Summary
Denne artikkelen beskriver spektral-cytometri, en ny tilnærming i flowcytometri som bruker former av emisjonsspektra for å skille fluorokromer. En algoritme erstatter kompensasjon og kan behandle auto-fluorescens som en uavhengig parameter. Denne nye tilnærmingen muliggjør riktig analyse av celler isolert fra faste organer.
Abstract
Strømningscytometri er blitt brukt for de siste 40 årene for å definere og analysere fenotypen til lymfoide og andre hematopoietiske celler. I første omgang begrenses til analyse av noen få fluorokromer, som for tiden er det mange forskjellige fluorescerende fargestoffer, og opp til 14-18 forskjellige fargestoffer kan kombineres på en gang. Men flere begrensninger fortsatt svekke analytiske evner. På grunn av mangfoldet av fluorescerende prober, og dataanalyse blitt stadig mer komplisert på grunn av behovet for store, multi-parametriske kompensasjon matriser. Dessuten har mutant musemodeller som bærer fluorescerende proteiner for å detektere og spore spesifikke celletyper i forskjellige vev blir tilgjengelig, slik at analyse (ved flowcytometri) av auto-fluorescerende cellesuspensjoner oppnådd fra faste organer er nødvendig. Spectral flowcytometri, som skiller formene av emisjonsspektra langs et bredt spekter av kontinuerlige bølgelengder, løser noen av disse problemene. Dataene blir analysert wed en algoritme som erstatter kompensasjon matriser og behandler auto-fluorescens som en uavhengig parameter. Således bør spektral flowcytometri være istand til å skjelne fluorokromer med tilsvarende utslippstopper, og kan tilveiebringe en multi-parametrisk analyse uten kompenseringsbehov.
Denne protokollen beskriver den spektrale flowcytometrianalyse, slik at for en 21 parameter (19 fluorescerende prober) karakterisering og styring av en auto-fluorescerende signal, som gir høy oppløsning i mindre populasjon deteksjon. Resultatene presentert her viser at spektralanalyse flowcytometri presenterer fordeler i analysen av cellepopulasjoner fra vev som er vanskelig å karakterisere på vanlig strømningscytometri, slik som hjerte og tarm. Spectral flowcytometri dermed demonstrerer multiparametrisk analysekapasitet på høy ytelse konvensjonell flowcytometri uten krav om erstatning og muliggjør auto-fluorescens administrasjon.
Introduction
I de siste tiårene, flowcytometri (FCM) ble en allment tilgjengelig analysemetode viktig for celle fenotyping studier. Det har vært en betydelig økning i de tilgjengelige fluorescerende fargestoffer, særlig fluorokromer eksiteres av den fiolette laser (405 nm) (for eksempel Brilliant Violet og nye Q-dot fargestoffer). Men øker veksten av tilgjengelige fluorescerende fargestoffer risikoen for overlappende utslipp og krever arbeidsintensive kompensasjon matriser. FCM ble allment brukt for å analysere cellesuspensjoner fra fast vev, men tilstedeværelsen av auto-fluorescerende celler begrenser diskriminering av spesifikt merket populasjoner.
De grunnleggende prinsipper for spektral FCM er gjengitt i detalj i Futamura et al. 1, 2. Kort sagt blir den spektrale FCM anvendt her (se tabell over materialer) er utstyrt med 405, 488, og 638 nm lasere. Den spektrale FCM fanger opp alt det utsendte fluorescence som spektra i en 32-kanals lineære gruppe PMT (32ch PMT) på 500 nm til 800 nm og 2 uavhengige PMTs på 420 nm til 440 nm og 450 nm til 469 nm, henholdsvis, som erstatter de konvensjonelle båndpassfiltre. De 488 og 405/638 nm laserpunkter som er romlig adskilt, mens de 405 nm og 638 nm laserpunkter som er ko-lineære. For hver enkelt partikkel, den spektrale FCM måler opp til 66 kanaler med fluorescens data som er eksitert ved 405 nm og 488 nm lasere. Når celler blir eksitert av 638 nm laser, måler den spektrale FCM 58 kanaler med fluorescens dataene fordi en maske er satt inn for å hindre at 638 nm laser fra skinner inn i PMT. Spektral FCM analyserer de innsamlede fulle spektrumdata med en algoritme basert på den vektede minste kvadraters metode (WLSM), som muliggjør separering av overlappende fluorescerende spektra. Spektra utledet fra enkelt-fargede og ufargede prøvene er anerkjent som den grunnleggende referanse-spektra. Multi-fargede prøver blir matematisk montert ennd ublandet, og spektret av en prøve med blandede fluorescerende markører er dekomponert i en samling av dets bestanddeler spektra. Den unmixing, i spektral teknologi 3, 4, erstatter den kompensasjon som fjerner signaler fra alle detektorene unntatt ett måling av et gitt fargestoff.
