Summary
ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。
Abstract
プログラマブル・ゲノム・編集ツールの開発は、特定のゲノム配列は、細胞および生物全体の機能に果たす役割を理解するための逆遺伝学の使用を容易にしました。この原因は、途方もなくCRISPR / Cas9システム - 研究者が対象で、他のもののうち、ノックアウト、するために、ゲノムやトランスクリプトームを操作ノックダウン、または遺伝子にノックすることを可能にする汎用性の高いツールの最近の導入によって助けられています方法。遺伝子をノックアウトするために、CRISPR / Cas9媒介二本鎖切断は、切れ目サイトでのヌクレオチドのフレームシフトの原因挿入または欠失を導入する非相同末端結合DNA修復経路を募集します。しかし、個々のガイドRNAは、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があり、これらを除外するために、複数のガイドRNAの使用が必要です。ターゲットのこの多様性はまた、今度はEFの使用を頼むれ、クローンの大量スクリーニングが必要であることを意味しノックアウトクローンの遺伝子型を決定するために、ハイスループット技術をficient。現在のジェノタイピング技術のいずれかは、それゆえ、高スループットのために、彼らは不適当、固有の限界に苦しむやコスト高を招きます。ここでは、詳細テンプレートとして粗細胞溶解物からのゲノムDNAを使用する蛍光PCRを用いて、次いで、キャピラリーゲル電気泳動によりPCRフラグメントを解決するためのプロトコル。この技術は、断片間に1つの塩基対の違いを区別するのに十分に正確であり、従って、標的遺伝子のコード配列におけるフレームシフトの有無を示すに十分です。この正確な知識を効果的に確認シーケンシング工程の必要性を排除し、ユーザーがプロセスに時間とコストを節約することができます。また、この技術は、ここで他の場所に示すように、多数の遺伝子に対するガイドRNAによって標的様々な組織起源の種々の哺乳動物細胞を遺伝子型決定に汎用性であることが証明されました。
Introduction
逆遺伝的アプローチは、科学者たちは、細胞または生物全体のゲノム中の特定の変化の影響を解明することができました。例えば、特定の遺伝子の発現は、これは、細胞の又は上の機能に及ぼす影響を決定するために、遺伝子ノックダウン1、2（部分的還元）または遺伝子ノックアウト3、4（完全切除）によって減衰させることができます生物の発生。
遺伝子ノックアウト実験は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの配列特異的プログラマブルヌクレアーゼ、の導入以来、より簡単になってきました。しかし、定期的にクラスタ化されたのは比較的最近の特徴付けは短い回文構造の繰り返し（CRISPR）を散在/ Cas9システムは、世代を実行するために、世界中のすべての実験室のためのそれは非常に簡単になりましたEノックアウト実験。本質的に、CRISPR / Cas9システムは、2つの必須成分、認識し、ゲノム中の特定の配列、及びCas9呼ばれるエンドヌクレアーゼに塩基相補性を介して結合する単一ガイドRNA（sgRNA）、から成ります。ゲノムDNA上のsgRNA-Cas9複合体の特異的結合および作用の余波は、DNAの二本鎖切断です。これは、今度は、その後の非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HR）経路を介して修復される細胞内のDNA損傷応答機構をトリガします。 NHEJ修復メカニズム（ただしHRメカニズム）は、多くの場合、挿入/欠失（インデル）の変異が生じ、修理の現場でのヌクレオチドのランダムな挿入または削除になりますので、それがシフトするエクソンの読み枠を引き起こす可能性があります。これは、その後、翻訳とナンセンス媒介崩壊5、6の早期終了に伴う遺伝子のノックアウトをもたらすことができます7。
遺伝子ノックアウトにCRISPR / Cas9システムの導入によって得られる利便性にもかかわらず、標的細胞のクローンの遺伝子型決定は、特に、8、9の設定ハイスループットで、ボトルネックのままです。主要な固有の制限を受けるか、財政的に高価であり、いずれかの既存の技術。これらのクローンは同一の対立遺伝子を有しているので、例えば、10の二重鎖DNA中のミスマッチを検出する酵素アッセイでSURVEYORまたはT7E1アッセイは、野生型クローンおよびホモ接合変異体（対立遺伝子同一に変異させるクローン）を区別することができないので、彼らのDNA配列11に不整合が存在しません。また、高スループットの設定で、変異体クローンの遺伝子型決定におけるゴールドスタンダードと考えられているサンガー法の使用は、その高いコストのために望ましくありません。ここでは、DETを提示します他の既存の遺伝子型決定技術の制限を回避し、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループットスクリーニングを実施するのに特に有用であることができ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法、のailedプロトコル。このメソッドは、実行することが技術的に簡単で、時間とコストを節約できます。
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Protocol
1. CRISPR / Cas9標的単一細胞クローンを取得
