Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri

doi: 10.3791/55578 Published: May 5, 2017

Summary

Den här artikeln beskriver spektral cytometry, en ny strategi i flödescytometri som använder formen på emissionsspektra för att skilja fluorokromer. En algoritm ersätter kompensationer och kan behandla auto-fluorescens som en oberoende parameter. Denna nya metod gör det möjligt för en korrekt analys av celler som isolerats från fasta organ.

Abstract

Flödescytometri har använts under de senaste 40 åren för att definiera och analysera fenotypen av lymfoida och andra hematopoetiska celler. Inledningsvis begränsat till analysen av några fluorokromer, för närvarande det finns massor av olika fluorescerande färgämnen, och upp till 14-18 olika färger kan kombineras på en gång. Men flera begränsningar fortfarande försämra analyskapacitet. På grund av mångfalden av fluorescerande prober har dataanalys blivit alltmer komplicerad på grund av behovet av stora, multi-parametriska ersättning matriser. Dessutom har muterade musmodeller bär fluorescerande proteiner för att detektera och spår specifika celltyper i olika vävnader blir tillgängliga, så analysen (genom flödescytometri) av auto-fluorescerande cellsuspensioner erhållna från fasta organ krävs. Spektral flödescytometri, vilket skiljer formerna på emissionsspektra längs ett brett intervall av kontinuerliga våglängder, tar upp några av dessa problem. Data analyseras wed en algoritm som ersätter ersättnings matriser och behandlar auto fluorescens som en oberoende parameter. Sålunda bör spektral flödescytometri ha förmåga att diskriminera fluorokromer med liknande toppar utsläpps och kan ge en fler parametrisk analys utan kompensationskrav.

Detta protokoll beskriver den spektrala flödescytometrianalys, vilket möjliggör en 21-parameter (19 fluorescerande prober) karakterisering och förvaltning av en auto-fluorescerande signal, som ger hög upplösning i mindre population detektering. De resultat som presenteras här visar att spektral flöde presenteras cytometry fördelar i analysen av cellpopulationer från vävnader svåra att karakterisera vid konventionell flödescytometri, såsom hjärtat och tarmen. Spectral flödescytometri sålunda demonstrerar den fler parametriska analyskapacitet av högpresterande konventionell flödescytometri utan kravet på kompensation och möjliggör automatisk fluorescenshantering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under de senaste årtiondena, flödescytometri (FCM) blev en allmänt tillgänglig analysmetod väsentlig för cell fenotypning studier. Det har skett en väsentlig ökning av de tillgängliga fluorescerande färgämnen, i synnerhet fluorokromer exciteras av violett laser (405 nm) (t.ex. Brilliant Violet och nya Q-dot färgämnen). Men ökar tillväxten av tillgängliga fluorescerande färger risken för överlappning utsläpp och kräver arbetsintensiva ersättning matriser. FCM blev allmänt använd för att analysera cellsuspensioner från fast vävnad, men närvaron av auto-fluorescerande celler begränsar diskriminering av specifikt märkta populationer.

De grundläggande principerna för spektral FCM redovisas i detalj i Futamura et al. 1, 2. Kortfattat är den spektrala FCM som används här (se tabellen av material) utrustad med 405, 488, och 638 nm lasrar. Den spektrala FCM fångar all den emitterade fluorescence som spektra i en 32-kanals linjär array PMT (32ch PMT) för 500 nm till 800 nm och 2 oberoende PMTs för 420 nm till 440 nm och 450 nm till 469 nm, respektive, som ersätter de konventionella bandpassfiltren. De 488 och de 405/638 nm laserpunkter är rumsligt separerade, medan 405 nm och 638 nm laserpunkter är kolinjära. För varje individuell partikel, de spektrala FCM mäter upp till 66 kanaler av fluorescensdata som exciteras av 405 nm och 488 nm lasrar. När celler exciteras av 638 nm laser, den spektrala FCM mäter 58 kanaler av fluorescensdata, eftersom en mask är insatt för att förhindra att 638 nm laser från skiner in i PMT. Spektral FCM analyserar de förvärvade fullständiga spektrumdata med en algoritm baserad på den vägda minsta kvadratmetoden (WLSM), som möjliggör separation av överlappande fluorescerande spektra. Spektra härrörande från enkelsträn färgade och ofärgade prover redovisas som den grundläggande referensspektra. Multi-färgade prover matematiskt monterade ennd oblandade, och spektrumet av ett prov med blandade fluorescerande märkningar sönderdelas till en samling av sitt konstituerande spektra. Den unmixing, i spektral teknik 3, 4, ersätter den ersättning som tar bort signalen från alla detektorer utom den mätning av en given färgämne.

