Summary
Bu makalede, sitometrisi spektral, fluorochromes ayırt emisyon spektrumları şekilleri kullanan akış sitometrisi yeni bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bir algoritma, tazminat değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi edebilir. Bu yeni yaklaşım, katı organ izole edilmiş hücre uygun analizi sağlar.
Abstract
Akış sitometrisi tanımlar ve lenfoid ve diğer hematopoietik hücrelerin fenotipinin analiz etmek için, son 40 yıldır kullanılmaktadır. Başlangıçta birkaç fluorochromes analizi ile sınırlı, şu anda farklı floresan boyalar düzinelerce vardır ve en fazla 14-18 farklı boyalar bir anda birleştirilebilir. Ancak, çeşitli sınırlamalar hala analitik yeteneklerini bozar. Çünkü floresan probları çokluğu, veri analizi nedeniyle büyük, çok parametre dengeleme matrislerinin ihtiyaç giderek daha karmaşık hale gelmiştir. Katı organlar elde edilen otomatik flüoresan hücre süspansiyonları (akış sitometrisi ile) analizi gereklidir, böylece Ayrıca, tespit etmek ve farklı dokularda spesifik hücre tipleri iz floresan proteinleri taşıyan mutant fare modelleri, mevcut hale gelmiştir. Sürekli dalga boylarında çok geniş bir aralık boyunca emisyon spektrumları şekil ayıran, akış sitometrisi Spektral, bu problemlerin bir kısmını ortadan kaldırır. Veri ağırlık incelendiğindedengeleme matrisleri yer değiştirir ve bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan tedavi eden bir algoritma i. Bu nedenle, spektral akış sitometri benzer emisyon tepe noktalarıyla fluorochromes ayırt etme yeteneğine sahip olmalıdır ve dengeleme şartları olmadan multi-parametrik analiz ortaya koyar.
Bu protokol küçük nüfus tespiti yüksek çözünürlük sağlayan bir 21-parametresi (19 floresan probları) karakterizasyonu ve bir oto-floresan sinyalinin yönetimi sağlayan, sitometri analizi spektral akışını açıklar. Burada sunulan sonuçlar, spektral akış sitometri gibi kalp ve bağırsak gibi sitometri geleneksel akış karakterize edilmesi zor dokular, hücre popülasyonlarının analizi avantaj sunar göstermektedir. sitometrisi böylece akış tazminat gereksinimi olmadan sitometrisi geleneksel akışını ve performansı yüksek ve sağlayan otomatik floresan yönetiminin çok parametrik analitik kapasitesini gösteriyor Spektral.
Introduction
Son birkaç on yılda, akış sitometrisi (FCM) hücre fenotiplendirme çalışmaları için gerekli bir yaygın kullanılan analitik yöntem haline geldi. Özellikle mor lazer (405 nm) (örneğin, parlak mor ve yeni Q-nokta boyalar) ile uyarıldığında, florokromlar mevcut floresan boyalar olarak önemli bir artış, olmuştur. Ancak, mevcut floresan boyalar büyüme örtüşen emisyon riskini artırır ve emek yoğun tazminat matrisleri gerektirir. FCM katı bir doku hücre süspansiyonları analiz etmek için yaygın olarak kullanılan oldu ama otomatik floresan hücrelerinin varlığı, spesifik olarak etiketlenmiş popülasyonlarının ayrımı sınırlar.
Spektral FCM temel ilkeleri Futamura ve ark detaylı olarak bildirilmektedir. 1, 2. Kısaca, burada kullanılan spektral FCM (malzemelerin tabloya bakınız) 405, 488 ve 638 nm lazer ile donatılmıştır. spektral FCM tüm yayılan f yakalar800 nm, 500 nm ve geleneksel bant-geçişli filtreler yerine 420 nm sırasıyla nm ila 469 nm ila 440 ve 450 için 2 bağımsız PMT'lerin için 32 kanallı bir doğrusal dizi PMT (32CH PMT) içerisinde spektrumları olarak luorescence. 405 nm ve 638 nm lazer noktaları eş-doğrusal ise 488 ve 405/638 nm lazer noktaları uzamsal ayrılır. her bir parçacık için, 405 nm ile uyarılmış floresan veri 66 kanal ve 488 nm lazer kadar spektral FCM ölçer. Hücreler 638 nm lazeri tarafından uyarılır ne zaman bir maske PMT bir parlamasını 638 nm lazer önlemek için yerleştirildiği için, spektral FCM floresan veri 58 kanal ölçer. Spektral FCM floresan spektrumu örtüşen ayrılmasını sağlayan ağırlıklı en küçük kareler metodu (WLSM), temel bir algoritma ile elde edilen tam bir spektrum analiz eder. -Tek boyanmış ve boyanmamış numunelerden türetilen Spectra temel referans spektrumları olarak kabul edilmektedir. Çok lekeli örnekler matematiksel monte edildiği birkarışmamış ve karma floresan etiketler ile bir numunenin spektrumu nd kurucu spektrumları bir koleksiyonu halinde ayrıştırılır. Karışmama, spektral teknoloji 3, 4, belirli bir boya ölçüm dışındaki tüm detektör sinyali çıkarır tazminat yerini alır.