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した抗生物質を含まないダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）2mL中ウェルあたり500,000細胞で6ウェルプレートにシードHepG2細胞。 37℃で24時間、5％CO 2インキュベートします。
- プラスミドを、製造業者の指示に従って適切なトランスフェクション試薬を用いて目的の遺伝子に対してCas9と特定sgRNAを共発現する細胞をトランスフェクトします。
注：以前に4記載したように例えば、sgRNAは、pSpCas9（BB）-2A-GFPベクターにクローニングすることができます。 - 新鮮な抗生物質を含まない培地の2mLのトランスフェクション後16時間 - 培地4を置き換えます。
- トランスフェクション後約48時間、細胞をトリプシン処理により単一細胞懸濁液を収集します。
- 0.25％トリプシンEDTAの0.2 mL中に細胞をトリプシン処理し、5分間37℃でインキュベートします。培地1mLを加え、再懸濁thoroughlY。
- 以前に12を説明したように、GFP陽性クローンの細胞を選別し、約3,500の細胞を集めます。
- プレートペニシリン/ストレプトマイシンを補充した培養培地8mlにディッシュあたり500、1,000〜2,000細胞で10cmディッシュ上のGFP陽性選別細胞。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- それらが裸眼で見えるように十分な大きさの単一細胞コロニーに成長するまで、5日ごとに培地を交換し、37℃で、5％CO 2で細胞を維持します。ほとんどの癌細胞株の場合、これはメッキの日から約2週間かかります。
- コロニーは、適切なサイズ（肉眼で、すなわち、目に見える）である場合に、10％FBSを補充したDMEMの200μLを含む96ウェル培養プレートのウェルに個々のコロニーを移します。
- 培地の小容量の200μLピペットを用いて単一細胞コロニーを吸引します。徹底的中で細胞を再懸濁数回粉砕することによりdividual井戸。
- 90％のコンフルエンス-それらが50に達するまで、5日ごとに培地を交換し、37℃で、5％CO 2で細胞を維持します。 48時間 - ほとんどの癌細胞株の場合、これは約24かかります。
2.直接溶解法を用いた粗ゲノムDNA抽出
- 細胞が50に達すると - 90％のコンフルエンスに、マルチチャンネル真空吸引またはマルチチャンネルピペットを使用して可能な限りウェルから培養培地をできるだけ多く除去します。
- 各ウェルに0.05％トリプシン-EDTA（フェノールレッドを含まない）の25μLを添加し、7分間37℃でインキュベートします。
- ピペッティングにより数回上下徹底的にトリプシン処理した細胞を再懸濁します。彼らはプラスチックの表面から剥離されていることを確認するために、顕微鏡下で細胞を確認してください。
- 空の96ウェル培養PLATに単一細胞懸濁液の約5μLを移すことによって、個々のクローンの複製を作成します電子。各ウェルに培地200μLを添加し、陽性クローンを蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動を用いて同定されるまで（下記参照）の細胞を維持します。シリアル10cmディッシュまたは選択した任意の他のスケールに細胞を拡大（セクション7を参照）。
- （10 mMトリスpHは8.0、2.5mMのEDTA、0.2 MのNaCl、0.15％SDS、0.3％のTween-20）自家製直接溶解緩衝液10μL12にステップ2.3からの単一細胞懸濁液の5μLを加えます96ウェルPCRプレートとを数回ピペッティングにより完全に混和します。手短に遠心（ウェルの底まで液体をもたらすこと）。
- 一緒にステップ2.4からの複製と、ステップ2.3からの細胞懸濁液の残り〜15μLに培地200μLを添加し、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- 細胞およびゲノムDNAの放出の完全な溶解を確実にするために、次の熱サイクリングプログラムにステップ2.5からの溶解物を供する：65℃3について0秒、30秒、8°C、1.5分間、1分間、3分間、1分間、3分間、97°C、8°C、65°C、97°C、1を65°C、65°C分、および10分間80°C。簡単に溶解物を遠心分離します。
- ヌクレアーゼフリー水40μLを追加することにより、溶解物を希釈し、ボルテックスミキサーを用いて完全に混合します。遠心分離簡潔に。希釈した溶解物を直ちに使用するか、または品質の著しい損失なしに数ヶ月間-20℃で保存することができます。
3. CRISPR / Cas9標的領域を増幅する蛍光PCRを行います
- 各CRISPR / Cas9標的領域のための設計2のフルオロフォアで標識されたフォワードプライマー（両方の5' 末端で標識されました）。互いから300塩基対よりもさらにある部位を切断する非標的野生型対照とCRISPR / Cas9標的クローンについて青色フルオロフォア標識プライマーについて、例えば、緑色フルオロフォア標識プライマー（二つの別々のターゲット領域として考慮されるべきである。 マテリアの表を参照 LS）。
- 従って、これらのフォワード標識プライマーおよび非標識リバースプライマーを調達。 500bpの長い - プライマーは、選択した任意のツールを使用して設計することができることとアンプリコンは200でなければならないことに注意してください。
- 標識されたプライマーを用いて標的領域を増幅するために、以前に12記載のようにPCRを行います。
