Summary
Kutane tumoren worden vaak weggegooid na Mohs micrografische chirurgie. Hier wordt een protocol beschreven dat klinisch ondersteunend personeel effectief kan verwerken en opslaan van huidkanker ( bv. Plaveiselcelcarcinoom, basale celcarcinoom en melanoom) monsters voor stroomafwaartse laboratoriumtoepassingen zonder in te grijpen bij klinische operaties.
Abstract
De incidentie van huidkanker (bijvoorbeeld plaveiselcarcinoom, basaalcelcarcinoom en melanoom) is de afgelopen jaren toegenomen. Er wordt verwacht dat er sprake is van een parallelle vraag naar cutane tumormonsters voor biomedische onderzoeksstudies. De beschikbaarheid van weefsel is echter beperkt door de kosten van het opstellen van een biorepository en het ontbreken van protocollen die beschikbaar zijn voor het verkrijgen van klinische monsters die de klinische operaties niet interfereren. Er werd een protocol opgezet om kutane tumor en bijbehorende bloed- en speekselmonsters te verzamelen en te verwerken die minimale invloed hebben op routine klinische procedures op de datum van een Mohs-operatie. Tumormonsters worden verzameld en verwerkt van patiënten die hun eerste laag van Mohs-operatie ondergaan voor biopsie-bewezen kutane maligniteiten door de Mohs-histotechnoloog. Aangrenzend normaal weefsel wordt verzameld op het moment van chirurgische sluiting. Extra monsters die kunnen worden verzameld, zijn volledige bloed- en buccale swabs. Door gebruik te maken van weefselmonsters die normaal gesproken worden weggegooid, werd een biorepository gegenereerd die verschillende belangrijke voordelen biedt door in de kliniek versus de laboratoriumomgeving te zijn. Deze omvatten een breed scala van verzamelde monsters; Toegang tot ontdekte patiëntrecords, inclusief pathologieverslagen; En, voor de typische donor, toegang tot aanvullende monsters tijdens follow-upbezoeken.
Introduction
Kanker- en biomarker onderzoek is gebaseerd op een aanbod van kwaliteit menselijk weefselmonsters, en de beperkte voorraad heeft onderzoek 1 , 2 gehinderd. Veel dermatologische studies zijn beperkt door de ontoereikende toevoer, de variabele kwaliteit en de kosten die verband houden met het gebruik van menselijk weefsel. De kosten voor het opzetten van een grote, toegewijde biobank zijn geschat op ongeveer twee miljoen dollar 3 , en deze kosten maken het gebruik van menselijk weefsel buiten bereik van veel onderzoekers. Bovendien bestaat het proces van het genereren en opslaan van onderzoeksmonsters het risico om klinische operaties te beïnvloeden en de patiëntenzorg te vertragen, indien niet zorgvuldig uitgevoerd. Een kosteneffectieve klinische biorepositorie is opgericht die zich toelegt op huidkankermonsters na aanbeveelde best practices en sample validatie 4 , 5 , 6 .
Het doel van de micrografische chirurgische techniek van Mohs is ervoor te zorgen dat alle kankerweefsels worden verwijderd, terwijl zoveel mogelijk gezond weefsel wordt behouden. De procedure omvat de geleidelijke verwijdering van dunne lagen tumorweefsel. Elke opeenvolgende laag is zijnTologisch onderzocht (na cryosectie van het tumorweefsel en het uitvoeren van H & E-kleuring) door een dermatoloog om te bepalen of al het kankerweefsel is verwijderd. De excisie en het onderzoek van de volgende lagen weefsels wordt uitgevoerd terwijl de patiënt in het kantoor blijft. Deze techniek wordt beschouwd als de beste behandelingsoptie voor SCC 9 . Op dit punt is de wond afgesloten en, om de genezing en cosmetische verschijning te verbeteren, wordt aangrenzend normaal weefsel (ANT) vaak uitgesneden. Zo is deze chirurgische procedure om een tumor te verwijderen ideaal geschikt voor het verzamelen van histologisch gekarakteriseerd weefsel voor toekomstige studies.
De aanbestedingsprocedure voor het verkrijgen van tumorweefsel, aangrenzend normaal weefsel, speeksel en bloedmonsters is ontworpen om een minimale invloed op de normale staffuncties te hebben ( Figuur 1 ). Medische assistenten verrichten de bloeddruk tijdens het voorbereiden van de patiënt voor de procedure. Na afloop van de Mohs procedure, de M Ohs histotechnoloog bereidt aanvullende histologische dia's van het monster op en draagt het weefsel over naar het biorepository. Kosten verbonden aan het opstellen van de biorepository zijn de aankoop van cryopreservation freezers, het creëren van bescheiden klinische laboratoriumruimte en de ontwikkeling van een inventarisatie programma.