Bu çalışmada, bir araya getirilmiş ve fare dalağı içinde bulunan başlıca hematopoietik alt kümelerini, özelliği, tek bir 21-parametre analizi 19 fluorochromes test edilmiştir. Buna ek olarak, spektral sitometrisi ve böylece bağırsak intraepitelyal lenfositlerin ve embriyonik kalp karakterizasyonu iyileştirilmesi, otomatik floresan sinyali yönetebilir göstermiştir. Gerçekten de, bu dokularda, otomatik floresans yönetimi geleneksel FCM analiz dışlanacaklarını hücrelerine spesifik flöresan belirlenmesini mümkün kılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Pasteur Enstitüsü Etik Şartı ve AB kurallarına göre yapıldı ve Fransız Tarım Bakanlığı tarafından onaylanmıştır.
Yetişkin Fare organları 1. Hücre Süspansiyon Hazırlanması
- Splenositlerin izolasyonu
- servikal dislokasyon ile yetişkin fareler öldürülür. Karın orta hatta bir kesi olun ve makasla cilt açın. forseps ile dalak Hasat.
- 2 cam mikroskop ile dalak hücreleri ayırmak ve% 1 fetal buzağı serumu içeren Hank Dengeli Tuzlu Çözelti 5 mL (HBSS) (FCS) içinde seyreltilmesi slaytlar ezmek.
- 120 x g'de 10 dakika ve 4 ° C'de santrifüje. Süpernatant atılır.
- % 1 FCS, 5 mL pelletini. bir Trypan mavisi canlı bir boya kullanılarak bir Neubauer odası ile hücre sayımı.
NOT: 80 milyon hücre bir yetişkin dalak alınmalıdır.
- Isolatihücre üzerinde ince bağırsaktan
- servikal dislokasyon ile yetişkin fareler öldürülür. Makas kullanarak, karın orta hat deride bir kesi yapmak. bir elinde forseps ile ince bağırsak tutun ve her iki uçta kesmek için makas kullanın: sadece kalın bağırsakta girmeden hemen önce mide sonra ve daha sonra ince bağırsak sonunda ilk. bir iğne ile bir 2 ml şırınga kullanarak 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile ince bağırsak yıkayın.
- Bir kağıt havlu üzerine ince bağırsağı koyun ve dikkatlice keskin bir makas ile Peyer yamalarını kaldırın.
- bağırsak içindeki makas birer dal ekleyerek uzun tarafında bağırsağı açmak için makas kullanın. keskin bir makas kullanılarak 1-cm'lik parçalar halinde açılan bağırsak kesin.
- % 10 FCS ile HBSS, 30 mL sabit karıştırma altında 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- 50 mL'lik kalan ayrışmamış fragmanları ile hücre süspansiyonu yerleştirinPlastik boru ve yüksek hızda 5 dakika boyunca vorteks. NOT: doku başka ayrışma yoktur.
- Büyük, ayrışmamış fragmanları pelet haline getirmek üzere izin vermek için, buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin.
- Süpernatant toplayın ve 120 x g, 7 dakika boyunca santrifüj ile de konsantre edilir.
- Süpernatant atılır ve% 1 FCS içeren HBSS 10 mL pelletini. bir Trypan mavisi canlı bir boya kullanılarak bir Neubauer odası ile hücre sayımı.
Not: ~ 60 milyon intraepitelyal hücreleri (IELS) bir yetişkin ince bağırsak elde edilmelidir.
- Panel tasarım stratejisi
- şirketinden florokromlar ile birleştirilmiş antikorlar ile panelleri hazırlayın.
Not: Tüm antikorlar, daha önce hücre popülasyonlarının uygun tanımını elde etmek için titre edilir (titrasyon antikor parti ile değişebilir). Splenositlerin leke 19 renkli panelinde kullanılan antikorlar, Tablo 1 'de listelenmiştir. - Çok kolo Constructsitometrisi r panelleri. Bu zorlu görev olabilir gibi, paneller optimize etmek için aşağıdaki yönergeleri kullanın:
- Spektral konfigürasyon ve alet kullanılabilir floresan boyalar edin.
- Üretici tarafından sağlanan Parlaklık İndeksi / Boyama Endeksi bilgileri kullanın.
Not: Parlaklık Endeksi / Lekelenme Endeksi her florokrom için arka karşı floresan yoğunluğunun göreli göstergesidir. - Aşağıdaki kurallara aşağıdaki antikorlar seçin:
- zayıf ifade edilen proteinleri parlak fluorochromes ve daha yüksek düzeyde eksprese proteinler için en belirsiz fluorochromes seçin.
Not: Örneğin, CD45, CD4, CD8 ve yüksek düzeyde eksprese edilir ve loş florokromlar ile birlikte kullanılabilir. - önce en az sayıda floresan boya imkânına sahip antikorlar seçerek paneli tasarlama başlayın.
- Mümkünse, emisyon spektrumu f en küçük üst üste floresan boyalar seçmekya da belirteçler, aynı hücre tipinde tanımlanır.
NOT: ışığa maruz kalma ile bozulmaya daha açık olduğu gibi Tandems (örneğin, PE-Cy5, PE-Cy7 ve PerCP Cy5.5 @), dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır.
- zayıf ifade edilen proteinleri parlak fluorochromes ve daha yüksek düzeyde eksprese proteinler için en belirsiz fluorochromes seçin.