- 20μLの反応工程2.8から希釈した溶解物を3μlを使用して、次の熱サイクリングプログラム（ 表1参照）：10分（1サイクル）、94℃で、 10秒間94℃、30秒間64℃、1分（4サイクル）68°C。 10秒間94℃、30秒間61°C、1分（4サイクル）68°C。 10秒間94℃、30秒間58℃、1分（4サイクル）68°C。 10秒間94℃、30秒間55℃、1分間68°C（35サイクル）。
- サイズおよびアンプリコンの相対的な量を確認するために1％アガロースゲル上のPCRアンプリコンの5μLを解決SS = "外部参照"> 12。
注：すべてのサンプルについて、この手順を実行するには、奨励が、必要はありません。サンプルの選択された数を解決することは一般にサンプル中に存在するアンプリコンの量を推定するのに十分です。
キャピラリーゲル電気泳動4.準備のサンプル
- 野生型のアンプリコン（非標的親細胞）と約2.5 ng /μLでのヌクレアーゼフリー水にCRISPR / Cas9標的DNAを希釈します。各標的DNAサンプル（標的サンプルあたり希釈野生型サンプルの0.5μLの最小値が必要とされる）に追加されるのに十分な野生型DNAサンプルを希釈してください。
- 等しい比率で希釈し、野生型と標的DNAサンプルを混合（ 例えば、標的試料の1μLと野生型試料の1μLを混合します）。
- 脱イオン化ホルムアミドの8.7μLを混合したアンプリコンの1μLを添加し、遺伝的ANと互換性のある96ウェルPCRプレートに色素標識サイズ標準の0.3μLalyzer。
注：ホルムアミドのマスターミックスを使用すると、サイズ標準（ すなわち、ホルムアミドのプレミックスの製造及び29でサイズの標準：前に標準化された金額を確保するためのアンプリコンのほかに1比）が推奨されます。 - しっかりプレートを密封し、PCRサーモサイクラーを用いて、3分間95℃でサンプルを加熱します。
- 直ちに加熱工程の後、氷上でプレートを置き、少なくとも3分間インキュベートします。
ジェネティックアナライザーでキャピラリーゲル電気泳動を行う5.
- アッセイパラメーター、機器のプロトコル、および遺伝的解析装置に接続され、キャピラリーゲル電気泳動ソフトウェア上のサイズ-呼び出しプロトコルを設定します。
注：この手順は、最初の電気泳動操作のために必要とされます。プログラムは、将来の使用のために保存することができます。その後の実行のために、5.2の手順に直進。- ソフトウェアのダッシュボードの「新しいプレートの作成」アイコンをクリックしてください。
- Rを与えます国連はダミーの名前とは、次のオプションを選択します。井戸の数、96;プレートタイプ、フラグメント;キャピラリーの長さ、50センチメートル。およびポリマー、POP7。 「割り当てプレートコンテンツ」ボタンをクリックします。
- 下に「アッセイ」、「新しいアッセイを作成」をクリックしてください。新しいパネルが表示されます。
- アッセイ「FPCR-CGEアッセイを」名前を付けて、「アプリケーションの種類」が正しくとして設定されていることを確認し、「フラグメント。」
- 下の「新規作成」ボタンをクリックすることで、機器のプロトコルを設定する「インストゥルメントプロトコル。」
- 適切な領域で、次のオプションとパラメータを設定または選択します。アプリケーションの種類、フラグメントを、キャピラリーの長さ、50センチメートル。ポリマー、POP7。色素セット、G5;実行モジュール、FragmentAnalysis。プロトコル名、FPCR-CGEインストゥルメント・プロトコル。オーブン温度60°C。電圧を実行し、19.5 kVの。電圧、15 kVのを事前に実行します。注入電圧、1.6 kVの。ランタイム、1,330秒。前の実行時間、180秒。注入時間、15秒;そして、データ遅延、1秒。
- Clボタンやプログラムを保存するために、次に「ライブラリに保存」ボタン「アッセイに適用」をICK。継続してパネルを閉じます。
- 下の「新規作成」ボタンをクリックすることで、サイズの呼び出しプロトコルを設定する「Sizecallingプロトコル。」
- 適切な領域で、次のオプションとパラメータを設定または選択します。プロトコル名、FPCR-CGE Sizecallingプロトコル。サイズ標準、GS500（-250）LIZ。サイズ発信者、SizeCaller v1.1.0デベロッパー。解析設定、 - 。分析範囲、完全;完全な範囲を、サイジング。法、地方南部を呼び出すサイズ。プライマーピーク、現在;ブルー、グリーン、オレンジチャンネル、（チェック）。最小ピーク高さ、すべてのチャネルのための175。スムージング、なしを使用します。使用ベースライン（ベースラインウィンドウ（PTS））、（チェック）51。最小ピーク半価幅、2。ピークウィンドウサイズ、15;多項式の次数、3。勾配閾値ピークスタート、0.0;勾配閾値ピークエンド、0.0; QC設定、 - 。サイズの品質、 - 。値が<0.25である場合には失敗。値が<0.75であれば合格。 80から0塩基対から直線を想定0 BP;そしてアクチュエプルアップフラグもしプルアップ0.1≤比プルアップスキャン≤1。
- 「アッセイに適用」ボタンをクリックし、プログラムを保存するために「ライブラリに保存」ボタンをクリックします。継続してパネルを閉じます。
- アッセイは、もう一度「ライブラリに保存」ボタンをクリックすることで保存されていることを確認し、「閉じる」ボタンをクリックしてパネルを終了します。
- 戻る「割り当てプレート内容」ページで、下の「新しいファイル名条約の作成」リンクをクリックして「ファイル名の表記。」
- プログラム「FPCR-CGEファイル名を。」という名前を付けます