Figuur 1: Opeenvolging van steekproefverzameling en verantwoordelijke medewerkers. Bij de patiënt inchecken en het bereiken van de toestemming van de patiënt verzamelt de medische assistent een buccale swab en voert hij een bloedtekening uit. De dermatoloog en medische assistent accijnzen dan de tumor en sluiten de wond, gedurende welke tijd SCC en ANT-monsters worden verzameld. Een toegewijde laboratoriumtechnicus verwerkt het bloed en deelt de SCC- en ANT-monsters voor weefselkweek, behoud en toegang tot de biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verscheidenheid van verzamelde monsters zorgt voor een verscheidenheid aan experimentele benaderingen ( Figuur 2 ). Monsters die van de patiënt zijn verzameld zijn buccale swabs (speeksel kan ook worden verzameld indien nodig), heel bloed en uitgesneden weefsel. De buccale swabs en een monster van het gehele bloed worden opgeslagen, zonder verwerking, voor genotyping en weefsel matching. Geheel bloed wordt gescheiden in witte bloedcel (WBC) en plasmafracties voor toekomstige analyses. Na het verwerken van Mohs wordt de bevroren tumor direct in vloeibare stikstof geplaatst en overgebracht naar een -80 ° C vriezer. Vers, levensvatbaar tumorweefsel en ANT-monsters worden gekweekt onder toepassing van modificaties van eerdere technieken 10 , 11 en vervolgens cryopreserveerd. Tijdens het verzamelen wordt het nummer van elk steekproef opgenomen op een spreadsheet voorafgaand aan inschrijving Het inventarisatieprogramma om de nauwkeurige verwerking te vergemakkelijken ( tabel 1 ).
Figuur 2: Overzicht van klinische biorepository-inzameling en verwerking van klinieken. Een buccale zwabber en bloedmonster worden verzameld van de patiënt en opgeslagen voor downstream genotyping en weefsel matching. Geheel bloed wordt verder verwerkt voor witte bloedcellen (WBC) isolatie en CTC analyse, evenals voor plasma-insameling en vloeibare biopsie analyse. Weefsel uitgesneden tijdens de Mohs-procedure wordt histologisch verwerkt voor diagnostische doeleinden, waarna de histologische dia's experimenteel kunnen worden gebruikt voor verdere immunohistochemische analyses. Met dien verstande dat het uitgesneden weefselmonster groot genoeg is, wordt een gedeelte van versweefsel verwijderd en gesneden voor eiwit- en RNA-isolatie en voor de oprichting van gekweekte cellijnen.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| Inzamelingsdatum: | |||||
| Patiënt 1 | Patiënt 2 | Patiënt 3 | Patiënt 4 | Patiënt 5 | |
| Voorletters en Geboortedatum | |||||
| Oogkleur | |||||
| Sample Type | |||||
| Plaats van de steekproef | |||||
| Speeksel | |||||
| wGat bloed | |||||
| Plasma | |||||
| Tumor levensvatbaar | |||||
| Weefsel Normaal Leefbaar | |||||
| Tumor Mohs Liquid Stikstof | |||||
| Weefsel Normaal vloeibaar stikstof | |||||
| slides |
Tabel 1: Checklist om steekproeven te registreren. Gegevens die worden opgespoord en opgenomen met elk verzameld monster, omvatten patiënt initialen, geboortedatum en oogkleur (voor huidtypen), evenals de locatiOp het verwijderen van het monster. Het aantal speekselmonsters, bloedinzamelvolumes en het aantal levende en geconserveerde weefselmonsters verzameld worden ook opgenomen als referenties voor toewijzingen tot latere toepassingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Om de voorbeeldinzamelingsprocedures te valideren, is elk monstertype getest in downstream toepassingen. Door gebruik te maken van wijzigingen van eerdere technieken 12 , zijn tumor en ANT succesvol gebruikt in eiwit- en RNA-isolatie en kan deze mogelijk worden gebruikt voor DNA-isolatie. Bruikbare planten uit de weefselsecties zijn geëvalueerd door microscopie, terwijl opgeslagen histologische dia's zijn gebruikt voor immunohistochemie en immunofluorescentie.
