。
- 子宮筋壁と微細なピンセットとハサミで内臓卵黄嚢続いて、各脱落膜との間に切断することにより、各胚を単離します。胚int型を引き出し行為。最後に、へその緒を切りました。
- 解剖を開始する前にハサミ（断頭）とE17.5胚の頭をカットします。
- 心のコレクション
- 湿った紙タオル皿の底に寝具および1％FCSを含むHBSSの50 mLを含む90×15 mm 2のペトリ皿に断頭胚を浸します。
- 腹側が上を向いているように、実体顕微鏡下で、総鉗子で各胚を保持します。
- 慎重に心臓への損傷を防ぐために、はさみで胸の右側を切断することにより、胸部グリッドを開きます。
- 総鉗子で胸郭を保持することによって心臓を露出。
- （心臓の入口及び流出の大きな血管を含む）大血管を保持することにより（依然として肺および胸腺で組み立て）は、心臓を引き離すと、HBSS 2mlで35×15mmの2ペトリ皿に置きますFCSと1％。
- 周囲の器官から心を隔離し、細かいピンセットやメスで結合組織。
- HBSS、1％FCS 2 mlの新しい35×15mmのペトリ皿に心を洗って、心臓がチャンバ内部に血液を送り出すことができるように20分間氷上でそれらを保ちます。
- 心臓細胞懸濁液の調製
- 37℃にHBSS + / +（以下、酵素液と呼ぶ）中の200μg/ mLのコラゲナーゼを予め温めます。
注：酵素活性を最大にするために（のCa 2+及びMg 2+カチオンを有する）+ / + HBSSでコラゲナーゼを希釈。コラゲナーゼ活性は、バッチ間で安定しています。 - 予め温めた酵素溶液1mLで心臓（HBSS、1％FCS）を浸漬洗浄溶液を交換してください。
- 実体顕微鏡下で、1mmの中に微細なピンセットおよび外科用メスを使用して3個の心臓をミンチ。予め温めた酵素溶液の別の1ミリリットルを加え、蓋を5mLのチューブに細分化した組織を移します。
注：最適な消化のため、配置酵素溶液2mL当たり5つのE17.5心臓の最大値。より心を同時に消化される場合、異なる5 mLチューブにそれらを分割します。 - 37°Cで15分間みじん切り心をインキュベートします。
注：溶液に沿って組織を広げるためにインキュベーター中で5 mLチューブ（正しく閉じ）を下にして置き。- インキュベーションの終わりに、P1000ピペットで上下に約20回ピペッティングすることにより、同じ酵素溶液中で組織を均質化します。垂直位置に5 mLのチューブを入れ、残りの組織フラグメント堆積物（約3分間）をしましょう。
- 続けながら、50 mLチューブに（懸濁液中の消化細胞を含む）上清を回収HBSS、10％FCS（酵素溶液の体積は、組織断片に加え同じボリューム）の2 mLを加え、そして氷上にそれらを保ちます消化プロセス。
注：HBSS、10％のFCS水溶液と氷が残っている組織がある一方、酵素作用を不活性化するために重要です消化。 - 残りの組織フラグメントを有する5 mLチューブに予め温めた酵素溶液2mLを追加し、それ以上の組織が観察されなくなるまでステップ3.3.4を繰り返すことにより消化を続けます。
注：消化の約4サイクルが完全に心臓組織（酵素溶液2mL中5 E17.5心）を解離するのに十分です。
- 300×gで10分間、懸濁液中の細胞を有する50 mLチューブを遠心し、上清を捨てます。
- 、細胞ペレットを再懸濁HBSS 1mLの追加 - / - 1％FCS、および70μmのナイロンメッシュも細胞懸濁液をフィルタリングします。トリパンブルー生体染色を使用してノイバウアー室で細胞をカウントします。
注：HBSSで細胞を再懸濁- / - （のCa 2+及びMg 2+カチオンを含まない）細胞凝集を最小限にするために。 80万間および1,000,000細胞が1人のE17.5の心から取得されます。
- 37℃にHBSS + / +（以下、酵素液と呼ぶ）中の200μg/ mLのコラゲナーゼを予め温めます。
- 蛍光抗体を用いて心臓細胞を染色
注：すべてのantibodIESは、以前心臓パネルに用い【選択抗体は、表1に列挙されている（滴定抗体バッチで変化し得る）細胞集団の最適な定義を得るために滴定します。- 96ウェルプレート（丸底）を介して懸濁液中の心臓細胞を配布。 480×gで1分間、96ウェルプレート必要なすべてのウェル（ウェル当たり200μL）、短いスピン遠心分離機全体に均一に配布し、上清を捨てます。