- 下に「使用可能な属性、」（例えば、「ファイル名を指定して実行の日、」「ファイル名を指定して実行の時、」「まあポジション、」と「サンプル名」など）、ファイル名に表示されます目的の属性を選択します。実行結果が格納される目的のファイルの場所を選択します。
- その後、「アッセイに適用」ボタンをクリックし、プログラムを保存するために「ライブラリに保存」ボタンをクリックします。継続してパネルを閉じます。
- 戻る「プレート内容の割り当て」ページで、下の「新しい結果グループの作成」リンクをクリックして、「結果のグループ。」
- プログラム名「FPCR-CGEは、グループ結果を。」
- 下に「使用可能な属性、」（こうした「アッセイ名」など）、ファイル名に表示されます目的の属性を選択します。実行結果が格納される目的のファイルの場所を選択します。
- 「アッセイに適用」ボタンをクリックし、プログラムを保存するために「ライブラリに保存」ボタンをクリックします。継続してパネルを閉じます。
- 以下の手順で実行し、電気泳動のためのプログラムを設定します。
- ダッシュボードに移動し、「新しいプレートの作成」アイコンをクリックしてください。
- （簡単に参照するための日付、細胞株、および遺伝子名を含む）は、所望のように実行に名前を付けます。次のオプションを選択します。井戸の数、96。プレートタイプ、フラグメント;キャピラリーの長さ、50センチメートル。およびポリマー、POP7。 「割り当てプレートコンテンツ」ボタンをクリックします。
- 必要に応じて、サンプルの各ウェルにラベルを付ける（ 例えば、サンプルがウェルがネガティブコントロールであることを示すために、「NC」と命名することができます）。
- 「アッセイ」、「ファイル名の表記、」および「結果グループの下に追加ライブラリからの」リンク「ボックス、クリックして」と5.1.17へのステップ5.1.3で作成したプログラムを選択します。
- 分析対象となるすべてのウェルをハイライト表示し、下の該当するプログラムを選択し、「アッセイ」、「ファイル名の表記、」と「その横のボックスをチェックして結果グループ」。
- 遺伝子解析装置のトレイ上にプレートをロードする前に、96ウェルプレート上のゴム製シールを適用し、遺伝子解析装置に付属のプラスチックケースに密閉プレートを置きます。
- 遺伝子解析装置の前面に「トレイ」ボタンを押し、そして場合トレイ再装置の前面を痛、ドアを開けてトレイに入れ、プレートをロードします。プレートが所定の位置にロックされていることを確認してからドアを閉じます。
- ボタン「ファイル名を指定して実行のためのリンクプレート」をクリックします。
- 「ファイル名を指定して実行のためのロードプレート」ページでは、すべての試薬及び条件が正しいと順序になっていることを保証するために最終チェックを行います。
- 「スタートファイル名を指定して実行」ボタンをクリックします。 24のサンプル（96ウェルプレートの最初の3x8ウェル）の各ランが完了するまでに55未満分を要します。
塩基対の違いを決定するために、電気泳動図の分析6.
- キャピラリーゲル電気泳動の実行が完了すると、結果を分析する分析ソフトウェアを開きます。
- アイコンを、実行ファイルを含むフォルダを検索し、「プロジェクトにサンプルを追加」をクリックします。ステップ5.1.12からの結果ファイルの割り当てられた場所を思い出してください。
- 完了した実行とCLの各注入のすべての結果ファイルを選択します「リストに追加」ボタンで嫌。これらのファイルの名前は、「インジェクション」で始まり、実行の詳細が含まれています。
- 分析を進めるための「追加と分析」ボタンをクリックしてください。
- 最初のサンプルをクリックし、最後のサンプルまでカーソルをドラッグして、実行中のすべてのサンプルを選択し、「表示プロット」アイコンをクリックしてください。
- サイズ標準の品質を確認するには、オレンジ色のアイコンをチェックし、色付きのアイコンの残りの部分をオフにして、結果のオレンジ色のチャネルを開きます。これは、サイズの呼び出しは、正確かつ信頼性があることを確認することが重要です。
- 非標的コントロール由来の断片と標的クローンに対応するピークを表示するには、これらのチャネルからの測定値を開くために青と緑のアイコンを確認してください。
- 最初の結果プロットの横軸の上にカーソルを置き、選択し、右クリックし、「すべて表示」を決定するために一目ですべての結果を表示するためにスクロールダウン実行してすべての主要な問題がある場合。プロットの関連軸上でマウスを右クリックし、値の特定の範囲にズームインするには、「ズームに...」を選択し、関心の値の範囲内のキー。
注：一つの潜在的大きな問題は、すべてのサンプルは、低強度のピークを与えるということです。これは、キャピラリー電気泳動ランまたは容易PCR工程を繰り返すことにより、または、それぞれ、下部希釈係数を使用してアンプリコンを希釈することによって修正することができるアンプリコンの過剰希釈、前にフルオロフォアで標識されたアンプリコンの長期貯蔵に通常です。 - 結果を保存するには、以下の手順に従ってください。
- 青と緑のチャンネルが選択されていることを確認し、「サイズ表」アイコンをクリックしてください。
- 「ファイル」を開いて選択することで、タブ区切りテキスト（.txt）形式で値のテーブルを保存「エクスポートテーブルを。」それに応じてファイルに名前を付け、選択したファイルの場所を選択します。
- プロットを保存するにはPDF形式の実行のSは、「ファイル」に移動し、「印刷」オプションをクリックしてください。関連するPDFライターを押し選択して「印刷」をそれに応じてファイルに名前を付け、選択したファイルの場所を選択します。
