Summary
Genotypebestemmelse teknikken beskrevet her, som kobler fluorescerende polymerasekædereaktion (PCR) til kapillær gelelektroforese muliggør high-throughput genotyping af nuklease-medieret knockout kloner. Den omgår begrænsninger af andre genotypebestemmelsesteknikker står og er mere omkostningseffektive end sekventeringsfremgangsmåder.
Abstract
Udviklingen af programmerbare genom-redigeringsværktøjer har lettet anvendelsen af revers genetik til at forstå de roller specifikke genomiske sekvenser spiller i cellernes funktion og hele organismer. Denne årsag er blevet voldsomt hjulpet på vej af den nylige indførelse af CRISPR / Cas9 systemet et alsidigt værktøj, der giver forskerne at manipulere genomet og transkriptom for at blandt andet, knock out, banke ned, eller banke i gener i en målrettet måde. Med henblik på at udskære et gen, CRISPR / Cas9-medieret dobbeltstrengede brud rekruttere det ikke-homolog endesammenbinding DNA-reparationsvej at indføre rammeforskydningssignalsekvensen-forårsager insertion eller deletion af nukleotider ved pausen site. Dog kan en privat guide RNA forårsage uønskede off-target effekter, og at udelukke disse ud, anvendelsen af flere guide RNA'er er nødvendig. Denne mangfoldighed af mål betyder også, at en screening af kloner med høj volumen er påkrævet, hvilket igen giver anledning til at anvende en efstrækkelig højt gennemløb teknik til genotype knockout kloner. Aktuelle genotypebestemmelsesteknikker enten lider af iboende begrænsninger eller pådrage sig høje omkostninger, dermed gør dem uegnede til high-throughput formål. Her, vi detaljeret protokol for anvendelse af fluorescerende PCR, som anvender genomisk DNA fra råt cellelysat som skabelon, og derefter løse PCR-fragmenterne via kapillær gelelektroforese. Denne teknik er nøjagtig nok til at skelne et basepar forskel mellem fragmenter og dermed er tilstrækkelig i indikerer tilstedeværelse eller fravær af et rammeskift i den kodende sekvens af det målrettede gen. Denne præcise viden effektivt udelukker behovet for en bekræftende sekventering skridt og giver brugerne mulighed for at spare tid og omkostninger i processen. Endvidere er denne teknik vist sig at være alsidig i genotypebestemmelse forskellige pattedyrceller af forskellige vævsoprindeise målrettet ved hjælp af styrestænger RNA'er mod talrige gener, som vist her og andre steder.
Introduction
Reverse genetiske tilgange har tilladt forskerne at belyse virkningerne af specifikke ændringer i genomet på cellen eller hele organismen. For eksempel kan ekspressionen af et bestemt gen svækkes ved gen knockdown 1, 2 (delvis reduktion) eller gen-knockout 3, 4 (komplet ablation) for at bestemme den virkning, dette har på funktionen af cellen eller på udvikling af organismen.
Gen-knockout eksperimenter er blevet lettere siden indførelsen af sekvensspecifikke programmerbare nukleaser, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkriptions- aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens). Men den relativt nylige karakterisering af de grupperede regelmæssigt afbrudt kort palindrom gentagelse (CRISPR) / Cas9 system har gjort det ekstremt nemt for alle laboratorier rundt om i verden for at udføre gene knockout eksperimenter. I det væsentlige, CRISPR / Cas9 systemet består af to væsentlige komponenter-en enkelt guide RNA (sgRNA), som genkender og binder via basen komplementaritet til en specifik sekvens i genomet, og en endonuklease kaldet Cas9. Eftervirkningerne af specifik binding og virkningen af sgRNA-Cas9 kompleks på genomisk DNA er dobbeltstrenget spaltning af DNA. Dette igen, udløser DNA beskadigelse respons mekanisme i cellen, som efterfølgende repareret via ikke-homologe endesammenslutning (NHEJ) eller homolog rekombination (HR) veje. Da NHEJ reparationsmekanisme (men ikke HR-mekanismen) resulterer ofte i vilkårlig insertion eller deletion af nukleotider på stedet for reparation, hvilket resulterer i insertion / deletion (InDel) mutationer, kan det forårsage læserammen for et exon at flytte. Dette kan resultere i knockout af genet grund af for tidlig terminering af translation og nonsense-medieret henfald 5, 6,7.
Trods den bekvemmelighed gav ved indføring af CRISPR / Cas9 system udskære et gen, genotypebestemmelse af kloner af målrettede celler er stadig en flaskehals, især i en høj kapacitet indstilling 8, 9. Eksisterende teknikker enten lider store iboende begrænsninger eller er økonomisk bekostelige. For eksempel SURVEYOR eller T7E1 assay, som er et enzymatisk assay, der påviser fejlparringer i DNA-duplekser 10, er ikke i stand til at skelne mellem vildtype kloner og homozygote mutanter (kloner, hvis alleler er muterede identisk), da disse kloner har identiske alleler og dermed ikke udgør fejlparringer i deres DNA-sekvens 11. Hertil kommer, at anvendelsen af Sanger-sekventering, hvilket betragtes som den gyldne standard i genotypebestemmelse af mutante kloner, i en high-throughput setup er uønsket på grund af dets høje omkostninger. Her præsenteres en itailed protokol af det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik, som kan omgå begrænsningerne ved de øvrige eksisterende genotypebestemmelsesteknikker og er særlig nyttig ved udførelse af en high-throughput screen for nuklease-medieret knockout kloner. Denne metode er teknisk enkel at udføre og sparer tid og omkostninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opnåelse CRISPR / Cas9 målrettede Single-cellekloner
- Frø HEPG2-celler på en plade med 6 brønde ved 500.000 celler per brønd i 2 ml af antibiotikum-frit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Transficere celler med plasmid coudtrykker Cas9 og specifik sgRNA mod genet af interesse ved anvendelse af en passende transfektionsreagens i henhold til fabrikantens anvisninger.