- şirketinden florokromlar ile birleştirilmiş antikorlar ile panelleri hazırlayın.
- Sitometri analizi için hücre boyama
- Negatif kontrol olarak kullanılmak üzere boyanmadan tutmak, 1 x 10 6 splenosit ve 1 x 10 6 bağırsak hücreleri ile bir 5 ml tüp ile bir 5 ml tüp hazırlanır.
- Hazırlama ve Tablo 1 'e uygun numune başına ve panel için bir 5 ml tüp etiketleyin. % 1 FCS içinde, Tablo 1 'e göre, antikor karışımı hazırlayın.
- Aktarım 1 x 10 6 hücre - ya splenositler veya bağırsak hücreleri - her biri 5 mL tüpe. 4 ° C'de 5 dakika ve 120 x g 2 mL HBSS,% 1 FCS ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atılır ve antikor karışımı 50 uL pelet tekrar süspansiyon.
- s Etiket2 adımda plenocytes. İlk olarak, 5 mL'lik bir tüp içerisinde PE-siyanin 5, PerCP siyanin 5.5 ve PerCP ile etiketlenmiş antikorlar ihtiva eden karışım, 50 uL (Fc reseptörü bloke) kullanın. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika inkübasyondan sonra, 5 ml tüp diğer antikorlar ihtiva eden karışım, 50 uL ekleyin.
NOT: Bu strateji sterik engel sınırlar. - 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.
- 4 ° C'de 5 dakika ve 120 x g 2 mL HBSS,% 1 FCS ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atılır ve 0.5 ug / ml propidium iodide (PI) ile HBSS,% 1 FCS 200 uL pelletini.
(Örneğin, UltraComp eBeads) Ticari telafisi Boncuk Mikrokürelerin her bir florokrom için tek boyama 2. Hazırlık, Bundan sonra boncuklar olarak anılacaktır
- Hazırlama ve paneller kullanılan antikorların sayısı kadar 5 ml tüpler etiketleyin. Her bir tüp içinde boncuk 1 damla yerleştirin ve 1 & # eklemek181; tüp başına antikorun L.
Not: Burada kullanılan boncuklar (malzemelerin tabloya bakınız) (pozitif) ve boyanmamış (negatif) boncuk lekeli içerir. Antikorlar Her boya için, böylece berrak bir spektral imza parlak sinyal sağlamak için boncuklar üzerinde fazla konulmasını. Bu kesin bir unmixing yapabilmek için yazılım tarafından gereklidir. - 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.
- x g 120 ° C'de 5 dakika süre ile% 1 FCS ve santrifüj 2 mL ekleyin. Süpernatant atılır ve% 1 FCS, 100 uL pelet tekrar süspansiyon.
Embriyonik Fare Kalpler 3. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
- Embriyoların Diseksiyonlarında
- (17 ve 19 saat arasında), günün sonunda (her zaman erkek kafesinde), bir erkek ile 2 kadın çiftleşme önceden zamanlı gebe dişiler için planı. Ertesi sabah, vajinal fişleri ile dişiler sonrası coitum 0.5 gün olarak kabul edilir.
- E17.5 hamile femal Euthanizeservikal dislokasyon ile es. Hayvan sıkıca fare pençe (ayak tutam refleks) üzerine basarak tepkisiz olduğundan emin olun. sterilize etmek ve fare kürk yayılmasını önlemek için% 70 etanol ile karın ıslatın.
- Karın kullanarak makas ortasında deride bir kesi yapın ve parmaklarınızı ayırarak deriyi çekin.
- Karnın iki taraf brüt forseps ve makas kullanılarak doğru merkezden karın kaslarında kesiler çekerek ve yaparak karın boşluğu açın.
NOT: Hemen periton kas altına ince bağırsak, zarar vermemeye özen gösterin. - uterus gövdesi seviyesinde ve yumurtalıkların hem kesilerek (embriyolar ile) rahim boynuzları toplayın. DPBS 50 mL bir 90 x 15 mm2 bir Petri tabağına bekletin.
- rahim kas duvar ardından her desiduada ve iyi bir pens ve makasla viseral yolk kesesi arasında kesilerek her bir embriyo izole edin. Embriyolar int çekindavranmak. Son olarak, göbek kordonu kesti.
- diseksiyon başlamadan önce makas (başları kesilerek) ile E17.5 embriyo kafaları kesilir.
- Kalplerin Koleksiyon
- Bir ıslak kağıt havlu çanak tabanında yatak ve% 1 FCS içeren HBSS, 50 mL içeren bir 90 x 15 mm2 bir Petri kabındaki başları embriyolar bekletin.
- ventral yüzü yukarı bakacak şekilde bir stereo mikroskop altında, brüt forseps ile her bir embriyo tutun.
- Kalbe zarar görmesini önlemek amacıyla, makas ile göğüs sağ yanının kesilmesiyle göğüs ızgara açın.
- Brüt forseps ile göğüs kafesinin tutarak kalp Açığa.
- (Içi ve dışı akış kalbin büyük damarları ihtiva eden) büyük damarlar tutarak (hala akciğer ve timus ile birleştirilmiş) bir kalp birbirinden çekip HBSS 2 mL bir 35 x 15 mm2 bir Petri tabağına yerleştirin FCS ile% 1.