I denna studie, vi kombinerades och testades 19 fluorokromer i en enda, 21-parameteranalys som känne de stora hematopoietiska delmängder som finns i musmjälte. Dessutom visade vi att den spektrala cytometry klarar automatisk fluorescerande signal, vilket förbättrar karakterisering av intestinala intraepitelial lymfocyter och embryonala hjärta. Faktum är att i dessa vävnader, auto-fluorescens management tillåtet för tilldelningen av specifika fluorescens till celler som skulle uteslutas från analysen vid konventionell FCM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla experiment utfördes enligt Pasteurinstitutet Ethic stadgan och EU: s riktlinjer och godkändes av den franska jordbruksministeriet.

1. Cell Suspension Preparation från vuxen mus Organs

  1. Isolering av splenocyter
    1. Euthanize vuxna möss genom cervikal dislokation. Gör ett snitt på buken mittlinjen och öppna huden med en sax. Skörda mjälten med pincett.
    2. Krossa mjälten mellan två glasobjektglas för att dissociera cellerna och späda ut dem i 5 ml av Hanks balanserade Saltade Solution (HBSS) innehållande 1% fetalt kalvserum (FCS).
    3. Centrifugera i 10 min vid 120 xg och 4 ° C. Kassera supernatanten.
    4. Återsuspendera pelleten i 5 ml HBSS 1% FCS. Räkna cellerna med en Neubauer kammare med användning av en Trypan blå vital färgning.
      OBS: 80 miljoner celler bör erhållas från en vuxen mjälte.
  2. Isolatipå av celler från tunntarmen
    1. Euthanize vuxna möss genom cervikal dislokation. Med hjälp av en sax, gör ett snitt i huden på buken mittlinjen. Ta tag i tunntarmen med pincett i ena handen och använda sax för att klippa det i båda ändarna: första, direkt efter magen och sedan i slutet av tunntarmen, strax före tjocktarmen. Spola tunntarmen med 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med användning av en 2 ml spruta med en nål.
    2. Sätt tunntarmen på en pappershandduk och försiktigt bort Peyers plack med ett par vassa saxar.
    3. Använd sax för att öppna tarmen på sin långsida genom att sätta in en gren av saxen inne i tarmen. Skär den öppnade tarmen in 1 cm bitar med hjälp av vass sax.
    4. Inkubera i 30 min vid 37 ° C under konstant omrörning i 30 ml HBSS med 10% FCS.
    5. Placera cellsuspensionen med de återstående icke-dissocierade fragmenten i en 50 mlplaströr och vortexblanda i 5 minuter vid hög hastighet. OBS: Det finns ingen ytterligare dissociation av vävnaden.
    6. Inkubera i 10 minuter på is för att tillåta de stora, icke-dissocierade fragmenten för att pelletera.
    7. Samla supematanten och koncentrera den genom centrifugering under 7 min vid 120 x g.
    8. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml HBSS med 1% FCS. Räkna celler med en Neubauer kammare med användning av en Trypan blå vital färgning.
      NOT: ~ 60 miljoner intra-epitelial-celler (IELs) bör erhållas från en vuxen tunntarmen.
  3. Panel designstrategi
    1. Förbereda panelerna med antikroppar direkt kopplade med fluorokromer.
      NOTERA: Alla antikroppar är tidigare titreras för att erhålla den optimala definition av de cellpopulationer (titreringen kan variera med antikroppen sats). De antikroppar som används i den 19-färgpanelen för att färga splenocyter är listade i tabell 1.
    2. Konstruera fler color paneler för cytometri. Eftersom detta kan vara en utmanande uppgift, använd följande riktlinjer för att optimera panelerna:
      1. Kontrollera den spektrala konfiguration och fluorescerande färgämnen som kan användas på instrumentet.
      2. Använd Brightness Index / Färgning Index information från tillverkaren.
        OBS: Ljusstyrka Index / rökfärgningsindex är den relativa indikator på fluorescensintensiteten kontra bakgrunden för varje fluorokrom.
      3. Välj antikropparna efter reglerna nedan:
        1. Välj de ljus fluorokromer för proteiner som svagt uttrycks och dimmest fluorokromer för högre uttryckta proteiner.
          OBS: Till exempel är CD45, CD4 och CD8 starkt uttryckt och kan användas med dim fluorokromer.
        2. Börja utforma panelen genom att först välja antikroppar med minst antal fluorescerande färgämne möjligheter.
        3. Om möjligt, välja fluorescerande färgämnen med den minsta överlappningen av emissionsspektra feller markörer uttrycks på samma celltyper.
          OBS: dubbel (t.ex. PE-Cy5, PE-Cy7 och PerCP-Cy5.5) skall användas med försiktighet, eftersom de är mer känsliga för nedbrytning av ljusexponering.
  4. Färgning av celler för cytometri-analys
    1. Förbereda en 5 ml rör med 1 x 10 6 splenocyter och en 5 ml rör med 1 x 10 6 tarmceller och hålla dem ofärgade för användning som negativa kontroller.
    2. Förbereda och märka en 5 ml rör per prov och per panel enligt Tabell 1. Förbereda den blandning av antikroppar, enligt tabell 1, i HBSS 1% FCS.
    3. Överförings 1 x 10 6 celler - antingen splenocyter eller tarmceller - in i varje 5 ml rör. Lägg 2 ml HBSS 1% FCS och centrifugera i 5 min vid 4 ° C och 120 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 | il av antikropp mix.
    4. Märka splenocytes i 2 steg. Först använder 50 mikroliter av blandningen som innehåller de antikroppar märkta med PE-Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5,5, och PerCP (med Fc-receptorblockerande) i ett 5 ml rör. Efter 20 minuters inkubation i mörker vid 4 ° C, tillsätt 50 | il av blandningen som innehåller alla andra antikroppar till ett 5 ml rör.
      OBS: Denna strategi begränsar steriskt hinder.
    5. Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C.
    6. Lägg 2 ml HBSS 1% FCS och centrifugera i 5 min vid 4 ° C och 120 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 mikroliter av HBSS 1% FCS med 0,5 ug / ml propidiumjodid (PI).

