Summary
В этой статье описана спектральные цитометрии, новый подход в проточной цитометрии, который использует форму спектров излучения, чтобы отличить флуорохромы. Алгоритм заменяет возмещения и может относиться к автофлуоресценции как независимый параметр. Этот новый подход позволяет для правильного анализа клеток, выделенных из солидных органов.
Abstract
Проточная цитометрия была использована в течение последних 40 лет для определения и анализа фенотипа лимфоидных и других гемопоэтических клеток. Первоначально ограниченный анализом нескольких флуорохромов, в настоящее время существуют десятки различных флуоресцентных красителей, и одновременно можно комбинировать до 14-18 различных красителей. Однако некоторые ограничения все еще ухудшают аналитические возможности. Из-за большого количества флуоресцентных зондов анализ данных становится все более сложным из-за необходимости больших многопараметрических матриц компенсации. Кроме того, появились модели мутантных мышей, несущих флуоресцентные белки для обнаружения и отслеживания конкретных типов клеток в разных тканях, поэтому необходим анализ (с помощью проточной цитометрии) суспензий автофлуоресцентных клеток, полученных из твердых органов. Спектральная проточная цитометрия, которая различает формы спектров излучения в широком диапазоне непрерывных длин волн, решает некоторые из этих проблем. Данные анализируются wIth алгоритма, который заменяет матрицу компенсации и обрабатывает автофлуоресценцию как независимый параметр. Таким образом, спектральная цитометрии потока должна быть способна различать флуорохромы с аналогичными пиками излучения и может обеспечить мульти-параметрический анализ без требований компенсации.
Этот протокол описывает спектральный анализ проточной цитометрии, что позволяет в течение 21-параметра (19) флуоресцентные зондов характеристики и управления авто-флуоресцентный сигнала, обеспечивая высокое разрешение в незначительном обнаружении населения. Результаты, представленные здесь, показывают, что спектральная проточной цитометрии представляет преимущества при анализе клеточных популяций из тканей трудно охарактеризовать в обычной проточной цитометрии, таких как сердце и кишечник. Спектральный проточной цитометрии, таким образом, демонстрирует мульти-параметрический аналитического потенциала высокопроизводительной обычной проточной цитометрии без требования о компенсации и дает возможность управления авто-флуоресценции,
Introduction
В течение последних нескольких десятилетий, проточной цитометрии (FCM) стал широко доступен аналитический метод необходим для изучения клеток фенотипирования. Там было значительное увеличение доступных флуоресцентных красителей, в частности , флюорохромами возбуждаются фиолетового лазера (405 нм) (например, Brilliant Violet и новые Q-точка красителей). Тем не менее, рост доступных флуоресцентных красителей повышает риск перекрывающихся выбросов и требует матрицы компенсации трудоемкой. FCM стал широко использоваться для анализа клеточных суспензий из твердых тканей, но наличие авто-флуоресцентного клеток ограничивает дискриминацию специально обозначенных групп населения.
Основные принципы спектрального FCM представлены подробно в Futamura и соавт. 1, 2. Если коротко, то спектральная ТСМ используется здесь (смотри таблицу материалов) оснащена 405, 488 и 638 нм лазеров. Спектральная ТСМ фиксирует весь испускаемый пluorescence в спектрах в 32-канальный линейный массив РМТ (ПМТ) 32ch на длине волны 500 нм до 800 нм и 2 независимых ФЭУ для 420 нм до 440 нм и 450 нм до 469 нм, соответственно, которые заменяют обычные фильтры полосовые. 488 и лазерные пятна 405/638 нм пространственно разделены, в то время как 405 нм и 638 нм лазерные пятна коллинеарной. Для каждой отдельной частицы, спектральные меры FCM до 66 каналов данных флуоресценции при возбуждении на 405 нм и 488 нм лазеров. Когда клетки возбуждаются нм лазера 638, спектральная ТСМ измеряет 58 каналов данных флуоресценции, так как маска вставлена, чтобы предотвратить 638 нм лазер светит в ПМТ. Спектральный анализ ТСМ полученные полные данные спектра с помощью алгоритма на основе метода взвешенной по методу наименьших квадратов (WLSM), что дает возможность разделения перекрывающихся спектров флуоресцентного. Спектры получены из отдельных окрашенных и неокрашенных образцов признаны в качестве основных эталонных спектров. Мульти-окрашенные образцы математически, подключеный несмешанные, и спектр образца со смешанными флуоресцентными метками разлагаются в совокупность ее состав спектров. Несмешивание, в спектральной технологии 3, 4, заменяет компенсацию , который удаляет сигнал от всех датчиков , кроме одного измерения данного красителя.
