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Genetics

एक उच्च throughput प्रारूप में / Cas9 की मध्यस्थता नॉकआउट म्यूटेंट CRISPR जीनोटाइप के लिए एक फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग करते हुए

Published: April 8, 2017 doi: 10.3791/55586
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer & Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School

Summary

जीनोटाइपिंग तकनीक यहाँ वर्णित है, जो जोड़ों फ्लोरोसेंट पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (पीसीआर) जेल वैद्युतकणसंचलन केशिका, nuclease की मध्यस्थता नॉकआउट क्लोन के उच्च throughput जीनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है। यह अन्य जीनोटाइपिंग तकनीक को पेश आ रही सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न और अनुक्रमण तरीकों की तुलना में अधिक लागत प्रभावी है।

Abstract

प्रोग्राम जीनोम संपादन उपकरण के विकास रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग भूमिकाओं विशिष्ट जीनोमिक दृश्यों कोशिकाओं और पूरे जीवों के कामकाज में खेलने को समझने के लिए मदद की है। इस कारण काफी / Cas9 प्रणाली एक बहुमुखी उपकरण है कि शोधकर्ताओं, के क्रम में जीनोम और transcriptome हेरफेर करने के लिए अन्य बातों के अलावा, नॉक आउट, नीचे दस्तक, या एक लक्षित में जीन में दस्तक की अनुमति देता है CRISPR की हाल ही में परिचय द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है तौर तरीका। एक जीन बाहर दस्तक के प्रयोजन के लिए, CRISPR / Cas9 की मध्यस्थता डबल भूग्रस्त टूटता गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के डीएनए की मरम्मत मार्ग की भर्ती को तोड़ने स्थल पर frameshift के कारण प्रविष्टि या न्यूक्लियोटाइड का विलोपन लागू करने के लिए। हालांकि, एक व्यक्ति गाइड आरएनए अवांछनीय ऑफ-टारगेट प्रभाव का कारण हो सकता है, और इन से इनकार करने के लिए, कई गाइड RNAs के उपयोग आवश्यक है। लक्ष्यों की एक बहुतायत में भी मतलब है कि क्लोन के एक उच्च मात्रा स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है, जो बारी में एक एफई के उपयोग भीख माँगताउच्च throughput तकनीक ficient नॉकआउट क्लोन जीनोटाइप के लिए। वर्तमान जीनोटाइपिंग तकनीक या तो निहित सीमाओं से ग्रस्त हैं या उच्च लागत उठाना, इसलिए उन्हें उच्च throughput उद्देश्यों के लिए अनुपयुक्त हो जाता है। यहाँ, हम विस्तार फ्लोरोसेंट पीसीआर, जो एक टेम्पलेट के रूप में कच्चे तेल की सेल lysate से जीनोमिक डीएनए का उपयोग करता है का उपयोग कर, और फिर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से पीसीआर टुकड़े हल करने के लिए प्रोटोकॉल। इस तकनीक को काफी सही टुकड़े के बीच एक आधार जोड़ी अंतर अंतर करने के लिए है और इसलिए लक्षित जीन की कोडिंग अनुक्रम में उपस्थिति या frameshift के अभाव का संकेत में पर्याप्त है। यह सटीक ज्ञान को प्रभावी ढंग से पुष्टिकारक अनुक्रमण कदम के लिए की जरूरत precludes और उपयोगकर्ताओं की प्रक्रिया में समय और लागत को बचाने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक के रूप में यहाँ और कहीं और से पता चला, कई जीनों के खिलाफ गाइड RNAs द्वारा लक्षित विभिन्न ऊतक मूल के विभिन्न स्तनधारी कोशिकाओं जीनोटाइपिंग में बहुमुखी साबित हो गया है।

Introduction

रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण वैज्ञानिकों सेल या पूरे जीव पर जीनोम में विशिष्ट परिवर्तन की प्रभाव स्पष्ट करना अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, एक विशेष जीन की अभिव्यक्ति के क्रम प्रभाव है कि इस सेल की या पर समारोह पर है निर्धारित करने के लिए जीन नॉकडाउन 1, 2 (आंशिक कमी) या जीन नॉकआउट 3, 4 (पूरा पृथक) द्वारा तनु किया जा सकता है जीव के विकास।

जीन नॉकआउट प्रयोगों ऐसे जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) के रूप में अनुक्रम विशेष प्रोग्राम न्युक्लिअसिज़, की शुरूआत के बाद आसान हो गए हैं। हालांकि, नियमित रूप से कम मुरजबंध संबंधी दोहराने (CRISPR) बीच-बीच में क्लस्टर के अपेक्षाकृत हाल ही में लक्षण वर्णन / Cas9 प्रणाली यह बहुत आसान दुनिया भर में किसी भी प्रयोगशाला जनरल प्रदर्शन करने के लिए बना दिया हैई नॉकआउट प्रयोगों। संक्षेप में, CRISPR / Cas9 प्रणाली के दो आवश्यक घटक-एक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) है, जो पहचानता है और जीनोम में एक विशिष्ट क्रम में करने के लिए आधार संपूरकता के माध्यम से बांधता है, और एक endonuclease Cas9 कहा जाता है के होते हैं। जीनोमिक डीएनए पर sgRNA-Cas9 परिसर के विशिष्ट बंधन और कार्रवाई के बाद डीएनए की डबल भूग्रस्त दरार है। यह, बारी में, सेल, जो बाद में गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) या समरूप पुनर्संयोजन (एचआर) रास्ते के माध्यम से ठीक किया जाता है में डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया तंत्र से चलाता है। के बाद से NHEJ मरम्मत तंत्र (लेकिन मानव संसाधन तंत्र) अक्सर मरम्मत के स्थल पर यादृच्छिक प्रविष्टि या न्यूक्लियोटाइड को हटाए जाने का परिणाम, प्रविष्टि / विलोपन (INDEL) म्यूटेशन में जिसके परिणामस्वरूप, यह एक एक्सॉन के पढ़ने के फ्रेम शिफ्ट करने के लिए कारण हो सकता है। यह तो, अनुवाद और बकवास की मध्यस्थता क्षय 5, 6 के समय से पहले समाप्ति की वजह से जीन के नॉक आउट में हो सकता है7।

सुविधा एक जीन बाहर दस्तक में CRISPR / Cas9 प्रणाली की शुरुआत द्वारा प्रदान के बावजूद, लक्षित कोशिकाओं के क्लोन की जीनोटाइपिंग विशेष रूप से एक उच्च प्रवाह क्षमता 8, 9 की स्थापना में अड़चन बनी हुई है,। मौजूदा तकनीक या तो प्रमुख निहित सीमाओं पीड़ित हैं या आर्थिक रूप से महंगा है। उदाहरण के लिए, सर्वेक्षक या T7E1 परख है, जो एक एंजाइमी परख कि डुप्लेक्स 10 डीएनए में बेमेल का पता लगाता है, wildtype क्लोन और समयुग्मक उत्परिवर्ती के बीच भेद करने में सक्षम नहीं है (क्लोन जिसका युग्मविकल्पी हूबहू उत्परिवर्तित कर रहे हैं), क्योंकि ये क्लोन समान जेनेटिक तत्व है और इस तरह उनके डीएनए अनुक्रम 11 में बेमेल पेश नहीं करते। इसके अलावा, सेंगर अनुक्रमण, जो उत्परिवर्ती क्लोन जीनोटाइपिंग, एक उच्च throughput सेटअप में में स्वर्ण मानक माना जाता के उपयोग इसकी ऊंची कीमत की वजह से अवांछनीय है। यहाँ, हम एक det पेशफ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक है, जो अन्य मौजूदा जीनोटाइपिंग तकनीक की सीमाओं को दरकिनार और nuclease की मध्यस्थता नॉकआउट क्लोन के एक उच्च throughput स्क्रीन प्रदर्शन में विशेष रूप से उपयोगी है सकते हैं की ailed प्रोटोकॉल। इस विधि को करने के लिए तकनीकी रूप से आसान है और समय और लागत की बचत होती है।