注：96ウェルプレート（丸底）の全てのウェルを使用することができます。 - ペレットを再懸濁し、抗体のカクテルの100μLで4℃で暗所で20分間心臓細胞をインキュベート（ すなわち、CD45-PE、TER119-PE、CD31-アレクサ647、およびSCA-1-PE-Cyanine5 - / - 1％FCS）HBSSで希釈しました。
- 480×gで1分間細胞を遠心分離し、1％FCSおよびショートスピン - / - 200μLのHBSSを添加することにより、抗体の過剰から心臓細胞を洗浄します。
- 上清と繰り返しを破棄短いスピン遠心分離（ステップ3.4.3）。
- - / - 200μLのHBSSの中に細胞を再懸濁し、1％FCSを既にHBSSの200μLを含有する5mLのチューブに移す - / - 1％FCS。
- 0.5μg/ mLのPIで1％FCS及び70μmのナイロンメッシュしかし細胞懸濁液をフィルタ - / - 取得する前に、HBSSの400μLを加えます。
- 96ウェルプレート（丸底）を介して懸濁液中の心臓細胞を配布。 480×gで1分間、96ウェルプレート必要なすべてのウェル（ウェル当たり200μL）、短いスピン遠心分離機全体に均一に配布し、上清を捨てます。
スペクトラルフローサイトメーターで標識脾臓、小腸、および心臓細胞の4買収
- データの取得前に、自動的に、製造元の指示に従ってサイトメーターのスペクトルを校正。実験の毎日毎日、毎月の品質管理手順を実行します。
- サイトメーターの準備ができたら、すべての抗体で標識された細胞懸濁液を含有するサンプルのプレビューを開始します。
注：取得しないでください。 - すべてのレーザーは必要に応じて、上にあることを確認してください。全てのセルがそれぞれに表示されているように、FSCゲインを調整しますプロット細胞集団をゲートし、このゲートを488 nmと638/405 nmのレーザーに対応する2つのスペクトルプロットに適用します。
注：蛍光色素が638 nmレーザーで励起されると（638 nmレーザーがオンのとき）、617〜662 nmの光を遮蔽するマスクがあり、638 nmレーザーがPMTに輝くのを防ぎます。これは、スペクトルの一部の損失を誘発し、したがって、これらの波長で発光する近い染料のより低い分離を引き起こす。しかし、638 nmレーザーを取得する必要がない場合は、638 nmレーザーをオフにして信号全体を収集することができます。 - 488 nmと405/638を表示する2つの異なるスペクトルプロットで、すべての蛍光色素がy軸（1-10 6 ）で表示された強度の範囲内になるように、32チャネル光電子増倍管（PMT）電圧（％）を調整しますnm励起。
注：使用するすべての蛍光色素のスペクトルを認識するためにトレーニングが必要です。 - サンプルの取得を開始します。クリック ";プレビュー」画面上で細胞を可視化した後にクリックし、 『サンプルを記録するために、』取得する各試料からの2×10 6イベント割引。
- 染色されたサンプルを取得した後、サンプル生体染色色素で染色し、次いで、補償ビーズが個々に使用されるすべての抗体で染色し得ます。画面上の細胞を可視化するために、「プレビュー」をクリックし、「取得」にサンプルを記録すること。
注：すべてのサンプルとコントロール（ すなわち、ビーズと染色されていないサンプル）のために、同じPMT電圧をキープ。 5000回のイベントは大部分が十分です。 - 最後に、未染色細胞懸濁液からデータを取得します。画面上の細胞を可視化するために、「プレビュー」をクリックし、「取得」にサンプルを記録すること。
注：実験の終了時に、未染色試料の取得は、蛍光細胞のキャリーオーバーを最小化します。 - メーカーの指示をAN以下のサイトメーターを清掃してください取得フォルダ内の実験を閉じdは。
注：のみの実験を閉じた後、それが保存され、分析のために利用できます。
スペクトラルFCMソフトウェアを使用したデータの分析5。