BEMÆRK: For eksempel sgRNA kan klones ind i pSpCas9 (BB) -2A-GFP-vektoren, som tidligere 4 beskrevet. - Erstatte dyrkningsmediet 4 - 16 timer efter transfektion med 2 ml frisk antibiotikum-frit medium.
- Ca. 48 timer efter transfektion, indsamle enkeltcellesuspension ved trypsinbehandling af cellerne.
- Trypsinisér cellerne i 0,2 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter. Tilsæt 1 ml medium og opblande thoroughly.
- Sortere celler til GFP-positive kloner, som tidligere beskrevet 12, og indsamle omkring 3.500 celler.
- Plade GFP-positive sorterede celler på 10 cm skåle ved 500, 1.000 og 2.000 celler pr skål i 8 ml penicillin / streptomycin-suppleret dyrkningsmedium. Inkubere cellerne ved 37 ° C og 5% CO2.
- Opretholde cellerne ved 37 ° C og 5% CO2, udskiftning af medium hver fem dage, indtil de vokser til enkeltstrenget cellekolonier store nok til at være synlige for det blotte øje. For de fleste kræft cellelinjer, tager dette omkring to uger fra dagen for plating.
- Når kolonierne har en passende størrelse (dvs. synlige for det blotte øje), overføre individuelle kolonier til brønde i en 96-brønds dyrkningsplade indeholdt 200 pi DMEM suppleret med 10% FBS.
- Aspirere enkelt-cellekolonier under anvendelse af en 200-pi pipette med et lille volumen af medium. Resuspender cellerne grundigt i iankringer brønde ved triturering flere gange.
- Opretholde cellerne ved 37 ° C og 5% CO2, udskiftning af medium hver fem dage, indtil de når op på 50 - 90% konfluens. For de fleste cancercellelinier, tager dette ca. 24 - 48 h.
2. Udtræk Rå Genomisk DNA anvendelse af en direkte Lysis Metode
- Når cellerne når op på 50 - 90% konfluens, fjerne så meget af dyrkningsmediet fra brøndene som muligt under anvendelse af multi-kanal vakuumsugning eller en multi-kanal pipette.
- 25 pi 0,05% trypsin-EDTA (uden phenolrødt) i hver brønd og inkuber ved 37 ° C i 7 min.
- Resuspender de trypsiniserede celler grundigt ved pipettering op og ned flere gange. Tjek cellerne under et mikroskop for at sikre, at de er løsrevet fra plasten overflade.
- Skabe en gengivelse af de individuelle kloner ved at overføre ca. 5 pi af enkeltcelle-suspension til en tom 96 brønde kultur plate. Tilsæt 200 pi dyrkningsmedium til hver brønd og vedligeholde cellerne indtil positive kloner identificeres ved anvendelse af fluorescerende PCR-kapillær-gelelektroforese (se nedenfor). Serielt udvide cellerne til 10-cm skåle eller enhver anden skala af valg (se afsnit 7).
- Tilsæt 5 pi af enkeltcelle-suspension fra trin 2.3 til 10 pi hjemmelavet direkte lyserer buffer (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS og 0,3% Tween-20) 12 i en 96-brønds PCR-plade og bland grundigt ved pipettering op og ned flere gange. Centrifuge kortvarigt (at bringe væsken ned til bunden af brøndene).
- Tilsæt 200 pi dyrkningsmedium til den resterende ~ 15 pi cellesuspension fra trin 2.3 og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 sammen med replikat fra trin 2.4.
- Underkaste lysater fra trin 2.5 til følgende termisk cykling program for at sikre fuldstændig lyse af cellerne og frigivelse af genomisk DNA: 65 ° C i 30 s, 8 ° C i 30 s, 65 ° C i 1,5 min, 97 ° C i 3 minutter, 8 ° C i 1 minut, 65 ° C i 3 minutter, 97 ° C i 1 minut, 65 ° C i 1 min og 80 ° C i 10 min. Centrifuger kort på lysater.
- Fortynd lysaterne ved tilsætning af 40 pi nuclease-frit vand og blandes grundigt med en vortex-blander. Centrifuge kortvarigt. De fortyndede lysater kan anvendes straks eller opbevares ved -20 ° C i flere måneder uden betydeligt tab af kvalitet.
3. Udførelse Fluorescerende PCR til amplifikation CRISPR / Cas9 målregioner
- Design to fluorofor-mærkede fremad primere (begge mærket ved 5'-enden) for hver CRISPR / Cas9 målområdet; skæring websteder, der er længere end 300 bp fra hinanden bør betragtes som to separate målregioner (fx grøn fluorofor-mærket primer for målrettede vildtype kontrol og blå fluorofor-mærket primer for CRISPR / Cas9-målrettede kloner, se tabel af materia ls).