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Protocol

1. CRISPR / Cas9-लक्षित एकल सेल क्लोन प्राप्त

  1. एंटीबायोटिक से मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक के 2 एमएल में अच्छी तरह से प्रति 500,000 कोशिकाओं में एक 6-अच्छी तरह से थाली पर बीज HepG2 कोशिकाओं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  2. साथ Transfect कोशिकाओं प्लाज्मिड सह व्यक्त निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर Cas9 और ब्याज की जीन के खिलाफ विशिष्ट sgRNA।
    नोट: उदाहरण के लिए, sgRNA pSpCas9 (बी बी) -2A-GFP वेक्टर में, जैसा कि पहले 4 वर्णित क्लोन जा सकता है।
  3. ताजा एंटीबायोटिक से मुक्त माध्यम के 2 एमएल के साथ अभिकर्मक के बाद 16 घंटे - संवर्धन माध्यम 4 बदलें।
  4. अभिकर्मक के बाद के बारे में 48 घंटे, कोशिकाओं trypsinizing द्वारा एकल कोशिका निलंबन इकट्ठा।
    1. 0.25% ट्रिप्सिन- EDTA के 0.2 एमएल में कोशिकाओं Trypsinize और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और फिर से निलंबित thoroughly।
  5. GFP पॉजिटिव क्लोन के लिए कोशिकाओं, जैसा कि पहले 12 में वर्णित सॉर्ट, और लगभग 3500 कोशिकाओं को इकट्ठा।
  6. पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन-पूरक संस्कृति मध्यम के 8 एमएल में पकवान प्रति 500, 1000 और 2000 की कोशिकाओं में 10 सेमी बर्तन पर GFP पॉजिटिव अनुसार क्रमबद्ध कोशिकाओं प्लेट। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर कोशिकाओं सेते हैं।
  7. जब तक वे काफी बड़ी नंगी आंखों से दिखाई दे सकता है एकल सेल कालोनियों के रूप में विकसित,, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखें मध्यम की जगह हर पाँच दिन। सबसे कैंसर कोशिका लाइनों के लिए, यह चढ़ाना के दिन से लगभग दो सप्ताह लग जाते हैं।
  8. कालोनियों उचित आकार (यानी, नग्न आंखों से) के होते हैं, एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति DMEM के 200 μL युक्त थाली के कुओं के लिए अलग-अलग कालोनियों हस्तांतरण 10% एफबीएस के साथ पूरक।
    1. माध्यम की एक छोटी मात्रा के साथ एक 200-μL पिपेट का उपयोग एकल कोशिका कालोनियों Aspirate। कोशिकाओं को अच्छी तरह से में में Resuspendकई बार triturating द्वारा जुदा कुओं।
  9. , 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखें मध्यम की जगह हर पाँच दिन, जब तक वे 50 तक पहुंच - 90% संगम। 48 ज - सबसे कैंसर कोशिका लाइनों के लिए, इस बारे में 24 लेता है।

2. निकाला जा रहा है क्रूड जीनोमिक डीएनए एक प्रत्यक्ष Lysis विधि का प्रयोग

  1. कोशिकाओं 50 तक पहुंच जाती है - 90% संगम, संभव का उपयोग करते हुए मल्टी चैनल वैक्यूम सक्शन या एक विंदुक मल्टी चैनल के रूप में कुओं से संस्कृति के माध्यम के रूप में ज्यादा हटा दें।
  2. अच्छी तरह से प्रत्येक में 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA (फिनोल लाल के बिना) के 25 μL जोड़ें और 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. pipetting और कई बार नीचे अच्छी तरह से trypsinized कोशिकाओं Resuspend। एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच करें कि वे प्लास्टिक सतह से अलग कर रहे हैं।
  4. एक खाली 96-अच्छी तरह संस्कृति प्लेट के लिए एकल कोशिका निलंबन के लगभग 5 μL स्थानांतरित करके अलग-अलग क्लोन के एक दोहराने बनाएंई। कल्चर माध्यम के 200 μL प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ सकते हैं और जब तक सकारात्मक क्लोन फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन (देखें नीचे) का उपयोग कर पहचान कर रहे हैं कोशिकाओं को बनाए रखने। क्रमानुसार 10 सेमी व्यंजन या पसंद के किसी भी अन्य पैमाने करने के लिए कोशिकाओं का विस्तार (धारा 7 देखें)।
  5. 5 μL एक में घर का बना प्रत्यक्ष-ल्य्से बफर के 10 μL (10 मिमी Tris पीएच 8.0, 2.5 मिमी EDTA, 0.2 एम NaCl, 0.15% एसडीएस, और 0.3% बीच 20) से 12 कदम 2.3 से एकल कोशिका निलंबन के जोड़े 96-अच्छी तरह पीसीआर प्लेट और कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह मिला दें। अपकेंद्रित्र संक्षेप में (कुओं के निचले भाग तक तरल लाने के लिए)।
  6. कदम 2.3 से सेल निलंबन की शेष ~ 15 μL के संवर्धन माध्यम के 200 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में सेते हैं, एक साथ कदम 2.4 से दोहराने के साथ।
  7. निम्नलिखित थर्मल साइकिल चालन कार्यक्रम के लिए कदम 2.5 से lysates अधीन कोशिकाओं की पूरी lysis और जीनोमिक डीएनए की रिहाई सुनिश्चित करने के लिए: 3 के लिए 65 डिग्री सेल्सियस0 एस, 30 एस के लिए 8 डिग्री सेल्सियस, 1.5 मिनट, 97 ° 1 मिनट के लिए 3 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए 3 मिनट के लिए सी, 8 डिग्री सेल्सियस, 65 डिग्री सेल्सियस, 97 डिग्री सेल्सियस, 1 के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस मिनट और 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस। lysates संक्षेप में अपकेंद्रित्र।
  8. nuclease मुक्त पानी के 40 μL जोड़कर lysates पतला और एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर अच्छी तरह मिला दें। अपकेंद्रित्र संक्षेप में। पतला lysates तुरंत इस्तेमाल या गुणवत्ता की महत्वपूर्ण हानि के बिना कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

3. फ्लोरोसेंट पीसीआर प्रदर्शन CRISPR / Cas9 लक्ष्य क्षेत्र बढ़ाना

  1. डिजाइन दो फ्लोरोफोरे लेबल आगे प्राइमरों (दोनों 5 'अंत में लेबल) प्रत्येक CRISPR / Cas9 लक्ष्य क्षेत्र के लिए; साइटों है कि 300 बीपी से एक दूसरे को दो अलग-अलग लक्ष्य क्षेत्रों (अलक्षित wildtype नियंत्रण और CRISPR / Cas9-लक्षित क्लोन के लिए नीले रंग फ्लोरोफोरे लेबल प्राइमर के लिए उदाहरण के लिए, हरी फ्लोरोफोरे लेबल प्राइमर के रूप में विचार किया जाना चाहिए की तुलना में आगे हैं काटने; मटेरिया की तालिका देख ls)।
    1. इन आगे लेबल प्राइमरों और लेबल नहीं किए गए रिवर्स प्राइमर तदनुसार की खरीद। ध्यान दें कि प्राइमरों पसंद के किसी भी उपकरण का उपयोग कर बनाया जा सकता है और amplicons 200 होना चाहिए कि - 500 ब्प लोंग।
  2. जैसा कि पहले 12 में वर्णित लेबल प्राइमरों का उपयोग कर लक्ष्य क्षेत्रों बढ़ाना पीसीआर निष्पादित करें।
    1. एक 20 μL प्रतिक्रिया में कदम 2.8 से पतला lysates के 3 μL का प्रयोग करें और निम्नलिखित थर्मल साइकिल चालन कार्यक्रम (तालिका 1 देखें): 10 मिनट (1 चक्र) के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 64 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट (4 चक्र) के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 61 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट (4 चक्र) के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट (4 चक्र) के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस (35 चक्र)।
  3. आकार और amplicons के रिश्तेदार राशि के लिए जाँच करने के लिए एक 1% agarose जेल पर पीसीआर amplicons की 5 μL का समाधान करेंएस एस = "xref"> 12।
    नोट: सभी नमूनों के लिए इस कदम प्रदर्शन के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, लेकिन जरूरी नहीं; नमूनों की एक चयनित संख्या को हल करने सामान्य रूप में नमूने में मौजूद amplicons की राशि का अनुमान लगाने के लिए पर्याप्त है।

4. केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए नमूने तैयार कर रहा है

  1. लगभग 2.5 एनजी / μL के wildtype (अलक्षित पैतृक कोशिकाओं) और nuclease मुक्त पानी में CRISPR / Cas9-लक्षित डीएनए के amplicons पतला। पर्याप्त wildtype डीएनए नमूना पतला करने के लिए सुनिश्चित प्रत्येक लक्षित डीएनए नमूना के लिए जोड़ा जा करने के लिए (लक्षित नमूना प्रति पतला wildtype नमूना के 0.5 μL की एक न्यूनतम आवश्यकता होती है) बनाओ।
  2. पतला wildtype और समान अनुपात में लक्षित डीएनए नमूनों मिक्स (जैसे, लक्षित नमूने के 1 μL साथ wildtype नमूने के 1 μL मिश्रण)।
  3. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली है कि आनुवांशिक एक के साथ संगत है में विआयनीकृत formamide का 8.7 μL और डाई लेबल आकार मानक के 0.3 μL करने के लिए मिश्रित amplicons की 1 μL जोड़ेंalyzer।
    नोट: formamide का एक मास्टर मिश्रण और आकार मानक के उपयोग (यानी, formamide के premix की तैयारी और एक 29 में आकार मानक: amplicons के अलावा करने से पहले 1 के अनुपात मानकीकृत मात्रा सुनिश्चित करने के लिए) की सिफारिश की है।
  4. कसकर थाली सील और एक पीसीआर thermocycler का उपयोग 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने गर्म करें।
  5. तुरंत हीटिंग चरण के बाद बर्फ पर थाली रखें और कम से कम 3 मिनट के लिए सेते हैं।

5. एक जेनेटिक विश्लेषक पर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन

  1. परख मापदंडों साधन प्रोटोकॉल, और केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन एक आनुवंशिक विश्लेषक से जुड़े सॉफ्टवेयर पर आकार-बुला प्रोटोकॉल सेट करें।
    नोट: यह कदम केवल पहले वैद्युतकणसंचलन रन के लिए आवश्यक है; कार्यक्रम भविष्य में उपयोग के लिए बचाया जा सकता है। बाद में रनों के लिए, तो चरण 5.2 सीधे जाओ।
    1. सॉफ्टवेयर डैशबोर्ड पर "नई प्लेट बनाएँ" आइकन पर क्लिक करें।
    2. आर देंसंयुक्त राष्ट्र एक डमी नाम और निम्न विकल्पों का चयन: कुओं की संख्या, 96; प्लेट प्रकार, टुकड़ा; केशिका लंबाई, 50 सेमी; और पॉलिमर, POP7। "असाइन प्लेट सामग्री" बटन पर क्लिक करें।
    3. के तहत "Assays," क्लिक "नई परख बनाएँ"; एक नया पैनल दिखाई देगा।
    4. परख "FPCR-CGE परख" नाम और जांचें कि "ऐप्लिकेशन प्रकार" सही ढंग से के रूप में सेट किया गया है "टुकड़ा।"
    5. के अंतर्गत "नया बनाएँ" बटन पर क्लिक करके साधन प्रोटोकॉल सेट करें "साधन प्रोटोकॉल।"
      1. सेट करें या निम्नलिखित विकल्पों और मानकों को उचित क्षेत्रों में चुनें: आवेदन प्रकार, टुकड़ा; केशिका लंबाई, 50 सेमी; पॉलिमर, POP7; डाई सेट, G5; भागो मॉड्यूल, FragmentAnalysis; प्रोटोकॉल नाम, FPCR-CGE साधन प्रोटोकॉल; ओवन तापमान 60 डिग्री सेल्सियस; भागो वोल्टेज, 19.5 केवी; पूर्व रन वोल्टेज, 15 केवी; इंजेक्शन वोल्टेज, 1.6 केवी; भागो समय, 1,330 रों; पूर्व रन टाइम, 180 रों; इंजेक्शन समय, 15 रों; और डेटा विलंब, 1 एस।
    6. क्लोरीन"लागू परख करने के लिए" बटन और फिर "सहेजें लाइब्रेरी के लिए" बटन पर ick कार्यक्रम को बचाने के लिए। जारी रखने के लिए पैनल को बंद करें।
    7. के अंतर्गत "नया बनाएँ" बटन पर क्लिक करके एक आकार-बुला प्रोटोकॉल सेट करें "Sizecalling प्रोटोकॉल।"
      1. सेट करें या निम्नलिखित विकल्पों और मानकों को उचित क्षेत्रों में चुनें: प्रोटोकॉल नाम, FPCR-CGE Sizecalling प्रोटोकॉल; आकार मानक, GS500 (-250) लिज़; आकार-फोन करने वाले, SizeCaller v1.1.0; विश्लेषण सेटिंग्स, -; विश्लेषण रेंज, पूर्ण; आकार रेंज, पूर्ण; आकार कॉलिंग विधि, स्थानीय दक्षिणी; प्राइमर पीक, वर्तमान; नीला, हरा, नारंगी चैनल, (चेक); न्यूनतम पीक ऊंचाई, सभी चैनलों के लिए 175; चौरसाई, कोई नहीं का उपयोग करें; उपयोग baselining (बेसलाइन विंडो (अंक)), (चेक) 51; न्यूनतम पीक आधी चौड़ाई, 2; पीक विंडो आकार, 15; बहुपद डिग्री, 3; ढाल थ्रेसहोल्ड पीक प्रारंभ, 0.0; ढाल थ्रेसहोल्ड पीक एंड, 0.0; क्यूसी सेटिंग्स, -; आकार गुणवत्ता, -; में विफल रहते हैं मूल्य है <0.25; दर्रा अगर मूल्य है <0.75; 80 करने के लिए 0 बीपी से रैखिकता मान लें0 बी पी; और अत्यधिक पुल-अप ध्वज अगर पुल-अप 0.1 ≤ अनुपात और पुल-अप स्कैन ≤ 1।
    8. कार्यक्रम को बचाने के लिए "लागू परख करने के लिए" बटन और फिर "सहेजें लाइब्रेरी के लिए" बटन पर क्लिक करें। जारी रखने के लिए पैनल को बंद करें।
    9. सुनिश्चित करें कि परख "पुस्तकालय के लिए सहेजें" बटन पर एक बार फिर पर क्लिक करके सहेजा जाता है और "बंद" बटन पर क्लिक करके पैनल से बाहर निकलें।
    10. वापस "असाइन प्लेट सामग्री" पेज पर, के अंतर्गत "नया फ़ाइल नाम कन्वेंशन बनाएँ" लिंक पर क्लिक करें "फ़ाइल नाम कन्वेंशनों।"
    11. कार्यक्रम को नाम "FPCR-CGE फ़ाइल नाम।"
    12. के तहत "उपलब्ध विशेषताओं," वांछित विशेषताओं (जैसे कि "भागो की तिथि," "भागो के समय," "ठीक है स्थिति," और "नमूना नाम") है कि फ़ाइल नाम में दिखाई देगा का चयन करें। इच्छित फ़ाइल स्थान जहां रन के परिणाम संग्रहीत किया जाएगा का चयन करें।
    13. "परख करने के लिए लागू करें" बटन पर क्लिक करें और फिर"सहेजें लाइब्रेरी के लिए" बटन कार्यक्रम को बचाने के लिए। जारी रखने के लिए पैनल को बंद करें।
    14. वापस "असाइन करें प्लेट सामग्री" पेज पर, के अंतर्गत "नया परिणाम समूह बनाएँ" लिंक पर क्लिक "परिणाम समूह।"
    15. कार्यक्रम को नाम "FPCR-CGE समूह परिणाम।"
    16. के तहत "उपलब्ध विशेषताओं," वांछित विशेषताएं (जैसे कि "परख नाम" के रूप में) है कि फ़ाइल नाम में दिखाई देगा का चयन करें। इच्छित फ़ाइल स्थान जहां रन के परिणाम संग्रहीत किया जाएगा का चयन करें।
    17. कार्यक्रम को बचाने के लिए "लागू परख करने के लिए" बटन और फिर "सहेजें लाइब्रेरी के लिए" बटन पर क्लिक करें। जारी रखने के लिए पैनल को बंद करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके चलाने एक वैद्युतकणसंचलन के लिए कार्यक्रम निर्धारित करें।
    1. डैशबोर्ड पर जाएं और "नया प्लेट बनाएँ" आइकन पर क्लिक करें।
    2. रन के रूप में वांछित को नाम दें (आसान संदर्भ के लिए, तिथि, सेल लाइन, और जीन नाम शामिल हैं)। निम्नलिखित विकल्पों का चयन करें: कुओं की संख्या, 96; प्लेट प्रकार, टुकड़ा; केशिका लंबाई, 50 सेमी; और पॉलिमर, POP7। "असाइन प्लेट सामग्री" बटन पर क्लिक करें।
    3. नमूने के प्रत्येक अच्छी तरह से लेबल करें वांछित (जैसे, एक नमूना "एन सी" संकेत मिलता है कि अच्छी तरह से एक नकारात्मक नियंत्रण है नामित किया जा सकता है)।
    4. के तहत "Assays," "फ़ाइल नाम कन्वेंशनों," और "परिणाम समूह जोड़ें लाइब्रेरी से" लिंक "बॉक्स, क्लिक करें" और 5.1.17 के लिए कदम 5.1.3 में बनाया कार्यक्रमों का चयन करें।
    5. सभी कुओं का विश्लेषण किया जाए हाइलाइट करें और के तहत संबंधित कार्यक्रमों का चयन करें "Assays," "फ़ाइल नाम कन्वेंशनों," और "उनके बगल में बॉक्स चेक करके परिणाम समूह"।
  3. आनुवंशिक विश्लेषक की ट्रे पर थाली लोड करने से पहले, 96-अच्छी तरह थाली पर रबर सील लागू करते हैं और प्लास्टिक मामले कि आनुवंशिक विश्लेषक के साथ आता है में सील प्लेट डाल दिया।
  4. आनुवंशिक विश्लेषक के सामने "ट्रे" बटन पुश, और जब ट्रे फिर सेउपकरण के सामने दर्द, दरवाजा खोलने और ट्रे पर encased प्लेट लोड। सुनिश्चित करें कि थाली जगह में बंद कर दिया जाता है और फिर दरवाजा बंद।
  5. बटन "रन के लिए लिंक प्लेट" पर क्लिक करें।
  6. "रन के लिए लोड प्लेट्स" पृष्ठ में, यह सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मकों और शर्तों सही और क्रम में हैं एक अंतिम जाँच करते हैं।
  7. "प्रारंभ भागो" बटन पर क्लिक करें। 24 नमूने (96-अच्छी तरह थाली के पहले 3x8 कुओं) के प्रत्येक रन पूरा करने के लिए कम से कम 55 मिनट लगते हैं।