I denne studien vi kombinert og prøvet 19 fluorokromer i en enkelt, 21-parameteranalyse som karakteriseres de store hematopoietiske undergrupper som finnes i musemilt. I tillegg demonstrerte vi at den spektrale cytometri kan styre auto fluorescerende signal, og dermed forbedre karakteriseringen av intestinale epitelceller intra-lymfocytter og av embryonale hjertet. Faktisk, i disse vev, auto-fluorescens styring tillatt for tildeling av spesifikk fluorescens for cellene som vil bli ekskludert fra analysen på konvensjonell FCM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i henhold til Pasteur Institute Ethic Charter og EU retningslinjer og ble godkjent av den franske Landbruksdepartementet.
1. Cell Suspension klargjøring fra Adult Mouse Organs
- Isolering av splenocytes
- Avlive voksne mus ved halshugging. Lag et snitt i buken midtlinjen og åpne huden med saks. Høste milt med pinsett.
- Knuse milten mellom to glassmikroskopobjektglass for å dissosiere cellene og fortynne dem i 5 ml av Hanks balanserte Saltet oppløsning (HBSS) inneholdende 1% føtalt kalveserum (FCS).
- Sentrifuger i 10 minutter ved 120 xg og 4 ° C. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 5 ml HBSS 1% FCS. Tell cellene med en Neubauer kammer ved hjelp av en Trypan blå flekk vital.
MERK: 80 millioner celler bør innhentes fra en voksen milt.
- isolasjonseffektervidere av celler fra tynntarmen
- Avlive voksne mus ved halshugging. Ved hjelp av saks, gjør et snitt i huden på magen midtlinjen. Tak i tynntarmen med pinsett i den ene hånden og bruke saks for å klippe det i begge ender: For det første, rett etter magesekken, og deretter på slutten av tynntarmen, like før den tykktarmen. Skyll tynntarmen med 1x Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS) ved anvendelse av en 2 ml sprøyte med en nål.
- Sett tynntarmen på et papirhåndkle og forsiktig fjerne Peyerske plakk med en skarp saks.
- Bruke saks for å åpne tarmen på sin langside ved å sette inn en gren av saksen inne i tarmen. Skjær åpnes tarmen inn 1-cm stykker ved bruk av en skarp saks.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C under konstant omrøring i 30 ml HBSS med 10% FCS.
- Plasser cellesuspensjonen med de resterende ikke-dissosiert fragmenter i et 50 mLplastrør og virvle i 5 minutter ved høy hastighet. MERK: Det er ikke lenger dissosiasjon av vevet.
- Inkuber i 10 minutter på is for å tillate de store, ikke-dissosiert fragmenter til pellet.
- Samle supernatanten og konsentrere det ved sentrifugering i 7 minutter ved 120 x g.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml HBSS med 1% FCS. Cellene telles med en Neubauer kammer ved hjelp av en Trypan blå flekk vital.
MERK: ~ 60 millioner intra-epitelceller (IELs) bør innhentes fra en voksen tynntarmen.
- Panel designstrategi
- Fremstille paneler med antistoffene direkte koblet med fluorokromer.
NOTE: Alle antistoffer er tidligere titrert for å oppnå optimal definisjonen av cellepopulasjoner (titreringen kan variere med antistoffet batch). Antistoffene anvendt i den 19-farge panel for å farge splenocytter er oppført i tabell 1. - Konstruer multi-farger paneler for cytometri. Da dette kan være en utfordrende oppgave, kan du bruke følgende retningslinjer for å optimalisere panelene:
- Sjekk den spektrale konfigurasjon og fluorescerende fargestoffer som kan brukes på instrumentet.
- Bruk Lysstyrke Index / Farging Index opplysninger gitt av produsenten.
MERK: Brightness Index / fargeindeksen er den relative indikator på fluorescens intensitet som funksjon av bakgrunnen for hvert fluorokrom. - Velg antistoffer følgende reglene nedenfor:
- Velg de skarp fluorokromer for proteiner som er svakt uttrykt og dimmest fluorokromer for mer høyt uttrykte proteiner.
MERK: For eksempel er CD45, CD4 og CD8 sterkt uttrykt, og kan brukes med dim fluorokromer. - Begynne å designe panelet ved først å velge antistoffer med færrest fluorescerende fargestoff muligheter.
- Hvis det er mulig, velger fluorescerende fargestoffer med den minste overlapping av emisjonsspektra feller markører som uttrykkes på de samme celletyper.