- Skaffe disse mærkede fremad primere og en umærket reverse primer overensstemmelse hermed. Bemærk at primerne kan designes under anvendelse af et værktøj af valg og at amplikonerne skal være 200 - 500 bp lang.
- Udføre PCR som tidligere 12 beskrevet til amplifikation målregioner under anvendelse af de mærkede primere.
- Bruge 3 pi af de fortyndede lysater fra trin 2,8 i en 20-pi reaktion (se tabel 1) og den følgende termisk cykling program: 94 ° C i 10 minutter (1 cyklus); 94 ° C i 10 s, 64 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 min (4 cyklusser); 94 ° C i 10 s, 61 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 min (4 cyklusser); 94 ° C i 10 s, 58 ° C i 30 s, 68 ° C i 1 min (4 cyklusser); 94 ° C i 10 s, 55 ° C i 30 s og 68 ° C i 1 minut (35 cykler).
- Løse 5 pi af PCR-amplikoner på en 1% agarosegel for at kontrollere for størrelse og relative mængde af amplikonerss = "xref"> 12.
BEMÆRK: Udførelse af dette trin for alle prøverne tilskyndes, men ikke nødvendigt; løse et udvalgt antal prøver er tilstrækkeligt til at anslå mængden af amplikoner er til stede i prøverne i almindelighed.
4. Forberedelse Prøver til kapillargelelektroforese
- Fortynd amplikoner af vildtype (ikke-målrettede parentale celler) og CRISPR / Cas9 målrettet DNA i nukleasefrit vand til ca. 2,5 ng / pl. Sørg for at fortynde nok vildtype DNA-prøve, hvormed hvert målrettet DNA-prøve (et minimum på 0,5 pi fortyndet vildtype prøve pr målrettet prøve er påkrævet).
- Bland den fortyndede vildtype og målrettet DNA-prøver i lige forhold (fx bland 1 pi vildtype prøve med 1 pi målrettet prøve).
- Tilsæt 1 pi af de blandede amplikoner til 8,7 pi deioniseret formamid og 0,3 pi farvestofmærket størrelse standard i en 96-brønds PCR-plade, der er kompatibel med den genetiske enalyzer.
BEMÆRK: Brugen af en mester blanding af formamid og størrelsen standard (dvs. et præparat af en forblanding af formamid og størrelsen standard i en 29: 1 ratio før tilsætning af amplikoner at sikre standardiserede mængder) anbefales. - Stramt forsegle pladen og opvarme prøverne ved 95 ° C i 3 minutter under anvendelse af en PCR thermocycler.
- Pladen anbringes på is umiddelbart efter opvarmningstrinnet og inkuberes i mindst 3 min.
5. Udførelse kapillargelelektroforese på en Genetic Analyzer
- Nedsat assayparametre, instrument protokol og størrelse-ringer protokol om kapillargelelektroforese software forbundet med en genetisk analysator.
BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt for første elektroforese løb; programmet kan gemmes til senere brug. For efterfølgende kørsler, gå direkte til trin 5.2.- Klik på "Opret ny plade" ikonet på softwaren instrumentbrættet.
- Giv run en dummy navn, og vælg følgende indstillinger: Antallet af brønde, 96; Plade type, Fragment; Kapillær Længde, 50 cm; og Polymer, POP7. Klik på knappen "Tildel Plate indhold".
- Under "Analyser," klik "Opret ny Assay"; et nyt panel vises.
- Navngiv analysen "FPCR-CGE-analyse", og kontrollér, at "Application Type" er indstillet korrekt som "Fragment".
- Opsæt instrument protokol ved at klikke på knappen "Opret ny" under "Instrument-protokollen."
- Indstil eller vælg følgende indstillinger og parametre i de relevante områder: Anvendelse Type, Fragment; Kapillær Længde, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Kør modul, FragmentAnalysis; Protokol navn, FPCR-CGE Instrument protokollen; Ovn Temperatur, 60 ° C; Køre Spænding, 19,5 kV; Forkørt Spænding, 15 kV; Injektion Spænding, 1,6 kV; Run Time, 1.330 s; Forkørt Time, 180 s; Injektion Tid, 15 s; og Data Delay, 1 s.
- click på "Anvend på Assay" knappen og derefter på "Gem til bibliotek" knappen for at gemme programmet. Luk panelet til at fortsætte.
- Opsæt en størrelse-kald protokol ved at klikke på knappen "Opret ny" under "Sizecalling-protokollen."
- Indstil eller vælg følgende indstillinger og parametre i de relevante områder: protokol navn, FPCR-CGE Sizecalling protokollen; Størrelse standard, GS500 (-250) LIZ; Størrelse-opkalds, SizeCaller v1.1.0; Analyse Indstillinger -; Analyse Range, Full; Dimensionering Range, Full; Størrelse Opkald Metode, Lokalt sydlige; Primer Peak, Present; Blå, grøn, orange Kanaler, (Check); Mindste Peak Højde, 175 for alle kanaler; Brug Smoothing, Ingen; Brug baselining (Baseline Window (PTS)), (Check) 51; Minimum Peak halvbredde, 2; Peak Window Size, 15; Polynomial kurser, 3; Slope Threshold Peak Start, 0,0; Slope Threshold Peak End, 0,0; QC-indstillinger -; Størrelse Kvalitet, -; Fail hvis værdi er <0,25; Pass hvis værdi er <0,75; Antag Linearitet fra 0 bp til 800 bp; og aktivering af Pull-Up flag, hvis Pull-Up Ratio ≤ 0,1 og Pull-Up Scan ≤ 1.