2. Framställning av Single-färgning för varje fluorokrom om affärsKompensations Bead Mikrosfärer (t.ex. UltraComp eBeads), nedan kallade pärlor

  1. Förbereda och märk så många 5 ml rör som antalet antikroppar som används i panelerna. Placera en droppe av pärlor i varje rör och tillsätt 1 & #181; L av antikropp per rör.
    OBS: Kulorna som används här (se tabell av material) innehåller färgade (positiv) och ofärgade (negativa) pärlor. Antikroppar sätts i överskott på pärlorna för att säkerställa en ljus signal och således en klar spektral signatur för varje färgämne. Detta krävs av programvaran för att kunna göra en exakt unmixing.
  2. Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C.
  3. Tillsätt 2 ml av HBSS 1% FCS och centrifugera i 5 min vid 120 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 mikroliter av HBSS 1% FCS.

3. Cell Suspension Preparation från Embryonala Mus Hearts

  1. Dissektioner av embryon
    1. Planerar att erhålla tidsinställd-gravida honor i förväg genom att para 2 honor med en hane (alltid i hanens bur) i slutet av dagen (mellan 17 och 19 h). Nästa morgon är honor med vaginalpluggar anses vara 0,5 dagar efter coitum.
    2. Euthanize E17.5 gravid kvies genom cervikal dislokation. Se till att djuret inte svarar genom att trycka hårt på musen tass (toe-nypa reflex). Väta buken med 70% etanol för att sterilisera och för att förhindra spridning av mus päls.
    3. Gör ett snitt i huden i mitten av buken med hjälp av en sax och dra huden isär med fingrarna.
    4. Öppna bukhålan genom att dra och göra snitt i buken muskler från centrum mot de två sidorna av buken med hjälp av brutto pincett och sax.
      OBS: Var noga med att inte skada tunntarmen, som är omedelbart under peritoneal muskeln.
    5. Samla livmoderhornen (med embryona) genom att skära både på nivån av livmoderkroppen och av äggstockarna. Blöta dem i en 90 x 15 mm 2 petriskål med 50 ml DPBS.
    6. Isolera varje embryo genom att skära mellan varje decidua, följt av livmodern muskelväggen och den viscerala gulesäcken med en fin pincett och sax. Dra ut embryon intspela teater. Slutligen klippa navelsträngen.
    7. Skär E17.5 embryon huvuden med sax (halshuggning) innan dissekering.
  2. Insamling av hjärtan
    1. Blöta avhuggna embryona i en 90 x 15 mm 2 petriskål med en våt pappershandduk strö i skålen botten och 50 ml HBSS med 1% FCS.
    2. Under en stereomikroskop, hålla varje embryo med brutto pincett så att den ventrala sidan är vänd uppåt.
    3. Öppna försiktigt bröstkorg gallret genom att skära den högra sidan av bröstkorgen med en sax för att undvika skador på hjärtat.
    4. Exponera hjärtat genom att hålla bröstkorgen med brutto pincett.
    5. Dra isär hjärtat (fortfarande monteras med lungorna och tymus) genom att hålla de stora kärlen (innehållande de stora kärlen i in- och ut-strömning av hjärtat) och placera dem i ett 35 x 15 mm 2 petriskål med 2 ml HBSS 1% med FCS.
    6. Isolera hjärtan från de omgivande organ ochbindväv med fin pincett och en skalpell.
    7. Tvätta hjärtan i ett nytt 35 x 15 mm Petri skål med 2 ml av HBSS 1% FCS och hålla dem på is under 20 min för att tillåta hjärtat att pumpa ut blodet inuti kamrarna.
  3. Framställning av hjärt cellsuspensioner
    1. Pre-värma 200 | ig / ml kollagenas i HBSS + / + (nedan kallad enzymatisk lösning) till 37 ° C.
      OBS: Späd kollagenas i HBSS + / + (med Ca2 + och Mg2 + katjoner) för att maximera enzymaktivitet; kollagenasaktivitet är stabil mellan satser.