MERK: dobbelt (f.eks, PE-Cy5, PE-Cy7, og PerCP-Cy5.5) må brukes med forsiktighet, da de er mer mottakelige for nedbrytning ved lyseksponering.
- Velg de skarp fluorokromer for proteiner som er svakt uttrykt og dimmest fluorokromer for mer høyt uttrykte proteiner.
- Fremstille paneler med antistoffene direkte koblet med fluorokromer.
- Farging av cellene for cytometri analyse
- Fremstill en 5 ml rør med 1 x 10 splenocytter 6 og en 5 ml rør med 1 x 10 6-tarmceller og holder dem ufarget for bruk som negativ kontroll.
- Forbered og merke en 5 ml rør per prøve og pr panel i henhold til tabell 1. Klargjør blanding av antistoffer, ifølge tabell 1, i HBSS 1% FCS.
- Overføring av 1 x 10 celler 6 - enten splenocytter eller tarmceller - i hver 5 ml rør. Tilsett 2 ml HBSS 1% FCS og sentrifuger i 5 minutter ved 4 ° C, og 120 x g. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 50 pl av antistoffblandingen.
- Merke splenocytes i 2 trinn. Bruk først 50 ul av blandingen som inneholder de antistoffer merket med PE-cyanin 5, PerCP-cyanin-5,5, og PerCP (med Fc-reseptor-blokkerende) i et 5 ml rør. Etter 20 minutters inkubering i mørke ved 4 ° C, tilsett 50 pl av blandingen inneholdende alle de andre antistoffer til et 5 ml rør.
MERK: Denne strategien begrenser sterisk hindring. - Inkuber i 20 min i mørket ved 4 ° C.
- Tilsett 2 ml HBSS 1% FCS og sentrifuger i 5 minutter ved 4 ° C, og 120 x g. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl HBSS 1% FCS med 0,5 ug / ml propidiumjodid (PI).
2. Fremstilling av Single-farging for hvert fluorokrom på kommersielle kompensasjon Bead-mikrokuler (for eksempel UltraComp eBeads), heretter referert til som perler
- Forbered og merke så mange 5 ml rør som antallet antistoffer som brukes i panelene. Plasser en dråpe perler i hvert rør og tilsett 1 & #181; l av antistoff per rør.
MERK: Perlene som brukes her (se tabellen av materialer) inneholder farget (positiv) og ufargede (negative) perler. Antistoffer blir satt i overskudd på perlene for å sikre en lys signal og således en klar spektral signatur for hver fargestoff. Dette kreves av programvare for å kunne foreta en nøyaktig unmixing. - Inkuber i 20 min i mørket ved 4 ° C.
- Tilsett 2 ml HBSS 1% FCS og sentrifuger i 5 minutter ved 120 x g. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 100 pl HBSS 1% FCS.
3. Cell Suspension klargjøring fra embryonale mus hjerter
- Disseksjoner av embryoer
- Plan for å oppnå tidsinnstilt-gravide hunner på forhånd ved å parre 2 hunner med en hann (alltid i hannens bur) ved slutten av dagen (mellom 17 og 19 timer). Neste morgen, blir hunner med vaginal plugger ansett for å være 0.5 dager etter samleie.
- Avlive E17.5 gravid kvies ved halshugging. Sikre at dyret ikke svarer ved å trykke hardt på musen pote (tå-klype refleks). Fukt magen med 70% etanol for å sterilisere og for å hindre spredning av mus pels.
- Lag et snitt i huden på midten av magen ved hjelp av saks og dra huden fra hverandre med fingrene.
- Åpne bukhulen ved å trekke og lage skår i bukmuskelen fra midten og ut mot de to sidene av buken ved hjelp av brutto tenger og sakser.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skader tynntarmen, som er rett under peritoneal muskel. - Samle livmorhornene (med embryoene) ved å kutte både på nivået av livmorlegemet og av eggstokkene. Suge dem i et 90 x 15 mm 2 petriskål med 50 ml DPBS.
- Isolere hver embryo ved å skjære mellom hver decidua, etterfulgt av livmor muskelveggen og visceral plommesekken med en fin pinsett og sakser. Trekk ut embryoer inthandling. Til slutt, kuttet navlestrengen.
- Skjær E17.5 embryo hoder med saks (halshogging) før du starter disseksjon.
- Innsamling av hjerter
- Bløt de halshugde embryoene i et 90 x 15 mm 2 petriskål inneholdende en våt papirhåndkle sengeklær på skålbunnen og 50 ml HBSS med 1% FCS.
- Under et stereomikroskop, holde hver embryo med brutto tang, slik at buksiden vender opp.
- åpne thorax gitter forsiktig ved å kutte den høyre side av brystet med saks for å forhindre skade på hjertet.