- 非標的野生型対照とCRISPR / Cas9標的クローンから誘導された断片のサイズの差を計算するために、以下に説明する手順に従います。
- スプレッドシートプログラムとステップ6.9.2からタブ区切りテキスト（.txt）ファイルを開きます。 （青や緑のチャネルを示す）「染料/試料ピーク」、「サンプル・ファイル名」（最初の文字は、ウェルまたはサンプル名を示す）、「サイズ」（の大きさを示す：表は、これらの4つの重要な列を含める必要があります）と呼ばれる断片、および「高さ」（ピークの蛍光強度を示します）。
- 関連するピークを選び出すために、予想される大きさの範囲内にないものを除外する。
注：一般的に、インデル変異はめったに以上になりませんサイズは100-bpの差より、従って、そのサイズ（緑色チャネルにおける支配的なピーク）野生型コントロールピークから100以上の塩基対だけ異なるピークが除外されます。これは、簡単にスプレッドシートの「条件付き書式」機能でオプション「間」を使用して行うことができます。 - バックグラウンドレベルから区別できない非特異的なピークを除去するために、その高さが2,000単位より低いピークを除外するために、スプレッドシート・プログラムの「条件付き書式」機能の下に「より小さい」オプションを使用します。このカットオフ値は、経験的に決定され、適合と見なさここ従って調整することができます。
- 前者から後者を差し引くことにより、青色チャネル（CRISPR / Cas9標的クローン）および緑色チャネル（非標的野生型コントロール）における唯一のピークが得られたピークの各々の間のフラグメントサイズの差を計算します。
注：各キャピラリーelectrophorに起因する値を使用することが重要ですESISサンプルは、のように、野生型コントロールの断片サイズのサンプル間の差異があってもよいです。 - もしあれば、中に挿入またはから削除された塩基対の数、問題のゲノム配列を決定するために、最も近い整数に丸めた値。遺伝子をノックアウトすることは重要である場合には、フレームシフトは、コード配列であることを保証するために、そのインデル変異は、3塩基対の倍数でないクローンを選択します。
クローンのノックアウト状態の7.検証
- 0.25％トリプシン-EDTAの25μLを用いて細胞をトリプシン処理し、5分間37℃でインキュベートすることにより、24ウェルプレートに（ステップ2.4および2.6からの）96ウェルプレートからの個々のノックアウトクローンを展開。
- トリプシン処理した細胞に培地を125μLを（DMEM、10％FBSを補充した）を添加し、十分に再懸濁します。
- 室温で5分間400×gで15 mLチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移します。
- 、真空吸引またはピペットを使用して、可能な限り媒体のできるだけ多くを除去培地500μlに細胞ペレットを再懸濁し、24ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液を移します。細胞が80~90％コンフルエントに達するまで37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- 24ウェルプレートから6ウェルプレートに、6ウェルプレートから、それらが80に達する10 cmのディッシュに直列に個々のクローンを展開 - 次ボリュームを使用して繰り返すステップ7.1 7.4に、90％コンフルエンスに： （6ウェルプレートに24ウェルプレートから拡大するため）、0.25％トリプシンEDTAおよび培地150μLの50μLの0.25％トリプシンEDTAおよび培地1mL（200μL6-膨張させますウェル）を10cmディッシュにプレート。
- 0.25％トリプシン-EDTAを1mLを用いて、5分間37℃でインキュベートした細胞をトリプシン処理することにより90％のコンフルエンス - それらが80に達したときにクローンを収穫。
- トリプシン処理した細胞とresuspeに培地5mlを（DMEM、10％FBSを補充した）追加徹底的ND。
- 室温で5分間、400×gで2つの15 mLチューブ、遠心分離機に均等に細胞懸濁液を転送し、そして可能な限り多くのメディアを削除します。細胞の一部は、ゲノムDNA抽出のためであり、他方は、総タンパク質抽出のためのものです。
- サンガー配列決定を経由して検証するために、以下の手順に従ってください。
- 先に説明したように12個のクローンからゲノムDNAを抽出します。
- セクション3.2で説明したように、CRISPR / Cas9標的部位に及ぶ領域のPCR増幅を行ったが、非標識プライマーを使用します。タグからの蛍光は、その後のサンガー配列決定のステップを妨害するように、このステップのための標識プライマーを使用しないでください。
- 先に説明したように12、PCRクリーンアップキットを使用してアンプリコンを精製します。
- シーケンス記載previouslように、クローンの遺伝子型を決定するステップ7.9.2で使用されるPCRプライマーを用いて精製したアンプリコンY 12。
- 以前に12記載のようにウェスタンブロット分析を介して、検証のために、野生型細胞と標的クローンから全タンパク質を抽出します。
- 以前に12のように、標的遺伝子のタンパク質に対する適切な抗体を用いたウエスタンブロット分析を行います。真のノックアウトクローンは、タンパク質の発現を欠いています。
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Representative Results