Door het hier beschreven protocol te volgen is het mogelijk om dit model uit te breiden naar andere dermatologische klinieken, andere tumortypen (zoals melanoom), En andere chirurgische specialiteiten en praktijken om menselijke weefselmonsters te leveren voor veelzijdig onderzoek naar menselijke kanker. Lichte wijzigingen van dit protocol zijn waarschijnlijk nodig voor andere praktijken, maar in principe is dit protocol van toepassing op elke chirurgische praktijk die routinematig de patiëntenmonsters verzamelt die tijdens de patiëntbehandeling zijn verzameld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten op humane weefselmonsters werden goedgekeurd door Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). Het enige criterium voor het verzamelen van weefsels voor deze procedures is een biopsie-bewezen diagnose van SCC. Er werden geen uitsluitingskriteria beschreven in het oorspronkelijke IRB-protocol, maar monsters van patiënten met een bekende overdraagbare overdraagbare ziekte werden niet gebruikt. Geïnformeerde toestemming werd verkregen voor het verzamelen van kutane weefsel, bloed en speeksel. Midwestern Institutional Review Board heeft het validatiewerk goedgekeurd met klinische biorepository monsters bij Midwestern University (AZ # 807).
1. Kutane tumorweefselverwerking
OPMERKING: Dit wordt uitgevoerd door een Mohs histotechnoloog.
- Verwerking van Vers Vloeibaar Cellcarcinoom (SCC) Weefsel voor RNA en Explante Cultuur
- Nadat het weefsel door de Mohs-chirurg is uitgesneden, moet u 10 tot 50 mg (≥ 10 mm 3) oogsten OPMERKING: Dit is alleen mogelijk als de tumor groot genoeg is om een monster van 10-50 mg (≥10 mm 2 ) te laten verwijderen voordat de histologische beoordeling, die deel uitmaakt van de Mohs-procedure, moet worden verwijderd. Als de tumor niet groot genoeg is om een minimum van 2 mm 3 te laten verwijderen, ga dan niet verder met verwerking voor RNA (stap 5 overslaan).
- Breng het levensvatbare weefsel over aan een gelabelde 1,5 ml buis bevattende kweekmedium (1: 1 mengsel van DMEM: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) met behulp van pincetjes en zorg ervoor dat Weefsel is volledig ondergedompeld in het medium. Bewaar deze buis bij 4 ° C voor extra verwerking.
- Gebruik het weefsel voor RNA isolatie en expressie analyse (zie stap 5) en / of het establishmEnt van een explante cultuur (zie stap 6) binnen 24 uur.
- Plaats de rest van het tumormonster dat verwijderd is van de patiënt (stap 1.1.1) op een cryostatweefselhouder (of "chuck"). Bevestig het weefsel in een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding, bevroren het weefsel in de houder, om de voltooiing van Mohs histologie mogelijk te maken en voor de bereiding van extra histologische slides voor experimentele analyse.
- Voorbereiding van Histologische Slides
- Knippen weefselsecties 7 μm dik met behulp van een cryostat en creëer twee (of meer) glijbanen voor elk tumormonster. Zorg ervoor dat elke dia maximaal drie delen van de volledige tumor bevat.
OPMERKING: Eén van de twee glijbanen wordt gekleurd met behulp van H & E door de Mohs histotechnoloog, en de extra glijbaan (s) kunnen worden verwerkt met IF, IHC of FISH analyse. - Plaats de dia's in aceton gedurende 1-2 s om het weefsel op te lossen. Zet deze dia's opzij om te drogen. Niet H & EVlek of deksel verwijderen van de dia die gebruikt wordt voor toekomstige immunofluorescentie (IF), immunohistochemie (IHC) of fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) analyse, afhankelijk van het experimentele protocol.
- Knippen weefselsecties 7 μm dik met behulp van een cryostat en creëer twee (of meer) glijbanen voor elk tumormonster. Zorg ervoor dat elke dia maximaal drie delen van de volledige tumor bevat.
- Verwerking van Post-Mohs Weefsel
- Zodra de verwerking van Mohs is voltooid (stappen 1.1-1.2), werk in de cryostatkamer en steek het monster uit het cryo-embedding medium en plaats het weefsel in een gelabelde cryogene buis.
- Plaats de gelabelde flesje in vloeibare stikstof voordat het weefsel ontdooid is. Als monsters worden gebruikt voor eiwit- en / of DNA-analyse, kunnen ze binnen een paar minuten overgebracht worden naar vloeibare stikstof of een -80 ° C vriezer om te worden opgeslagen voor toekomstige eiwituitdrukking en DNA-mutatieanalyse (zie stap 4-5) .
OPMERKING: Als intact RNA gewenst is uit het post-Mohs monster, is het essentieel om het monster te bevroren tijdens het verwijderen van het cryo-embedding medium. Als extreme zorg niet uitgeoefend wordt opDeze stap moet het post-Mohs-monster gereserveerd worden voor eiwit- en / of DNA-analyse.