- Blottlegge hjertet ved å holde brystkassen med brutto tang.
- Trekk fra hverandre i hjertet (umontert med lungene og thymus) ved å holde de store fartøyene (inneholdende de store skip av inn- og ut- strømning av hjertet) og plassere dem i et 35 x 15 mm 2 petriskål med 2 ml HBSS 1% med FCS.
- Isoler hjertene fra de omkringliggende organer ogbindevev med fin pinsett og en skalpell.
- Vask hjertene i en ny 35 x 15 mm Petri skål med 2 ml HBSS 1% FCS, og holde dem på is i 20 minutter for å tillate hjertet til å pumpe ut blodet inne i kamrene.
- Fremstilling av hjertecellesuspensjoner
- Forvarme den 200 mikrogram / ml kollagenase i HBSS + / + (heretter referert til som enzymatisk oppløsning) til 37 ° C.
MERK: Fortynn kollagenase i HBSS + / + (med Ca2 + og Mg2 + kationer) for å maksimalisere enzymaktiviteten; Kollagenaseaktiviteten er stabil mellom satsene. - Erstatte vaskeløsningen soaking hjertene (HBSS 1% FCS) med 1 ml forvarmet enzymatisk løsning.
- Under et stereomikroskop, hakke hjertene til 1 mm 3 stykker ved hjelp av fin pinsett og en skalpell. Legge til ytterligere 1 ml forvarmet enzymatisk oppløsning og overføre det hakkede vev til et 5 ml rør med et lokk.
MERK: For en optimal fordøyelse, plassere enmaksimalt 5 E17.5 hjerter per 2 ml enzymatisk oppløsning. Dersom flere hjerter nedbrytes samtidig, splitte dem i forskjellige 5 ml rør. - Inkuber hakket hjertene i 15 minutter ved 37 ° C.
MERK: Legg ned de 5 ml rør (ordentlig lukket) i inkubatoren for å spre vevet langs oppløsningen.- Ved slutten av inkubasjonen, homogenisere vevet i den samme enzymatiske løsning ved å pipettere opp og ned omtrent 20 ganger med P1000 pipette. Sett 5 ml rør i vertikal stilling og la den gjenværende vev fragment sediment (ca. 3 minutter).
- Samle supernatanten (inneholdende spaltede celler i suspensjon) i et 50 ml rør, tilsett 2 ml HBSS 10% FCS (det samme volum som volumet av enzymatiske løsning tilsatt til vevsfragmentene), og holde dem på is mens de fortsatte fordøyelsen.
MERK: HBSS 10% FCS-oppløsning og is er viktig for å inaktivere enzymvirkning, mens den gjenværende vev erfordøye. - Tilsett 2 ml forvarmet enzymatisk løsning på 5 ml rør med de gjenværende vevsfragmentene og fortsette fordøyelse ved å gjenta trinn 3.3.4 inntil det ikke mer vev er observert.
NOTE: Rundt 4 sykluser av fordøyelse er nok til fullstendig å dissosiere hjertevevet (5 E17.5 hjerter i 2 ml enzymatisk oppløsning).
- Sentrifuger 50-ml rør med celler i suspensjon i 10 minutter ved 300 xg og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten, tilsett 1 ml HBSS - / - 1% FCS, og filtrere cellesuspensjonen selv om en 70 um nylonnett. Tell cellene med en Neubauer kammer ved hjelp av en Trypan blå flekk vital.
MERK: Resuspender cellene med HBSS - / - (uten Ca2 + og Mg2 + kationer) for å minimalisere celleaggregering. Mellom 800.000 og 1.000.000 celler blir oppnådd fra en E17.5 hjerte.
- Forvarme den 200 mikrogram / ml kollagenase i HBSS + / + (heretter referert til som enzymatisk oppløsning) til 37 ° C.
- Beising hjerteceller med fluoriserende antistoffer
MERK: All Antibodies er tidligere titrert for å oppnå optimal definisjon av cellepopulasjoner (titreringen kan variere med antistoffet batch) .De antistoffer anvendt i hjertet panelet er angitt i tabell 1.- Fordel hjerteceller i suspensjon gjennom en 96-brønns plate (rund bunn). Fordele dem jevnt i alle nødvendige brønnene (200 ul per brønn) og kortsentrifuge sentrifuge 96-brønn plate i 1 minutt ved 480 xg, og supernatanten kastes.
NOTE: Alle brønner i 96-brønns plate (rund bunn) kan anvendes. - Resuspendere pelleten og inkuber hjerteceller i 20 minutter i mørke ved 4 ° C med 100 pl av den cocktail av antistoffer (dvs. CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647, og Sca-1-PE-Cyanine5 ) fortynnet i HBSS - / - 1% FCS.