В этом исследовании мы объединили и проходят 19 флуорохромов в одном, 21-анализа параметров, которые были характерны основные кроветворные подмножества найдены в селезенке мыши. Кроме того, мы показали, что спектральная цитометрии может управлять авто-флуоресцентный сигнал, тем самым улучшая характеристику кишечника внутри эпителиальных лимфоцитов и эмбрионального сердца. Действительно, в этих тканях, управление автофлуоресценцией позволило для назначения специфической флуоресценции клеток, которые будут исключены из анализа в обычном ТСМЕ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Пастера Институт Этики Устава и руководящими принципами ЕС и были утверждены Министерством сельского хозяйства Франции.
1. Клеточная суспензия Подготовка от взрослой мыши органов
- Выделение спленоцитов
- Эвтаназии взрослых мышей путем смещения шейных позвонков. Сделайте надрез на животе средней линии и откройте кожу с помощью ножниц. Урожай селезенки с пинцетом.
- Измельчите селезенка между 2 предметные стекла микроскопа, чтобы отделить клетки и развести их в 5 мл сбалансированного Соленым раствор Хенкса (HBSS), содержащим 1% фетальной сыворотки теленка (FCS).
- Центрифуга в течение 10 мин при 120 мкг и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают.
- Ресуспендируют осадок в 5 мл HBSS 1% FCS. Граф клеток с камерой Нойбауэра с использованием трипанового синего витальным красителем.
Примечание: 80 миллионов клеток должны быть получены из одного взрослого селезенки.
- Isolatiна клетки из тонкого кишечника
- Эвтаназии взрослых мышей путем смещения шейных позвонков. С помощью ножниц, сделать надрез в коже на животе средней линии. Возьмитесь тонкой кишки с щипцами в одной руке и использовать ножницы, чтобы разрезать его на обоих концах: во-первых, сразу же после того, как желудок, а затем в конце тонкой кишки, непосредственно перед толстой кишки. Промыть в тонкую кишку с 1x Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS) с использованием 2 мл шприца с иглой.
- Поместите в тонкую кишку на бумажное полотенце и осторожно удалить пятна в бляшках с парой острых ножниц.
- Используйте ножницы, чтобы открыть кишечник на длинной стороне, вставив одну ветвь ножниц внутри кишечника. Вырезать открытый кишечник в 1 см части, используя острые ножницы.
- Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С при постоянном перемешивании в 30 мл HBSS с 10% FCS.
- Поместите суспензию клеток с остальными не-диссоциированных фрагментов в 50 млпластиковая труба и вихревое течение 5 мин при высокой скорости. Примечание: Там нет никакой дальнейшей диссоциации ткани.
- Инкубирую в течение 10 мин на лед, чтобы позволить большим, не-диссоциированным фрагменты для осаждения.
- Собирают супернатант и концентрируют его центрифугированием в течение 7 мин при 120 х г.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл HBSS с 1% FCS. Граф клеток с камерой Нойбауэра с использованием трипанового синего витальным красителем.
Примечание: ~ 60 миллионов интраэпителиальной клетки (IELS) должна быть получена из одного взрослых тонкого кишечника.
- Стратегия дизайна панели
- Подготовка панелей с антителами, непосредственно связанных с флюорохромами.
Примечание: Все антитела предварительно титрует, чтобы получить оптимальное определение клеточных популяций (титрование может меняться в зависимости от партии антител). Антитела , используемые в 19-цветовой панели для окрашивания спленоцитов, перечислены в таблице 1. - Построить мульти-Coloг панель для цитометрии. Как это может быть сложной задачей, используйте следующие рекомендации для оптимизации панелей:
- Проверьте спектральную конфигурацию и флуоресцентные красители, которые могут быть использованы на приборе.
- Использовать информацию о яркости Index / Индекс Окрашивание, предоставляемая производителем.
Примечание: Яркость Индекс / Индекс Окрашивания является относительным показателем интенсивности флуоресценции по сравнению с фоном для каждого флуорохрома. - Выберите антитела следующих правил ниже:
- Выберите самые яркие флуорохромии для белков, которые слабо выражены и тусклые флуорохромии для более высокого уровня экспрессии белков.
Примечание: Например, CD45, CD4, CD8 и имеют высокий уровень экспрессии и могут быть использованы с тусклыми флюорохромами. - Начало проектирования панели при первом выборе антител с наименьшим количеством флуоресцентных возможностей красителя.
- Если это возможно, выбирать флуоресцентные красители с наименьшим перекрытием спектров излучения Fили маркеры экспрессируются на одних и тех же типов клеток.
Примечание: тандемы (например, PE-Cy5, PE-Cy7 и PerCP-Cy5.5) следует использовать с осторожностью, так как они более восприимчивы к деградации освещенности.