- Çevredeki organlardan kalpleri izole edin veince forseps ve bir neşter ile bağ dokusu.
- % 1 FCS, 2 mL ile, yeni bir 35 x 15 mm Petri kabındaki kalpleri yıkayın ve kalp odası içinde kan pompa izin 20 dakika süreyle buz üzerinde muhafaza edin.
- Kalp hücre süspansiyonları hazırlanması
- 37 ° C'ye kadar HBSS + / + (bundan sonra enzimatik solüsyon olarak da adlandırılır) içinde 200 ug / ml kollajenaz önceden ısıtın.
Not: HBSS kolajenaz seyreltin + / + enzim etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için (Ca2 + ve Mg2 + katyonları ile birlikte); kolajenaz aktivitesi gruplar arasında stabildir. - Önceden ısıtılmış enzimatik solüsyon 1 mL kalpleri (% 1 FCS) ıslatma, yıkama çözeltisi değiştirin.
- Bir stereomikroskop altında, 1-mm içine ince forseps ile bir neşter kullanılarak 3 adet kalpleri kıyma. önceden ısıtılmış enzimatik solüsyonun bir başka 1 mL ekleyin ve kapaklı bir 5 ml tüp kıyılmış doku aktarın.
NOT: Optimal sindirim için, bir koyunenzimatik solüsyon 2 mL başına 5 E17.5 kalplerin en. daha kalpleri aynı zamanda sindirilmiş ise, farklı 5 ml tüpler içine bölündü. - 37 ° C'de 15 dakika süre ile kıyılmış kalpler inkübe edin.
Not: çözelti boyunca doku yaymak için bir inkübatörde 5 ml tüpler (uygun şekilde kapalı) bırak.- İnkübasyonun sonunda, P1000 pipet ile aşağı, yaklaşık 20 kat ve yukarı pipetlenerek aynı enzimatik solüsyon içerisinde dokuyu homojenleştirin. kalan doku parçası tortu (yaklaşık 3 dk) dikey konumda 5 ml tüp koyun ve bildirin.
- 50 ml bir tüp içinde (süspansiyon içinde sindirilmiş hücresi içeren) için supernatant toplamak yazı 2 devam ederken% 10 FCS (enzimatik solüsyon hacmi aynı ses doku parçaları ilave edilir), ve buz üzerinde tutmak HBSS mL sindirim süreci.
Not: HBSS% 10 FCS çözeltisi ve buz kalan doku ise enzim işlemi etkin önemlidirsindirerek. - Kalan doku parçaları ile 5 mL tüplere 2 mL önceden ısıtılmış enzimatik solüsyon ekleyin ve daha fazla doku görülmedikçe adım 3.3.4 tekrarlayarak sindirime devam edin.
NOT: Yaklaşık 4 sindirim çevrimi, kalp dokusunu tamamen ayırmak için yeterlidir (enzimatik çözeltinin 2 mL'si içinde 5 E17.5 kalp).
- Süspansiyon hücreleri ile 50-mL tüpleri 300 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini süspansiyon haline getirin, 1 mL HBSS - / -% 1 FCS ilave edin ve hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir naylon örgü vasıtasıyla filtreleyin. Tripan mavisi hayati bir leke kullanarak bir Neubauer odası ile hücreleri sayın.
NOT: Hücrelerin toplanmasını en aza indirmek için hücreleri HBSS - / - (Ca 2+ ve Mg 2+ katyonları olmadan) ile tekrar süspanse edin. Bir E17.5 kalpten 800.000 ila 1.000.000 hücre elde edilir.
- 37 ° C'ye kadar HBSS + / + (bundan sonra enzimatik solüsyon olarak da adlandırılır) içinde 200 ug / ml kollajenaz önceden ısıtın.
- Florasan antikorlar ile kardiyak hücrelerin boyanması
NOT: Bütün antibodler önce hücre popülasyonlarında (titrasyon antikor parti ile değişebilir), kalp panelinde kullanılan .bir antikorlar, Tablo 1 'de listelenen optimal tanımını elde etmek için titre edilir.- 96 oyuklu bir plaka (yuvarlak tabanlı) üzerinden süspansiyon kardiyak hücreler dağıtın. Gerekli tüm oyuklara (oyuk başına 200 uL) boyunca eşit bir şekilde dağıtmak, kısa eğirme santrifüj 480 x g'de 1 dakika için 96 gözlü levha, ve süpernatant atılır.
NOT: 96 oyuklu plaka (yuvarlak tabanlı) bütün havuzlarına kullanılabilir. - Pelet yeniden süspanse edin ve antikor kokteyli, 100 uL (yani, CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647 ve Sca-1-PE-Cyanine5 ile 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca kardiyak hücreler inkübe ) HBSS içinde seyreltilmiş - / -% 1 FCS.
- HBSS 200 uL eklenmesiyle antikorların fazla kardiyak hücreler yıkayın - / -% 1 FCS ve 480 x g, 1 dakika için hücreler santrifüj kısa eğirme.
- Süpernatant ve tekrar atılırKısa sıkma santrifüjleme (adım 3.4.3).
- - / - HBSS 200 uL hücrelerin tekrar% 1 FCS ve önceden HBSS 200 uL ihtiva eden bir 5 ml tüp aktarmak - / -% 1 FCS.