- Vask de kardiale celler fra overskuddet av antistoffer ved å tilsette 200 ul HBSS - / - 1% FCS og kort-spin-sentrifugering av cellene i 1 min ved 480 x g.
- Kast supernatanten og gjentakort sentrifugesentrifugering (trinn 3.4.3).
- Resuspender cellene i 200 pl HBSS - / - 1% FCS, og overføre dem til et 5 ml rør som allerede inneholdt 200 ul HBSS - / - 1% FCS.
- Før anskaffelse, tilsett 400 ul HBSS - / - 1% FCS med 0,5 ug / ml PI og filtrere cellesuspensjonen selv om en 70 um nylonnett.
- Fordel hjerteceller i suspensjon gjennom en 96-brønns plate (rund bunn). Fordele dem jevnt i alle nødvendige brønnene (200 ul per brønn) og kortsentrifuge sentrifuge 96-brønn plate i 1 minutt ved 480 xg, og supernatanten kastes.
4. Anskaffelse av merket milt, tarmkanalen og hjerteceller med Spectral Flowcytometer
- Før oppkjøpet av dataene, automatisk kalibrere den spektrale cytometeret følge produsentens instruksjoner. Utfør daglig og månedlig kvalitetskontrollen hver dag i forsøket.
- Når cytometer er ferdig, starter forhåndsvisning av prøvene med cellesuspensjoner som er merket med alle antistoffer.
MERK: Ikke kjøpe. - Kontroller at alle lasere er på etter behov. Juster FSC forsterkningen slik at alle celler som er synlige i de respektivetomter. Gate cellepopulasjonen og anvende denne port til de to spektrale plott svarende til 488 nm og til 638/405-nm lasere.
MERK: Når fluorokromer eksiteres av den 638-nm laser (det vil si når 638-nm laser er på), er det en maske som skjermer lyset 617 til 662 nm, for å hindre at 638 nm laser fra skinner inn i PMT. Dette induserer tapet av en del av spekteret, og forårsaker derfor en lavere separasjon av nære fargestoffer som emitterer i disse bølgelengdene. Imidlertid kan hele signalet bli innsamlet ved å slå av 638-nm laser hvis det ikke er nødvendig for anskaffelse. - Juster den 32-kanals fotomultiplika (PMT) spenning (%) slik at alle fluorokromer er innenfor området av den intensitet som vises i y-aksen (1-10 6) i de to forskjellige spektrale plott som viser 488 nm og 405/638 nm excitations.
MERK: Opplæring er nødvendig for å gjenkjenne spektra av alle fluorokromer brukt. - Begynn å skaffe prøvene. Klikk på "; Preview" for å visualisere cellene på skjermen, og klikk deretter på 'Hent' for å spille inn prøven Spar opp til 2 x 10 6 hendelser fra hver prøve..
- Etter å skaffe de fargede prøver, erverve prøven farget med det vitale fargestoff og deretter kompensasjons kulene enkeltvis farget med alle antistoffene som anvendes. Klikk på “Preview” for å visualisere cellene på skjermen og deretter på “Acquire” for å ta prøvene.
MERK: Hold samme PMT spenning for alle prøver og kontroller (dvs. perler og ufargede prøver); 5.000 hendelser er stort sett tilstrekkelig. - Endelig skaffe dataene fra de ufargede cellesuspensjoner. Klikk på "Preview" for å visualisere cellene på skjermen og deretter på "Acquire" for å ta prøvene.
MERK: Innhente de ufargede prøvene ved slutten av forsøket minimerer overføringen av det fluorescerende celler. - Rengjør cytometeret følge produsentens instruksjoner end lukker eksperiment i anskaffelse mappen.
MERK: Bare etter stengetid forsøket vil det bli lagret og tilgjengelig for analyse.
5. Analyse av data med Spectral FCM programvare
- I "fargepalett" vindu i "Analyse" tab, registrere alle parametre som er tilstede i panelet ved å legge hvert fluorokrom anvendes og den tilsvarende markør (velge fra listen over tilgjengelige eller legge til en ny parameter). Dessuten innbefatter auto-fluorescens og levedyktighet parametre; alle valgte parametere vil vises i "unmixing" -vinduet.
- Velg den første singelen farget prøven (ferdig med kompensasjon perler) i "Control" vinduet under "Tube List" av dette eksperimentet på “Analyse” -kategorien. I regnearket, klikker du på "polygon designverktøy" og designe en gate på perle befolkningen i FSC / SSC plot. Dobbeltklikk på toppen av porten for å åpne en spektral eller prikkplottå visual gated perler i en datter plot.