- Выберите самые яркие флуорохромии для белков, которые слабо выражены и тусклые флуорохромии для более высокого уровня экспрессии белков.
- Подготовка панелей с антителами, непосредственно связанных с флюорохромами.
- Окрашивание клеток для анализа цитометрии
- Подготовьте 5 мл пробирку с 1 × 10 6 спленоцитов и один 5 мл пробирку с 1 × 10 6 клеток кишечника и держать их неокрашенными для использования в качестве отрицательного контроля.
- Подготовка и маркировать один 5 мл пробирку на образец и на панели в соответствии с таблицей 1. Готовят смесь антител, в соответствии с таблицей 1, в HBSS 1% FCS.
- Передача 1 × 10 6 клеток - либо спленоциты или кишечных клеток - в каждую 5 мл пробирку. Добавить 2 мл HBSS 1% FCS и центрифуги в течение 5 мин при 4 ° С и 120 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл смеси антител.
- Этикетка секplenocytes в 2 этапа. Во-первых, использовать 50 мкл смеси, содержащей антитела, меченные РЕ-цианиновыми 5, PerCP-цианиновыми 5,5, и PerCP (с блокированием рецептора Fc) в 5 мл трубки. Через 20 мин инкубации в темноте при 4 ° С, добавляют 50 мкл смеси, содержащей все другие антитела к 5 мл трубки.
Примечание: Эта стратегия ограничивает пространственное затруднение. - Инкубируют в течение 20 мин в темноте при 4 ° С.
- Добавить 2 мл HBSS 1% FCS и центрифуги в течение 5 мин при 4 ° С и 120 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл HBSS 1% FCS с 0,5 мкг / мл иодида пропидия (PI).
2. Получение единого окрашивания для каждого Флуорохром на коммерческих компенсации бисера микросфер (например, UltraComp eBeads), далее именуемые как бисер
- Подготовка и маркировать как можно больше 5 мл пробирки, как количество антител, которые используются в панелях. Поместите 1 каплю шариков в каждой пробирке и добавить 1 & #181, L антитела на пробирку.
Примечание: Шарики, используемые здесь (смотрите таблицу материалов) содержит окрашенные (положительное) и неокрашенный (отрицательный) бисер. Антитела помещают в избытке на шариках, чтобы обеспечить яркий сигнал и, таким образом, четкие спектральные подписи для каждого красителя. Это требуется программное обеспечение, чтобы иметь возможность сделать точное расслоение. - Инкубируют в течение 20 мин в темноте при 4 ° С.
- Добавляют 2 мл HBSS 1% FCS и центрифуги в течение 5 мин при 120 х г. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл HBSS 1% FCS.
3. Cell Подвеска Подготовка от эмбриональной Мыши Сердца
- Вскрытия эмбрионов
- Планирует получить тайм-беременные самка заранее скрещивание 2 самки с одним самцом (всегда в клетке самца) в конце дня (между 17 и 19 ч). На следующее утро, женщины с вагинальными пробками считаются на 0,5 дней после коитуса.
- Эвтаназии E17.5 беременной FemalДисплазией шейки матки. Убедитесь, что животное не реагирует на нажатие на лапу мыши (рефлекс на носок). Мокрый живот с 70% этанола стерилизовать и, чтобы предотвратить распространение меха мыши.
- Сделайте разрез на коже в середине живота, используя ножницы, и разведите пальцами кожу.
- Откройте брюшную полость, потянув и делая надрезы в брюшной мышце от центра к двум сторонам живота, используя грубые щипцы и ножницы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Будьте осторожны, чтобы не повредить тонкую кишку, которая находится непосредственно ниже перитонеальной мышцы. - Соберите рог матки (с эмбрионами), разрезая оба на уровне тела матки и яичников. Впитайте их в чашку Петри 90 х 15 мм 2 с 50 мл DPBS.
- Изолируйте каждый зародыш путем разрезания между каждым децидуа, а затем матки и мышечной стенки висцерального желточного мешка с помощью тонких щипцов и ножниц. Вытяните эмбрионы intакт. Наконец, перерезать пуповину.
- Вырезать Возглавляет E17.5 эмбрионов с ножницами (обезглавливание) перед началом рассечение.
- Коллекция сердец
- Замачивание обезглавленных эмбрионов в 90 х 15 мм 2 чашки Петри , содержащую влажную бумажное полотенце постельные принадлежности в нижней части тарелки и 50 мл HBSS с 1% FCS.
- Под стереомикроскопом, удерживая каждый эмбрион с грубыми щипцами, так что брюшная сторона обращена вверх.
- Осторожно откройте грудную сетку резания правой стороны груди с помощью ножниц, чтобы предотвратить повреждение сердца.
- Expose сердца, удерживая грудную клетку с грубыми щипцами.