    2. Ersätta tvättlösningen blötläggning hjärtan (HBSS 1% FCS) med 1 ml förvärmda enzymatisk lösning.
    3. Under ett stereomikroskop, finhacka hjärtan in i en-mm 3 bitar med hjälp av fin pincett och en skalpell. Lägga till ytterligare en ml förvärmda enzymatisk lösning och överföra det malda vävnaden till ett 5 ml rör med lock.
      OBS: För en optimal matsmältning, placera enmax 5 E17.5 hjärtan per 2 ml av enzymatisk lösning. Om fler hjärtan digereras samtidigt, dela upp dem i olika 5 ml rör.
    4. Inkubera malet hjärtan för 15 min vid 37 ° C.
      OBS: Lägg ner de 5 ml rör (ordentligt stängd) i inkubatorn för att sprida vävnaden längs lösningen.
      1. Vid slutet av inkubationen, homogenisera vävnaden i samma enzymatiska lösningen genom att pipettera upp och ner ungefär 20 gånger med P1000 pipett. Sätta 5 ml rör i vertikalt läge och låta den återstående vävnadsfragment sediment (ca 3 min).
      2. Samla supernatanten (innehållande de digere celler i suspension) i ett 50 ml rör, tillsätt 2 ml HBSS 10% FCS (samma volym som volymen av enzymatisk lösning sattes till vävnadsfragmenten), och hålla dem på is under fortsatt rötningsprocessen.
        OBS: HBSS 10% FCS-lösning och isen är viktiga för att inaktivera enzymverkan medan den återstående vävnaden ärsmälta.
      3. Lägg 2 ml förvärmda enzymatisk lösning på 5 ml rör med de återstående vävnadsfragmenten och fortsätta spjälkningen genom att upprepa steg 3.3.4 tills ingen mer vävnad observeras.
        OBS: Cirka fyra cykler av matsmältningen är tillräckligt för att fullständigt dissociera hjärtvävnaden (5 E17.5 hjärtan i 2 ml av enzymatisk lösning).
    5. Centrifugera 50-ml rör med celler i suspension under 10 minuter vid 300 xg och kassera supernatanten.
    6. Resuspendera cellpelleten, tillsätt 1 ml HBSS - / - 1% FCS, och filtrera cellsuspensionen även om en 70 | im nylonnät. Räkna cellerna med en Neubauer kammare med användning av en Trypan blå vital färgning.
      OBS: Resuspendera cellerna med HBSS - / - (utan Ca2 + och Mg2 + katjoner) för att minimera cell-aggregering. Mellan 800 tusen och 1.000.000 celler erhålls från en E17.5 hjärta.
  4. Färgning hjärtceller med fluorescerande antikroppar
    OBS: All Antibodtalet är tidigare titreras för att erhålla optimal definition av de cellpopulationer (titreringen kan variera med antikroppen sats) .De använda antikropparna i hjärtat panelen är listade i tabell 1.
    1. Distribuera hjärtcellerna i suspension genom en 96-brunnsplatta (rundbottnad). Fördela dem jämnt i hela alla nödvändiga brunnar (200 jil per brunn), kort-spin centrifugera 96-brunnsplatta för en min vid 480 xg och kassera supernatanten.
      NOTERA: Alla brunnar i 96-brunnsplatta (rundbottnad), kan användas.
    2. Resuspendera pelleten och inkubera hjärtcellerna för 20 min i mörker vid 4 ° C med 100 mikroliter av den cocktail av antikroppar (dvs CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647, och Sca-1-PE-Cyanine5 ) utspädd i HBSS - / - 1% FCS.
    3. Tvätta de hjärtceller från överskottet av antikroppar genom tillsats av 200 mikroliter av HBSS - / - 1% FCS och kortspinncentrifugering av cellerna under en min vid 480 x g.
    4. Kasta bort supernatanten och upprepaden kortspinncentrifugering (steg 3.4.3).
    5. Resuspendera cellerna i 200 mikroliter av HBSS - / - 1% FCS och överföra dem till en 5 ml rör som redan innehåller 200 mikroliter av HBSS - / - 1% FCS.
    6. Före förvärvet, tillsätt 400 mikroliter av HBSS - / - 1% FCS med 0,5 | ig / ml PI och filtrera cellsuspensionen även om en 70 | im nylonnät.