ここで説明する蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動技術は、外来DNAの送達に適している実質的に任意の細胞株におけるゲノムの任意のターゲッティング可能な領域に適用可能であることが予想されます。我々は以前、大腸癌細胞株12における三つの遺伝子を標的とすることにより、その適用を実証しています。ここで、我々は肝細胞癌細胞株の遺伝子型決定でその有効性を示し、CRISPR / Cas9を対象とHEPG2は、1と同様にヌクレオソームタンパク質1（NAP1L1）遺伝子に対して構築します。実際に、我々は正常に多数の他の遺伝子12、13を対象とする非ヒト哺乳動物細胞系を含む種々の他の細胞を、遺伝子型蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を利用しています。
実験ワイズ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動techniqUEは、実行するのは簡単かつ高速です。 Cas9とsgRNA発現の導入は、細胞および陽性クローンの選択に構築した後、個々のクローンを自家製溶解緩衝液、ダイレクトを溶解バッファ12を用いて、96ウェル培養プレートから直接溶解されます。我々の経験では、結果として溶解物をゲノムDNAの質を著しく損なうことなく数ヶ月のために-20℃以下で保存することができます。溶解工程は、CRISPR標的領域にまたがるフルオロフォアタグ付けされたアンプリコンの産生を伴うPCR増幅工程が続きます。提供蛍光PCRプロトコルは、この目的のために最適化されており、一貫して関係なく、増幅される領域の、十分なPCR産物を生産しています。 図1は、個々のCRISPR / Cas9標的クローンに対応する各レーン及びcorresp様々なバンドと、蛍光PCR工程に由来するアンプリコンの解像度の代表的な結果を示しますクローンにおける個々の対立遺伝子の増幅された領域にonding。我々の経験では、他のポリメラーゼとその付随プロトコルの使用は、下のアンプリコン収量が得られました。これは容易にキャピラリーゲル電気泳動のための試料調製中希釈係数を調整することによって修正することができるが低い収量のアンプリコンが使用される場合、背景やノイズレベルが結果的に高くてもよいです。 PCR工程の後、アンプリコンを希釈し、そして野生型サンプルと標的クローンのものは、それらを脱イオンホルムアミドバッファとサイズ規格に追加される前に、等しい割合で混合し、変性、およびキャピラリーゲル上で分離されています。
キャピラリーゲル電気泳動が完了した後、遺伝子型決定の結果は、分析される準備ができています。電気泳動は、個々の蛍光シグナルに対応するピークを含有し目：結果の二つの重要なセットは、電気泳動操作に必要とされます計算に必要なすべての必要な値を含むE結果テーブル。 図2は、HepG2細胞におけるNAP1L1遺伝子に対するsgRNAによって標的二つのクローンの遺伝子型決定の結果を示します。青色ピークはCRISPR / Cas9標的クローンのインデル変異含有対立遺伝子のアンプリコンに対応する一方、緑色のピークは、親HepG2細胞における非標的野生型対立遺伝子のアンプリコンに相当します。明確に示されているように、二つのクローンは、両方の対立遺伝子上の一と10ヌクレオチドの欠失を有するホモ接合変異体（同じ変異対立遺伝子を有する変異体）です。ピーク値は、標的クローンおよび野生型細胞のそれの単位複製配列の間の塩基対の違いの数を決定する際に重要である一方、電気泳動のみ可視化目的のために使用されていることに留意することが重要です。
ノックアウト状態の信憑性を検証するために、我々は実行をお勧めします細胞における遺伝子発現の廃止を確認するためのサンガー配列決定およびウェスタンブロット分析。上記識別される2つのクローンは、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動の結果（ 図3A）と一致サンガー配列決定の結果を与えました。ノックアウトクローンの予想されるように、それらはまた、NAP1L1タンパク質発現（ 図3B）の完全な除去を示しました。
図1：NAP1L1 遺伝子に対するCRISPR / Cas9によって標的HEPG2クローンのPCRアンプリコン。蛍光PCR工程のアンプリコンは、2つの別個のアガロースゲル（上部と下部）上で分離し、各レーンは、個々の標的クローンに相当します。 L：DNAラダー（個々のバンドのサイズは、次の図に示されています）。 彼女をクリックしてくださいeがこの図の拡大版を表示します。
図2： キャピラリーゲル電気泳動を経て解決しました二つの試料からの蛍光シグナルのプロット。横軸は、フラグメントのサイズを示し、縦軸は蛍光シグナル強度を表します。グリーンピークは、野生型細胞に由来するフラグメントに対応している青色のピークは、CRISPR / Cas9媒介標的クローンに由来するフラグメントに対応します。マゼンタラインが一貫してサンプルを横切るピークを示す位置をマークする分析ソフトウェアによって決定自動ピーク呼び出す位置に対応します。個々のピークの隣に提供される値は、（BPに）断片の大きさに対応し、解析ソフトウェアから得られます。括弧内の値は、個々FRA間の大きさの計算された差を示しています対象クローンおよび野生型フラグメントからgments。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： アッセイの結果は、2つのクローンにおける標的遺伝子のノックアウトを確認します。指示されたタンパク質に対する抗体を用いて（A）サンガー配列決定の結果と（B）ウエスタンブロット分析。青色ヌクレオチドはsgRNA標的配列を表し、赤色のものはprotospacer隣接モチーフ（PAM）を表し、褐色におけるものは塩基置換ヌクレオチドを表し、破線は、ヌクレオチドが対立遺伝子で削除された位置を表します。個々のクローンの名前の隣に括弧内の値は、クローンの対立遺伝子の遺伝子型を表します。 "-1" と「-10"対立遺伝子は、それぞれ、1および10ヌクレオチドの欠失を含んでいることを意味し、ウエスタンブロットで検出されたタンパク質のおおよそのサイズ分析：。。NAP1L1およびP84のための〜84 kDaの（コントロールをロードする）ための〜54 kDaで表示するには、こちらをクリックしてください。この図の拡大版。