- 0.5 ug / mL, P 'ile,% 1 FCS ve 70 um naylon örgü da hücre süspansiyonu filtre - / - satın alma önce, HBSS 400 uL ekleyin.
- 96 oyuklu bir plaka (yuvarlak tabanlı) üzerinden süspansiyon kardiyak hücreler dağıtın. Gerekli tüm oyuklara (oyuk başına 200 uL) boyunca eşit bir şekilde dağıtmak, kısa eğirme santrifüj 480 x g'de 1 dakika için 96 gözlü levha, ve süpernatant atılır.
Spektral Akış Sitometresinde ile Etiketli Dalak, Bağırsak ve Kardiyak Hücre 4. Toplama
- Verilerin edinimi önce, otomatik olarak üreticinin talimatlarını takip sitometrede spektral kalibre. Deneyin her gün günlük ve aylık kalite kontrol prosedürleri uygulayın.
- sitometresinin hazır olduğunda, bütün antikorları ile etiketlenmiş hücre süspansiyonları içeren örneklerin önizleme başlatın.
NOT: kazanmak vermeyin. - Tüm lazerler gerektiği gibi üzerinde olduğundan emin olun. Tüm hücreler, ilgili görünür olacak şekilde FSC kazanç ayarlamaaraziler. Kapı hücre popülasyonu ve 488-nm ve 638/405-nm lazerler karşılık gelen iki spektral araziler için bu kapıyı uygulayın.
NOT: fluorokromun 638-nm lazeri tarafından uyarılır zaman (638-nm lazer açıkken yani), kalkanlar PMT bir parlamasını 638 nm lazer önlemek için 617-662 nm den ışık maske var. Bu spektrum, bir kısmının kaybına yol açar ve bu nedenle, bu dalga boyunda yayan yakın boyaların daha düşük bir ayrılmasına yol açar. Ancak, tüm sinyal o edinimi için gerekli değilse 638-nm lazer kapatarak toplanabilir. - Tüm fluorokromun 488 nm ve 405/638 gösteren iki farklı spektral parsellerde, y-ekseni (1-10 6) görüntülenen yoğunluk aralığında olduğu (PMT) gerilim (%), örneğin 32 kanal çoğaltıcı ayarlama mil uyarılmalar.
NOT: Eğitim kullanılan tüm fluorochromes spektrumları tanımak için gereklidir. - örnekleri elde etmek başlayın. Tıklamak "; Önizleme" ekranında hücreleri görselleştirmek ve ardından tıklayın 'örnek kaydetmek için' Edinme her örnekten 2 x 10 6 olaylara kadar tasarruf edin..
- lekeli örnekleri aldıktan sonra, daha sonra vital boya ve bireysel olarak kullanılan tüm antikorlar ile boyanmış dengeleme boncuklar ile boyanmış örnek kazanır. Ekranda hücreleri görselleştirmek için “Önizleme” yi ve ardından “Edinme” konulu numune kaydetmek için.
NOT: Tüm numunelerin ve kontrollerin (yani boncuklar ve boyanmamış numunelerin) için aynı PMT gerilimi tutun; 5000 olayları büyük ölçüde yeterlidir. - Son olarak, lekesiz hücre süspansiyonları veri elde. Ekranda hücreleri görselleştirmek için "Önizleme" yi ve ardından "Edinme" konulu numune kaydetmek için.
NOT: Deney sonunda lekesiz örnekleri Kazanılması floresan hücrelerin taşınmasını en aza indirir. - Üreticinin talimatlar aşağıdaki Sitometreyi temizleyinedinim klasöründe deney kapatmak d.
NOT: Yalnızca deney kapattıktan sonra o kaydedilecek ve analiz için kullanılabilir.
Spektral FCM Yazılımı ile Verilerin 5. Analizi
- "Analiz" sekme "Renk Paleti" penceresinde, kullanılan her bir florokrom ve karşılık gelen markalama maddesini ilave ederek panelinde bulunan tüm parametreleri kayıt mevcuttur (listeden seçmek veya yeni bir parametre). Ayrıca, otomatik floresans ve canlılık parametreleri içerir; Seçilen tüm parametreler "Karışmama" penceresinde görüntülenir.
- “Analiz” sekmesine Bu deneyin "Tüp Listesi" altında "Denetim" penceresinde (kompanzasyon boncuk ile yapılır) İlk single lekeli örnek seçin. Çalışma sayfasında, "çokgen tasarım aracı" tıklayıp FSC / SSC arsa içinde boncuk nüfus üzerinde bir kapı tasarımı. Spektral veya nokta arsa açmak için kapının üstündeki çift tıklayınBir kızı planında kapılı boncuk görselleştirmek için.
- Pozitif için tek kapısı ve spektrum veya nokta arsa üzerinde ya olumsuz boncuklar için bir kapısı tasarlayın. Her pozitif ve negatif fraksiyon için iki lazer setine karşılık gelen bütün spektrum kontrol edin ve arka arkaya yolluk ve kızı nüfusu doğrulamak için kapısı tıklayarak uç değerleri ortadan kaldırır. "Karışmama" penceresinde negatif ve pozitif kapılarından girin.
- her bir boyalı numune için tekrarlayın Adım 5.2.