4. Förvärv av Märkta mjälten, Tarm, och hjärtceller med Spectral flödescytometer

  1. Före förvärvet av data automatiskt kalibrera spektrala cytometern enligt tillverkarens anvisningar. Utför dagligen och de månatliga förfaranden för kvalitetskontroll varje dag i experiment.
  2. När cytometern är klar, startar förhandsgranskningen av proverna innehåller cellsuspensioner märkta med alla antikroppar.
    OBS: inte förvärva.
  3. Se till att alla lasrar är på efter behov. Justera FSC förstärkningen så att alla celler är synliga i respektivetomter. Grind cellpopulationen och tillämpa denna grind till de två spektrala kurvor som motsvarar den 488-nm och med 638/405 nm lasrar.
    OBS: När fluorokromer exciteras av den 638-nm laser (dvs när 638-nm laser är på), det finns en mask som skyddar ljus från 617-662 nm för att förhindra att 638 nm laser från skiner in i PMT. Detta inducerar förlusten av en del av spektrumet och orsakar en lägre separation av nära färgämnen emitterar i dessa våglängder därför. Emellertid kan hela signalen samlas genom att stänga av 638-nm laser om det inte krävs för förvärv.
  4. Justera 32-kanals fotomultiplikator (PMT) spänning (%) så att alla fluorokromer är inom intervallet av intensiteten som visas i y-axeln (1-10 6) i de två olika spektrala kurvor som visar 488 nm och 405/638 nm exciteringar.
    OBS: Utbildning krävs för att känna igen spektra av alla fluorokromer används.
  5. Börja med att skaffa proverna. Klicka på "; Förhands" för att visualisera celler på skärmen och klickar sedan på 'Hämta' för att spela in provet och spara upp till 2 x 10 6 händelser från varje prov..
  6. Efter att ha förvärvat de färgade prover, förvärva provet färgas med det vitala färgämnet och sedan kompensations pärlor individuellt färgade med alla antikroppar som används. Klicka på ”Preview” för att visualisera cellerna på skärmen och sedan på ”Acquire” för att spela in proverna.
    OBS: Håll samma PMT spänning för alla prover och kontroller (dvs pärlor och ofärgade prover); 5000 händelser är i stort sett tillräcklig.
  7. Slutligen, förvärva data från ofärgade cellsuspensioner. Klicka på "Preview" för att visualisera cellerna på skärmen och sedan på "Acquire" för att spela in proverna.
    OBS: Att få de ofärgade prover vid slutet av experimentet minimerar överföring av fluorescerande celler.
  8. Rengör cytometern enligt tillverkarens anvisningar end stänga experimentet i förvärvet mappen.
    OBS: Endast efter stängning försöket kommer den att sparas och tillgängliga för analys.

5. Analys av de data med Spectral FCM Software

  1. I "Color Palette" fönstret i "Analysis" fliken, registrera alla parametrar som finns i panelen genom att lägga till varje fluorokrom som används och motsvarande markör (välj från tillgängliga listan eller lägga till en ny parameter). Också, inkluderar auto-fluorescens och livsduglighetsparametrar; alla valda parametrar visas i "unmixing" fönstret.
  2. Välja den första singel färgade prov (gjort med kompensations pärlor) i "Control" fönstret under "Tube List" med detta experiment på ”Analysis” fliken. I kalkylbladet, klicka på "polygon designverktyg" och utforma en grind på pärlan befolkningen i FSC / SSC plot. Dubbelklicka på toppen av porten för att öppna en spektral eller punktdiagramatt visualisera de gated pärlorna i en dotter tomt.
    1. Utforma en grind för den positiva och en grind för de negativa pärlorna antingen på spektrum eller på punktdiagram. Kontrollera hela spektra motsvarar de två laseruppsättningar för varje positiv och negativ fraktion och eliminera extremvärden genom att successivt gating och klicka på grinden för att kontrollera dottern befolkningen. Ange de negativa och positiva portar i "Unmixing" fönstret.
    2. Upprepa steg 5,2 för varje enkel färgade provet.
      OBS: Var medveten om att de positiva och negativa gating strategi motsvarar provet som analyseras, även om programmet gör det möjligt att den kan placeras i något prov. I stället för att bestämma en negativ fraktion för varje enkel färgade provet, använda en ofärgade vulst prov för att ställa in en universell negativ.
  3. Välj ofärgade cellprovet i "Tube List" och design grindar för autofluorescerande och för icke-autofluorescerande celler.
  4. <li> När alla de negativa och positiva grindar för alla parametrar, inklusive automatisk fluorescens och livskraft, väljs i "Unmixing" fönstret, klicka på "Beräkna". Applicera unmixing till de prover som ska analyseras.
  5. Analysera data genom att utforma grindar och skapa två-parameter tomter.
    1. Först utforma en grind för SSC kontra FSC och sedan ta bort döda celler genom att utesluta alla celler märkta med lönsamheten markör (PI kontra CD45). På resten av cellerna, design grindar för alla populationer av intresse efter den strategi som beskrivs för varje cellsuspension (Figur 1-3).
      OBS: Om det behövs justerar ersättning i "referensspektrum justerings." Detta är ett verktyg som kan användas efter unmixing att åter justera medianen av de positiva befolknings för varje fluorokrom om algoritmen inte kunde göra det perfekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