6. electropherogram के विश्लेषण से बेस-जोड़ी मतभेद का निर्धारण करने के

  1. जब केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन रन पूरा हो गया है, परिणामों का विश्लेषण करने विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
  2. पर क्लिक करें आइकन "नमूने जोड़े प्रोजेक्ट" और रन फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर के लिए खोज। कदम 5.1.12 परिणाम फ़ाइलों की सौंपा स्थान से याद।
  3. पूरा रन और सीएल में सभी परिणाम प्रत्येक इंजेक्शन की फ़ाइलों का चयन करें"सूची में जोड़ें" बटन पर ick; इन फ़ाइलों के नाम "इंज" के साथ शुरू करने और चलाने के विवरण होते हैं।
  4. विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए "जोड़ें और विश्लेषण" बटन क्लिक करें।
  5. पहला नमूना पर क्लिक करके और पिछले नमूना करने के लिए नीचे कर्सर को खींच कर समय में सभी नमूनों का चयन करें और फिर क्लिक करें "प्रदर्शन भूखंड" आइकन।
  6. आकार मानक की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, नारंगी आइकन जाँच और रंगों के आइकन के बाकी अनचेक करके परिणामों की नारंगी चैनल खुला; इस लिए सुनिश्चित करें कि आकार-बुला सटीक और विश्वसनीय है महत्वपूर्ण है।
  7. चोटियों टुकड़े अलक्षित नियंत्रण से ली गई और लक्षित क्लोन करने के लिए इसी देखने के लिए, इन चैनलों से रीडिंग को खोलने के लिए नीले और हरे रंग माउस की जाँच करें।
  8. पहला परिणाम साजिश और चयन करने के लिए राइट क्लिक करें की क्षैतिज अक्ष पर कर्सर जगह "पूर्ण देखें।" एक नज़र में सभी परिणाम देखने के लिए निर्धारित करने के लिए नीचे स्क्रॉल करेंअगर वहाँ रन के साथ किसी भी बड़ी समस्या है। मूल्यों की एक विशिष्ट श्रेणी पर ज़ूम इन करने के लिए, साजिश के प्रासंगिक अक्ष पर माउस पर राइट क्लिक करें, चुनें "ज़ूम करने के लिए ...," और ब्याज की मानों की श्रेणी में महत्वपूर्ण।
    नोट: एक संभावित बड़ी समस्या यह है कि सभी नमूनों कम तीव्रता चोटियों देना है। यह आमतौर पर केशिका वैद्युतकणसंचलन रन या amplicons की ओवर-द कमजोर पड़ने, जो आसानी से पीसीआर कदम को दोहराते हुए हैं या कम कमजोर पड़ने कारक क्रमश का उपयोग कर amplicons कमजोर द्वारा सुधारा जा सकता है के लिए पहले फ्लोरोफोरे लेबल amplicons की लंबे समय तक भंडारण के कारण है।
  9. परिणाम बचाने के लिए, नीचे दिए गए चरणों वर्णित का पालन करें।
    1. सुनिश्चित करें कि नीले और हरे रंग चैनल का चयन कर रहे हैं और "आकार तालिका" आइकन पर क्लिक करें।
    2. "फ़ाइल" खोलने और चयन करके टैब-सीमांकित पाठ (.txt) स्वरूप में मानों की तालिका सहेजें "निर्यात तालिका।" फ़ाइल तदनुसार नाम और पसंद की फ़ाइल स्थान का चयन करें।
    3. भूखंड को बचाने के लिएपीडीएफ प्रारूप में रन की है, "फाइल" पर जाएं और "प्रिंट" विकल्प पर क्लिक करें। प्रासंगिक पीडीएफ लेखक और प्रेस चुनें "प्रिंट।" फ़ाइल तदनुसार नाम और पसंद की फ़ाइल स्थान का चयन करें।
  10. टुकड़े अलक्षित wildtype नियंत्रण और CRISPR / Cas9-लक्षित क्लोन से व्युत्पन्न के आकार में अंतर की गणना करने के लिए नीचे दिए चरणों वर्णित का पालन करें।
    1. एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम के साथ कदम 6.9.2 से टैब सीमांकित पाठ (.txt) फ़ाइल खोलें। तालिका इन चार महत्वपूर्ण स्तंभों में शामिल करना चाहिए: "डाई / नमूना पीक" (एक नीली या हरी चैनल का संकेत), "नमूना फ़ाइल नाम", "आकार" (प्रथम वर्ण अच्छी तरह से या नमूना नाम से संकेत मिलता है) (के आकार का संकेत टुकड़ा कहा जाता है), और "ऊंचाई" (चोटी के प्रतिदीप्ति तीव्रता का संकेत)।
    2. प्रासंगिक चोटियों खास तौर करने के लिए, उन है कि उम्मीद आकार सीमा में नहीं हैं शामिल नहीं है।
      नोट: आमतौर पर, INDEL म्यूटेशन शायद ही कभी अधिक में परिणामआकार में 100 बीपी अंतर से; इस प्रकार, चोटियों जिसका आकार wildtype नियंत्रण शिखर (हरा चैनल में प्रमुख चोटी) से 100 से अधिक बीपी द्वारा अलग है बाहर रखा गया है। यह आसानी से स्प्रेडशीट में उपयोग करते हुए विकल्प "के बीच" "सशर्त स्वरूपण" समारोह के तहत किया जा सकता है।
    3. गैर विशिष्ट चोटियों, जो पृष्ठभूमि स्तर से अप्रभेद्य हैं निकालने के लिए, चोटियों जिसका ऊंचाइयों 2,000 इकाइयों की तुलना में कम कर रहे हैं बाहर करने के लिए स्प्रेडशीट प्रोग्राम में "सशर्त स्वरूपण" समारोह के तहत विकल्प "से कम" का उपयोग करें। यह कट ऑफ मूल्य अनुभव निर्धारित किया गया है और इसलिए जहां फिट समझा समायोजित किया जा सकता।
    4. पूर्व से बाद घटाकर नीले चैनल (CRISPR / Cas9-लक्षित क्लोन) और हरे रंग चैनल (अलक्षित wildtype नियंत्रण) में एकमात्र शिखर है, जिसके परिणामस्वरूप चोटियों में से प्रत्येक के बीच टुकड़ा आकार में अंतर की गणना।
      नोट: यह प्रत्येक केशिका electrophor के लिए जिम्मेदार ठहराया मानों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैESIS नमूना, के रूप में वहाँ wildtype नियंत्रण से टुकड़ा आकार में अंतर-नमूना अंतर हो सकता है।
    5. निकटतम पूर्णांक तक मूल्यों बंद दौर आधार जोड़े कि में डाला गया है या से, यदि कोई हो, सवाल में जीनोमिक अनुक्रम नष्ट कर दिया की संख्या का निर्धारण करने के लिए। जब एक जीन बाहर दस्तक ब्याज की है, चयन क्लोन जिसका INDEL म्यूटेशन 3 बीपी के गुणकों के नहीं हैं सुनिश्चित करने के लिए कोडिंग अनुक्रम में frameshift नहीं है।