- Klik på "Anvend på Assay" knappen og derefter på "Gem til bibliotek" knappen for at gemme programmet. Luk panelet til at fortsætte.
- Sørg for, at analysen er gemt, ved at klikke på knappen "Gem til bibliotek" en gang mere og forlade panelet ved at klikke på "Luk" knappen.
- Tilbage på "Tildel Plate Indhold" skal du klikke på linket "Opret nyt filnavn konventionen" under "File Name konventionerne."
- Navngiv programmet "FPCR-CGE filnavn."
- Under "Tilgængelige attributter," vælg de ønskede egenskaber, der vises i filnavnet (såsom "Dato for Run", "Time of Run", "Nå Stilling," og "Sample Name"). Vælg den ønskede fil sted, hvor resultatet af kørslen vil blive gemt.
- Klik på knappen "Anvend på Assay" og derefter"Gem til bibliotek" knappen for at gemme programmet. Luk panelet til at fortsætte.
- Tilbage på "Tildel Plate Indhold" skal du klikke på "Opret ny Results Group" linket under "Resultater Grupper."
- Navngiv programmet "FPCR-CGE Resultater Grupper."
- Under "Tilgængelige attributter," vælg de ønskede egenskaber, der vises i filnavnet (såsom "Assay Name"). Vælg den ønskede fil sted, hvor resultatet af kørslen vil blive gemt.
- Klik på "Anvend på Assay" knappen og derefter på "Gem til bibliotek" knappen for at gemme programmet. Luk panelet til at fortsætte.
- Opsætning af programmet for en elektroforese køre ved at følge nedenstående trin.
- Gå til betjeningspanelet, og klik på "Opret ny plade" ikonet.
- Navngiv køre som ønsket (for nem reference, omfatter den dato, cellelinje, og gen-navn). Vælg mellem følgende muligheder: Antal brønde, 96; Plade type, Fragment; Kapillær Længde, 50 cm; og Polymer, POP7. Klik på knappen "Tildel Plate indhold".
- Mærke hver brønd af prøven som ønsket (for eksempel en prøve kan navngives "NC" for at angive, at brønden er en negativ kontrol).
- Under "Analyser," "File Name konventionerne," og "Resultater Grupper" bokse, klik på "linket Tilføj fra bibliotek" og vælge de programmer skabt i trin 5.1.3 til 5.1.17.
- Fremhæv alle de brønde, der skal analyseres og vælg de relevante programmer under "Analyser", "File Name konventionerne," og "Resultater grupper" ved at markere afkrydsningsfelterne ved siden af dem.
- Før indlæsning af pladen på bakken af den genetiske analysator, anvende gummilisten på plade med 96 brønde og sætte den forseglede plade i plast, der kommer med den genetiske analysator.
- Tryk på knappen "Bakke" på forsiden af den genetiske analysator, og når bakken rehovedpine forsiden af udstyret, åbne døren og læg indkapslet plade på bakken. Sikre, at pladen er låst på plads og derefter lukke døren.
- Klik på "Link Plade til Kør" knappen.
- I "Load Plader til Kør" side, gør en sidste kontrol for at sikre, at alle reagenser og betingelser er korrekte og i orden.
- Klik på knappen "Start Kør". Hver kørsel af 24 prøver (de første 3x8 brønde af 96-brønds plade) tager mindre end 55 minutter at færdiggøre.
6. Analyse af elektroferogrammet at Bestem basepar Forskelle
- Når kapillargelelektroforese er fuldført, åbnes analyse software til at analysere resultaterne.
- Klik på "Tilføj Prøver til projekt" ikonet og søge efter den mappe, der indeholder de køre filer. Recall fra trin 5.1.12 den tildelte placering af resultaterne filer.
- Vælg alle resultaterne filer af hver injektion i den færdige løb og click på "Tilføj til liste" -knappen; navnene på disse filer begynder med "Inj" og indeholder detaljerne i løb.
- Klik på knappen "Tilføj og Analyze" for at fortsætte med analysen.
- Vælg alle prøverne i tiden ved at klikke på den første prøve og trække markøren ned til den sidste prøve, og klik derefter på "Display Plots" ikonet.
- For at kontrollere kvaliteten af den størrelse standard, skal du åbne den orange kanal af resultaterne ved at kontrollere orange ikon og fjerne markeringen resten af de farvede ikoner; dette er vigtigt at sikre, at størrelsen-kald er nøjagtig og pålidelig.
- At se toppene for fragmenterne afledt af ikke-målrettede kontrol og de målrettede kloner, kontrollere de blå og grønne ikoner til at åbne aflæsninger fra disse kanaler.
- Placer markøren over den vandrette akse i første resultater plot og højreklik for at vælge "Fuld visning." Rul ned for at se alle resultaterne på et øjeblik til at bestemmehvis der er nogen større problemer med kørslen. For at zoome ind på et bestemt område af værdier, skal du højreklikke med musen på den relevante akse af plottet, vælg "Zoom til ...", og nøglen i intervallet af værdier af interesse.
BEMÆRK: Et potentielt stort problem, at alle prøverne giver toppe lav intensitet. Dette er normalt på grund af langvarig opbevaring af fluorofor-mærkede amplikoner forud for kapillærelektroforese løb eller over-fortynding af amplikoner, som let kan afhjælpes ved at gentage PCR-trinnet eller ved fortynding amplikonerne bruger lavere fortyndingsfaktor hhv. - For at gemme resultaterne, skal du følge trinene beskrevet nedenfor.