- 「分析」タブの「カラーパレット」ウィンドウで、使用される各蛍光色素と対応するマーカーを追加することによって、パネル内に存在するすべてのパラメータを登録する（利用可能なリストから選択するか、新しいパラメータを追加します）。また、自家蛍光と生存能力パラメータを含みます。選択したすべてのパラメータは、「アンミキシング」ウィンドウに表示されます。
- 「分析」タブで、この実験の「チューブ・リスト」の下に「コントロール」ウィンドウで、（補償ビーズで行う）最初単一の染色サンプルを選択します。ワークシートでは、「多角形のデザインツール」をクリックして、FSC / SSCプロットにビーズ集団にゲートを設計します。スペクトルまたはドットプロットを開くには、ゲートの上にダブルクリックします娘プロットしてゲートビーズを可視化します。
- 正のための1つのゲートと、スペクトル上またはドットプロット上のいずれかの負のビーズに1つのゲートを設計します。それぞれ正と負の小数のための2つのレーザー・セットに対応した全体のスペクトルをチェックして、連続的にゲートと娘集団を検証するためにゲートをクリックすることで、異常値を排除します。 「アンミキシング」ウィンドウに負と正のゲートを入力します。
- 各単一染色標本のための手順を繰り返し5.2。
注：正と負のゲーティング戦略は、それが任意のサンプルに配置するためのプログラムができますが、分析されているサンプルに対応していることに注意してください。代わりに、各単染色した試料について陰性画分を決定するための、ユニバーサル負を設定するために染色されていないビーズサンプルを使用。
- 自家蛍光用と非自己蛍光細胞のための「チューブリスト」とデザインゲートで染色されていない細胞サンプルを選択します。 <自己蛍光および生存率を含めたすべてのパラメータのためのすべての負と正のゲートは、「アンミキシング」ウィンドウで選択された場合LI>、をクリックして「計算。」分析対象のサンプルにアンミキシングを適用します。
- ゲートを設計し、2パラメータのプロットを作成して、データを分析します。
- まず、FSC対SSCためのゲートを設計し、生存率マーカー（CD45対PI）で標識したすべてのセルを除外することによって死細胞を除去します。細胞の残りの部分に、関心のある全ての集団の設計ゲートは、各細胞懸濁液（ 図1~3）について記載した戦略に従います。
注：必要に応じて、中に補償を調整する「基準スペクトル調整。」これは、アルゴリズムは完全にそれを行うことができなかった場合は、各蛍光色素のために正の集団の中央値を再調整するためにアンミキシングの後に使用することができるツールです。
- まず、FSC対SSCためのゲートを設計し、生存率マーカー（CD45対PI）で標識したすべてのセルを除外することによって死細胞を除去します。細胞の残りの部分に、関心のある全ての集団の設計ゲートは、各細胞懸濁液（ 図1~3）について記載した戦略に従います。
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Representative Results
21パラメータ脾細胞を分析するスペクトルFCMパネル
CD45は、全ての造血有核細胞を標識しつつ図1は 、T、B、NK、樹状突起、および骨髄細胞のサブセットを認識する異なる抗体を含む脾臓細胞に適用し19蛍光抗体パネルを用いて得られた結果を示しています。パネルはまた、生存色素（PI）、ならびにサイズ（FSC）および粒状度（SSC）パラメータを含みます。 図1Aは、基準蛍光スペクトルを示します。 CD45 +ゲート（ 図1B）における死細胞を除去した後、分析は、CD3 + T細胞がTCRβ鎖を発現し、CD4 T細胞におけるCD25 +細胞の予想されるCD4 / CD8分布および割合を有することを示します。 CD8 T細胞は、CD44-およびLy49D発現細胞の正常な分布を示します。 CD19 + B細胞を共発現B220のAN成熟した脾臓B細胞の典型的なD MHCII、ならびにIgMおよびIgDの、。 NK1.1 + NK細胞のサブセットは、Ly49Dを共発現する脾臓リンパ球の小さいサブセットを表します。残りの細胞はまた、のCD11b +であったいくつかのMHC IIの高いレベルでのCD11c +樹状細胞の小さなサブセットを含みます。組織常駐マクロファージ共発現CD11bおよび脾臓に見出されるCD44の最高レベルの特性F4 / 80 +細胞。残りの細胞（CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 -のCD11c - ）はおそらく前駆体に対応する、二重陽性細胞の小さなサブセットもまた、CD44を高レベルで発現するCD11bおよび群Gr1の発現によって細分化することができます脾臓中の低周波数で存在することが知られています。大部分は、3つのマーカーは陰性でした。 図2は、補償を調整する前に、同じ分析を示します。