7. क्लोन्स के नॉकआउट स्थिति का सत्यापन

  1. 0.25% ट्रिप्सिन- EDTA के 25 μL का उपयोग कर कोशिकाओं trypsinizing और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर विकासशील द्वारा एक 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 96-अच्छी तरह प्लेट (चरणों 2.4 और 2.6 से) से अलग-अलग नॉकआउट क्लोन का विस्तार करें।
  2. माध्यम के 125 μL (DMEM 10% FBS के साथ पूरक) trypsinized कोशिकाओं में जोड़े और अच्छी तरह से फिर से निलंबित।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG में एक 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
  4. संभव वैक्यूम सक्शन या एक विंदुक का उपयोग के रूप में माध्यम के रूप में ज्यादा निकालें, मध्यम के 500 μL में सेल गोली resuspend, और एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में सेते हैं जब तक कोशिकाओं 80-90% संगम तक पहुँचते हैं।
  5. 24-अच्छी तरह से थाली से एक 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए और 6-अच्छी तरह से थाली से एक 10 सेमी पकवान जब वे 80 तक पहुंचने के लिए क्रमानुसार व्यक्तिगत क्लोन का विस्तार करें - दोहरा चरणों 7.1 7.4 के लिए, निम्न संस्करणों का उपयोग करके 90% संगम: 0.25% के 50 μL ट्रिप्सिन- EDTA और मध्यम के 150 μL (24-अच्छी तरह से थाली से 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए विस्तार के लिए) और 0.25% की 200 μL ट्रिप्सिन- EDTA और माध्यम के 1 एमएल (6 से विस्तार के लिए अच्छी तरह से 10 सेमी पकवान के लिए प्लेट)।
  6. क्लोन जल को संचित करें जब वे 80 तक पहुंच - 0.25% ट्रिप्सिन- EDTA के 1 एमएल का उपयोग करने और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते कोशिकाओं trypsinizing से 90% संगम।
  7. माध्यम के 5 एमएल (DMEM 10% FBS के साथ पूरक) trypsinized कोशिकाओं और resuspe में जोड़ेअच्छी तरह से nd।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG में दो 15-एमएल ट्यूबों, अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन समान रूप से स्थानांतरण, और जितना संभव हो उतना मध्यम हटा दें। कोशिकाओं में से एक भाग जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए है और कुल प्रोटीन निकासी के लिए अन्य है।
  9. सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से सत्यापन के लिए, नीचे दिए गए चरणों वर्णित का पालन करें।
    1. क्लोन से जीनोमिक डीएनए निकालें के रूप में पहले से 12 का वर्णन किया।
    2. खंड 3.2 में वर्णित के रूप में, इस क्षेत्र CRISPR / Cas9 लक्ष्य साइट फैले की पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करना है, लेकिन लेबल हटाया गया प्राइमरों का उपयोग करें। , इस कदम के लिए लेबल प्राइमरों का उपयोग के रूप में टैग से प्रतिदीप्ति बाद सेंगर अनुक्रमण कदम के साथ हस्तक्षेप कितना समय लगेगा।
    3. जैसा कि पहले 12 में वर्णित है, एक पीसीआर सफाई किट का उपयोग amplicons शुद्ध।
    4. कदम 7.9.2 में इस्तेमाल पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर क्लोन के जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए शुद्ध amplicons, वर्णित previousl के रूप में क्रमy 12।
  10. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से सत्यापन के लिए,, wildtype कोशिकाओं और लक्षित क्लोन से कुल प्रोटीन निकालने के रूप में पहले से 12 का वर्णन किया।
    1. जैसा कि पहले 12 में वर्णित है, लक्ष्य जीन के प्रोटीन के खिलाफ उचित एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण निष्पादित करना; एक सच्चे नॉकआउट क्लोन प्रोटीन की अभिव्यक्ति से रहित है।

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Representative Results

फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन यहाँ वर्णित तकनीक वास्तव में किसी भी सेल लाइन है कि विदेशी डीएनए वितरण के लिए उत्तरदायी है में जीनोम में किसी भी लक्षित करने योग्य क्षेत्र के लिए लागू होने की उम्मीद की जाती है। हम पहले से एक कोलोरेक्टल कैंसर कोशिका लाइन 12 में तीन जीन को लक्षित करके अपने आवेदन प्रदर्शन किया है। यहाँ, हम एक हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइन, HepG2, एक CRISPR के साथ लक्षित जीनोटाइपिंग में इसकी क्षमता / Cas9 nucleosome विधानसभा प्रोटीन 1 के खिलाफ निर्माण की तरह 1 (NAP1L1) जीन दिखा। वास्तव में, हम सफलतापूर्वक गैर मानव स्तनधारी सेल लाइनों, कई अन्य जीनों 12 पर लक्षित, 13 सहित विभिन्न अन्य कोशिकाओं, जीनोटाइप के लिए फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग किया है।