- Designe en port for positiv og en port for den negative perlene enten i spekteret eller på dot plot. Sjekk hele spektra svarer til de to lasersettene for hver positiv og negativ fraksjon og eliminere utliggere ved suksessiv gating og klikke på porten for å bekrefte den datter populasjonen. Skriv inn de negative og positive porter i "Unmixing" -vinduet.
- Gjenta trinn 5.2 for hver enkeltprøve farget.
MERK: Vær oppmerksom på at den positive og negative gating strategien tilsvarer prøven som blir analysert, selv om programmet tillater det å bli plassert i en prøve. I stedet for å bestemme en negativ fraksjon for hver enkeltprøve farget ved å bruke et ufarget vulst prøve å sette en universell negativ.
- Velg unstained celleprøve i "Tube List" og design porter for autofluorescent og for ikke-autofluorescent celler. <li> Når alle de negative og positive porter for alle parametere, inkludert auto-fluorescens og levedyktighet, er valgt i "Unmixing" vindu, klikk på "Beregn". Påfør unmixing til prøvene som skal analyseres.
- Analysere dataene ved å utforme porter og skape to-parameter plott.
- Først lager en port for SSC versus FSC og deretter fjerne døde celler ved å utelate alle celler merket med levedyktigheten markør (PI versus CD45). På resten av cellene, utforming porter for alle populasjoner av interesse etter den strategi som er beskrevet for hver cellesuspensjon (figurene 1-3).
MERK: Hvis det er nødvendig, justere kompensasjon i "referansespekteret adjuster." Dette er et verktøy som kan brukes etter unmixing å re-justere medianen av de positive populasjoner for hver fluorochrome hvis algoritmen ikke kunne gjøre det perfekt.
- Først lager en port for SSC versus FSC og deretter fjerne døde celler ved å utelate alle celler merket med levedyktigheten markør (PI versus CD45). På resten av cellene, utforming porter for alle populasjoner av interesse etter den strategi som er beskrevet for hver cellesuspensjon (figurene 1-3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21-parameter spektral FCM panel for å analysere splenocytter
Figur 1 viser resultatene oppnådd med den 19-fluorescerende antistoff-panel påført miltceller som omfatter forskjellige antistoffer som gjenkjenner undergrupper av T, B, NK, dendrittiske, og myeloide celler, mens CD45 etiketter alle hematopoetiske celler med kjerne. Panelet omfatter også en levedyktighet fargestoff (PI), så vel som størrelsen (FSC) og kornethet (SSC) parametere. Figur 1A viser referanse fluorokrom spektra. Etter eliminering av døde celler i CD45 + porten (figur 1 B), viser analysen at CD3 + T-celler uttrykker TcRβ kjeden og har den forventede CD4 / CD8 fordeling og andelen av CD25 + celler i CD4 T-celler. CD8 T-celler viser en normal fordeling av CD44- og Ly49D-uttrykkende celler. CD19 + B-celler ko-uttrykke en B220d MHCII, så vel som IgM og IgD, typisk av modne milt-B-celler. En undergruppe av NK1.1 + NK-celler representerer en liten undergruppe av miltlymfocytter som co-uttrykte Ly49D. De gjenværende celler omfatter en liten undergruppe av CD11c + dendritiske celler med høye nivåer av MHC II, hvorav noen var også CD11b +. F4 / 80 + celler er karakteristisk for vev-resident makrofager co-uttrykte CD11 og de høyeste nivåene av CD44 er funnet i milten. De gjenværende celler (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) kan være oppdelt ved hjelp av ekspresjonen av CD11b og GR1, hvor liten del av dobbelt-positive celler som også uttrykker høye nivåer av CD44, sannsynligvis tilsvarende forløpere kjent for å være til stede ved lave frekvenser i milten. En stor fraksjon var negativ for de tre markører. Figur 2 viser den samme analysen før justering av kompensasjon.
Figur 1: En 19-farge Antistoff Panel for analyse av murine miltceller. (A) musesplenocytter ble farget med det foregående antistoff kombinasjon, til hvilken CD45-utvikle seg 655 ble tilsatt. Referansen spektra av alle fluorokromer vises. Fluorophore-merket CD45 er markert med en rød pil. De fluorokromer er oppført i tabell 1. (B) konturopptegninger viser den diskriminerende kapasitet av denne multi-parametrisk analyse for å skille de forskjellige populasjoner av B, T, NK, dendrittiske eller myeloide celler. Analysen ble utført på konvensjonell FCM programvare etter unmixing dekonvolvering.
Figur 2: En 19-farge Antistoff Panel for analyse av murine miltceller. Den samme analyse som i figur 1 ble utført før den adjustment av kompensasjonen med referansespektra adjuster.