- Растащить сердце (еще собранное с легкими и тимуса), держа большие сосуды (содержащие большие сосуды в- или из потока сердца) и поместите их в 35 х 15 мм 2 чашки Петри с 2 мл HBSS 1% с FCS.
- Изолировать сердце от окружающих органов иСоединительная ткань с тонкими щипцами и скальпелем.
- Вымойте сердца в новой чашке Петри 35 x 15 мм с 2 мл HBSS 1% FCS и держите их на льду в течение 20 минут, чтобы сердце могло выкачать кровь из камер.
- Приготовление суспензий клеток сердца
- Предварительно нагревают коллагеназу 200 мкг / мл в HBSS + / + (далее называемый ферментативным раствором) до 37 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ. Разбавьте коллагеназу в HBSS + / + (с катионами Ca 2+ и Mg 2+ ), чтобы максимизировать активность фермента; Активность коллагеназы стабильна между партиями. - Замените промывочный раствор, впитывающий сердца (HBSS 1% FCS), 1 мл предварительно нагретого ферментативного раствора.
- Под стереомикроскоп, фарш сердца в 1 мм 3 штуки с использованием тонких щипцов и скальпелем. Добавьте еще 1 мл предварительно нагретого ферментативного раствора и перенесите измельченную ткань в 5 мл пробирку с крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптимального пищеварения поместитемаксимум 5 E17.5 сердца в 2 мл ферментного раствора. Если больше сердец перевариваются в то же самое время, разделить их на разные 5 мл пробирки. - Инкубируйте фарш сердца в течение 15 мин при 37 ° С.
Примечание: сложить 5 мл пробирки (закрытые) надлежащим образом в инкубаторе для распространения ткани вдоль раствора.- В конце инкубации, гомогенизация ткани в том же ферментативном растворе с помощью пипетки вверх и вниз примерно в 20 раз с P1000 пипеткой. Поместите по 5 мл трубки в вертикальном положении, и пусть оставшийся фрагмент ткани осадок (приблизительно 3 мин).
- Собирает супернатант (содержащий переваренные клетки в суспензии) в трубке 50 мл, добавляют 2 мл HBSS 10% FCS (такой же объем, как и объем ферментного раствора добавляет к фрагментам ткани), и держать их на льде, продолжая переваривание процесс.
Примечание: HBSS, 10% -ный раствор FCS, и лед играют важную роль в неактивное действие фермента в то время как остальные тканипереваривание. - Добавить 2 мл подогретого ферментативного раствора в пробирки по 5 мл с остальными фрагментами ткани и продолжить пищеварение повторяя шаг 3.3.4, пока не наблюдается более ткани.
Примечание: Около 4 циклов пищеварения достаточно, чтобы полностью отделить ткань сердца (5 E17.5 сердца в 2 мл ферментного раствора).
- Центрифуга пробирки на 50 мл с клетками в суспензии в течение 10 мин при 300 мкг и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток, добавляют 1 мл HBSS - / - 1% FCS, и фильтровать суспензии клеток, хотя нейлоновое сито 70 мкм. Граф клеток с камерой Нойбауэра с использованием трипанового синего витальным красителем.
Примечание: Ресуспендируют клетки с HBSS - агрегации клеток (без Ca 2+ и Mg 2+ катионов) , чтобы свести к минимуму - /. Между 800000 и 1000000 клетки получают из одного E17.5 сердца.
- Предварительно нагревают коллагеназу 200 мкг / мл в HBSS + / + (далее называемый ферментативным раствором) до 37 ° С.
- Окрашивание сердечных клеток с флуоресцентными антителами
Примечание: Все Antibodх годов предварительно титруют , чтобы получить оптимальное определение клеточных популяций (титрование может меняться в зависимости от партии антител) .The антитела , используемые в панели сердца , перечисленных в таблице 1.- Распределить сердечные клетки в суспензии через 96-луночный планшет с круглым дном (). Распределить их равномерно во всех необходимых скважин (200 мкл на лунку), короткого спина центрифуги 96-луночный планшет в течение 1 мин при 480 мкг, и отбросить супернатант.
Примечание: Все лунки 96-луночного планшета с круглым дном () могут быть использованы. - Ресуспендируют осадок и инкубировать сердечные клетки в течение 20 мин в темноте при 4 ° С со 100 мкл коктейля антител (то есть, CD45-PE, Ter119-PE, CD31-Alexa 647, и Sca-1-PE-Cyanine5 ) разводили в HBSS - / - 1% FCS.
- Промывают сердечные клетки от избытка антител путем добавления 200 мкл HBSS - / - 1% FCS, и короткое спина центрифугирование клеток в течение 1 мин при 480 х г.
- Жидкость над осадком сливают и повторкороткого спинового центрифугирования (этап 3.4.3).