21-parameter spektral FCM panelen för att analysera splenocyter

Figur 1 visar de resultat som erhölls med 19-fluorescerande-antikroppspanel appliceras på mjältceller innefattande olika antikroppar som känner igen underuppsättningar av T, B, NK, dendritisk och myeloidceller, medan CD45 etiketter alla hematopoetiska kämförsedda celler. Panelen innefattar också en viabilitet färgämne (PI), såväl som storleken (FSC) och kornighets (SSC) parametrar. Figur 1A visar referens fluorokrom spektra. Efter eliminering av döda celler i CD45 + grind (Figur 1B), visar analysen att CD3 + T-celler uttrycker TCRp-kedjan och har den förväntade CD4 / CD8 distribution och andelen CD25 + celler i CD4 T-celler. CD8 T-celler uppvisar en normal fördelning av CD44- och Ly49D-uttryckande celler. CD19 + B-celler samuttrycker B220 end MHCII, såväl som IgM och IgD, typisk för mogna mjält-B-celler. En undergrupp av NK1.1 + NK-celler utgör en liten delmängd av de mjältlymfocyter som samuttrycker Ly49D. De återstående cellerna innefattar en liten underuppsättning av CD11c + dendritiska celler med höga nivåer av MHC II, av vilka några var också CD11b +. F4 / 80 + -celler karaktäristiska av vävnads bosatt makrofager samuttrycker CD11b och de högsta nivåerna av CD44 hittats i mjälten. De återstående cellerna (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) kunde uppdelas genom expressionen av CD11b och Gr1, där den lilla undergrupp av dubbelpositiva celler uttrycker också höga halter av CD44, sannolikt motsvarande progenitorer kända för att vara närvarande i låga frekvenser i mjälten. En stor fraktion var negativa för de tre markörer. Figur 2 visar samma analys innan justering av kompensationen.


Figur 1: En 19-färg Antikropp Panel för analys av murina mjältceller. (A) Mus splenocyter färgades med den föregående kombinationen antikropp, till vilken CD45-evolve 655 tillsattes. Referensspektra för alla fluorokromer visas. Fluorofor-märkt CD45 markeras med en röd pil. Fluorokromerna är listade i tabell 1. (B) de konturdiagram visar urskiljande kapaciteten hos denna multi-parametrisk analys för att separera de olika populationer av B, T, NK, dendritiska eller myeloida celler. Analysen gjordes i konventionell FCM programmet efter unmixing avfaltning.

figur 2
Figur 2: En 19-färg Antikropp Panel för analys av murina mjältceller. Samma analys som i figur 1 gjordes innan justertment av kompensationen med referensspektra justeraren.

Tunntarmen intraepitelial lymfocyter

Flera T-cellspopulationer finns i tarmen inom det epiteliala cellskiktet 5, 6. Konventionell isolering av dessa undergrupper innefattar en densitetsgradient som separerar lymfocyter från epitelceller. Dock är denna beredning delikat, tidskrävande och resulterar i cellförlust. Att förbättra kvantifiering och för att underlätta det experimentella förfarandet, var potentialen av spektral FCM att diskriminera populationer av tarm lymfocyter inom en stor fraktion av epitelceller testas. Efter mekanisk sönderdelning av epitelvävnad, har cellsuspensioner färgades med antikroppar som märker delmängder av αβ och yö T-celler som vanligtvis finns i tarmepitelet. Deceller analyserades i två konventionella cytometrar och i spektral FCM.

Figur 3 visar resultaten efter efter ett liknande grindningsstrategi, med eliminering av döda celler grind på PI-negativa celler. Närvaron av auto-fluorescerande celler är uppenbar i alla konventionella cytometrar och i spektral cytometri när auto-fluorescens manager inaktiveras (toppaneler, röda pilar), vilket resulterar i en dålig särskiljning av de levande cellerna. I alla tomter, är celler inom FSC-A / SSC-A lymfocytinramningen visas i blått och celler med större scatter (epitelceller gate) visas i rött. Både konventionella instrument var oförmögna att lösa CD3 + T-cell-subset (i blått) (turkos pil) från de återstående cellerna. Därför TCRp - celler (grön pil) kontaminerad CD3 + TcRγδ - populationen, en biologiskt osannolik delmängd aldrig detekteras efter separatipå av lymfocyterna från epitelceller. Däremot i spektral FCM efter autofluorescenshantering, analysen av de olika T-cellunderuppsättningar inte försämras av närvaron av epitelceller, populationerna var väl-separerades, och det fanns inga TcR-negativa celler i CD3 + Port.

figur 3
Figur 3: Den Närvaro av Auto-fluorescerande celler inte försämrar Detektion av Intra-epiteliala Lymfocyter i Spectral FCM. Små tarmceller, inklusive epitelceller och lymfocyter, färgades med antikroppar som känner igen TcRδ, PI, TCRp Cy7-APC CD3 (paneler B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (paneler C), och CD8 FITC (paneler D). PI sattes i FACS buffert före analys. Förvärvet av data gjordes i tur och ordning i de tre instrumenten efter lämplig kvalitetskontroll. Dubletter var Eliminated i FSC-H / FSC-W. Analysen gjordes i konventionell FCM programvara. Tomter visar de olika stegen i gating strategi. Celler inom FSC-A / SSC-A lymfocytinramningen är märkta i blått, medan celler i intestinala epitelceller grind är märkta i rött. Pilarna pekar på olika befolknings snedvridningar och auto-fluorescens. Tomter i C visar en analys av data som erhållits i spektral FCM utan autofluorescens hantering i unmixing, medan D visar samma data efter unmixing med autofluorescens hantering.