- Sørg for, at de blå og grønne kanaler er valgt, og klik på "Dimensionering tabel" ikonet.
- Gem tabel med værdier i tabulatorsepareret tekst (.txt) format ved at åbne "File" og vælge "Export Table". Navngiv filen i overensstemmelse hermed, og vælg den placering af valg-fil.
- Hvis du vil gemme plottets af kørslen i PDF-format, gå til "Filer" og klik på "Udskriv" valgmulighed. Vælg den relevante PDF-writer og tryk på "Udskriv". Navngiv filen i overensstemmelse hermed, og vælg den placering af valg-fil.
- Til at beregne forskellen i størrelsen af de fragmenter afledt målrettede vildtype kontrol og CRISPR / Cas9-målrettede kloner, følge de nedenfor beskrevne trin.
- Åbn tabulatorsepareret tekst (.txt) fra trin 6.9.2 med et regnearksprogram. Tabellen bør omfatte disse fire vigtige søjler: "Dye / Sample Peak" (hvilket indikerer en blå eller grøn kanal), "Sample File Name" (de første tegn indikerer brønden eller prøve navn), "Størrelse" (angivelse af størrelsen af den fragment kaldes), og "Højde" (med angivelse af fluorescensintensiteten af toppen).
- For at fremhæve relevante toppe, udelukke dem, der ikke i den forventede størrelse rækkevidde.
BEMÆRK: Typisk InDel mutationer sjældent resultere i mereend en 100-bp forskellen i størrelse; således bliver toppe, hvis størrelse afviger med mere end 100 bp fra vildtype kontrol top (dominerende top i den grønne kanal) de udstødte. Dette kan nemt gøres ved at bruge "Mellem" under "Betinget formatering" funktionen i regnearket. - For at fjerne ikke-specifikke toppe, som ikke kan skelnes fra baggrundsniveauet, bruge "Mindre end" under "Betinget formatering" funktion i regnearksprogram at udelukke toppe, hvis højder er lavere end 2.000 enheder. Denne cut-off værdi er blevet bestemt empirisk og kan derfor justeres, hvis anses for egnet.
- Beregne forskellen i fragmentstørrelse mellem hver af de resulterende toppe i den blå kanal (CRISPR / Cas9-målrettede kloner) og sålen top i den grønne kanal (ikke-målrettet vildtype kontrol) ved at subtrahere det sidstnævnte fra det tidligere.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge værdier for hver kapillær ElectrophorESIS prøve, da der kan være inter-sample forskelle i fragmentstørrelse på vildtype kontrol. - Afrunder værdier til nærmeste heltal at bestemme antallet af basepar, som er blevet indsat i eller slettet fra eventuelle den genomiske sekvens pågældende. Når udskære et gen af interesse, til at vælge kloner hvis Indel mutationer er ikke af multipla af 3 bp sikre, at der er rammeskift i den kodende sekvens.
7. Kontrol af Knockout status af kloner
- Expand individuelle knockout kloner fra 96-brønds plade (fra trin 2.4 og 2.6) til en plade med 24 brønde ved trypsinbehandling af cellerne under anvendelse af 25 pi 0,25% trypsin-EDTA og inkubering ved 37 ° C i 5 minutter.
- Tilføj 125 pi medium (DMEM suppleret med 10% FBS) til de trypsiniserede celler og resuspender grundigt.
- Overfør cellesuspensionen til 15 ml rør og centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern så meget af mediet som muligt ved hjælp vakuumsugning eller en pipette, resuspender cellepelleten i 500 pi medium, og overfør cellesuspensionen til en brønd i en plade med 24 brønde. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2, indtil cellerne når 80-90% konfluens.
- Udvide de individuelle kloner serielt fra 24-brønds plade til en plade med 6 brønde og fra 6-brønds plade til en 10 cm skål, når de op på 80 - 90% sammenløb ved gentagelse af trin 7.1 til 7.4, under anvendelse af følgende mængder: 50 pi af 0,25% trypsin-EDTA og 150 pi medium (til at ekspandere fra 24-brønds plade til plade med 6 brønde) og 200 pi 0,25% trypsin-EDTA og 1 ml medium (til at ekspandere fra 6- brønd plade til den 10-cm skål).
- Høste klonerne når de op på 80 - 90% sammenløb ved trypsinbehandling af cellerne med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter.
- Tilsæt 5 ml medium (DMEM suppleret med 10% FBS) til de trypsiniserede celler og resuspend grundigt.
- Overfør cellesuspensionen ligeligt i to 15-ml rør, centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, og fjern mediet så meget som muligt. En del af cellerne er for genomisk DNA-ekstraktion og den anden er for totalt protein ekstraktion.
- Til verifikation via Sanger sekventering følge trinene beskrevet nedenfor.
- Uddrag genomisk DNA fra klonerne som tidligere 12 beskrevet.
- Udføre PCR-amplifikation af området, der spænder over CRISPR / Cas9 målsted, som beskrevet i afsnit 3.2, men brug umærkede primere. Brug ikke mærkede primere til dette trin, som den fluorescens fra tag vil interferere med efterfølgende Sanger sekventering trin.
- Oprense amplikonerne anvendelse af en PCR oprydning kit, som tidligere 12 beskrevet.