図1：マウス脾臓細胞の分析のための19色抗体パネル。 （A）マウス脾細胞を前抗体の組み合わせで染色し、CD45-進化655れる添加しました。すべての蛍光色素の参照スペクトルを示しています。蛍光団で標識されたCD45は、赤い矢印でマークされています。蛍光色素は、表1（B）に記載されている等高線プロットは、B、T、NK、樹状、または骨髄細胞の異なる集団を分離するために、このマルチパラメータ分析の弁別能力を示します。分析は、デコンボリューションをアンミックスした後、従来のFCMソフトウェアで行いました。
図2：マウス脾臓細胞の分析のための19色抗体パネル。図1と同様の分析がadjus前に行われました参照スペクトル調整と補償のtment。
小腸上皮内リンパ球
いくつかのT細胞集団は、上皮細胞層5,6内腸において見出されています。これらのサブセットの従来の単離は、上皮細胞からリンパ球を分離、密度勾配を含みます。しかし、この準備は、セル損失の微妙な、時間がかかる、との結果です。定量化を改善するために、実験手順を容易にするために、上皮細胞の大部分内腸リンパ球の集団を区別するスペクトルFCMの電位を試験しました。上皮組織の機械的破壊後、細胞懸濁液をαβのサブセット、通常腸上皮に見出されるγδT細胞を標識抗体で染色しました。ザ・細胞は、2つの従来のサイトメータで、スペクトルFCMで解析しました。
図3は、PI陰性細胞をゲート死細胞を除去しながら、同様のゲーティング戦略に従った後の結果を示しています。自家蛍光マネージャは、生細胞の乏しい識別その結果、（上部パネル、赤矢印）を不活性化されたときに、自動蛍光細胞の存在は、全ての従来のサイトメトリーおよび分光サイトメトリーで明らかです。すべてのプロットでは、FSC-A / SSCリンパ球ゲート内の細胞は青色で示され、大きな散乱（上皮細胞ゲート）を有する細胞は赤色で示されています。両方の従来の器具は、残りの細胞から（青）CD3 + T細胞サブセット（青緑色の矢印）を解決することができませんでした。したがって、TCRβ -細胞（緑の矢印）CD3 +TCRγδ汚染-人口、separati後に検出されたことがない、生物学的にありそうサブセット上皮細胞からリンパ球の上。対照的に、スペクトルFCMで自動蛍光管理した後、異なるT細胞サブセットの分析は、上皮細胞の存在によって損なわれないし、集団は十分に分離し、CD3 +には、TCR陰性細胞は存在しませんでしたゲート。
図3：自動蛍光細胞の存在は、スペクトルFCMにおける上皮内リンパ球の検出を損ないません。上皮細胞およびリンパ球を含む小腸細胞は、TCRδ、PI、TCRβCy7の-APC CD3（パネルB）、Vγ7APC、Vδ4Cy7の-PE（パネルC）、およびCD8 FITC（パネルD）を認識する抗体で染色しました。 PIは、分析の前にFACSバッファーに追加されました。データの取得は、適切な品質管理の後に3台の機器に順次行われていました。ダブレットはeliminaましたFSC-H / FSC-Wでテッド。分析は、従来のFCMソフトウェアで行われました。プロットは、ゲーティング戦略の異なる段階を示します。腸上皮細胞のゲート内の細胞が赤色に標識されながら、FSC-A / SSCリンパ球ゲート内の細胞は、青色で標識されます。矢印は異なる人口の歪みと自己蛍光を指します。 Dは、自家蛍光管理をアンミックスした後、同じデータを示し、一方、Cのプロットは、アンミキシングに自家蛍光管理なしスペクトルFCMで得られたデータの分析を示します。
胚の心臓