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл HBSS - / - 1% FCS и передавать их в 5 мл пробирку, уже содержащую 200 мкл HBSS - / - 1% FCS.
- Перед приобретением, добавьте 400 мкл HBSS - / - 1% FCS с 0,5 мкг / мл PI и фильтрации суспензии клеток, хотя нейлоновое сито 70 мкм.
- Распределить сердечные клетки в суспензии через 96-луночный планшет с круглым дном (). Распределить их равномерно во всех необходимых скважин (200 мкл на лунку), короткого спина центрифуги 96-луночный планшет в течение 1 мин при 480 мкг, и отбросить супернатант.
4. Получение меченых селезеночные, кишечная и сердечные клетки со спектральным проточным цитометром
- До получения данных, автоматически калибровать спектральные цитометрии в соответствии с инструкциями изготовителя. Выполнение ежедневного и ежемесячных процедур контроля качества каждый день эксперимента.
- Когда цитометра готова, начать просмотр образцов, содержащих клеточные суспензии, меченные все антитела.
Примечание: Не приобретать. - Убедитесь, что все лазеры на по мере необходимости. Отрегулируйте усиление FSC таким образом, что все клетки видны в соответствующемучастки. Ворота популяция клеток и применить эти ворота к двум спектральных участков, соответствующих 488 нм и на 638/405 нм лазеров.
Примечание: Когда флуорохромы возбуждаются 638-нм лазера (т.е. когда 638-нм лазер включен), есть маска , что экраны свет от 617-662 нм , чтобы предотвратить 638 нм лазер светит в ПМТ. Это вызывает потерю части спектра и, следовательно, вызывает более низкое разделение близких красителей, излучающие в этих длинах волн. Тем не менее, весь сигнал может быть собран путем выключения 638-нм лазер, если это не требуется для приобретения. - Настройка 32-канальный фотоумножительную (ПМТ) напряжение (%) таким образом, что все флуорохромы находятся в пределах диапазона интенсивности , отображаемой в у-осей (1-10) 6 в двух различных спектральных участках , где отображается 488 нма и 405/638 нм возбуждения.
Примечание: Требуется обучение распознавать спектры всех люминофоры используются. - Начинают приобретать образцы. Нажмите на "; Предварительный просмотр» , чтобы визуализировать клетки на экране , а затем нажмите на„Приобретать“ , чтобы записать образец Сэкономьте до 2 х 10 6 событий из каждого образца..
- После получения окрашенных образцов, приобретают образец окрашивали витальным красителем, а затем компенсационные бусинами индивидуально окрашивали антителами всех используемых. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр», чтобы визуализировать клетки на экране, а затем на «захватит» для записи образцов.
Примечание: Держите одинаковое напряжение ФЭУ для всех образцов и контролей (то есть, бусин и неокрашенных образцов); 5000 событий в основном достаточно. - И, наконец, получают данные из неокрашенных клеточных суспензий. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр», чтобы визуализировать клетки на экране, а затем на «захватит» для записи образцов.
Примечание: Получение неокрашенных образцов в конце эксперимента сводит к минимуму уноса флуоресцирующих клеток. - Очистите цитометр следующих инструкций апа производителяd закрыть эксперимент в папке сбора.
Примечание: Только после закрытия эксперимента она будет сохранена и доступна для анализа.
5. Анализ данных с помощью спектрального ТСМ Software
- В окне «Цветовая палитра» на вкладке «Анализ», регистрировать все параметры, присутствующие в панели, добавляя каждый флуорохром, используемый и соответствующий маркер (выбрать из списка доступных или добавить новый параметр). Кроме того, включают в себя авто-флуоресценции и жизнеспособность параметры; все выбранные параметры будут отображаться в окне «расслоение».
- Выберите первый сингл окрашенную образца (сделано с компенсацией бус) в окне «Управление» под «Список труб» этого эксперимента на вкладке «Анализ». На листе, нажмите на «дизайн многоугольника инструмента» и создать ворота на населении бисерного в FSC / SSC участке. Дважды щелкните на верхней части ворот , чтобы открыть спектральный или точечный участоквизуализировать стробированные бусины в дочернем участке.
- Дизайн одних ворот для положительного и одних ворот для отрицательных бусин либо на спектре или на точечном участке. Проверьте все спектры, соответствующие два лазерных наборов для каждой положительной и отрицательной фракции и устранить выбросы путем последовательного стробирования и нажав на воротах, чтобы проверить дочь населения. Введите отрицательные и положительные ворота в окне «расслоение».
- Повторите шаг 5.2 для каждого отдельного окрашенных образца.