- Sekventere oprensede amplikoner under anvendelse af PCR-primere anvendt i trin 7.9.2 at bestemme genotypen af klonerne, som beskrevet previously 12.
- Til verifikation via Western blot-analyse, udtrække totalt protein fra vildtypeceller og målrettede kloner, som tidligere 12 beskrevet.
- Udføre Western blot-analyse under anvendelse af passende antistoffer mod proteinet af målgenet, som tidligere 12 beskrevet; et sandt knockout klon er blottet for ekspressionen af proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknikken beskrevet her forventes at kunne anvendes på enhver målrettes region i genomet i stort set enhver cellelinie, som er modtagelig for fremmed DNA levering. Vi har tidligere vist sin ansøgning ved at målrette tre gener i en kolorektal cancer cellelinje 12. Her, viser vi dens virkningsfuldhed i genotypebestemmelse af en hepatocellulært carcinom cellelinie, HEPG2, målrettet med en CRISPR / Cas9 konstruktionen mod nukleosomet Assembly Protein 1 lide 1 (NAP1L1) gen. Faktisk har vi med succes anvendt det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik til genotype forskellige andre celler, herunder ikke-humane mammale cellelinier, rettet mod talrige andre gener 12, 13.
Eksperiment-Wise, det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese technique er nemt og hurtigt at udføre. Efter indførelsen af Cas9 og sgRNA ekspressionskonstruktioner ind i cellerne og udvælgelse af positive kloner, er de enkelte kloner lyseret direkte fra 96-brønds dyrkningsplade ved hjælp af vores hjemmelavede lysispuffer, Direkte Lyse Buffer 12. Det er vores erfaring, kan de resulterende lysater opbevares ved -20 ° C eller lavere i flere måneder uden betydeligt tab af genomisk DNA kvalitet. Lysistrinnet efterfølges af PCR-amplifikation trin, som indebærer produktion af fluorofor-mærkede amplikoner, der spænder CRISPR målområdet. Det fluorescerende PCR-protokollen billede er blevet optimeret til dette formål og har konsekvent produceret rigelig PCR-produkter, uanset den region, der amplificeres. Figur 1 viser et repræsentativt resultat af løsningen af amplikonerne afledt af fluorescerende PCR trin med hver bane svarer til en individuel CRISPR / Cas9 målrettet klon og de forskellige bands CORRESPonding til de amplificerede regioner af individuelle alleler i klonerne. Det er vores erfaring, brug af andre polymeraser og deres samtidige protokoller resulterede i en lavere amplikon udbytte. Selv om dette kan let afhjælpes ved at justere fortyndingsfaktoren under prøveforberedelsen til kapillargelelektroforese kan baggrunden eller støjniveauet følgelig være højere, når der anvendes amplikoner af lavere udbytte. Efter PCR-trinnet, er amplikonerne fortyndes, og de af vildtype-prøven og de målrettede kloner blandes i lige forhold, inden de sættes til deioniseret formamid buffer og en størrelse standard, denatureret, og opløst på en kapillær gel.
Efter afslutningen af den kapillære gelelektroforese de genotype resultater er klar til at blive analyseret. To vigtige sæt resultater er påkrævet fra elektroforese run: Elektroferogrammerne indeholdende toppene svarende til de individuelle fluorescenssignaler og the resultat tabel, der indeholder alle de nødvendige værdier for beregning. Figur 2 viser resultaterne for genotypebestemmelse af to kloner er omfattet af sgRNA mod NAP1L1 genet i HepG2-celler. De grønne toppe svarer til amplikonerne af ikke-målrettede vildtype allel i de parentale HEPG2-celler, hvorimod de blå toppe svarer til amplikoner af InDel mutationsbaserede indeholdende alleler af CRISPR / Cas9-målrettede kloner. Som det klart fremgår, de to kloner er homozygote mutanter (mutanter med identisk muterede alleler), med deletion af en og ti nukleotider på begge alleler. Det er vigtigt at bemærke, at elektropherogrammer anvendes kun visualiseringsformål, hvorimod spidsværdierne er vigtig ved bestemmelse af antallet af basepar-forskelle mellem amplikon af de målrettede kloner og den for vildtypeceller.
For at validere ægtheden af knockout status, anbefaler vi udførerSanger sekventering og Western blot-analyse for at bekræfte afskaffelsen af genekspression i cellerne. De to kloner identificeret ovenfor gav Sanger sekventeringsresultaterne overensstemmelse med de fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese resultater (figur 3A). De udviste også fuldstændig ablation af NAP1L1 proteinekspression (figur 3B), som forventes af knockout kloner.