NOT: Herhangi bir numunede yerleştirilmesini için programı izin vermesine rağmen, pozitif ve negatif yolluk strateji analiz ediliyor numuneye karşılık geldiğini unutmayın. Bunun yerine her bir boyalı numune için negatif bir kısmını tayin eden ve evrensel negatif ayarlamak için bir boyanmamış boncuk örnek kullanmak.
- "Tüp Listesi" ve autofluorescent için tasarım kapıları ve dışı autofluorescent hücreler için lekesiz hücre örneği seçin. <Otomatik floresan ve canlılığı dahil tüm parametreler için tüm negatif ve pozitif girişler, "Karışmama" penceresinde seçildiğinde li> tıklayın "Hesapla". numunelerine unmixing uygula analiz edilecek.
- Kapıları tasarımı ve iki parametreli araziler oluşturarak verileri analiz edin.
- Birincisi, FSC karşı SSC için bir kapı tasarlayıp sonra yaşayabilirlik işaretleyici (CD45 karşı PI) ile etiketlenmiş tüm hücreleri hariç tutarak ölü hücreleri çıkarmak. Hücrelerin geri kalanı, her hücre süspansiyonu için tarif edilen bir strateji, aşağıdaki ilgi tüm nüfus için dizayn kapıları (1-3 Şekiller).
NOT: Gerekirse, tazminat ayarlamak "referans spektrum ayarlayıcı." Bu algoritma mükemmel şekilde yapamasaydım her florokrom için pozitif popülasyonlar ortancasını yeniden ayarlamak için unmixing sonra kullanılabilecek bir araçtır.
- Birincisi, FSC karşı SSC için bir kapı tasarlayıp sonra yaşayabilirlik işaretleyici (CD45 karşı PI) ile etiketlenmiş tüm hücreleri hariç tutarak ölü hücreleri çıkarmak. Hücrelerin geri kalanı, her hücre süspansiyonu için tarif edilen bir strateji, aşağıdaki ilgi tüm nüfus için dizayn kapıları (1-3 Şekiller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21 parametreli splenositlerin analiz etmek için spektral FCM paneli
CD45 bütün hematopoietik çekirdekli hücreleri etiketler ise Şekil 1, T, B, NK, dendritik ve miyeloid hücrelerin alt kümelerini tanıyan farklı antikorları içeren dalak hücrelerinde uygulanan 19-floresan antikor paneli ile elde edilen sonuçları göstermektedir. Panel, aynı zamanda bir canlılığı boya (PI), hem de boyut (FSC) ve ayrıntı (SSC) parametreleri içerir. Şekil 1A, bir referans florokrom spektrumlarını göstermektedir. CD45 + kapısı (Şekil 1B) yer alan ölü hücrelerin ortadan kaldırılmasından sonra, analiz CD3 + T hücreleri TCRp zincir ifade eden ve CD4 T hücrelerinin CD25 + hücrelerinin beklenen CD4 / CD8 dağılımı ve oran sahip olduğunu göstermektedir. CD8 T hücreleri, CD44- ve Ly49D eksprese eden hücrelerin normal bir dağılım göstermektedir. CD19 + B hücreleri, ko-ifade B220 birOlgun ve splenik B hücrelerinin tipik d MHC II, aynı zamanda, IgM ve IgD. NK1.1 + NK hücrelerinin bir alt kümesi, Ly49D-ekspres birlikte dalak lemfositlerinin küçük bir kısmını temsil eder. Geri kalan hücreler CD11 +, aynı zamanda, bazıları bir MHC II, yüksek seviyeleri ile CD11c + dendritik hücrelerin küçük bir kısmını ihtiva eder. Karakteristik dokuya bulunan makrofajlar ko-ifade CD11b ve dalakta bulunan CD44 en üst düzeyde F4 / 80 + hücreleri. Geri kalan hücreler (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) çift pozitif hücrelerin küçük bir alt grubu da muhtemelen progenitörlerin tekabül eden, CD44 yüksek seviyelerde ifade CD11b ve GR-1 ekspresyonu ile bölünmüş olabilir dalakta düşük frekanslarda mevcut olduğu da bilinir. Büyük bir bölümü üç işaret için negatifti. Şekil 2, tazminat ayarlamadan önce, aynı analizini göstermektedir.
Şekil 1: Kemirgen Dalak Hücrelerinin Analiz için bir 19 renkli Antikor panel. (A), fare splenositleri, bir önceki antikor kombinasyonu ile lekelenmiş olan CD45-hücreler gelişebilir 655 ilave edildi. Tüm florokromların referans spektrumları gösterilmiştir. Florofor etiketli CD45 kırmızı okla işaretlenir. Fluorokromun kontur planlarıdır, T NK, dendritik veya miyeloid hücrelerin B farklı popülasyonlar ayırmak için bu çok parametre analizi ayırt edici kapasitesini gösteren Tablo 1. (B) 'de listelenmiştir. Analiz dekonvulasyon unmixing sonra geleneksel FCM yazılımında yapıldı.
Şekil 2: Murin Dalak Hücrelerinin Analiz için bir 19 renkli Antikor panel. Şekil 1 'deki ile aynı analiz alacak şekilde ayarlayın önce yapıldıReferans spektrumları ayarlayıcı tazminat işlenmesiyle.