Tynntarm intra-epithelial lymfocytter
Flere T-cellepopulasjoner er funnet i tarmen innenfor epitelcellelaget 5, 6. Konvensjonell isolering av disse undergrupper innbefatter en tetthetsgradient som skiller lymfocytter fra epitelceller. Men dette er forberedelse delikat, tidkrevende, og resulterer i celle tap. For å bedre kvantifisering og for å lette den eksperimentelle prosedyre, ble potensialet for spektral FCM å diskriminere populasjoner av tarm lymfocytter i løpet av en stor fraksjon av epitelceller ble testet. Etter den mekaniske forstyrrelse av epitelvev, ble cellesuspensjoner farget med antistoffer som etiketter til undergrupper av αβ og yS-T-celler som vanligvis finnes i tarmepitelet. DeCeller ble analysert i to konvensjonelle cytometre og i spektral FCM.
Figur 3 viser resultatene etter å ha fulgt en lignende gatingstrategi, med eliminering av døde celler gating på PI-negative celler. Tilstedeværelsen av auto-fluorescerende celler er åpenbar i alle konvensjonelle cytometre og i spektral cytometri når auto-fluorescensbehandleren er inaktivert (topp paneler, røde piler), noe som resulterer i dårlig diskriminering av levende celler. I alle tomter er celler i FSC-A / SSC-A-lymfocyttporten vist i blå, og celler med større spredninger (epithelialcelleport) vises i rødt. Begge konvensjonelle instrumentene klarte ikke å løse CD3 + T-cellens undergruppe (i blått) (turkispil) fra de gjenværende cellene. Derfor forurenset TcRβ - celler (grønn pil) CD3 + TcRγδ - befolkningen, en biologisk usannsynlig delmengde som aldri oppdages etter separasjonenpå av lymfocyttene fra epitelceller. I motsetning til dette, i spektral FCM etter auto fluorescens styring, og analysen av de forskjellige T-celleundermengder ble ikke forringet ved nærvær av epitelceller, populasjonene var godt separert, og det var ingen TcR-negative celler i CD3 + Port.
Figur 3: Tilstedeværelse av Auto-fluorescerende celler ikke svekker Påvisning av Intra-epiteliale lymfocytter i Spectral FCM. Små tarmceller, innbefattende epitelceller og lymfocytter, ble farget med antistoffer som gjenkjenner TcRδ, PI, TcRβ Cy7-APC CD3 (panel B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (panelene C), og CD8 FITC (panelene D). PI ble tilsatt i FACS-buffer før analyse. Ervervet av dataene ble utført i rekkefølge i de tre instrumenter etter at den aktuelle kvalitetskontroll. Dubletter var eliminated i FSC-H / FSC-W. Analysen ble utført på konvensjonell FCM programvare. Tomter viser de ulike trinnene i gating strategien. Cellene i FSC-A / SSC-A lymfocytt-port er merket i blått, mens cellene i tarm epitelcelle-porten er merket med rødt. Pilene peker på ulike befolknings skjevheter og auto-fluorescens. Tomter i C viser analysen av data som er oppnådd i spektral FCM uten autofluorescens styring i unmixing, mens D viser de samme data etter unmixing med autofluorescens administrasjon.
embryonale hjerte
Konvensjonell FCM viste en stor populasjon av auto-fluoriserende celler (sort pil) som ble ekskludert fra analysen, fordi det fluorescerte i CD45 og TER119 tømmekanal (PE), for å markere hematopoetiske celler. I motsetning til dette auto fluorescerende populasjonen var ikke til stede som sådan i spektral FCM og er innbefattet i CD45
Figur 4: Auto-fluorescerende celler i E17.5 Hjertecellesuspensjoner er riktig Inkludert i negativ cellefraksjonen i Spectral FCM. (A) Cellesuspensjoner fra fetale hjerte ble farget med anti-TER119 og CD45-PE, Sca-1-PECy5, og CD31-antistoffer og APC sekvensielt ervervet i de tre instrumenter. Svarte pilene viser auto-fluorescerende celler i to conventional fotometere, mens disse celler ikke blir detektert som auto-fluorescerende i spektral-cytometri og kan således bli analysert for spesifikk fluorescensfarging. (B) Auto-fluorescerende celler (i løpet av den elliptiske porten i grønt), men ikke CD31 + celler (rektangulær port i blått, negativ kontroll), viste ekspresjon av hjerte troponin (TNNT2) 7 og atrial lettkjede-2 (MYL7) 8 transkripsjoner. au - vilkårlige enheter i forhold til GAPDH hus-holde transkripsjon. Data presentert som middelverdi ± SEM.