Примечание: Имейте в виду, что положительная и отрицательная стратегия стробирования соответствует образцу, который в настоящее время анализируется, хотя программа позволяет ему быть размещены в любом образце. Вместо того, чтобы определить отрицательную часть для каждого отдельного окрашенных образца, использовать неокрашенной образец шарика, чтобы установить универсальный негатив.
- Выберите неокрашенный образец ячейки в «Списке труб» и дизайн вороте для autofluorescent и для не autofluorescent клеток. <li> Когда все отрицательные и положительные ворота для всех параметров, в том числе автофлуоресценции и жизнеспособности, выбираются в окне «расслоение», нажмите на кнопку «Рассчитать». Примените расслоение к образцам для анализа.
- Анализ данных по проектированию ворота и создания графиков двух параметров.
- Во-первых, создать ворота для SSC против ФСБ и затем удаляют омертвевшие клетки, за исключением всех клеток, меченных жизнеспособность маркера (PI против CD45). На остальной части клетки, дизайн ворот для всех групп населения , представляющих интерес следующих стратегий , описанные для каждой клеточной суспензии (фиг.1-3).
Примечание: При необходимости, отрегулируйте компенсацию в «опорный регулятор спектра.» Это инструмент, который может быть использован после того, как расслоение перенастраивать медиану положительных популяций для каждого флуорохрома, если алгоритм не мог сделать это прекрасно.
- Во-первых, создать ворота для SSC против ФСБ и затем удаляют омертвевшие клетки, за исключением всех клеток, меченных жизнеспособность маркера (PI против CD45). На остальной части клетки, дизайн ворот для всех групп населения , представляющих интерес следующих стратегий , описанные для каждой клеточной суспензии (фиг.1-3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21-параметр спектральной ТСМ панели для анализа спленоцитов
На рисунке 1 показаны результаты , полученные с 19-флуоресцентной-антителом панели , приложенной к селезеночным клеткам , содержащих различные антитела , распознающие подмножества T, B, NK, дендритные, и миелоидным клеток, в то время как CD45 этикеток всех кроветворным клеток ядросодержащих. Панель также включает в себя жизнеспособность красителя (PI), а также размер (FSC) и гранулярности параметров (SSC). На фиг.1А показаны спектры опорного Флуорохром. После устранения мертвых клеток в CD45 + ворот (рис 1В), анализ показывает , что CD3 + Т - клетки экспрессируют цепь TCR & beta ; и имеют ожидаемый CD4 / CD8 и распределение доли CD25 + клеток в CD4 Т - клеток. CD8 T-клетки демонстрируют нормальное распределение CD44- и Ly49D-экспрессирующих клеток. CD19 + В - клетки со-экспресс В220D MHCII, а также IgM и IgD, типичные для зрелых селезеночных B-клеток. Подмножество NK1.1 + NK клеток представляет собой небольшое подмножество лимфоцитов селезенки, которые экспрессируют Ly49D. Остальные клетки содержат небольшое подмножество CD11c + дендритных клеток с высокими уровнями MHC II, некоторые из которых также являются CD11b + . Клетки F4 / 80 + , характерные для тканевых резидентных макрофагов, экспрессируют CD11b и самые высокие уровни CD44, обнаруженные в селезенке. Оставшиеся клетки (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c - ) можно подразделить на экспрессию CD11b и Gr1, где небольшое подмножество двойных положительных клеток также экспрессирует высокие уровни CD44, вероятно, соответствующие предшественникам Как известно, присутствует на низких частотах в селезенке. Для трех маркеров значительная доля была отрицательной. На рисунке 2 показан такой же анализ, прежде чем корректировать компенсацию.
Рисунок 1: 19-цветное Антитело Панель для анализа Мышиных клеток селезенки. Спленоциты (А) Мыши были окрашены с предыдущей комбинацией антител, к которому-эволюционируют CD45 655 были добавлены. Опорные спектры всех флюорохромов показаны. Флуорофора меченных CD45 отмечен красной стрелкой. В флуорохромах приведены в таблице 1. (В) Контурных графиках показывают дискриминационную емкость этого многопараметрического анализа для разделения различных популяций B, T, NK, дендритные или миелоидных клеток. Анализ проводился в обычном программном обеспечении ТСМА после расслоения деконволюции.
Рисунок 2: 19-цветное Антитело Панель для анализа Мышиных клеток селезенки. Же анализ, как на фиг.1, был сделан до регулировки оборотовtment компенсации с эталонными спектрами регулятора.