従来のFCMは、造血細胞をマーキング、CD45及びTER119ダンプチャネル（PE）で蛍光を発しているため、分析から除外した自己蛍光細胞（黒矢印）の主要な集団を示しました。対照的に、この自己蛍光集団はスペクトルFCM内などに存在しないし、CD45に構成されました
図4：E17.5心臓細胞懸濁液における自動蛍光細胞を適切スペクトルFCMにおける陰性細胞画分に含まれています。胎児の心臓からの（A）細胞懸濁液は、SCA-1-PECy5、抗TER119およびCD45-PEで染色し、CD31-APC抗体と順次3台の機器で取得しました。黒矢印はconve 2で自動蛍光細胞を示し、ntionalサイトメーター、これらの細胞は、スペクトルサイトメトリーにおける自家蛍光として検出されないので、特定の蛍光染色について分析することができるが。 （B）（緑色楕円ゲート内）自動蛍光細胞ではなくCD31 +細胞（青色、陰性コントロール矩形ゲート）は、心筋トロポニンの発現（TNNT2）7および心房軽鎖-2（MYL7）を示しました8つの転写産物。 AU - GAPDHのハウスキーピング転写物に対する任意の単位を。平均値±SEMとして提示されたデータ。
| 励起レーザー | 蛍光色素 | 特異 | クローン | |
| 488 nmの | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nmの FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nmの | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nmの | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nmの | PE-Cy5で | CD44 | IM7 | |
| 488 nmの | PE-Cy7を | CD11bを | M1 / 70 | |
| 488 nmの | PerCPを-Cy5.5を | IgM抗体 | R6-60.2 | |
| 488 nmの | PerCPを | GR-1 | RB6-8CS | |
| 488 nmの | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nmの | ヨウ化プロピジウム | 可能性 | ||
| 405 nmの | V450 | IgDの | 11-26c.2a | 405 nmの | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nmの | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nmの | BV570 | TCRB | H57-597 | |
| 405 nmの | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nmの | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nmの | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nmの | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nmの | 655を進化させます | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | 精製しました | CD16 / CD32 | 2.4G2 | Fc受容体ブロック |
| カルディで使用される抗体のリストac細胞懸濁液 | ||||
| 638nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
表1：19色パネルおよび心臓細胞懸濁液で使用される抗体のリスト。
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Discussion
従来のFCMは、蛍光プローブの励起後に放出された光子の検出に基づいています。別の蛍光色素からの信号を測定するように設計された検出器で検出された1つの蛍光色素の蛍光放出は、物理的な重なりを誘導します。発光スペクトルの中でこの波及は補償によって修正される必要があります。