- Verwerking van verse ANT
- Op het moment van de sluiting van Mohs, ontvang ANT van de Mohs-chirurg.
- Verwijder een gelijke of grotere hoeveelheid ANT zoals geoogst uit het SCC-monster (zie hierboven) van de apicale kant van het normale weefsel en overbrengen naar een gemerkt 1,5 ml buis bevattend kweekmedium (1: 1 mengsel van DMEM: Ham's F- 12 aangevuld met 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) met behulp van tweezers.
- Dompel het weefsel volledig in hetzelfde kweekmedium en berg deze bij 4 ° C tot volgende verwerking (zie stap 4-6).
2. Bloed-, speeksel- en buccale zwabbeverwerking
- Verkrijg ongeveer 10 ml bloed in de EDTA-collectiebuizen via venipunctuur.
- Breng het bloed van de verzamelbuizen naar een steriele 15- of 50 ml centrifugebuis. Verwijder ongeveer 200 μL in een 1,5 ml cryogene buis, vermijd bellen; Bewaar dit gehele bloedmonster bij -80 ° C, indien nodig voor toekomstige genotyping en weefsel matching.
- Spin het overblijvende bloed bij 1.000 xg gedurende 30 minuten en volg standaard procedures om de plasmafractie te verzamelen.
- Aliquot het plasma in stappen van 1 ml in 1,5 ml cryogene buizen en bewaar bij -80 ° C voor gebruik tijdens toekomstige vloeibare biopsie analyses.
- Gebruik een steriele zwabber om een buccal swab monster te verkrijgen en sla de zwabber in een steriele buis bij kamertemperatuur op.
- Verkrijg indien nodig een speekselmonster en sla bij kamertemperatuur in een steriele buis op.
OPMERKING: Deze monsters kunnen indien nodig gebruikt worden voor toekomstige genotyping en weefsel matching.
3. Opnemen van monsters
- Overdracht informatie van de checklist van patiëntmonsters naar de biorepository database. Inclusief patiëntinformatie en diagNose uit de patiëntenkaart.
- Print labels met een streepjescode voor elk monster en record elk in de database om elk verzameld monster te koppelen met patiëntgegevens.
- Noteer de verdeling van de ontdekte monsters in de biorepository database voordat u de monsters naar het onderzoekslaboratorium overbrengt.
4. Proteïnenisolatie en Western Blot Analysis
- Plaats elk weefselmonster (SCC en / of ANT) in een injectieflacon met 500 μl cellysisbuffer die proteaseremmers bevat per 100 mg weefsel om het weefsel te lichten.
OPMERKING: We gebruikten een radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer, samengesteld uit 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholaat, 1,0% NP-40 en 0,1% SDS. Andere cellysis buffers kunnen worden gebruikt. - Homogeniseer de weefsels met behulp van een weefselhomogenisator gedurende 5 minuten in intervallen van 20 s bij 4 ° C. Spin de monsters bij 21.000 xg en 4 ° C gedurende 20 minuten en verzamel het supernatant bevattende eiwit in een frisse tuworden. Spoel het supernatant opnieuw met dezelfde omstandigheden en verzamel het laatste supernatant in een frisse buis.
- Elektroforese 30-50 μg eiwit uit elk monster met behulp van een 4-20% SDS-polyacrylamidegradientgel. Vlek de gel met Coomassie Blue om, indien gewenst, eiwitbanden te visualiseren.
- Als Western blot-analyse van uitgedrukte eiwitten nodig is, overdragen de eiwitten van de gel naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan volgens standaardprotocollen. Na overdracht vlek Ponceau het PVDF-membraan om, indien gewenst, eiwitbanden te visualiseren.
- Blokkeer het PVDF membraan en probe om eiwitten van belang te detecteren volgens standaardprotocollen. Gebruik primaire antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit (en) van belang, samen met bijbehorende secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichamen, bij concentraties die door de fabrikant worden aanbevolen voor Western blot-analyse.
- Laat het gemene membraan bloot met behulp van een chemiluminescerend substraat en beeld het membraan met behulp van een imagiNg-systeem.
5. RNA-isolatie en kwantitatieve polymerase ketenreactie (qPCR)
- Plaats verse weefselmonsters (SCC en / of ANT) onmiddellijk in een 1,5 ml buis die een RNA-stabiliseringsoplossing bevat en plaats na-Mohs weefselmonsters in een 1,5 ml buis die een bevroren weefselovergangsoplossing bevat, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Zorg ervoor dat het weefsel volledig ondergedompeld is. Bewaar deze monsters bij -80 ° C tot gebruik.