Тонкая кишка интраэпителиальной лимфоциты
Несколько популяции Т-клеток обнаружены в кишечнике в пределах эпителиального клеточного слоя 5, 6. Обычная изоляция этих подмножеств содержит градиент плотности, отделяющие лимфоциты из эпителиальных клеток. Однако, этот препарат является деликатным, отнимает много времени и приводит к гибели клеток. Для того, чтобы улучшить количественные и облегчить экспериментальную процедуру, был испытан потенциал спектральной FCM различать популяции кишечных лимфоцитов в пределах большой фракции эпителиальных клеток. После механического разрушения эпителиальной ткани, клеточные суспензии окрашивали антитела, которые маркируют подмножества аи и γδ Т-клетку обычно находится в кишечном эпителии.Клетки анализировали в двух обычных цитометрах и в спектральной FCM.
На рисунке 3 показаны результаты после выполнения аналогичной стратегии стробирования, с устранением мертвых клеток стробирования на PI-негативные клетки. Наличие авто-флуоресцентные клетки очевидно во всех обычных цитометров и в спектральной цитометрии, когда менеджер авто-флуоресценции инактивируется (верхние панели, красные стрелки), что приводит к плохому дискриминации живых клеток. Во всех участках, клетки в FSC-A / SSC-лимфоците ворот показаны в синем и клетках с более крупными разбросами (эпителиальные клетками затвора) показаны красным цветом. Оба обычных инструменты были неспособны решить подмножество Т-клеток CD3 + (синим) (бирюзовые стрелки) от остальных клеток. Таким образом, TCR & beta ; - клетки (зеленая стрелка) загрязнена на CD3 + TcRγδ - население, биологически неправдоподобно подмножество никогда не обнаружено после separatiНа лимфоциты из эпителиальных клеток. Напротив, в спектральном FCM после управления автофлуоресценцией анализ различных T-клеточных подмножеств не был нарушен присутствием эпителиальных клеток, популяции были хорошо отделены и не было TcR-отрицательных клеток в CD3 + Ворота.
Рисунок 3: Наличие автофлуоресцентных клеток не влияет на обнаружение внутриэпителиальных лимфоцитов в спектральном FCM. Мелкие клетки кишечника, включая эпителиальные клетки и лимфоциты, были окрашены антителами, распознающими TcRδ, PI, TcRβ Cy7-APC CD3 (панели B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (панели C) и CD8 FITC (панели D). PI добавляли в буфер FACS перед анализом. Получение данных осуществлялось последовательно в трех инструментах после соответствующего контроля качества. Дублеты были устраненыTed в FSC-H / FSC-W. Анализ проводился в обычном программном обеспечении ТСМ. Графики показывают различные этапы стратегии стробирования. Клетки в рамках FSC-A / SSC-лимфоцита ворота помечены синим цветом, в то время как клетки внутри кишечника эпителиальных клеток ворот помечены красным цветом. Стрелки указывают на различные искажения населения и автофлуоресценции. Участки в C показывают анализ данных, полученных в спектральной FCM без управления автофлуоресцентного в расслоении, тогда как D показывает те же данные, после того, как расслоении с управлением автофлуоресцентным.
Эмбриональные сердца
Обычные FCM показали значительное население авто-флуоресцентный клеток (черная стрелка), который был исключен из анализа, поскольку флуоресцирующий в CD45 и Ter119 свалке канала (PE), маркировке кроветворных клеток. В отличие от этого, этот автомобиль-флуоресцентный населения не присутствовал как таковой в спектральном ТСМ и состояла в CD45
Рисунок 4: Авто-флуоресцентные клетки в E17.5 кардиологических Суспензии клеток Должным В Отрицательной фракции клеток в спектральном ТСМ. (А) Суспензии клеток из эмбриональных сердец окрашивали анти-Ter119 и CD45-PE, Sca-1-PECy5 и CD31-APC антител и последовательно полученные в трех инструментов. Черные стрелки показывают авто-флуоресцентные клетки в два удобстеntional цитометры, в то время как эти клетки не обнаружены, как авто-флуоресцентные в спектральной цитометрии, и, таким образом, могут быть проанализированы для конкретного флуоресцентного окрашивания. (В) Авто-флуоресцентных клетки ( в пределах эллиптического ворота в зеленом цвете), но не CD31 + -клетки (прямоугольные ворота в синем, отрицательном контроле), показали экспрессию сердечного тропонина (TNNT2) 7 и предсердный легкая цепь-2 (MYL7) 8 транскриптов. аи - произвольные единицы по отношению к дому по поддержанию транскрипта GAPDH. Данные представлены как среднее значение ± SEM.