embryonala hjärta

Konventionell FCM visade en huvudpopulationen av auto-fluorescerande celler (svart pil) som var uteslutna från analysen eftersom det fluorescerade i CD45 och TER119 dump kanal (PE), märkning hematopoietiska celler. Däremot denna auto-fluorescerande populationen var inte närvarande som sådan i spektral FCM och bestod i CD45 - delmängd (Figur 4). För att visa att dessa celler var hjärt- och inte endotel eller hematopoetisk uttrycker låga nivåer av CD45, TER119 eller CD31 uttrycket av transkript som är specifika för kardiomyocyter kvantifierades på sorterade celler. Höga nivåer av hjärtmuskel troponin T (TNNT2) 7 och atriella lätta kedjan-2 (MYL7) 8-transkript återfanns i auto-fluorescerande populationen.

figur 4
Figur 4: Auto-fluorescerande celler i E17.5 Hjärtcell Suspensioner Korrekt Ingår i Negativ cellfraktionen i Spectral FCM. (A) Cellsuspensioner från fetala hjärtan färgades med anti-TER119 och CD45-PE, Sca-1-PECy5, och CD31-APC-antikroppar och sekventiellt förvärvats i de tre instrumenten. Svarta pilar visar auto-fluorescerande celler i två conventional cytometrar, medan dessa celler inte detekteras som auto-fluorescerande i spektral cytometri och kan således analyseras för specifik fluorescerande färgning. (B) Bil-fluorescerande celler (inom den elliptiska grinden i grönt), men inte CD31 + celler (rektangulär grind i blått, negativ kontroll), visade expression av kardiellt troponin (TNNT2) 7 och atriella lätta kedjan-2 (MYL7) 8-transkript. au - godtyckliga enheter i förhållande till GAPDH huset bevarande avskrift. Data presenteras som medelvärde ± SEM.

<tr>
excitation laser fluorokrom specificitet Klona
488 nm BB515 CD8 53-6,7
488 nm FITC Ly49D 4E5
488 nm PE F4 / 80 6F12
488 nm PE-CF594 NK1,1 PK136
488 nm PE-Cy5 CD44 IM7
488 nm PE-Cy7 CD11b M1 / 70
488 nm PerCP-Cy5.5 IgM R6-60.2
488 nm PerCP Gr-1 RB6-8CS
488 nm AF532 CD3 17a2
488 nm propidiumjodid Livskraft
405 nm V450 IgD 11-26c.2a
405 nm BV421 CD11c HL3
405 nm BV510 CD19 1D3
405 nm BV570 TCRb H57-597
405 nm BV605 CD4 RM4-5
405 nm BV650 CD45R / B220 RA3-6B2
405 nm BV711 IA / IE M5 / 114
405 nm BV786 CD25 PC61
405 nm evolve 655 CD45 30-F11
N / A renat CD16 / CD32 2.4G2 Fc-receptorblocket
Lista över antikroppar som används i koftaac cellsuspension
638 nm Alexa Fluor 647 CD31 MEC13.3
488 nm PE CD45 30-F11
488 nm PE-Cy5 Sca-1 D7
488 nm PE Ter119 TER-119

Tabell 1: Förteckning över antikroppar som används i 19-färgpanelen och Cardiac cellsuspensionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Konventionell FCM är baserat på detekteringen av fotoner som emitteras efter excitering av fluorescerande prober. Fluorescensemissionen av en fluorokrom detekteras i en detektor utformad för att mäta signalen från en annan fluorokrom inducerar fysikalisk överlappning. Denna spillover bland emissionsspektra måste korrigeras med ersättningar.

Spektral FCM och databehandling av unmixing avfaltning algoritmen möjliggör för kombinationen av fluorokromer med nära emissionstoppar utan ytterligare kompensation, förutsatt att de har olika spektrala former. Den algoritm som används för analysen behandlar auto fluorescens som en oberoende parameter, subtrahera icke-specifik fluorescens från fasta vävnads cellsuspensioner.

En panel av 19 fluorokromer sattes samman för att analysera immunceller med användning av endast två lasrar (488 nm och 405 nm). Indeed, när 638 nm laser var på, en sektion av den 32-kanals PMT motsvarandetill excitationsvåglängden av denna laser var inte tillgänglig. För att få maximal kapacitet PMT upptäckt, var röd laser avstängd. Mus mjältceller analyserades, vilket möjliggör detektering av mer än 12 olika cellpopulationer, av vilka några utgjordes 1% eller mindre av de hematopoetiska cellerna.