- Verwijder de RNA-monsters van -80 ° C en doei op ijs. Breng het weefsel over naar een nieuwe 1,5 ml buis die 1 ml RNA-extractiebuffer (fenol / guanidine thiocyanaat) per 50-100 mg weefsel bevat.
- Luister de weefsels met een weefselhomogenisator. Voer zes cycli van homogenisatie uit, gevolgd door een periode van monsterkoeling; Elke cyclus bestaat uit 20 s homogenisatie bij 4 ° C en een 40 s koelperiode. Na homogenisatie, incubeer het monster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 0,2 toeMl chloroform per 1 ml RNA-extractiebuffer en schud de buis krachtig met de hand gedurende 15 s. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur.
- Spin de monsters bij 12.000 xg en 4 ° C gedurende 15 minuten. Verwijder de waterfase van het monster en plaats het in een nieuwe 1,5 ml buis.
- Voeg 0,5 ml 100% isopropanol per 1 ml van de RNA-extractiebuffer die in stap 5.2 wordt gebruikt in de waterfase toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: als de RNA-opbrengsten naar verwachting laag zijn ( dwz het beginweefselvolume is minder dan 10 mg), kunnen monsters overnacht bij -80 ° C worden neergeslagen. Bovendien kan 5 μg RNase-vrij glycogeen per 500 μl RNA-extractiebuffer worden toegevoegd gedurende de isopropanol-precipitatiestap om RNA-opbrengsten te verbeteren. - Spin het monster gedurende 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en was de pellet met 1 ml 75% ethanol.
- Vortex het monster kort en draai het dan op 7.500 xg en 4 °C gedurende 5 minuten. Gooi de was weg en laat de pellet 5-10 minuten drogen.
- Resuspendeer de RNA-pellet in 20 μl RNase-vrij water.
- Indien gewenst, zuiver elk RNA-monster met een RNA-opruimingsset volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
OPMERKING: Kleine RNA's zullen van het monster verloren gaan als deze stap wordt uitgevoerd.
- Indien gewenst, zuiver elk RNA-monster met een RNA-opruimingsset volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Elektroforese een 1 μg monster met behulp van een 1,2% formaldehyde-MOPS agarosegel om de kwaliteit van RNA te analyseren.
OPMERKING: Analyseer monsters met behulp van een bioanalysator om een RIN nummer 13 te verkrijgen. - Reverse-transcribe het RNA naar cDNA met behulp van een omgekeerd transcriptie protocol voor qPCR analyse van target mRNAs (of miRNAs) van belang.
6. Weefseluitdagende culturen
- Steriliseer het uitgesneden weefsel voor de cultuur door het weefsel in 70% ethanol te dompelen.
- Plaats het weefsel op een dia of schotel en voeg voldoende kweekmedium toe (1: 1 mengsel van DMEM: Ham & #39; s F-12 aangevuld met 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) om het weefsel te bedekken (om te voorkomen dat het weefsel droogt). Snijd het weefsel zorgvuldig in fragmenten (<1 mm 3 ) met een scalpelblad.
- Breng de weefselfragmenten over op een 35 mm weefselkweekschotel en voeg ongeveer 20 μl foetaal runder serum (FBS) boven op elk fragment toe.
- Laat het gerecht 20-30 minuten open in een kweekkap of tot het bijna droog is.
- Voeg 1 ml kweekmedium (1: 1 mengsel van DMEM: Ham F-12 aangevuld met 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) toe aan elk gerecht en incubeer bij 37 ° C C in 5% CO 2 . Subcultuur of subcloneer de culturen indien nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumor en ANT zijn succesvol gebruikt bij het isoleren van eiwitten en getest door Western blotting. Zoals getoond in Figuur 3 kunnen cutane plaveiselcelcarcinoommarkers (Muc114, FHL-115 en p40 16 , 17 ) gedetecteerd worden in patiëntmonsters die zijn verzameld en opgeslagen in onze klinische biorepositor.
Figuur 3: Analyse van eiwitten geëxtraheerd uit ANT en SCC. Totaal eiwit werd geïsoleerd uit ANT- en SCC-monsters, en de expressie van bekende merkers voor SCC werden onderzocht door Western blot. Representatieve westerse blots van mucine 1 (MUC1), Factor H Like-1 (FHL-1) en p40 (paneel B) worden getoond. PleitenZie klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
RNA geïsoleerd met behulp van de bovenstaande technieken is getest door gelelektroforese, qPCR en RNA-integriteitanalyse. Figuur 4 toont twee patiëntmonsters waaruit hoogwaardig, intact RNA is geïsoleerd. Het RNA is geschikt voor alle downstream toepassingen.