Figur 1: PCR amplikoner af HEPG2 Kloner Målrettede ved CRISPR / Cas9 Against the NAP1L1 Gene. Amplikoner af fluorescerende PCR trin blev opløst på to separate agarosegeler (top og bund), og hver bane svarer til en individuel målrettet klon. L: DNA-stige (størrelserne af individuelle bånd er givet ved siden af diagrammet). Klik hendee for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Plots af fluorescenssignaler fra to prøver løst via kapillargelelektroforese. Den vandrette akse repræsenterer fragmentstørrelse og den lodrette akse repræsenterer fluorescenssignalet intensitet. De blå toppe svarer til fragmenter afledt CRISPR / Cas9-medierede målrettede kloner, mens de grønne toppe svarer til fragmenter afledt vildtypeceller. Magenta linier svarer til automatiske peak-ringer positioner, der bestemmes ved analyse software, som markerer positioner, konsekvent viser toppe tværs prøver. De ved siden af individuelle toppe værdier svarer til størrelserne af fragmenterne (i bp) og opnås fra analysesoftware. Værdierne i parentes skildrer den beregnede forskel i størrelse mellem de enkelte fromgments fra en målrettet klon og vildtype-fragmentet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Resultater af assays til Bekræft Knockout af det målrettede gen i to kloner. (A) Sanger sekventeringsresultaterne og (B) Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod den indikerede protein. Nukleotider blå repræsenterer sgRNA målsekvensen, til dem i rød repræsenterer protospacer tilstødende motiv (PAM), dem i brun repræsenterer base- substituerede nukleotider, og stregerne repræsenterer de positioner, hvor nukleotidet er slettet i allelen. Værdierne i parentes ved siden af de enkelte klon navne repræsenterer genotypen af allelerne af klon; "-1" og "-10" betyder, at allelerne indeholder en deletion af en og ti nukleotider, henholdsvis Omtrentlig størrelse af proteiner detekteret i Western blot-analyser:. ~ 54 kDa for NAP1L1 og ~ 84 kDa for p84 (belastningskontrol). Venligst klik her for et større udgave af dette tal.
| Reagens | Volumen for én reaktion (il) |
| Kit specifik løsning | 4 |
| 10x PCR-buffer | 2 |
| 10 uM forward primer (mærket) | 1 |
| 10 uM revers primer (umærket) | 1 |
| 25 mM dNTP-blanding | 0,4 |
| Taq DNA Polymerase | 0,2 |
| Vand | 8.4 |
| Fortyndet lysat | 3 |
| Total | 20 |
Tabel 1: Reagenser til Fluorescent PCR Reaction.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den banke ud af et specifikt gen i en model udvalgt cellelinje er blevet rutine til at belyse den rolle, som genet spiller i denne særlige cellulære kontekst. Faktisk flere genom-dækkende skærme er i øjeblikket tilgængelige, der bruger CRISPR / Cas9 system til at målrette næsten alle kendte humane gener i genomet 14, 15, 16. Med disse store skærme (eller endog mindre målestok målretning af individuelle gener), er det vigtigt at udforme og udnytte sgRNAs målrettet forskellige loci af det samme gen. Ensartede resultater på tværs af de forskellige sgRNAs anvendte ville utvetydigt kapitulere den sande effekt af udtømningen af genet. Som sådan ville målretning af et enkelt gen kræver en høj-volumen genotypebestemmelse trin til præcist genotypebestemmelse et væld af kloner fra hver af de individuelle sgRNA anvendes. Det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknikken beskrevet hanre kan præcist udføre denne opgave.
Mens de fleste af de eksisterende genotypebestemmelsesmetoder er modtagelige for high-throughput formål, hver af dem lider af visse iboende begrænsninger, der gør dem mindre end ideelt. Den SURVEYOR eller T7E1, assay som detekterer fejlparringer i DNA-duplekser 10, er ikke i stand til at skelne mellem vildtypeceller og homozygote mutanter (kloner med to identisk muterede alleler) på grund af det faktum, at begge disse kloner gav duplekser blottet for fejlparringer 11. Den restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP) analyse, som rapporterer forsvinden restriktionssteder grund InDel mutationer i CRISPR målområdet 17, er begrænset af tilgængeligheden af egnede restriktionssteder ved målområdet 18. DNA smeltende analyseteknik, som skelner de forskellige genotyper på grundlag af deres smeltekurver 19, 20, lider under en mangel på konsistens. Hertil kommer, alle tre af disse metoder er ikke særligt oplysende i, at de ikke rapporterer forekomsten af en læserammeforskydning i den genetiske sekvens. I modsætning hertil Sanger sekventering - som er i øjeblikket den mest populære genotypebestemmelse teknik - er yderst informativ, da det giver den nøjagtige sekvens af den genomiske region bliver målrettet. Denne teknik er kostbar, især i store eksperimenter. Således karakterisering af fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknikken beskrevet her er afgørende, fordi det kan omgå alle de begrænsninger ved de andre ovenfor beskrevne teknikker står over for.
Det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik gør det muligt for brugerne at skelne mellem alle mulige genotyper en klon kan eksistere i-vildtype, heterozygote mutante (karakteriseret ved en vildtype-allel og en mutant allel), homozygot mutant (karakteriseret ved to identgiske mutantalleler) og forbindelsen heterozygote mutante (karakteriseret ved to ikke-identiske mutantalleler). Disse genotyper er let differentiable af peak mønstre i elektroferogrammet. Desuden er denne genotypebestemmelse teknik rapporterer forskellen mellem fragmentstørrelse på vildtype amplikon og af de målrettede kloner og har en nøjagtighed på en enkelt basepar. Her rapporteres effektivt nærvær eller fravær af et rammeskift i den genetiske sekvens, således at brugerne kan reducere deres validering til kun en håndfuld af kloner, sparer tid og omkostninger. Oven i købet, denne teknik giver også mulighed for multipleksering af genmålretning (dvs. kan det samtidigt genotype mere end et mål), og det muliggør påvisning af en heterogen cellepopulation fra tilstedeværelsen af afvigende peak mønstre (fx tilstedeværelsen af tre eller flere toppe i elektroferogrammet af diploide celler). Ud over de anvendte cellelinjer her og tidligere 12 </ sup>, 13, har vi også med succes genotypet forskellige andre humane og ikke-humane cellelinjer, herunder stamceller og neuronale celler (upublicerede data), under anvendelse af fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik, og vi forventer, at denne teknik kan anvendes til eventuelle celler, der er modtagelige for CRISPR / Cas9 målretning. Da denne teknik rapporterer genotypen af individuelle alleler i cellen, er det ekstremt nyttige i genotypebestemmelse multi-allele celler, såsom cancerceller, der har aneuploidi eller genetiske amplifikationer.