| 試薬 | 一つの反応のための容量（μL） |
| キット固有のソリューション | 4 |
| 10×PCR緩衝液 | 2 |
| 10μMフォワードプライマー（ラベル） | 1 |
| 10μMリバースプライマー（未標識） | 1 |
| 25mMのdNTPミックス | 0.4 |
| Taq DNAポリメラーゼ | 0.2 |
| 水 | 8.4 |
| 希薄化後の溶解物 | 3 |
| トータル | 20 |
表1：蛍光PCR反応のための試薬。
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Discussion
選択のモデル細胞株に特異的な遺伝子のノックアウト遺伝子が特定の細胞のコンテキストで果たす役割を解明するためのルーチンとなっています。実際には、いくつかのゲノムワイドスクリーンはゲノム14、15、16に実質的に全ての公知のヒト遺伝子を標的とするためにCRISPR / Cas9システムを使用する現在利用可能です。これらの大規模スクリーン（又は関心のある個々の遺伝子の標的も小規模）を用いて、設計と同じ遺伝子の異なる遺伝子座を標的sgRNAsを利用することが重要です。使用異なるsgRNAs間で一貫性のある結果が明確遺伝子の枯渇の真の効果を降伏でしょう。このように、単一の遺伝子の標的を正確に使用される個々のsgRNAの各々からのクローンの多くの遺伝子型を決定するために大量の遺伝子型決定のステップを必要とするであろう。蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、彼の説明しました再は、正確にこのタスクを実行することができます。
既存の遺伝子型決定法のほとんどは、高スループットの目的に適している一方で、それらの各々は、理想よりも少ないそれらをレンダリングする特定の固有の制限に苦しんでいます。 10の二重鎖DNA中のミスマッチを検出SURVEYOR、またはT7E1、アッセイは、野生型細胞とにより、これらの両方のクローンが不一致11を欠く二重鎖を生じるという事実にホモ接合変異体（二同じ変異対立遺伝子を有するクローン）を区別することができません。 CRISPR対象領域17内のインデル変異に起因する制限部位の消失を報告する制限断片長多型（RFLP）アッセイは、標的領域18における適当な制限部位の利用可能性によって制限されます。それらの融解曲線19に基づいて、異なる遺伝子型を判別するDNA融解分析技術、 20は 、一貫性の欠如に苦しんでいます。さらに、これらの方法の3つのすべては、彼らが遺伝子配列にフレームシフトが発生したことを報告していないという点で特に有益ではありません。これとは対照的に、サンガー配列決定 - 現在最も人気のある遺伝子型解析技術である - それは目標とされたゲノム領域の正確な配列を提供するので、非常に有益です。しかし、この技術は、特に大規模な実験では、コスト高です。それは上記の他の技術が直面しているすべての制限を回避することができるので、このように、ここで説明する蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法の特徴付けは重要です。
蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、クローンに、野生型存在し得る全ての可能な遺伝子型を区別することができます、ホモ接合変異体（野生型対立遺伝子と変異対立遺伝子によって特徴付けられる）ヘテロ接合変異体（二IDENTによって特徴付けiCalの変異対立遺伝子）、および2つの非同一の変異体対立遺伝子によって特徴付けられる化合物ヘテロ接合変異体（）。これらの遺伝子型は、電気泳動でピークパターンで簡単に微分可能です。さらに、この遺伝子型決定法は、標的クローンの断片の野生型アンプリコンの大きさとの差を報告し、単一塩基対に対して正確です。これは実質的に、ユーザーがそれらに時間とコストを節約し、クローンのほんの一握りにその検証を軽減することができ、遺伝子配列におけるフレームシフトの有無を報告します。その上、この手法は、（ すなわち、それは同時に一つのターゲット以上の遺伝子型を決定することができる）標的遺伝子の多重化を可能にし、それが異常なピークパターンの存在（ 例えば、存在から不均質な細胞集団の検出を可能にします二倍体細胞の電気泳動に3つ以上のピーク）の。ここで、先に12使用した細胞株に加えて</ SUP>、13、我々はまた、正常蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いて、幹細胞および神経細胞（未発表データ）を含む種々の他のヒトおよび非ヒト細胞系を、遺伝子型を決定している、と我々は、この技術が適用可能であることが予想しますCRISPR / Cas9ターゲティングに適している任意のセルに。この技術は、細胞内の個々の対立遺伝子の遺伝子型を報告するので、そのような異数性や遺伝的増幅を有する癌細胞などのマルチ対立遺伝子の細胞を、遺伝子型同定に極めて有用です。