Figuur 4: RNA-integriteitsanalyse met behulp van bioanalyse. Beoordeling van RNA-grootte en integriteit door gelelektroforese (paneel A). Een RNA-integriteit nummer (RIN) werd gegenereerd voor elk monster op basis van het elektroforetische spoor van het RNA-monster, inclusief de verhouding van ribosomaal RNA en de aanwezigheid of afwezigheid van afbraakproducten (paneel B). Een RIN van "10" staat voor een perfect RNA-monster, zonder enige afbraakproducten, terwijl "1" een volledig afgebroken sample. Densitometrieprofielen van de banden worden afgebeeld als fluorescentie-eenheden (FU) versus nucleotiden (nt) (paneel C) voor representatieve RNA-monsters van SCC- en ANT-patiëntweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bruikbare explanten uit de weefselsecties zijn geëvalueerd door middel van microscopie ( Figuur 5A ). Deze explantieve culturen, gegenereerd uit tumor- en ANT-monsters, zijn gemengde keratinocyt- en fibroblastculturen. Deze culturen kunnen subculturen of gebruikt worden voor toekomstige cellijn ontwikkeling. Gebergte histologische dia's zijn gebruikt voor immunohistochemie en immunofluorescentie. In Figuur 5B blijkt een SCC-monster positief kleuring voor een epitheel-tot-mesenchymale transitie marker in SCC 18 .
Figuur 5: Explantiekweek en IF-kleuring van SCC-secties. Fase contrastbeeld van een plaveiselcelcarcinoom weefsel explant (paneel A, schaalbalk = 50 μm) en weefselsecties verzameld als onderdeel van Mohs micrografische chirurgie, gekleurd met een anti-pSnail / Slug primair antilichaam (paneel B, schaalbalk = 25 μm ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
We hebben experimenteel vastgesteld dat we 24 tot 48 uur bij 4 ° C voor weefsel RNA isolatie (stap 5) of explantcultuur (stap 6) kunnen bewaren zonder resultaat te beïnvloeden. RNA-opbrengst of -integriteit, zoals beoordeeld door gelelektroforese of bioanalysator en RIN-nummer, worden niet gecompromitteerd. Daarnaast worden explante culturen gemakkelijk verkregen door gebruik te maken van weefsel opgeslagen bij 4 ° C voor dezeS tijdsduur. Dit zorgt voor meer flexibiliteit bij het overbrengen van monsters tussen de kliniek en het onderzoekslaboratorium. Aangezien RNA isolatie en explantcultuur in het onderzoekslaboratorium en niet in de kliniek wordt uitgevoerd, maakt deze functie de klinische biorepository een robuuster model dan we eerder verwacht hadden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naar de kennis van de auteur is dit protocol de eerste in zijn soort dat zich richt op de klinische aanbesteding van cutane weefselmonsters in zowel een kosteneffectieve als snelle aanpak. Patiënten die Mohs-microchirurgie ondergaan, worden meestal gepland tijdens specifieke tijdstippen, en de inzameling is beperkt tot deze perioden. Proefcollectie omvat inspanning van de medische assistent die betrokken is bij patiëntenzorg, de Mohs-histotechnoloog die de tumormonsters verwerkt en een aangewezen laboratoriumpersoneel die monsterinvoer en bloedverwerking behandelt.
Met zorgvuldige coördinatie tussen de drie leden van het verzamelteam ( dat wil zeggen de medische assistent, Mohs histotechnoloog en laboratoriumtechnicus) hebben we geconstateerd dat het bestaande medisch medewerkend personeel de aanvullende taken in verband met de verzameling van 3-5 weefselmonsters kan voltooien Per dag zonder enige schijnbare vertraging in klinische operaties. Verkrijgen van de toestemming van de patiënt En het verzamelen van buccale swabs en bloed worden voltooid tijdens normale wachttijden die betrokken zijn bij de Mohs-microchirurgieprocedure. Anders dan de beslissing over hoe een monster moet worden verwerkt, zijn de taken waarvoor de Mohs-histotechnoloog verantwoordelijk is, voltooid aan het eind van de Mohs-verwerking van patiëntmonsters en zal ongeveer 30 minuten aan het dagelijkse schema toevoegen. Typisch is één lid van de kliniekpersoneel verantwoordelijk voor het etiketteren en verwerken van de bloedmonsters en voor het uitvoeren van overdracht en invoer van monsters in de database. Afhankelijk van het aantal verwerkt monsters, kunnen deze taken aanzienlijke tijd vergen van bestaande rechten; Zo moet het verzamelen van monsters alleen worden uitgevoerd wanneer voldoende laboratoriumpersoneel beschikbaar is. Specifiek, als er meer dan 5 monsters in één dag worden verzameld of als er meerdere bloedmonsters van patiënten worden verzameld, is er een paar uur extra inspanning nodig van de laboratoriumtechnicus.