Protokollen beskrevet her (herunder alle det anvendte materiale) er blevet optimeret til den alsidige og reproducerbar genotypebestemmelse af CRISPR / Cas9-målrettede kloner. Alligevel er der nogle dele, som berettiger modifikation. De omfatter, men er ikke begrænset til: 1) anvendelse af en anden sgRNA ekspressionsvektor (eller kloning strategi), hvilket kan kræve brug af en anden markering strategi(Fx antibiotisk selektion af kloner i stedet for FACS); 2) anvendelse af en anden polymerase for fluorescerende PCR trin; og 3) anvendelse af forskellige fluorescerende mærker. Desuden er det værd at bemærke, at et par væsentlige skridt i protokollen kan vise sig problematisk. For en, kan de fluorescerende PCR amplikonerne opnåelse uspecifikke bånd i agarosegelen elektroferogram, eller peak mønster i kapillarrøret gel elektroferogram kan være "støjende". Dette skyldes sandsynligvis sub-optimal kvalitet af PCR-primerne, og derfor kan afhjælpes ved re-designe disse primere. Det anbefales at teste kvaliteten af primerne under anvendelse af umærkede oligonukleotider før fremskaffelse fluoroforen-mærkede dem til at sikre sammenhæng, reproducerbarhed, og specificiteten af amplifikationen trin. Den anden vigtige faktor at bemærke er effektiviteten af CRISPR guide RNA, som kan bestemme hastigheden for at opnå sande positive knockout kloner. Da ingen af de sgRNA søgning progvæddere, der i øjeblikket er tilgængelige, er idiotsikker, effektiviteten af hver enkelt sgRNA kan kun bestemmes empirisk. Således er det vigtigt at udforme og anvender mere end én sgRNA (fortrinsvis tre eller flere) for hver målrettede gen at reducere risikoen for ikke at opnå en vellykket knockout klon.
Mens det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik er informativ, følsom og let at bruge, det kommer med nogle advarsler. Første kræver denne teknik anvendelse af en genetisk analysator, som ikke må være let tilgængelige. Eftersom den genetiske analysator anvendes til dette formål er den samme, der benyttes til Sanger sekventeringsforsøg, den kapillargelelektroforese protokol kan outsourcet til eksisterende Sanger sekventering tjenesteydere. Faktisk har vi tidligere arrangeret med vores sekventering tjenesteyderen at udføre kapillargelelektroforese protokol til en pris sammenlignelig med når færdig internt. For det andet, nøjagtighed Technique kan lide, når InDel mutationer længere end 30 bp er involveret. Det er vores erfaring, det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik tendens til at undervurdere størrelsen af indels når store indels (> 30 bp) er observeret. Men vores erfaring, et stort flertal af mutanter viste meget kort InDel mutation længder (de fleste er mindre end 5 bp). Ikke desto mindre er meget afhængig af CRISPR målstedet og anvendte cellelinje. Tredje, det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik er ikke i stand til at detektere basesubstitutioner upon NHEJ reparation på CRISPR / Cas9 kløvningspunkt. Ikke desto mindre er det blevet rapporteret, at basesubstitution som følge af NHEJ reparation af dobbeltstrengede brud er en sjælden begivenhed 21 og de ikke på skadelig ændre læserammen af genet. For det fjerde, denne teknik registrerer kun ændringer i målområdet forstærkes i den fluorescerende PCR skridt, og således ikke rapportere eventuelle off-target aberrationer (genetiske ændringer outside den amplificerede region). Hvis en sådan omfattende undersøgelse af de off-target effekter af individuelle CRISPR sgRNA er påkrævet, anbefaler vi hele genomet sekventering nøjagtigt at detektere eventuelle ændringer i genomet af de målrettede kloner. Men denne temmelig bekostelig eksperiment er ikke nødvendig, hvis der anvendes mere end én sgRNA pr målrettede gen, som beskrevet ovenfor. Sidste, det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknikken beskrevet her har en fragmentstørrelse grænse på 600 bp. Dette kan udgøre et problem, hvis målet region består af gentagne sekvenser eller har høj guanin-cytosin (GC) indhold undtagelsesvis, hvilket kan påvirke PCR-amplifikation effektivitet og specificitet. Dette let kan forebygges problem understreger vigtigheden af omhyggelig sgRNA target design, som skal omfatte behørig hensyntagen til passende forstærkning af den målrettede region. Således overvejer styrker og advarsler af det fluorescerende PCR-kapillargelelektroforese teknik, denne let metode til genotypebestemmelsekan lette byrden af højvolumen genotypebestemmelse af knockout-kloner, som stadig er en flaskehals til denne dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ms Tan Shi Min, Ms Helen Ong, og Dr. Zhao Yi for at hjælpe med kapillargelelektroforese eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af NMRC / IRG give NMRC / 1314/2011 og MOE AcRF Tier 2 Fondens tilskud MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