İnce bağırsak içi epitel lenfositler
Çeşitli T-hücre popülasyonları epitel hücre katmanı 5, 6 içinde bağırsakta bulunurlar. Bu alt-konvansiyonel yalıtım epitel hücreleri lenfositlerin ayıran bir yoğunluk gradyanına yer vermektedir. Ancak bu hazırlık hassastır, zaman alıcı ve hücre kaybına yol açar. kantifikasyon artırmak ve deney prosedürü kolaylaştırmak için, epitel hücrelerinin büyük bir kısmı içinde bağırsak lenfosit popülasyonunu ayırmak için spektral FCM potansiyel test edilmiştir. Epitel doku mekanik olarak parçalanmasından sonra, hücre süspansiyonları, genellikle bağırsak epitelyumunda bulunan T hücrelerinin ap alt kümelerini etiket ve yö antikorları ile boyanmıştır.Hücreler iki geleneksel sitometre ve spektral FCM analiz edilmiştir.
Şekil 3, PI-negatif hücreler üzerinde geçiş sağlandıktan ölü hücrelerin ortadan kaldırılması ile, benzer bir yolluk stratejisi aşağıdaki sonra sonuçlar gösterilmektedir. otomatik floresans yöneticisi canlı hücrelerin zayıf bir ayrım ile sonuçlanır (üst panel, kırmızı oklar) inaktive edildiğinde otomatik flüoresan hücrelerin bulunması tüm konvansiyonel sitometre ve spektral sitometrisinde açıktır. Tüm çizimlere olarak, FSC A / SSC-Lenfositler geçitinde hücrelerin kırmızı ile gösterilmiştir büyük scatter (epitel hücre kapısı) mavi ve hücreler gösterilmiştir. Hem geleneksel araçlar kalan hücreler (mavi olarak) CD3 + T hücresi alt kümesi (turkuaz ok) çözemediği edildi. Bu nedenle, TCRP - hücreleri (yeşil ok) CD3 + TcRγδ kirlenmiş - nüfus, separati sonra tespit asla bir biyolojik olarak imkansız alt kümesiepitelyal hücrelerden lenfositlerin ile. Bunun aksine, spektral FCM oto-floresan yönetimi sonra, farklı T-Hücre alt kümelerinin analizi epitel hücrelerinin mevcudiyeti ile engelli değildi, popülasyonlar iyi ayrıldı ve CD3 + hiçbir TcR-negatif hücreler vardı kapı.
Şekil 3: Otomatik flüoresan hücrelerin varlığında Spektral FCM Intra-epitel Lenfositlerin Algılama bozmamaktadır. epitel hücreleri ve lenfositler olmak üzere küçük bağırsak hücreleri, TcRδ, PI, TCRp Cy7-APC CD3 (panel B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (panel C) ve CD8 FITC (panel D) tanıyan antikorlar ile boyandı. PI analizden önce FACS tamponu ilave edildi. veri toplama, uygun kalite kontrol sonra, üç unsur ardışık olarak yapıldı. Ikilileri Elimina edildiFSC H / ted FSC W. Analiz bilinen FCM yazılımında yapıldı. Arsalar yolluk stratejisinin farklı adımlarını göstermektedir. intestinal epitel hücre geçitinde hücrelerin kırmızı işaretlenirken göstermektedir FSC A / SSC-Lenfositler geçitinde hücrelerin, mavi etiketlenmiştir. Oklar farklı popülasyon çarpıtma ve otomatik floresan işaret ediyor. D otofloresan yönetimi ile unmixing sonra aynı verileri gösterirken, C Arsa, unmixing otofloresan yönetimi olmadan spektral FCM elde edilen verilerin analizini gösterir.
embriyonik kalp
Geleneksel FCM hematopoietik hücrelerin işaretleme, bu CD45 ve TER119 döküm kanalı (PE) 'de floresanlı için analize dahil edilmiştir otomatik floresan hücrelerinin (siyah ok) büyük bir popülasyonunu gösterdi. Bunun aksine, bu otomatik floresan nüfus spektral FCM içinde olduğu haliyle mevcut değildi ve CD45 indirgendiğini
Şekil 4: E17.5 Kalp hücre süspansiyonlarında Otomatik floresan hücreler düzgün Spektral FCM Negatif hücre fraksiyonu içinde dahil edilir. (A), fetal kalplerinden hücre süspansiyonları, anti-Ter119 ve CD45-PE, Sca-1-PECy5 ve CD31-APC üç aletleri alınan antikorların ve sırayla ile boyanmıştır. Siyah oklar, iki konve oto-floresan hücreleri göstermektedirntional sitometre, bu hücreler spektral sitometrisi oto-floresan olarak tespit edilmez ve bu nedenle belirli bir floresan boyama için analiz edilebilir ise. (B) (yeşil eliptik geçitinde) Kendiliğinden flüoresan hücrelerin değil, CD31 + hücreleri (mavi, negatif kontrol olarak dikdörtgen kapı), kardiyak troponin ekspresyonunu (TNNT2) 7 ve atriyal hafif zincir-2 (MYL7) gösterdi 8 transkript. au - GAPDH house-keeping transkript keyfi birimler göreceli. Veriler ortalama ± olarak ortalama değer sundu.