Jove_content "> Op de verzameldagen krijgen de medische assistenten (MA) toestemming van de patiënten voor donatie van weefsel. De MA krijgt daarna een buccal swab (en speeksel indien nodig) en verzamelt bloed voor verwerking door laboratoriumpersoneel. Patiënt betrokkenheid na de verzameling van deze monsters, dus vanuit het perspectief van de patiënt is de rest van het bezoek aan de kliniek ongewijzigd (hoewel zij gevraagd worden bloed te doneren tijdens elk vervolgbezoek). Momenteel kunnen we schatten dat 70% van de patiënten het instemmen 30% van die patiënten doneren ook bloed, 30% weigeren deel te nemen. Momenteel zijn alleen patiënten met een biopsie bewezen diagnose van kanker opgenomen in het biorepositum. Patiënten met een bekende door de overdraagbare overdraagbare ziekte die door bloed worden overgebracht, worden uitgesloten .De medewerker van het laboratorium is verantwoordelijk voor het coördineren met de andere twee leden van het verzamelteam en registreert de verzamelde monsters (tabel 1). Na eenN aanvankelijke steekproefverzameling, het ingevulde toestemmingsformulier, bloed en buccal swabs worden overgebracht naar het laboratoriumpersoneel, en de voorletters, geboortedatum en andere relevante informatie, zoals het steekproeftype, worden geregistreerd. Dit zorgt voor de opname van de getallen en soorten monsters die bij elke patiënt zijn verzameld tijdens de verzamelprocedure. De stroomdiagrammen die de verwerking van beide SCC-weefsel samenvatten ( Figuur 6 ) en ANT (Figuur 7) zijn nuttige hulpmiddelen voor het trainen van nieuw personeel bij inzamelingsprocedures.
Figuur 6: Flowchart afbakken van de verwerking van SCC monsters. Bij tumor excisie wordt de grootte van het monster beoordeeld. Als het monster ≤2 mm 3 is, wordt het gehele monster gebruikt voor Mohs-verwerking, zoals de beoordeling van de schone marges (de indicatieAtion van volledige tumorverwijdering) is de hoogste prioriteit. Na het verwerken van Mohs wordt elk overgebleven weefsel bevroren in vloeibare stikstof en overgebracht naar de biorepository. Als het monster groot genoeg is, zodanig dat een> 2 mm 3 gedeelte van het weefsel verwijderd kan worden, wordt dit gedeelte verzameld en geplaatst in een buis bevattende celkweekmedium, terwijl het resterende gedeelte wordt gebruikt voor Mohs-verwerking en opgeslagen zoals hierboven. Het deel van het monster dat is verwijderd naar celcultuurmedium wordt verder gesegmenteerd, waarbij een fragment van 0,5 mm3 verwijderd en gebruikt wordt voor het tot stand brengen van een celcultuurlijn; Het overgebleven weefselfragment wordt overgebracht naar het biorepositorie voor stroomafwaartse eiwit- en genxpressieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
er.within-page = "1"> 
Figuur 7: Flowchart afscheiding van de verwerking van ANT-monsters. Ten tijde van het sluiten van Mohs wordt een gedeelte van het naastliggende normaal weefsel (ANT) verwijderd en verzameld door de Mohs-chirurg. Als de steekproefgrootte ≤2 mm 3 is , wordt het gehele monster in een cryogene buis geplaatst en in vloeibare stikstof bevroren voordat deze naar de biorepository wordt overgebracht. Als het monster> 2 mm 3 is , wordt het gehele monster eerst in een buis bevattende celcultuurmedium geplaatst. Het monster wordt vervolgens verder gesneden in een ~ 0,5 mm 3 fragment, dat gebruikt moet worden voor de oprichting van celkweeklijnen. Het resterende weefselsectie wordt overgebracht naar het biorepository dat opgeslagen moet worden voor stroomafwaartse eiwit- en genexpressieanalyse.55583 / 55583fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Dit protocol is ontworpen om variatie tussen monsters in de biorepository te minimaliseren. Coördinatie en effectieve communicatie tussen de kliniekpersoneel en tussen de kliniek en alle laboratoriumpersoneel is essentieel om variabiliteit te minimaliseren en het bereiken van hoogwaardig DNA, RNA en eiwit uit de weefsels te maximaliseren. Terwijl het DNA en het eiwit in de weefsels robuust zijn, is RNA gewenst om de weefsels koud en in het juiste medium te houden tijdens het verzamelen, transporteren en verwerken om de RNA-integriteit te behouden. Een nauwkeurige recordhouding is ook van essentieel belang om de patiëntmonsters te koppelen aan hun geschiedenis en diagnose, omdat deze informatie vaak nodig is bij het analyseren van resultaten van downstream toepassingen.