प्रयोग के लिहाज से, फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन technique आसान और प्रदर्शन करने के लिए तेजी से होता है। Cas9 और sgRNA अभिव्यक्ति की शुरूआत कोशिकाओं और सकारात्मक क्लोन के चयन में निर्माण के बाद, व्यक्तिगत क्लोन 96-अच्छी तरह संस्कृति हमारे घर का बना lysis बफर, डायरेक्ट-Lyse बफर 12 का उपयोग कर थाली से सीधे lysed। हमारे अनुभव में, जिसके परिणामस्वरूप lysates जीनोमिक डीएनए गुणवत्ता का नुकसान बिना कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या उससे पहले वाले पर संग्रहित किया जा सकता है। lysis कदम पीसीआर प्रवर्धन कदम है, जो फ्लोरोफोरे-टैग amplicons कि CRISPR लक्ष्य क्षेत्र अवधि के उत्पादन शामिल है द्वारा पीछा किया। फ्लोरोसेंट पीसीआर प्रदान की प्रोटोकॉल इस उद्देश्य के लिए अनुकूलित किया गया है और लगातार पर्याप्त पीसीआर उत्पादों का उत्पादन किया गया, इस क्षेत्र की परवाह किए बिना परिलक्षित किया जा रहा। चित्रा 1 प्रत्येक लेन एक व्यक्ति CRISPR / Cas9-लक्षित क्लोन करने के लिए इसी और विभिन्न बैंड corresp साथ, amplicons फ्लोरोसेंट पीसीआर कदम से प्राप्त की संकल्प के एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलताक्लोन में अलग-अलग युग्मविकल्पियों के परिलक्षित क्षेत्रों के लिए onding। हमारे अनुभव में, अन्य पोलिमेरासिज़ और इससे जुड़ी हुई प्रोटोकॉल का उपयोग एक कम amplicon उपज में हुई। हालांकि यह आसानी से केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए नमूना तैयारी के दौरान कमजोर पड़ने कारक का समायोजन करके सुधारा जा सकता है, पृष्ठभूमि या शोर स्तर फलस्वरूप अधिक हो सकता है जब कम उपज के amplicons किया जाता है। पीसीआर चरण के बाद, amplicons पतला कर रहे हैं, और wildtype नमूना के उन लोगों और लक्षित क्लोन बराबर अनुपात में मिलाया जाता है इससे पहले कि वे विआयनीकृत formamide बफर और एक आकार मानक, विकृत करने के लिए जोड़ रहे हैं, और एक केशिका जेल पर संकल्प लिया।

केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन पूरी होने के बाद जीनोटाइपिंग परिणामों का विश्लेषण करने के लिए तैयार कर रहे हैं। परिणाम के दो महत्वपूर्ण सेट वैद्युतकणसंचलन रन से की आवश्यकता है: चोटियों युक्त electropherograms व्यक्ति प्रतिदीप्ति संकेतों और वें के लिए इसीई परिणाम के लिए सभी आवश्यक गणना के लिए आवश्यक मान युक्त तालिका। चित्र 2 HepG2 कोशिकाओं में NAP1L1 जीन के खिलाफ sgRNA द्वारा लक्षित दो क्लोन की जीनोटाइपिंग के लिए परिणाम दिखाता है। हरे रंग की चोटियों, माता पिता HepG2 कोशिकाओं में अलक्षित wildtype एलील के amplicons के अनुरूप जबकि नीले चोटियों CRISPR / Cas9-लक्षित क्लोन की INDEL उत्परिवर्तन युक्त जेनेटिक तत्व के amplicons के अनुरूप हैं। स्पष्ट रूप से दिखाया गया है, दो क्लोन समयुग्मक उत्परिवर्ती (हूबहू उत्परिवर्तित जेनेटिक तत्व के साथ उत्परिवर्ती), दोनों जेनेटिक तत्व पर एक और दस न्यूक्लियोटाइड का विलोपन के साथ कर रहे हैं। यह ध्यान रखें कि electropherograms, केवल दृश्य प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि शिखर मूल्यों को निशाना बनाया क्लोन की amplicon और उस wildtype कोशिकाओं के बीच बेस जोड़ा मतभेदों की संख्या निर्धारित करने में महत्वपूर्ण हैं महत्वपूर्ण है।

नॉकआउट स्थिति की प्रामाणिकता को मान्य करने के लिए, हम करने की अनुशंसासेंगर अनुक्रमण और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के उन्मूलन की पुष्टि करने के। इसके बाद के संस्करण की पहचान की दो क्लोन फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन परिणाम (चित्रा 3 ए) के अनुरूप सेंगर अनुक्रमण परिणाम दे दी है। उन्होंने यह भी NAP1L1 प्रोटीन अभिव्यक्ति की पूरी पृथक (चित्रा 3 बी) का प्रदर्शन नॉकआउट क्लोन की अपेक्षा के अनुरूप।

आकृति 1
चित्र 1: HepG2 क्लोन NAP1L1 जीन के खिलाफ CRISPR / Cas9 द्वारा लक्षित की पीसीआर amplicons। फ्लोरोसेंट पीसीआर कदम के amplicons दो अलग-अलग agarose जैल (ऊपर और नीचे) पर हल किया गया है, और प्रत्येक लेन एक व्यक्ति को निशाना बनाया क्लोन से मेल खाती है। एल: डीएनए सीढ़ी (व्यक्तिगत बैंड के आकार आरेख के बगल में दिए गए हैं)। उसे क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्र 2: दो नमूने से प्रतिदीप्ति सिग्नल भूखंड केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से हल। क्षैतिज अक्ष टुकड़ा आकार का प्रतिनिधित्व करता है और ऊर्ध्वाधर अक्ष प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। नीले चोटियों, CRISPR / Cas9 की मध्यस्थता लक्षित क्लोन से व्युत्पन्न टुकड़े के अनुरूप है, जबकि हरी चोटियों wildtype कोशिकाओं से व्युत्पन्न टुकड़े के अनुरूप हैं। मैजेंटा लाइनों स्वत: शिखर-बुला विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो पदों है कि लगातार नमूने भर में चोटियों को दिखाने के निशान द्वारा निर्धारित पदों के अनुरूप हैं। अलग-अलग चोटियों के बगल में प्रदान की जाती मूल्यों (बीपी में) टुकड़े के आकार के अनुरूप और विश्लेषण सॉफ्टवेयर से प्राप्त कर रहे हैं। कोष्ठक में मूल्यों व्यक्ति FRA के बीच आकार में गणना अंतर को दर्शातीएक लक्षित क्लोन और wildtype टुकड़ा से gments। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: परीक्षणों की परिणाम दो क्लोन में लक्षित जीन की नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए। (ए) सेंगर अनुक्रमण परिणाम और (बी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण संकेत प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर। नीले रंग में न्यूक्लियोटाइड sgRNA लक्ष्य अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं, लाल रंग में लोगों protospacer आसन्न मूल भाव (PAM) का प्रतिनिधित्व करते हैं, में लोगों को भूरे रंग के आधार एवजी न्यूक्लियोटाइड प्रतिनिधित्व करते हैं, और डैश पदों जहां न्यूक्लियोटाइड एलील में नष्ट हो जाती हैं प्रतिनिधित्व करते हैं। व्यक्तिगत क्लोन नाम के आगे कोष्ठक में मूल्यों क्लोन के युग्मविकल्पियों के जीनोटाइप प्रतिनिधित्व करते हैं, "-1" और "-10 "का मतलब है कि जेनेटिक तत्व एक और दस न्यूक्लियोटाइड के विलोपन, क्रमशः शामिल पश्चिमी धब्बा में पाया प्रोटीन की अनुमानित आकार का विश्लेषण करती है:। ~ NAP1L1 के लिए 54 केडीए और ~ 84 केडीए पी -84 (लोड हो रहा है नियंत्रण) के लिए। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इन आंकड़ों की बड़ा संस्करण।