アンミキシングデコンボリューションアルゴリズムによるスペクトルFCMおよびデータ処理は、異なるスペクトル形状を有することを条件とする、追加の補償なしに近い発光ピークを有する蛍光色素の組み合わせを可能にします。分析のために使用されるアルゴリズムは、固形組織の細胞懸濁液から非特異的蛍光を差し引く、独立したパラメータとして自己蛍光を扱います。
19の蛍光色素のパネルは、2つのレーザー（488 nmおよび405 nm）を使用して、免疫細胞を分析するために組み立てました。実際に、638 nmのレーザーは、対応する32チャネルPMTのセクション、にあった場合このレーザーの励起波長は利用できませんでした。 PMTの最大検出能力を得るために、赤色レーザをオフにした。マウス脾臓細胞を分析し、造血細胞の1％以下を含む12以上の異なる細胞集団の検出を可能にした。
自動蛍光を管理するためのスペクトルFCMの能力を試験するために、分析を損なう可能性のある2つの異なる状況、すなわちリンパ球が上皮細胞で汚染された状態と自己蛍光性心臓細胞が分析された状態を試験した。従来のFCMとは対照的に、分光サイトメトリーは、たとえそれらが小さなサブセットを表しているとしても、すべてのリンパ球サブセットの識別を可能にする。
成体心筋細胞9,10,11の再生能力に関する論争は、部分的には、criminateと心の中で生存細胞の明確なサブセットを分離。異なる心臓のサブセットを識別するためのマーカーの独特な組み合わせを定義するマルチパラメトリック分析がために分析することができる多数の細胞のまれなサブセットの検出を可能にするかもしれません。胎児心臓（E17.5）を分析し、従来のFCMで検出を免れたであろう自己蛍光細胞の大部分は、スペクトルFCMにおける非造血生存心筋細胞区画に統合されました。
この方法の再発の問題は、良質な蛍光標識抗体のための必要条件です。タンデムの成分が支配的であるタンデム色素を使用する場合、これは特に重要です。例えば、BV786及びCy7の-PEは、それぞれ、BV421およびPEから区別することは困難であることができます。
分析に基づいて、FCMは、補償Mを必要とせず、従来のFCMで得られるものよりも高い分析能力を提供しますatrices。この原稿は、高い分析能力、複雑な補償行列、自家蛍光による細胞サブセットの障害のない差別であり、さらに質量分析FCMのために必要なし、追加の金融コミットメントの欠如を示している別のアプローチがあるという証拠を提供します。スペクトルFCMは、このように、従来のFCMに通常適していない固体組織の様々なから得られた腫瘍で使用することができ、発生細胞の分析のための選択の方法であるように見える、および幹細胞生物学。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々はまた、批判的に原稿を改訂K・フタミュラ、スペクトルのフローサイトメトリーの技術と理論的な貢献を認めます。我々はC. AIT-マンスール、P.-H.にもお世話になっています批判的に原稿を読み取るためと無限の技術的なアドバイスやサポートのためのCommere、A. Bandeira、およびP.ペレイラ。我々はまた、抗Vγ7-APCとVδ4ビオチン標識抗体の贈り物のためにP.ペレイラに感謝します。私たちは、撮影の物流を歓迎し、支援するためのパスツール研究所からセンターD'Enseignementsをaknowledge。この作品は、パスツール研究所、研究所国立・デ・ラ・サンテら・デ・ラ・RECHERCHEMédicale（INSERM）によってサポートされていました。スイス国立科学財団とパスツールブルスルー（SS）; FundaçãoパラCiênciaEA Tecnologia - SFRH / BD / 2010分の74218（MV）。そして大学パリディドロ、アジャンス国立デラRECHERCHE（ANR）のプロジェクトTwothyme、ANR、およびプログラム（未来のための投資を復活させます）（AC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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