| Возбуждение лазера | флюорохром | специфичность | клон | |
| 488 нм | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 нм FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 нм | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 нм | ПЭ-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 нм | РЕ-Су5 | CD44 | IM7 | |
| 488 нм | ПЭ-Cy7 | CD11b | М1 / 70 | |
| 488 нм | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 нм | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 нм | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 нм | Пропидиум йодид | осуществимость | ||
| 405 нм | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 нм | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 нм | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 нм | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 нм | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 нм | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 нм | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 нм | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 нм | Развиваться 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | очищенный | CD16 / CD32 | 2.4G2 | Блок Fc-рецептора |
| Список антител используется в КардиСуспензию клеток переменного тока | ||||
| 638 нм | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 нм | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 нм | РЕ-Су5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 нм | PE | Ter119 | ТЕР-119 | |
Таблица1: Список антител , используемых в 19-цветной панели и в кардиохирургии клеточной суспензии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обычный ТСМ основан на обнаружении фотонов, излученных после возбуждения флуоресцентных зондов. Излучения флуоресценции одного флуорохрома обнаруженного в детекторе, предназначенный для измерения сигнала от другого флуорохрома вызывает физическое перекрытие. Это перелив среди спектров излучения должно быть исправлен путем компенсации.
Спектральный ТСМ и обработки данных с помощью алгоритма несмешивания деконволюции позволяют комбинацию флюорохромов с близкими пиками эмиссии без дополнительной компенсации, при условии, что они имеют разные спектральные формы. Алгоритм, используемый для анализа обрабатывает автофлуоресценцию как независимый параметр, вычитая неспецифическую флуоресценцию из суспензий твердых клеточных тканей.
Панель из 19 флюорохромами был собран для анализа иммунных клеток с использованием только двух лазеров (488 нм и 405 нм). Действительно, когда 638 нм лазер был включен, секция 32-канального ФЭУ, соответствующийна длине волны возбуждения этого лазера не был доступен. Для того, чтобы получить максимальную мощность обнаружения ЕГО, красный лазер был выключен. Была проанализирована Mouse клетка селезенки, что позволяет для обнаружения более чем 12 различных клеточных популяций, некоторые из которых составляли 1% или менее кроветворные клетки.
Для того, чтобы проверить способность спектральной FCM управлять автофлуоресценциями, были протестированы две различных ситуаций, которые могут ухудшить анализ: один, где лимфоциты были загрязнены с эпителиальными клетками, и один, где были проанализированы авто-флуоресцентные клетки сердца. В отличии от обычных FCM, спектральная цитометрии позволяет дискриминацию всех субпопуляций лимфоцитов, даже тогда, когда они представляют собой небольшие подмножества.
Споры вокруг регенеративной способности взрослых кардиомиоцитов 9, 10, 11 частично из - за отсутствия стратегии на дисинкриминировать и выделить различные подмножества жизнеспособных клеток в сердце. Мульти-параметрический анализ определяющий уникальных комбинаций маркеров для различения различных сердечных подмножеств может позволить обнаружение редких подмножеств из-за большое количество клеток, которые могут быть проанализированы. Были проанализированы сердца плода (E17.5), и большая часть авто-флуоресцентные клеток, которые избежали бы обнаружения в обычном ТСМЕ, была интегрирована в не кроветворных жизнеспособных клетках сердечного отсека в спектральной FCM.
Рекуррентный проблема этого метода является требование хорошего качества люминесцентных меченых антител. Это особенно важно при использовании тандемных красителей, когда компонент тандема является доминирующим. Например, BV786 и Cy7-РЕ может быть трудно отличить от BV421 и РЕ, соответственно.
ТСМ на основе спектрометрии обеспечивает аналитическую мощность выше, чем полученный с обычной FCM, без необходимости компенсации мatrices. Эта рукопись свидетельствует о том, что существует альтернативный подход, который демонстрирует высокий аналитический потенциал, отсутствие комплексных матриц компенсации, неразделенную дискриминацию клеточных субпопуляций из-за автофлуоресценции, и никаких дополнительных финансовых обязательств, которые по-прежнему необходимы для масс-спектрометрического ТСМА. Спектральный ТСМ, таким образом, по-видимому, является методом выбора для анализа клеток, полученных из широкого спектра твердых тканей, как правило, не поддающихся обычным ТСМ и могут быть использованы в опухоли, развития и биологии стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем технический и теоретический вклад в спектральную цитометрию К. Футамуры, который также критически пересмотрел рукопись. Мы также признательны К. Айт-Мансуру, П.-Х. Commere, A. Bandeira и P. Pereira за критическое чтение рукописи и бесконечные технические консультации и поддержку. Мы также благодарим П. Перейру за дар анти-Vγ7-APC и антител, меченных Vδ4-биотином. Мы знаем Центр d'Enseignements от института Пастера для того, чтобы приветствовать и поддерживать логистику съемок. Эта работа была поддержана Институтом Пастера, Национальным институтом прикладной математики (INSERM); Швейцарский национальный научный фонд и Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciêccia ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); И Université Paris Diderot, проект Национального агентства по реформе (ANR) Twothyme, ANR и программа REVIVE («Инвестиции в будущее»)) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