अभिकर्मक एक प्रतिक्रिया के लिए मात्रा (μl)
किट विशिष्ट समाधान 4
10x पीसीआर बफर 2
10 माइक्रोन आगे प्राइमर (लेबल) 1
10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर (लेबल नहीं किया गया) 1
25 मिमी dNTP मिश्रण 0.4
Taq डीएनए पोलीमरेज़ 0.2
पानी 8.4
पतला lysate 3
कुल 20

तालिका 1: फ्लोरोसेंट पीसीआर रिएक्शन के लिए अभिकर्मकों।

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Discussion

पसंद का एक मॉडल सेल लाइन में एक विशिष्ट जीन से बाहर दस्तक भूमिका का वर्णन है कि जीन कि विशेष रूप से सेलुलर संदर्भ में नाटकों के लिए नियमित बन गया है। वास्तव में, कई जीनोम चौड़ा स्क्रीन वर्तमान में जीनोम 14, 15, 16 में लगभग सभी ज्ञात मानव जीनों को लक्षित करने के CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग कि उपलब्ध हैं। इन बड़े पैमाने पर स्क्रीन (या यहां तक ​​कि छोटे पैमाने पर ब्याज की व्यक्तिगत जीनों को लक्ष्य करने वाली) के साथ, यह डिजाइन और एक ही जीन के विभिन्न स्थलों को निशाना बनाने sgRNAs उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस्तेमाल किया स्पष्ट रूप से जीन की कमी का असली प्रभाव हथियार डाल देना होगा अलग sgRNAs में एकरूप का परिणाम है। जैसे, एक ही जीन को लक्ष्य एक उच्च मात्रा जीनोटाइपिंग कदम की आवश्यकता होती है सही रूप में अलग-अलग इस्तेमाल किया sgRNA में से प्रत्येक से क्लोन की एक भीड़ जीनोटाइप के लिए होगा। फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक वह वर्णितफिर ठीक इस कार्य को कर सकते हैं।

जबकि मौजूदा जीनोटाइपिंग तरीकों में से सबसे उच्च throughput उद्देश्यों के लिए उत्तरदायी होते हैं, उनमें से प्रत्येक के कुछ निहित सीमाओं है कि उन्हें आदर्श से कम प्रस्तुत करना से ग्रस्त है। सर्वेक्षक, या T7E1, परख, जो डीएनए में बेमेल का पता लगाता है डुप्लेक्स 10, wildtype कोशिकाओं और समयुग्मक उत्परिवर्ती (दो हूबहू उत्परिवर्तित जेनेटिक तत्व के साथ क्लोन) तथ्य यह है कि इन दोनों क्लोन बेमेल 11 से रहित डुप्लेक्स उपज के कारण के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं है। प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) परख, जो CRISPR लक्ष्य क्षेत्र 17 में INDEL परिवर्तन की वजह से प्रतिबंध साइटों के लापता होने की रिपोर्ट है, लक्ष्य क्षेत्र 18 में उपयुक्त प्रतिबंध साइटों की उपलब्धता द्वारा सीमित है। डीएनए पिघलने विश्लेषण तकनीक है, जो उनकी पिघलने घटता 19 के आधार पर अलग अलग जीनोटाइप discerns, 20, स्थिरता की कमी से ग्रस्त है। इसके अलावा, इन तरीकों में से सभी तीन में है कि वे आनुवंशिक अनुक्रम में एक frameshift की घटना की रिपोर्ट नहीं देते विशेष रूप से जानकारीपूर्ण नहीं हैं। इसके विपरीत, सेंगर अनुक्रमण - जो वर्तमान में सबसे लोकप्रिय जीनोटाइपिंग तकनीक है - अत्यंत जानकारीपूर्ण है, क्योंकि यह जीनोमिक क्षेत्र का सही अनुक्रम को प्रदान करता है निशाना बनाया जा रहा। हालांकि, इस तकनीक महंगा है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर प्रयोगों में। इस प्रकार, फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन यहाँ वर्णित तकनीक के लक्षण वर्णन है क्योंकि यह सब ऊपर बताई गई सीमाएं अन्य तकनीकों को पेश आ रही दरकिनार कर सकते हैं महत्वपूर्ण है।

फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक उन सभी संभव जीनोटाइप एक क्लोन में wildtype मौजूद हो सकता है के बीच अंतर करने में सक्षम बनाता है, विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती, समयुग्मक उत्परिवर्ती (एक wildtype एलील और एक उत्परिवर्ती एलील की विशेषता) (दो अध्यक्ष की विशेषताiCal उत्परिवर्ती जेनेटिक तत्व), और यौगिक विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती (दो असमान उत्परिवर्ती जेनेटिक तत्व की विशेषता)। इन जीनोटाइप आसानी से electropherogram में शिखर पैटर्न द्वारा जो विभेदक हैं। इसके अलावा, इस जीनोटाइपिंग तकनीक wildtype amplicon का टुकड़ा आकार और है कि लक्षित क्लोन के बीच के अंतर को रिपोर्ट करता है और एक एकल आधार जोड़ी के लिए सटीक है। यह प्रभावी रूप से उपस्थिति या आनुवंशिक अनुक्रम में एक frameshift के अभाव की रिपोर्ट, उपयोगकर्ताओं को केवल क्लोन के एक मुट्ठी भर के लिए उनके सत्यापन कम करने के लिए, उन्हें समय और लागत की बचत की इजाजत दी। उस के शीर्ष पर, इस तकनीक को लक्षित करने (यानी, यह समवर्ती एक लक्ष्य से अधिक जीनोटाइप कर सकते हैं) जीन की बहुसंकेतन के लिए अनुमति देता है, और यह असामान्य शिखर पैटर्न की उपस्थिति (जैसे, उपस्थिति से एक विषम सेल आबादी का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है द्विगुणित कोशिकाओं के electropherogram में तीन या अधिक चोटियों) के। सेल यहाँ और पहले 12 इस्तेमाल किया लाइनों के अलावा </ sup>, 13, हम भी सफलतापूर्वक विभिन्न अन्य मानव और गैर मानव कोशिका लाइनों, genotyped है स्टेम कोशिकाओं और neuronal कोशिकाओं (अप्रकाशित डेटा) सहित, फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग कर, और हम आशा करते हैं कि इस तकनीक लागू होता है किसी भी कोशिकाओं है कि CRISPR / Cas9 लक्ष्य-निर्धारण के लिए उत्तरदायी होते हैं। इसके अलावा, के बाद से इस तकनीक सेल में अलग-अलग युग्मविकल्पियों के जीनोटाइप रिपोर्ट करती है, यह इस तरह कैंसर की कोशिकाओं को aneuploidy या आनुवंशिक amplifications है कि के रूप में बहु allelic कोशिकाओं, जीनोटाइपिंग में अत्यंत उपयोगी है।