| eksitasjon laser | fluorochrome | spesifisitet | Clone | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | propidiumjodid- | levedyktighet | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | Evolve 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | renset | CD16 / CD32 | 2.4G2 | Fc-reseptor-blokk |
| Liste over Antistoffer brukes i cardiac cellesuspensjon | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-en | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
Tabell 1: Liste over antistoffer som brukes i 19-farge Panel og i Cardiac cellesuspensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvensjonell FCM er basert på detektering av fotoner som utsendes etter eksitasjon av fluorescerende prober. Fluorescensemisjonen fra én fluorkrom detektert i en detektor som er utformet for å måle signalet fra en annen fluorokrom induserer fysiske overlapping. Dette ringvirkninger blant emisjonsspekter må korrigeres av kompensasjoner.
Spektral FCM og databehandling ved unmixing dekonvolveringen algoritme muliggjør en kombinasjon av fluorokromer med tett utslippstopper uten ytterligere kompensasjon, forutsatt at de har forskjellige spektrale former. Algoritmen som benyttes for analysen behandler auto-fluorescens som en uavhengig parameter, å subtrahere ikke-spesifikk fluorescens fra faste vev cellesuspensjoner.
Et panel av 19 fluorokromer ble satt sammen for å analysere immunceller ved hjelp av bare to lasere (488 nm og 405 nm). Faktisk, når den 638 nm laser var på, en seksjon av den 32-kanals PMT tilsvartil eksitasjonsbølgelengden for denne laser var ikke tilgjengelig. For å få maksimal deteksjon kapasiteten til PMT, ble den røde laseren slått av. Musemiltceller ble analysert, noe som åpner for deteksjon av mer enn 12 forskjellige cellepopulasjoner, hvorav omfattet 1% eller mindre av de hematopoetiske celler.
For å teste evnen av spektral FCM for å administrere auto-fluorescens ble to forskjellige situasjoner som kan svekke analysen testes: en hvor lymfocytter var forurenset med epitelceller, og en hvor auto-fluorescerende hjerteceller ble analysert. I motsetning til konvensjonelle FCM, gir spektral-cytometri for diskriminering av alle lymfocyttundergrupper, selv når de representerer mindre undergrupper.
Den kontrovers rundt evne til reproduksjon av voksne kardiomyocytter 9, 10, 11 er delvis på grunn av fraværet av en strategi for å discriminate og isolere distinkte undergrupper av levedyktige celler i hjertet. En multi-parametrisk analyse definerende unike kombinasjoner av markører for å diskriminere de forskjellige hjerte undergrupper kan muliggjøre deteksjon av sjeldne undergrupper på grunn av et stort antall celler som kan analyseres. Føtale hjerter (E17.5) ble analysert, og en stor fraksjon av auto-fluorescerende celler, noe som ville ha unnsluppet deteksjon ved konvensjonell FCM, ble integrert i den ikke-hematopoietisk levedyktig hjertecelleavdeling i spektral FCM.
Et tilbakevendende problem med denne metoden er kravet til god kvalitet fluorescensmerkede antistoffer. Dette er spesielt viktig ved bruk av tandem-fargestoffer, hvor en komponent i tandem er dominerende. For eksempel, kan BV786 og Cy7-PE være vanskelig å skille fra BV421 og PE, henholdsvis.
FCM basert på spektrometri gir den analytiske effektiviteten høyere enn det som oppnås med konvensjonelle FCM, uten behov for erstatning matrices. Dette manuskriptet gir bevis for at det er en alternativ tilnærming som demonstrerer en høy evne til å analysere fravær av komplekse kompensasjon matriser, er usvekket diskriminering av celleundergrupper på grunn av auto-fluorescens, og ingen ytterligere økonomiske forpliktelser som fremdeles kreves for massespektrometri FCM. Spektral FCM synes således å være en fremgangsmåte som velges for analyse av celler oppnådd fra et bredt utvalg av fast vev vanligvis ikke underkastes konvensjonelle FCM og kan brukes i tumor, utviklings, og stamcellebiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner de tekniske og teoretiske bidrag i spektral cytometri av K. Futamura, som også kritisk revidert manuskriptet. Vi er også i gjeld til C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, og P. Pereira for kritisk lesing av manuskriptet og for endeløs teknisk rådgivning og støtte. Vi takker også P. Pereira for gaven av anti Vγ7-APC og Vδ4-Biotin merkede antistoffer. Vi aknowledge Centre d'Enseignements fra Pasteur Institute for innbydende og støtte filming logistikk. Dette arbeidet ble støttet av Pasteur-instituttet, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM); Swiss National Science Foundation og Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para en Ciencia ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); og Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) prosjekt Twothyme, ANR, og Program GJENOPPLIVE (investering for fremtiden) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