プロトコルは、（使用されるすべての材料を含む）本明細書に記載CRISPR / Cas9標的クローンの汎用性と再現性の遺伝子型決定のために最適化されています。それにもかかわらず、変更を正当いくつかの部分があります。彼らは、これらに限定されないが：異なる選択戦略の使用を必要とすることができる1）異なるsgRNA発現ベクターの使用（またはクローニング戦略）（ 例えば、FACS代わりのクローンの抗生物質選択）。 2）蛍光PCR工程のための異なるポリメラーゼの使用。 3）異なる蛍光標識の使用。また、プロトコルにおける重要なステップのカップルが問題になるかもしれないことは注目に値します。一つは、蛍光PCRアンプリコンをアガロースゲル電気泳動に非特異的バンドを生じ得る、またはキャピラリーゲル電気泳動におけるピークパターンであってもよい、「うるさいです」。これは、PCRプライマーのサブ最適な品質に可能性があり、したがって、これらのプライマーを再設計することによって整流することができます。我々は、増幅工程の一貫性、再現性、および特異性を保証するために、フルオロフォアで標識されたものを調達する前に、非標識オリゴヌクレオチドを用いてプライマーの品質をテストすることをお勧めします。注意すべき他の重要な要因は、真陽性ノックアウトクローンを得る速度を決定してもよいCRISPRガイドRNAの効率です。 sgRNA検索PROGのいずれもので、現在利用可能なRAMは、各個々のsgRNAの効力しか経験的に決定することができる、きわめて簡単です。このように、設計し、成功したノックアウトクローンが得られない可能性を減らすために、各標的遺伝子に対して複数のsgRNA（好ましくは3つ以上）を利用することが重要です。
蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、有益敏感な、使いやすいであるが、それはいくつかの注意点が付属しています。まず、この技術は、容易に入手可能ではないかもしれない遺伝子解析装置の使用を必要とします。この目的のために使用される遺伝子解析装置は、サンガー配列決定実験に使用したのと同じものですので、キャピラリーゲル電気泳動プロトコルは、既存のサンガーシーケンシング・サービス・プロバイダーに委託することができます。実際には、我々は以前に社内で行われたときと同等のコストでキャピラリーゲル電気泳動プロトコルを実行するために、当社のシーケンシングサービスプロバイダに配置されています。 techniqの第二に、精度30塩基対より長いインデル変異が関与しているとき、UEが低下することがあります。我々の経験では、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、大きなインデル（> 30塩基対）が観察される場合インデルの大きさを過小評価する傾向があります。しかし、我々の経験では、突然変異体の大半は（ほとんどが5塩基対未満の）非常に短いインデル突然変異の長さを表示します。それにもかかわらず、これは使用CRISPR標的部位および細胞株に大きく依存しています。第三に、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、CRISPR / Cas9切断部位でのNHEJ修復の際に塩基置換を検出することができません。それにもかかわらず、二本鎖切断のNHEJ修復の結果として、塩基置換が稀な事象21であることが報告されている、と彼らは有害遺伝子の読み枠を変更しません。第四に、この技術は、蛍光PCR工程で増幅された標的領域の変化を検出し、従って、任意のオフターゲット収差を報告しない（遺伝的変化は、OU）増幅された領域tside。個々のCRISPR sgRNAのオフターゲット効果の、このような総合的な調査が必要な場合は、我々は正確に標的クローンのゲノムにおける任意の変化を検出するために、全ゲノムシーケンシングをお勧めします。上述のように複数のsgRNAは、標的遺伝子ごとに使用されている場合は、このかなり高価な実験は必要ではありません。最後に、ここで説明する蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、600塩基対の断片サイズの制限を有しています。標的領域は反復配列からなるか、またはPCR増幅効率および特異性に影響を与える可能性が非常に高いグアニン - シトシン（GC）含量を有する場合、これは問題を提起することができます。この簡単に予防できる問題は、標的領域の適切な増幅のために適切な配慮を含まなければならないように注意sgRNAターゲットデザインの重要性を強調します。従って、遺伝子型決定のこの容易な方法は、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法の長所と注意事項を考慮この日のボトルネックのままノックアウトクローンの大量のジェノタイピングの負担を軽減することがあります。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、キャピラリーゲル電気泳動実験を助けるため女史タン市ミンさん、ヘレン・オング、博士ザオ・イ感謝したいと思います。この作業は、/ 2011分の1314 NMRCとMOE ACRFティア2基金助成金MOE2011-T2-1-051を付与NMRC / IRGによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
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