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित CRISPR / Cas9-लक्षित क्लोन की बहुमुखी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जीनोटाइपिंग के लिए अनुकूलित किया गया है (सभी सामग्री का इस्तेमाल किया सहित)। फिर भी, कुछ भागों है कि संशोधन वारंट हैं। वे शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं:) एक अलग sgRNA अभिव्यक्ति वेक्टर के 1) उपयोग (या क्लोनिंग रणनीति है, जो एक अलग चयन रणनीति के उपयोग की जरूरत हो सकती है(जैसे, FACS के बजाय क्लोन की एंटीबायोटिक चयन); 2) फ्लोरोसेंट पीसीआर कदम के लिए एक अलग पोलीमर्स का उपयोग; और 3) विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग किया। इसके अलावा, यह है कि प्रोटोकॉल में आवश्यक कदम के एक जोड़े समस्याग्रस्त साबित हो सकता है ध्यान देने योग्य है। एक के लिए, फ्लोरोसेंट पीसीआर amplicons agarose जेल electropherogram में unspecific बैंड उपज सकता है, या केशिका जेल electropherogram में शिखर पैटर्न हो सकता है "शोर।" यह पीसीआर प्राइमरों के उप इष्टतम गुणवत्ता के कारण होने की संभावना है और इसलिए इन प्राइमरों फिर से डिजाइन द्वारा सुधारा जा सकता है। हम फ्लोरोफोरे लेबल वाले खरीद स्थिरता, reproducibility और प्रवर्धन कदम की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए करने से पहले लेबल हटाया गया ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स का उपयोग कर प्राइमरों की गुणवत्ता जांच करने की अनुशंसा। अन्य महत्वपूर्ण कारक नोट करने के लिए CRISPR गाइड शाही सेना है, जो सच सकारात्मक नॉकआउट क्लोन प्राप्त करने की दर निर्धारित कर सकते हैं की कार्यकुशलता है। sgRNA खोज prog में से कोई भी के बाद सेतोड़ने का कल कि वर्तमान में उपलब्ध हैं सरल कर रहे हैं, प्रत्येक व्यक्ति sgRNA की प्रभावकारिता केवल अनुभव निर्धारित किया जा सकता। इस प्रकार, यह डिजाइन और प्रत्येक लक्षित जीन के लिए एक से अधिक sgRNA (अधिमानतः तीन या अधिक) का उपयोग एक सफल नॉकआउट क्लोन प्राप्त नहीं की संभावना को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

जबकि फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक, सूचनात्मक संवेदनशील, और प्रयोग करने में आसान है, यह कुछ कैविएट्स के साथ आता है। सबसे पहले, इस तकनीक का एक आनुवंशिक विश्लेषक, जो आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है के उपयोग की आवश्यकता है। हालांकि, बाद से आनुवंशिक इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल विश्लेषक वही सेंगर अनुक्रमण प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है, केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटोकॉल मौजूदा सेंगर अनुक्रमण सेवा प्रदाताओं को आउटसोर्स किया जा सकता है। वास्तव में, हम पहले से हमारे अनुक्रमण सेवा प्रदाता लागत जब घर में किया करने के लिए तुलनीय पर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के साथ व्यवस्था की है। दूसरा, techniq की सटीकताue पीड़ित जब INDEL म्यूटेशन अब 30 से बीपी शामिल कर रहे हैं हो सकता है। हमारे अनुभव में, फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक indels का आकार कम करने के लिए जब बड़े indels (> 30 बीपी) मनाया जाता है जाता है। हालांकि, हमारे अनुभव में, उत्परिवर्ती की एक विशाल बहुमत से प्रदर्शित बहुत ही कम INDEL उत्परिवर्तन लंबाई (सबसे कम से कम 5 बीपी हैं)। बहरहाल, इस CRISPR लक्ष्य साइट और सेल लाइन का इस्तेमाल किया पर बहुत निर्भर है। तीसरा, फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक CRISPR / Cas9 कटौती स्थल पर NHEJ मरम्मत पर आधार प्रतिस्थापन पता लगाने में सक्षम नहीं है। फिर भी, यह सूचना दी गई है कि दोहरे धागे टूट जाता है की NHEJ मरम्मत की वजह से आधार प्रतिस्थापन एक दुर्लभ घटना 21 है, और वे deleteriously जीन के पढ़ने के फ्रेम परिवर्तित न करें। चौथा, यह तकनीक केवल लक्ष्य क्षेत्र फ्लोरोसेंट पीसीआर कदम में परिलक्षित में परिवर्तन का पता लगाता है और इस प्रकार किसी भी ऑफ-टारगेट aberrations रिपोर्ट नहीं करता (आनुवंशिक परिवर्तन कहांप्रवर्धित क्षेत्र tside)। व्यक्तिगत CRISPR sgRNA की ऑफ-टारगेट प्रभाव के इस तरह के एक व्यापक सर्वेक्षण की आवश्यकता है, हम पूरे जीनोम अनुक्रमण सही ढंग से लक्षित क्लोन के जीनोम में किसी भी परिवर्तन का पता लगाने के लिए सलाह देते हैं। बहरहाल, यह नहीं बल्कि महंगा प्रयोग यदि एक से अधिक sgRNA, जैसा कि ऊपर चर्चा लक्षित जीन प्रति प्रयोग किया जाता है आवश्यक नहीं है। अंतिम, फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक यहाँ वर्णित 600 बीपी का एक टुकड़ा आकार सीमा होती है। यह एक समस्या पैदा हो सकता है अगर लक्ष्य क्षेत्र दोहराया दृश्यों के होते हैं या असाधारण उच्च गुआनिन-साइटोसिन (जीसी) सामग्री है, जो पीसीआर प्रवर्धन दक्षता और विशिष्टता को प्रभावित कर सकता है। यह आसानी से रोके समस्या सावधान sgRNA लक्ष्य डिजाइन के महत्व है, जो लक्षित क्षेत्र के उचित प्रवर्धन के लिए उचित विचार को शामिल करना चाहिए पर जोर दिया। इस प्रकार, शक्तियों और फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक की चेतावनियां, जीनोटाइपिंग के इस सतही विधि पर विचारनॉकआउट क्लोन की उच्च मात्रा जीनोटाइपिंग, जो आज भी एक अड़चन बनी हुई है के बोझ को कम कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

लेखकों केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन प्रयोगों के साथ मदद करने के लिए सुश्री टैन शि मिन, सुश्री हेलेन ओंग, और डॉ झाओ यी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम NMRC / IRG द्वारा समर्थित किया गया NMRC / 1314/2011 और MOE AcRF टीयर 2 कोष अनुदान MOE2011-T2-1-051 अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPG2 cells ATCC HB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific SH30022.01
HyClone Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid Addgene PX458
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific 15400054
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
HyClone Water, Molecular Biology Grade GE Healthcare SH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) AITbiotech None Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'
CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) AITbiotech None Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
Unlabeled PCR amplification forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
HEX-labeled fluorescent PCR forward primer AITbiotech None Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
Unlabeled PCR reverse primer AITbiotech None Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'
Taq PCR Core Kit QIAGEN 201223
Hi-Di Formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard Thermo Fisher Scientific 4322682
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific 4306737
3500xL Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405633
3500 Series 2 program Thermo Fisher Scientific 4476988
Gene Mapper 5 program Thermo Fisher Scientific 4475073
Gentra Puregene Cell Kit QIAGEN 1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
NAP1L1 Antibody (N-term) Abgent AP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] GeneTex GTX70220
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 515-035-003

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References

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जेनेटिक्स अंक 122 जीनोम संपादन नॉकआउट प्रविष्टि / विलोपन उत्परिवर्तन उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रत्यक्ष lysis multiplexable
एक उच्च throughput प्रारूप में / Cas9 की मध्यस्थता नॉकआउट म्यूटेंट CRISPR जीनोटाइप के लिए एक फ्लोरोसेंट पीसीआर केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन तकनीक का उपयोग करते हुए
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Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A.… More

Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M. S., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. J. Vis. Exp. (122), e55586, doi:10.3791/55586 (2017).

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