| Uyarılma lazer | florokrom | Özgünlük | Klon | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6,7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11 | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | propidiyum iyodür | yaşayabilirlik | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PCR61 | |
| 405 nm | 655 gelişmeye | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | saflaştırılmış | CD16 / CD32 | 2.4G2 | Fc reseptörü blok |
| Antikorlar Listesi Cardi kullanılanAC Hücre süspansiyonu | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
Tablo 1: 19-renk Masası'nda ve Kardiyak Hücre Süspansiyon Kullanılan Antikorlar listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geleneksel FCM floresan probları uyarma sonra yayılan foton tespitine dayanmaktadır. Başka bir florokrom sinyalin yoğunluğunu ölçmek için tasarlanmış bir detektörde tespit edilir, bir fluorokrom floresans emisyon fiziksel örtüşme indükler. emisyon spektrumları arasında bu yayılma tazminatlar tarafından düzeltilmesi gerekiyor.
Karışmama ters evrişim algoritması tarafından spektral FCM ve veri işleme farklı spektral şekle sahip olması koşuluyla, ek ödeme olmaksızın yakın emisyon tepe ile florokromların kombinasyon sağlar. Analiz için kullanılan algoritma, katı doku hücre süspansiyonları spesifik olmayan floresans çıkarılarak, bağımsız bir parametre olarak otomatik floresan davranır.
19 florokromların bir panel sadece iki lazer (488 nm ve 405 nm) kullanılarak bağışıklık hücreleri analiz etmek için toplandı. 638 nm lazer oldu Gerçekten de, 32-kanallı PMT bir bölümü karşılık gelenBu lazerin dalgaboyu mevcut değildi. PMT maksimum algılama kapasitesini elde etmek için, kırmızı lazer kapalı idi. Fare dalak hücreleri, hematopoietik hücrelerin% 1 ya da daha az ihtiva bazıları fazla 12 farklı hücre popülasyonlarının, saptanması için izin analiz edilmiştir.
otomatik floresan yönetmek için spektral FCM kapasitesini test etmek için, analiz bozabilir iki farklı durum test edilmiştir: lenfositler epitel hücreleri ile kontamine bir ve otomatik floresan kalp hücreleri analiz edildi on. Geleneksel FCM ile tersine, spektral sitometri onlar minör alt kümelerini temsil bile tüm lenfosit alt kümelerinin ayrımcılık sağlar.
Yetişkin kardiyomiyositlerinde 9, 10, rejeneratif kapasitesinin yaklaşık tartışma, 11 nedeniyle dis bir strateji yokluğuna kısmındadıritham ve kalp canlı hücrelerin farklı alt kümelerini izole eder. farklı kalp alt kümelerini ayırmak için belirteçler benzersiz kombinasyonu tanımlayan bir çok parametre analizi için analiz edilebilir hücrelerin çok sayıda ender alt-saptanmasını mümkün kılabilir. Fetal kalpler (E17.5) kullanılarak analiz edilmiştir, ve konvansiyonel FCM içinde tespit edilemeyen olur otomatik flüoresan hücrelerin büyük bir kısmı, spektral FCM olmayan hematopoietik canlı kardiyak hücre bölmesine entegre edilmiştir.
Bu yöntemin bir tekrarlayan bir sorun iyi kalitede florasan etiketli antikorlar için bir gerekliliktir. tandem bir bileşeni baskın olduğu, tandem boyalar kullanıldığında bu durum özellikle önemlidir. Örneğin, BV786 ve Cy7-PE sırasıyla BV421 ve PE ayırt etmek zor olabilir.
spektrometresi göre FCM dengeleme m gerek olmadan geleneksel FCM ile elde edilenden daha analitik güç daha yüksek sağlaratrices. Bu el yazması yüksek analitik kapasiteye karmaşık dengeleme matrisleri yokluğunu nedeniyle otomatik floresan için hücre alt zarar görmemiş ayrımcılık ve hala kütle spektrometresi FCM için gerekli ek mali taahhütlerini gösteren alternatif bir yaklaşım olduğunu kanıtlar sunmaktadır. Spektral FCM Bu şekilde genellikle geleneksel FCM için uygun ve tümör gelişim kullanılabilir olmayan bir katı dokuların çeşitli elde edilen hücrelerin analizi için tercih edilen bir yöntem, ve kök hücre biyolojisi görünmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Makaleyi eleştirel olarak revize eden K. Futamura'nın spektral sitometride teknik ve teorik katkılarını kabul ederiz. Ayrıca C. Ait-Mansour'a borçluyuz, P.-H. El yazmasını eleştiren okumak ve sonsuz teknik tavsiye ve destek için Commere, A. Bandeira ve P. Pereira. Ayrıca, anti Vγ7-APC ve Vδ4-Biyotin etiketli antikorların armağanı için P. Pereira'ya teşekkür ediyoruz. Pasteur Enstitüsü'ndeki Merkezi Enstitüleri, film lojistiğini karşılamak ve desteklemek için biliyoruz. Bu çalışma, Pasteur Enstitüsü, Institut National de la Santé de la Recherche Médicale (INSERM) tarafından desteklenmiştir; İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); Ve Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) projesi Twothyme, ANR ve Program Yükseltme (Geleceğe Yatırım) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. "String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