Met de toenemende interesse in gepersonaliseerde geneeskunde en bioMarkering onderzoek, zijn onlangs een aantal biorepositories opgericht. Deze zijn meestal geassocieerd met ziekenhuisgebaseerde klinieken in grote academische centra en hebben aanzienlijke kosten betrokken bij de opstelling en operatie 2 , 8 , 19 . De ontwikkeling van een biorepositorie op basis van kliniek voor huidkankermonsters die als onderdeel van de dagelijkse praktijk wordt gegenereerd, heeft meerdere belangrijke voordelen ten opzichte van andere biorepositories. Ten eerste, met een enkele verzameling- en steekproefverwerkingsplaats, worden variaties in de verwerking van het monster, die de stroomafwaartse toepassingen in gevaar kunnen brengen, geminimaliseerd. Ten tweede, aangezien deze gedoneerde monsters worden getrokken uit een stabiele patiëntenpopulatie, zijn de toegang tot gedeïdentificeerde medische dossiers en patiëntenuitkomstgegevens ongeëvenaard. Deze gegevens kunnen worden geanonimiseerd en overgebracht van de patiëntenkaart naar de biorepository database bij het verzamelen van de monsters of bij een vervolgbezoek. Ten derde, met een loyale patiëntenbasis, de clIn-based biorepository kan meerdere monsters verzamelen van dezelfde patiënt, een voorbeeldset die niet vaak in andere instellingen wordt verkregen. Een van de beperkingen van dit protocol is dat het is geoptimaliseerd voor cutane monsters verkregen via Mohs micrografische chirurgie en kan nodig zijn voor andere soorten weefsels of klinische procedures.
Over het algemeen is een van de belangrijkste doelstellingen van de biorepository een breed spectrum van monsters van dezelfde donor te verschaffen om onderzoekers in staat te stellen een breed scala aan vragen te stellen, met name voor de ontwikkeling van vloeibare biopsies en kankermarkers. Specifiek, het vermogen om tumorhistologie en de expressie van biomarkers bij het mRNA en eiwitgehalten aan plasma-monsters te correleren, evenals de mogelijkheid om de uitkomstgegevens van de patiënt te verwijzen, creëert een uniek krachtig dataset. We hopen dat het biorepositorymodel op kliniek gebaseerd kan zijn op het verminderen van het tekort aan patiëntenmonsters in biomedisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, toegekend aan EEH, en het Midwestern University Office of Research en Gesponsorde Programma's Intramural Grant, toegekend aan KJL. Aanvullende ondersteuning is verleend door aangesloten laboratoria en geaffilieerde dermatologie. Wij bedanken Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody Jording, Stacie Schimke, Heather Kissel en Ali Zaidi voor hun technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA | ThermoFisher Scientific | 02-685-2B | |
| Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades | ThermoFisher Scientific | 50-949-411 | |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | ThermoFisher Scientific | 16-100-110 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-138 | |
| Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium | ThermoFisher Scientific | NC9791321 | |
| Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound | ThermoFisher Scientific | 50-363-579 | |
| Leica CM1950 Cryostat | Leica Biosystems | 14047743909 | |
| Frosted Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-343 | |
| Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 99-900-01 | |
| Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 03-337-7X | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| Boca Scientific BuccalT-Swab | ThermoFisher Scientific | NC9679349 | |
| Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer | ThermoFisher Scientific | 50-195-822 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | PI78443 | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 05-401-203 | |
| Pellet Morter Cordless Homogenizer | ThermoFisher Scientific | 12-141-3 | |
| RNAse Free Pellet Pestle | ThermoFisher Scientific | 121-141-364 | |
| Forma SteriCycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 13-998-089 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | SH30071.02 | |
| Gibco Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12-634-028 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140148 | |
| Gibco 1 M Hepes | ThermoFisher Scientific | 15-630-130 | |
| Nunc Cell Culture 35 mm with Vent | ThermoFisher Scientific | 1256591 | |
| Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24 | Abnova | MAB12583 | |
| Anti-p40 (p63 delta) antibody | Abnova | ABX-144A | |
| Anti MUC-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-7313 | |
| Anti-Snail + Slug (phospho S246) | Abcam | Ab63568 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 568 Phallodin | Molecular Probes | A12380 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P36941 | |
| Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera | Zeiss | 4300009901 | |
| Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera | Olympus | IX511F3 |
References
- Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
- Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
- Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
- National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
- Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
- Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
- Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
- Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
- Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
- Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
- Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
- Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
- Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
- Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
- Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
- Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
- Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).