Att testa kapaciteten av spektral FCM att hantera auto-fluorescens, användes två olika situationer som kan försämra analysen testas: en där lymfocyter var kontaminerade med epitelceller, och en där auto-fluorescerande hjärtceller analyserades. Till skillnad från konventionella FCM tillåter spektral metri för diskriminering av alla lymfocyter delmängder, även när de representerar mindre delmängder.

Kontroverser runt den regenerativa kapaciteten hos vuxna cardiomyocytes 9, 10, 11 är delvis på grund av frånvaron av en strategi att discriminate och isolera distinkta undergrupper av viabla celler i hjärtat. En multi-parametrisk analys definierar unika kombinationer av markörer för att särskilja de olika hjärtunderuppsättningar kan möjliggöra detektion av sällsynta underuppsättningar på grund av ett stort antal celler som kan analyseras. Fetala hjärtan (E17.5) analyserades, och en stor fraktion av auto-fluorescerande celler, som skulle ha undgått upptäckt vid konventionell FCM, integrerades i den icke-hematopoetiska viabel hjärtcellavdelning i spektral FCM.

Ett återkommande problem med denna metod är kravet på god kvalitet fluorescerande märkta antikroppar. Detta är särskilt kritisk vid användning av tandem färgämnen, där en komponent i tandem är dominant. Till exempel, kan BV786 och Cy7-PE vara svåra att skilja från BV421 och PE, respektive.

FCM baserat på spektrometri ger analytisk effekt högre än den som erhålls med konventionell FCM, utan behov av ersättning matrices. Detta manuskript visar att det finns en alternativ metod som uppvisar en hög analytisk förmåga, avsaknad av komplexa kompensations matriser, den felfri diskriminering av cellgrupper på grund av auto-fluorescens och inga ytterligare finansiella åtaganden som fortfarande krävs för masspektrometri FCM. Spektral FCM förefaller således vara ett förfarande för val för analys av celler erhållna från en bred variation av fasta vävnader vanligtvis inte mottagliga för konventionella FCM och som kan användas i tumör, utvecklings, och stamcellsbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi erkänner de tekniska och teoretiska bidrag i spektral cytometry av K. Futamura, som också kritiskt reviderat manuskriptet. Vi är också i skuld till C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira och P. Pereira för kritiskt läsa manuskriptet och oändliga teknisk rådgivning och stöd. Vi tackar också P. Pereira för gåvan av anti Vγ7-APC och Vδ4-biotinmärkta antikroppar. Vi aknowledge Centre d'Enseignements från Pasteurinstitutet för välkomnande och stöd filmningen logistik. Detta arbete stöddes av Pasteurinstitutet, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Swiss National Science Foundation och Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); och Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) projekt Twothyme, ANR, och program REVIVE (investering för framtiden) (AC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Janvier Labs CD45.2 Source of cells
Ethanol 70% VWR 83801.36 Sterilization
DPBS (Ca2+, Mg2+) GIBCO ThermoFisher 14040-174 Embryos collection
Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) GIBCO Life ThermoFisher 14025092 Dissociation, digestion and staining solutions
Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) GIBCO Life ThermoFisher 14175095 Dissociation, digestion and staining solutions
Fetal calf serum (FCS) EUROBIO CVFSVF00-0U Dissociation, digestion and staining solutions
Collagenase Sigma C2139 Enzymatic solution
90 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.
TPP T93100 Embryos and hearts collection
35 x 15 mm,
plastic tissue culture Petri dishes.
TPP T9340 Hearts collection
Fine iris scissor Fine Science Tools 14090-09 Dissection tools
Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) Fine Science Tools 11003-12 Dissection tools
Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) Fine Science Tools 11272-30 Dissection tools
Scalpel  VWR 21909-668 Dissection tools
LEICA MZ6 Dissection microscope LEICA MZ6 10445111 Sampling; Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source SCHOTT VWR KL1500 compact Sampling;
Two goose neck fibers adapted
FACS tubes VWR 60819-310 Digesting cells
96 well plate (round bottom) VWR 10861-564 Staining cells
Nylon mesh bolting cloth sterilized,
50/50 mm pieces.
SEFAR NITEX SEFAR NITEX Cell filtration
UltrasComp eBeads
Fluorescence labeled antibodies Biolegend Catalogue number see table below Staining cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87, (9), 830-842 (2015).
  2. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11, (8), e0159961 (2016).
  3. Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
  4. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, (8), 648-655 (2004).
  5. Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169, (7), 3736-3743 (2002).
  6. Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210, (9), 1839-1854 (2013).
  7. Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25, (2), 115-123 (2004).
  8. Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141, (3), 585-593 (2014).
  9. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, (6), 763-776 (2003).
  10. Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116, (7), 1216-1230 (2015).
  11. Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23, (19), 2263-2273 (2014).
Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (123), e55578, doi:10.3791/55578 (2017).More

Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (123), e55578, doi:10.3791/55578 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter