Summary
형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.
Abstract
프로그램 게놈 편집 도구의 개발은 특정 게놈 서열이 세포 전체 유기체의 기능에서하는 역할을 이해하는 역 유전학의 사용을 촉진했다. 이 원인은 엄청나게 CRISPR의 최근 도입 연구자하기 위해, 다른 것들 중, 게놈과 전 사체를 조작 노크, 노크, 또는 표적 유전자에 노크 할 수 있습니다 / Cas9 시스템 - 다용도 도구의 도움되었습니다 방법. 유전자를 녹아웃의 목적을 위해, CRISPR / 이중 가닥 나누기 휴식 사이트에서 뉴클레오티드의 틀 이동을 유발하는 삽입 또는 삭제를 소개하는 비 동종 최종 합류 DNA 수리 경로를 모집 Cas9는 매개. 그러나, 개별 가이드 RNA가 바람직하지 않은 오프 대상 영향을 일으킬 수 있으며, 이들을 배제하기 위해, 여러 가이드의 RNA의 사용이 필요하다. 대상이 또한 다수의 클론 대량 선별이 교대 EF에서의 사용을 돌려서, 이는 요구되는 것을 의미녹아웃 클론 유전자형 높은 처리량 기술을 ficient. 현재 유전자형 기술 중 하나는 따라서 높은 처리량을 위해 적합하지 않다 렌더링, 본질적인 한계로 고통 또는 높은 비용이 발생. 여기서, 주형으로 조 세포 용 해물로부터 게놈 DNA를 사용하여 형광 PCR을 사용하고, 모세관 젤 전기 영동을 통해 PCR 단편을 해결하기위한 우리 상세히 프로토콜. 이 기법은 하나의 단편 간의 염기쌍의 차이를 구별하기에 충분히 정확하고, 따라서 표적 유전자의 코딩 서열의 프레임 이동의 유무를 나타내는에 적합하다. 이 정확한 지식을 효과적으로 확증 시퀀싱 단계의 필요성을 배제하고 사용자가 그 과정에서 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다. 여기에 다른 곳에서와 같이 또한,이 기술은 다수의 유전자에 대한 가이드 RNA를 표적 다양한 조직 기원의 다양한 포유 동물 세포 유전형에 다양한 것으로 입증되었습니다.
Introduction
역방향 유전 방식은 과학자들이 셀 또는 전체 유기체의 게놈의 특정 변경의 효과를 규명 할 수있다. 예를 들어, 특정 유전자의 발현이 세포의 또는의 기능을 갖는다는 효과를 확인하기 위해 유전자 녹다운 (1, 2) (부분 감소) 또는 유전자 녹아웃 (3), 4 (완전 제거)에 의해 감쇠 될 수있다 유기체의 개발.
유전자 녹아웃 (knockout) 실험은 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs)와 같은 특정 프로그램 시퀀스 클레아의 도입 이후 쉽게되고있다. 그러나 정기적으로 짧은 회문 반복 (CRISPR)을 산재 클러스터 된의 상대적으로 최근의 특성화 / Cas9 시스템은 세대를 수행 할 수있는 전 세계 모든 실험실은 매우 간단했다전자 녹아웃 실험. 본질적으로, CRISPR / Cas9 시스템은 두 개의 필수 성분-A 인식 및 게놈의 특정 염기 서열에 상보성 단일 결합을 통해 가이드 RNA (sgRNA) 및 Cas9라고하는 효소로 구성된다. 게놈 DNA의 sgRNA-Cas9 복합체의 특이 적 결합 및 동작의 여파는 DNA의 이중 가닥을 절단한다. 이는 다시, 계속해서 비 - 상동 최종 접합 (NHEJ) 또는 동종 재조합 (HR) 경로를 통해 복구 된 세포에서 DNA 손상 반응 메커니즘을 트리거한다. NHEJ 수리 메커니즘 (그러나 HR 메커니즘이) 자주 삽입 / 삭제 (INDEL) 돌연변이의 결과로, 수리의 사이트에서 무작위로 삽입 또는 뉴클레오티드의 삭제를 초래하기 때문에, 엑손의 독서 프레임이 이동 될 수 있습니다. 이 다음에 의한 번역 및 넌센스 매개 붕괴 5, 6의 조기 종료에 유전자의 녹아웃 될 수 있습니다7.
유전자를 노크의 CRISPR / Cas9 시스템의 도입에 의해 제공되는 편리함에도 불구하고, 표적 세포의 클론의 유전자형은 특히 8, 9를 설정하는 높은 처리량, 병목 남아있다. 주요 본질적인 한계로 고통 또는 재정적 비용이 많이 드는 중 기존 기술. 예를 들어, 10 이중 가닥 DNA에서 불일치를 검출하는 효소 분석이다 검사원 또는 T7E1 분석은 야생형 클론 및 동형 접합성 돌연변이를 구별 할 수없는 이들 클론은 동일한 대립 유전자를 가지고 있고, 따라서 이후 (그 대립 동일 돌연변이 클론) 이들 DNA 서열 11 불일치를 표시하지 않는다. 또한, 높은 처리량 설정에서, 돌연변이 클론 유전형의 황금 표준으로 간주됩니다 생거 시퀀싱의 사용으로 인해 높은 비용 바람직하지 않다. 여기, 우리는 DET을 제시다른 유전자형 기존 기술의 한계를 회피하고 클레아 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 스크린을 수행하는데 특히 유용 할 수있는 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술의 ailed 프로토콜. 이 방법을 수행 할 기술적으로 간단하고 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다.
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Protocol
1. CRISPR / Cas9-대상으로 단일 세포 클론을 얻기
- 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 항생제가없는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 2 ㎖로 웰 당 500,000 개의 세포로 6 웰 플레이트에 시드 인 HepG2 세포. 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 부화.
- 와 형질 세포 플라스미드 공동 발현 제조업체의 지침에 따라 적절한 형질 전환 시약을 사용하여 Cas9 관심의 유전자에 대한 특정 sgRNA합니다.
주 : 앞서 설명한 (4) 예를 들어, sgRNA는 pSpCas9 (BB) -2a-GFP 벡터로 클로닝 될 수있다. - 새로운 항생 배지 2 mL를 형질 감염 후 16 시간 - 배양 배지를 교체 4.
- 형질 전환 후 48 시간이 세포 trypsinizing하여 단일 세포 현탁액을 수집한다.
- 0.25 % 트립신 EDTA 0.2 mL의 세포를 Trypsinize 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. thoroughl 배지 1 ㎖를 첨가하고 재현 탁와이.
- 이전 12 바와 같이, GFP 양성 클론 세포를 정렬하고, 약 3,500 세포를 수집한다.
- 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 배지 8 ㎖의 접시 500, 1,000 및 2,000 세포를 10-cm 접시에서 GFP 양성 세포 분류 접시. 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포를 인큐베이션.
- 그들은 육안으로 볼 수있을만큼 큰 단일 셀 식민지로 성장할 때까지, 5 일마다 매체를 교체, 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 유지합니다. 대부분의 암 세포주의 경우, 이것은 도금의 날로부터 약 2 주 정도 소요됩니다.
- 콜로니가 적절한 크기 (육안으로, 즉 표시)의 경우, 10 % FBS가 보충 된 DMEM 200 μL를 함유하는 96 웰 배양 플레이트의 웰에 개개의 콜로니를 옮긴다.
- 중간의 작은 부피 200 μL 피펫을 사용하여 단일 세포 콜로니 대기음. 철저하게 세포에 재현 탁여러 번 분쇄하여에 의해 분리 된 우물.
- 90 % 합류 - 그들이 50에 도달 할 때까지, 5 일마다 매체를 교체, 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 유지합니다. 48 시간 - 대부분의 암 세포주의 경우,이 약 24 걸립니다.
직접 용해 방법을 사용하여 2. 추출 원유 게놈 DNA
- 세포가 50에 도달 할 때, - 90 % 합류 가능하여 멀티 채널 진공 흡입 또는 멀티 채널 피펫 같은 웰에서 배지를 제거만큼.
- 각 웰에 (페놀 레드 없음) 0.05 % 트립신 EDTA의 25 μL를 추가 7 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 철저하게 트립신 세포를 재현 탁. 그들은 플라스틱 표면에서 분리되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인합니다.
- 빈 96 웰 배양 작은지면에 단일 세포 현탁액의 약 5 μL를 전송하여 개별 클론의 복제 만들기이자형. 각 웰에 배지 200 μL를 첨가하고 양성 클론을 PCR 형광 모세관 겔 전기 영동 (아래 참조)를 사용하여 식별 될 때까지 세포를 유지한다. 직렬 10 cm 요리 또는 선택한 다른 규모 세포를 확장 (7 항 참조).
- (A)에 (10 mM 트리스 pH를 8.0, 2.5 mM의 EDTA, 0.2 M의 NaCl, 0.15 % SDS, 0.3 % 트윈 -20) 제 직접 다운 Lyse 완충액 10 μL 12 단계 230에서, 단일 세포 현탁액을 5 μL를 추가 96 - 웰 PCR 플레이트와 여러 번을 피펫 아래에 의해 철저하게 섞는다. 원심 분리기 짧게 (우물의 바닥까지 액체을 가지고).
- 단계 2.4에서 함께 복제하여, 단계 2.3에서 세포 현탁액의 나머지 ~ 15 μL에 배지 200 μL를 첨가하고 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양한다.
- (3) 65 ° C : 전체 세포 용해와 게놈 DNA의 방출을 보장하기 위해 다음과 같은 온도 사이클 프로그램은 단계 2.5에서 용 해물을 주제0의 30 초 동안 11 ° C, 15 분, 1 분, 3 분, 1 분, 3 분, 97 ° C, 11 ° C, 65 ° C, 97 ° C, 1, 65 ° C, 65 ° C 분, 10 분, 80 ° C. 해물 짧게을 원심 분리기.
- 핵산 분해 효소가없는 물 40 μL를 추가하여 용해 액을 희석하고 와류 믹서를 사용하여 잘 혼합. 원심 분리기 잠시. 희석 된 해물을 즉시 사용 또는 품질의 상당한 손실없이 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
CRISPR / Cas9 대상 지역을 증폭하는 형광 PCR을 수행 (3)
- 각 CRISPR / Cas9 대상 영역 설계 개의 형광 표지 된 포워드 프라이머 (둘 다 5 '말단에 표지 된); 서로 다른 두 개의 별도의 타겟 영역 (불특정 야생형 제어 CRISPR / Cas9 타겟 클론 청색 형광 표지 된 프라이머 예컨대, 녹색 형광 표지 된 프라이머로서 간주되어야 300 염기쌍보다 더있는 부위를 절단하는 단계; 본초 표 참조 LS).
- 이러한 미래 라벨 프라이머와 레이블이없는 역 프라이머 따라 조달. 500 BP 롱 - 프라이머는 선택의 도구를 사용하여 설계 할 수 있음과 증폭 200해야합니다.
- 표지 된 프라이머를 사용하여 타겟 영역을 증폭하기 이전에 12 바와 같이 PCR을 수행한다.
- 20 μL 반응 단계 2.8에서 희석 해물 3 μL를 사용하여 다음과 같은 열 순환 프로그램 (표 1 참조) : 10 분 (1 사이클), 94 ° C 단계; 10 초 동안 94 ° C, 30 초 동안 64 ° C, 1 분 (4 회), 68 ° C; 10 초 동안 94 ° C, 30 초 동안 61 ° C, 1 분 (4 회), 68 ° C; 10 초 동안 94 ° C, 30 초 동안 58 ° C, 1 분 (4 회), 68 ° C; 10 초 동안 94 ° C, 30 초 동안 55 ℃, 1 분 동안 68 ° C (35 사이클).
- 크기 및 증폭의 상대적인 양을 확인하는 1 % 아가 로스 겔에서 PCR 앰플 리콘의 5 μL를 해결SS = "외부 참조"> 12.
참고 : 모든 샘플에 대해이 단계를 수행은 권장하지만, 필요하지 않습니다; 샘플들의 선택된 개수를 해결하기 일반 샘플에 존재하는 증폭 산물의 양을 추정하는 것으로 충분하다.
모세관 젤 전기 영동 4. 준비 샘플
- 약 2.5 NG / μL에 핵산 분해 효소가없는 물에 야생형 (타겟이 불분명 한 부모 세포) 및 CRISPR / Cas9 표적 DNA의 증폭을 희석. (필요한 타겟 샘플 당 희석 야생형 샘플 0.5 μL 최소) 각 타겟 DNA 샘플에 첨가 될 정도로 야생형 DNA 샘플을 희석 확인.
- 동일한 비율로 희석하고 야생형 표적 DNA 샘플을 믹스 (예를 들어, 타겟 샘플 1 μL와 야생형 샘플 1 μL를 혼합).
- 유전와 호환되는 96 웰 PCR 플레이트에 탈 포름 아미드 8.7 μL 염료 표지 된 표준 크기의 0.3 μL를 혼합 증폭 1 μL를 추가alyzer.
참고 : 포름 아미드의 마스터 믹스와 크기 표준의 사용 (즉, 포름 아미드의 프리믹스의 준비와 29의 크기 표준 : 표준화 된 금액을 보장하기에 앞서 증폭의 추가 1 비율)을 권장합니다. - 단단히 플레이트를 밀봉하고 PCR 용 열 순환기를 사용하여 3 분 동안 95 ℃에서 샘플을 가열한다.
- 즉시 가열 공정 후 얼음에 플레이트를 배치하고, 적어도 3 분 동안 배양한다.
5. 유전자 분석기에 모세관 젤 전기 영동을 수행
- 분석 매개 변수, 악기 프로토콜 및 유전자 분석기에 연결된 모세관 전기 영동 소프트웨어에 크기 호출 프로토콜을 설정합니다.
참고 :이 단계는 첫 번째 전기 실행이 필요합니다; 이 프로그램은 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. 후속 실행을 위해, 5.2 단계로 바로 이동합니다.- 소프트웨어 대시 보드에 "새 판 만들기"아이콘을 클릭합니다.
- 는 R주세요유엔은 더미 이름을 입력하고 다음 옵션을 선택합니다 우물의 수, 96; 플레이트 유형, 조각; 모세관 길이 50cm; 및 폴리머, POP7. 은 "할당 플레이트 내용"버튼을 클릭합니다.
- 에서 "분석 실험," "새 분석 만들기"를 클릭; 새로운 패널이 나타납니다.
- 분석 "FPCR-CGE 분석을"이름을 지정하고 "응용 프로그램 유형이"올바르게로 설정되어 있는지 확인 "조각."
- 아래에있는 "새로 만들기"버튼을 클릭하여 기기의 프로토콜 설정 "악기 프로토콜."
- 설정하거나 해당 영역에서 다음 옵션 및 매개 변수 선택 : 응용 프로그램 유형, 조각을; 모세관 길이 50cm; 중합체 POP7; 염료 설정, G5; 실행 모듈, FragmentAnalysis; 프로토콜 이름, FPCR-CGE 악기 프로토콜; 오븐 온도 60 ° C; 전압을 실행, 19.5 kV의; 사전 실행 전압 15 kV의; 주입 전압 1.6 kV로; 실행 시간, 1330의; 사전 실행 시간, 180 초; 사출 시간, 15 초; 및 데이터 지연, 1 개 초.
- CL"적용 분석에"버튼을 누른 후 "저장 라이브러리"버튼을 싫어지기 프로그램을 저장합니다. 패널이 계속 닫습니다.
- 아래에있는 "새로 만들기"버튼을 클릭하여 크기 호출 프로토콜 설정 "Sizecalling 프로토콜."
- 설정하거나 해당 영역에서 다음 옵션 및 매개 변수 선택 : 프로토콜 이름, FPCR-CGE Sizecalling 프로토콜; 크기 표준, GS500 (-250) 리즈; 크기 - 발신자, SizeCaller v1.1.0 개발자; 분석 설정, -; 분석 범위, 전체; 크기 조정 범위, 전체; 방법, 지역 남부를 호출 크기; 프라이머 피크, 현재; 블루, 그린, 오렌지 채널, (확인); 최소 피크 높이, 모든 채널 (175); 스무딩 없음을 사용하십시오; 사용 기준선 (베이스 라인 창 (승점)), (확인) (51); 최소 피크 절반 폭, 2; 피크 창 크기, 15; 다항식 과정, 3; 기울기 임계 값 피크 시작, 0.0; 경사 임계 피크 엔드, 0.0; QC 설정, -; 크기 품질, -; 값이 <0.25 실패; 값이 <0.75 합격; 80-0 (BP)에서 선형성 가정BP 0; 및 Actuate는 풀업 플래그 경우 풀업 0.1 ≤ 비율 풀업 스캔 ≤ 1.
- 프로그램을 저장하기 위해 "적용 분석에"버튼을 누른 후 "저장 라이브러리"버튼을 클릭합니다. 패널이 계속 닫습니다.
- 분석은 "저장 라이브러리"버튼을 한 번 더 클릭하여 저장되어 있는지 확인하고 "닫기"버튼을 클릭하여 패널을 종료합니다.
- 위로 "할당 플레이트 내용"페이지에서, 아래의 "새 파일 이름 협약 만들기"링크를 클릭 "파일 이름 규칙."
- 프로그램 이름 "FPCR-CGE 파일 이름을."
- 에서 "사용 가능한 속성"(예 : "실행 날짜", "실행의 시간", "잘 위치"및 "샘플 이름"과 같은) 파일 이름에 나타납니다 원하는 속성을 선택합니다. 실행의 결과가 저장 될 원하는 파일 위치를 선택합니다.
- 다음 "적용 분석에"버튼을 클릭하고"저장 라이브러리"버튼을 눌러 프로그램을 저장합니다. 패널이 계속 닫습니다.
- 위로 "플레이트 내용 지정"페이지에서, 아래의 "새로운 결과 그룹 만들기"링크를 클릭 "결과 그룹."
- 프로그램 이름 "FPCR-CGE는 그룹 결과를."
- 에서 "사용 가능한 속성"(예 : "분석 이름"과 같은) 파일 이름에 나타납니다 원하는 속성을 선택합니다. 실행의 결과가 저장 될 원하는 파일 위치를 선택합니다.
- 프로그램을 저장하기 위해 "적용 분석에"버튼을 누른 후 "저장 라이브러리"버튼을 클릭합니다. 패널이 계속 닫습니다.
- 다음 단계에 따라 실행 전기 영동을위한 프로그램을 설정합니다.
- 대시 보드로 이동하여 "새 판 만들기"아이콘을 클릭합니다.
- (쉽게 참조 할 날짜, 세포주, 유전자의 이름을 포함) 원하는대로 실행의 이름을 지정합니다. 다음 옵션을 선택합니다 : 우물의 수96; 플레이트 유형, 조각; 모세관 길이 50cm; 및 폴리머, POP7. 은 "할당 플레이트 내용"버튼을 클릭합니다.
- 원하는 샘플의 각 웰에 라벨 (예를 들어, 샘플 웰은 음성 대조군 인 것을 나타내는 "NC"라는 할 수있다).
- 은 "분석 실험", "파일 이름 규칙"및 "결과 그룹에서 추가 라이브러리에서"링크 "상자의를 클릭"을 5.1.17로 단계 5.1.3에서 만든 프로그램을 선택합니다.
- 분석 할 수있는 모든 우물을 선택하고 아래에있는 관련 프로그램을 선택 "분석 실험", "파일 이름 규칙"및 "옆에있는 상자를 선택하여 결과 그룹".
- 유전 분석기의 트레이에 판을로드하기 전에 96- 웰 플레이트의 고무 실을 적용하고 유전 분석기로 제공되는 플라스틱 케이스에 밀봉 판을 넣어.
- 유전 분석기의 전방에있는 "트레이"버튼을 누른 때 트레이 재문을 열고 트레이에 넣어 진 플레이트로드, 장비의 전면 아파. 플레이트가 제자리에 고정되어 있는지 확인하고 문을 닫습니다.
- 버튼을 "실행에 대한 링크 플레이트"를 클릭합니다.
- "로드 플레이트 실행을위한"페이지에서 모든 시약 및 조건이 올바른 순서에 있는지 확인하기위한 최종 점검을한다.
- "시작 실행"버튼을 클릭합니다. 24 개 샘플 (96- 웰 플레이트의 웰 제 3x8) 각각의 실행 완료 미만 55 분 걸린다.
Electropherogram 6. 분석 자료 쌍의 차이점을 확인하는
- 모세관 전기 영동 실행이 완료되면 결과를 분석하는 분석 소프트웨어를 엽니 다.
- 아이콘을 "프로젝트에 추가 샘플"및 실행 파일이 들어있는 폴더를 검색을 클릭합니다. 단계 5.1.12 결과 파일의 지정된 위치에서 상기하자.
- 완성 된 실행 및 CL 각 주입의 모든 결과 파일을 선택은 "목록에 추가"버튼을 싫어지기; 이러한 파일의 이름은 "INJ"로 시작 및 실행의 세부 사항을 포함한다.
- 분석을 진행하기 위해 "추가 분석"버튼을 클릭합니다.
- 첫 번째 샘플을 클릭하고 마지막 샘플까지 커서를 드래그하여 실행에있는 모든 샘플을 선택한 다음 "디스플레이 플롯"아이콘을 클릭합니다.
- 주황색 아이콘을 확인하고 컬러 아이콘의 나머지 부분을 취소하여 결과의 오렌지 채널을 열고, 크기 표준의 품질을 확인하려면; 이 크기-호출은 정확하고 신뢰할 수 있는지 확인하는 것이 중요하다.
- 타겟팅되지 않은 제어 유래의 단편과 클론 대상에 대응하는 피크를 확인하기 위해, 이들 채널에서 판독을 열고, 청색 및 녹색 아이콘을 확인.
- 첫 번째 결과 플롯을 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭의 수평 축 위에 커서를 놓고 "전체보기를." 결정을 한 눈에 모든 결과를 볼 수 아래로 스크롤실행에 어떤 큰 문제가있는 경우. 플롯의 관련 축에 마우스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 한 값의 특정 범위를 확대하려면 "확대하려면 ..."을 선택하고 관심의 값의 범위에서 키를 누릅니다.
참고 : 하나의 잠재적 인 큰 문제는 모든 샘플은 낮은 강도 피크를 제공한다는 것입니다. 이는 모세관 전기 영동으로 실행하거나 용이 PCR 공정을 반복함으로써, 또는 각각 낮은 희석 배수를 사용하여 증폭 산물을 희석하여 수리 할 수있는 증폭의 과도한 희석 전에 형광 표지 된 증폭 산물의 장기간 보관에 일반적이다. - 결과를 저장하려면, 아래에 설명 된 단계를 수행합니다.
- 파란색과 녹색 채널이 선택되어 있는지 확인하고 "크기 조정 표"아이콘을 클릭합니다.
- "파일"을 열고 선택하여 탭으로 구분 된 텍스트 (.txt) 형식으로 값의 테이블을 저장 "내보내기 테이블을." 그에 따라 파일 이름을 지정하고 원하는 파일 위치를 선택합니다.
- 플롯을 저장하려면PDF 형식의 실행의들, "파일"로 이동하여 "인쇄"옵션을 클릭합니다. 관련 PDF 작가를 눌러 선택 "인쇄." 그에 따라 파일 이름을 지정하고 원하는 파일 위치를 선택합니다.
- 불특정 야생형 제어 및 CRISPR / Cas9 타겟 클론으로부터 유도 된 단편의 크기의 차이를 계산하기 위해, 이하의 단계를 따른다.
- 스프레드 시트 프로그램과 단계 6.9.2에서 탭으로 구분 된 텍스트 (.txt) 파일을 엽니 다. 표는이 네 가지 중요한 열을 포함한다 : "염료 / 샘플 피크"(파란색 또는 녹색 채널을 나타냄), "샘플 파일 이름을", "크기"(첫 번째 문자가 잘 또는 샘플 이름을 표시 ()의 크기를 나타내는 단편이라고 함), 및 피크의 형광 강도를 나타내는 "높이"().
- 관련 피크를 골라하려면 예상 크기 범위에없는 자들을 제외합니다.
참고 : 일반적으로 INDEL 변이가 거의 더 발생하지크기가 100 bp의 차이보다; 이에 따라, 그 크기 (녹색 채널 지배적 피크) 야생형 제어 피크보다 100 bp의 차이에 의해 피크는 제외한다. 이것은 쉽게 스프레드 시트의은 "조건부 서식"기능에서 옵션 "사이"를 사용하여 수행 할 수 있습니다. - 배경 수준에서 구별되지 않은 특정 피크를 제거하려면, 그 높이 2,000 대보다 낮은 피크를 제외 할 스프레드 시트 프로그램에서 "조건부 서식"기능에서 "보다 작음"옵션을 사용합니다. 이 컷 - 오프 값은 경험적으로 결정되었으며 맞게하다고 인정하는 경우, 따라서 조정할 수 있습니다.
- 전자에서 후자를 뺀 청색 채널 (CRISPR / Cas9 타겟 클론) 및 녹색 채널 (불특정 야생형 대조군)의 유일한 피크 얻어진 각 피크 사이의 단편 크기의 차이를 계산한다.
참고 : 각 모세관 핵산 전기에 의한 값을 사용하는 것이 중요합니다ESIS 샘플로서 야생형 제어의 단편 크기에서 샘플 간 차이가있을 수있다. - 가장 가까운 정수로 값 오프 라운드에 삽입 또는 문제의 게놈 시퀀스 (있는 경우)에서 삭제 된 기본 쌍의 수를 결정합니다. 유전자를 두드리는 것은 관심을 때, 그 INDEL 변이없는 3 BP의 배수의있는 선택 클론 코딩 서열의 틀 이동이 있는지 확인합니다.
클론의 넉 아웃 상태 7. 확인
- 0.25 % 트립신 EDTA의 25 μL를 사용하여 세포를 trypsinizing 5 분 동안 37 ℃에서 배양하여 24 웰 플레이트 (단계 2.4 및 2.6)을 96 웰 플레이트에서 각각의 녹아웃 클론 확장.
- 트립신으로 세포 배지를 125 μL (DMEM, 10 % FBS가 보충 된)를 첨가하고, 철저히 재현 탁.
- 실온에서 5 분 동안 400 XG에 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 가능하여 진공 흡입 또는 피펫으로 매체만큼 제거 배지 500 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 24 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액을 전송. 세포를 80-90 % 컨 플루 언스 (confluence)에 도달 할 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션.
- 24 웰 플레이트에서 6 웰 플레이트와 6 웰 플레이트에서 그들은 80에 도달 10 cm 접시에 직렬로 개별 클론을 확장 - 다음 볼륨을 사용하여 반복 단계 7.1 7.4, 90 %의 합류를 : 0.25 %의 50 μL 트립신 및 EDTA (6 웰 플레이트에 24 웰 플레이트에서 확장하는) 배지 150 μL 0.25 % 200 μL 트립신 EDTA 및 배지 1 ㎖ (6-에서 확장하는 잘) 10 cm 접시에 접시.
- 0.25 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 사용하여 5 분, 37 ° C에서 배양 세포를 trypsinizing 90 % 합류 -가 80에 도달하면 클론을 수확.
- 트립신 resuspe 세포에 배지 5 ㎖를 (DMEM, 10 % FBS가 보충 된) 추가철저하게 ND.
- 실온에서 5 분 동안 400 XG 두 개의 15-㎖의 튜브, 원심으로 동일 세포 현탁액을 전송하고, 가능한 한 매체를 제거한다. 세포의 일부 게놈 DNA 추출을위한 것이며 다른 하나는 전체 단백질을 추출한다.
- 생거 시퀀싱을 통해 확인을 위해 아래에 설명 된 단계를 수행합니다.
- 이전 12 바와 같이 클론으로부터 게놈 DNA를 추출한다.
- 3.2 절에 설명 된대로 CRISPR / Cas9 대상 부위에 걸친 영역의 PCR 증폭을 수행하지만, 표지 된 프라이머를 사용한다. 태그에서 형광 후속 생거 시퀀싱 단계 방해로,이 단계 표지 프라이머를 사용하지 마십시오.
- 이전 12 바와 같이 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 증폭 산물을 정제.
- previousl 바와 같은 클론의 유전자형을 결정하는 단계 7.9.2에서 사용 된 PCR 프라이머를 사용하여 정제 된 앰플 리콘을 순차적예 12.
- 이전 12 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인 들어, 야생형 세포와 표적 클론에서 전체 단백질을 추출한다.
- 이전 12 바와 같이, 표적 유전자의 단백질에 대하여 적절한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행; 진정한 녹아웃 클론 단백질의 발현없는 것입니다.
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Representative Results
여기에 설명 된 PCR 형광 모세관 전기 영동 기술은 외래 DNA 전달하는 의무가 거의 모든 세포주에서 유전자 타겟팅 임의 영역에 적용될 것으로 기대된다. 우리는 이전에 대장 암 세포주 12 세 유전자를 대상으로 자사의 응용 프로그램을 증명하고있다. 여기서, 우리는 CRISPR와 대상으로 간암 세포주 인 HepG2를 유전형에서의 효능 / Cas9 1 (NAP1L1) 유전자와 마찬가지로 뉴 클레오 단백질 조립 한 구성에 대해 도시한다. 사실, 우리는 성공적 수많은 다른 유전자 (12)를 대상으로 인간을 제외한 포유 동물 세포주, (13)를 포함하여 다양한 세포 유전형하는 형광 PCR 모세관 전기 영동 방법을 이용했다.
실험 와이즈 형광 PCR 모세관 전기 영동 techniqUE는 쉽게 수행 할 빠릅니다. Cas9 및 sgRNA 식의 도입은 세포 및 양성 클론의 선택으로 구축 한 후, 개개 클론을 직접 만든 용해 완충액, 다이렉트 다운 Lyse 버퍼 (12)를 사용하여 96 웰 배양 플레이트에서 직접 용해된다. 우리의 경험에 의하면, 그 결과 해물을 게놈 DNA 품질의 상당한 손실없이 몇 달 동안 -20 ° C 이하에서 저장 될 수 있습니다. 용해 공정은 CRISPR 대상 영역에 걸쳐 형광 표지 된 증폭 산물의 생산을 포함 PCR 증폭 단계로 이어진다. 제공된 형광 PCR 프로토콜은 이러한 목적을 위해 최적화 된 관계없이 일관 영역의 증폭, PCR 충분한 제품을 생산하고있다. 도 1은 개별 CRISPR / Cas9 타겟 클론에 대응하는 각 레인 corresp 다양한 밴드 형광 PCR 공정 유래의 증폭의 해상도의 대표적인 결과를 나타낸다클론 개체의 대립 유전자의 증폭 지역 onding. 우리의 경험에서, 다른 중합 효소 및 그 수반 프로토콜의 사용은 낮은 앰플 리콘 수율 결과. 이 쉽게 모세관 겔 전기 영동 용 샘플 준비 동안 희석 배수를 조정하여 수리 할 수 있지만, 낮은 수율의 증폭이 사용되는 경우, 배경이나 노이즈 레벨은 결과적으로 더 높을 수있다. PCR을 공정 후, 증폭 산물이 희석되고, 야생형 샘플들 및 표적 클론 모세관 겔들은 탈 포름 아미드 버퍼 사이즈 표준 변성에 첨가되기 전에 동일한 비율로 혼합하고, 해결된다.
모세관 겔 전기 영동 완료 후, 유전자형 결과는 분석 될 준비가된다. 결과 중요한 두 세트는 전기 영동 실행에서 요구된다 피크 함유 electropherograms 개별 형광 신호 및 제 대응계산에 필요한 모든 필요한 값을 포함하는 전자 결과표. 도 2는 인 HepG2 세포에서의 유전자에 대해 NAP1L1 sgRNA 타겟팅 개의 클론의 유전자형에 대한 결과를 나타낸다. 청색 피크는 CRISPR / Cas9 표적 클론의 돌연변이 INDEL 함유 대립 유전자의 증폭에 대응하는 반면, 녹색 피크, 보호자 인 HepG2 세포에서의 불특정 야생형 대립 유전자의 증폭에 해당한다. 명확하게 도시 된 바와 같이, 두 개의 클론은 두 대립 유전자 하나 개와 열 뉴클레오티드의 삭제와 동형 접합 돌연변이 (동일 돌연변이 대립 유전자와 돌연변이)이다. 이 피크 값은 야생형 세포의 표적 클론의 증폭 및 그 사이의 염기쌍 차이의 개수를 결정하는 중요한 반면 electropherograms가 만 시각화를 위해 사용되는 것을 유의하는 것이 중요하다.
녹아웃 상태의 신뢰성을 검증하기 위해 수행하는 것이 좋습니다생거 시퀀싱 및 웨스턴 블롯 분석은 세포에서 유전자 발현의 폐지를 확인합니다. 위에 명시된 두 클론 형광 PCR 모세관 겔 전기 영동 결과 (도 3a)과 일치 생거 시퀀싱 결과를 주었다. 녹아웃 클론의 예상대로도 NAP1L1 단백질 발현을 완전히 절제 (도 3b)를 표시.
그림 1 : NAP1L1 유전자에 대해 CRISPR / Cas9에 의해 표적 인 HepG2 클론의 PCR 증폭. 형광 PCR 증폭 단계의 두 개의 별도의 아가 로스 겔 (상단 및 하단)에 해소하고, 각 레인은 개별 표적 클론에 대응한다. L :은 DNA 래더 (개별 대역의 크기는 다음 도면에 제공되어있다). 그녀를 클릭하십시오전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 : 모세관 젤 전기 영동을 통해 해결 된 두 샘플에서 형광 신호의 플롯. 수평축은 단편의 크기를 나타내고 수직축은 형광 신호 강도를 나타낸다. 녹색 피크 야생형 세포로부터 유래 된 단편에 해당하는 반면 청색 피크, CRISPR / Cas9 매개 표적 클론 유래의 단편에 대응한다. 마젠타 선 일관 샘플에 걸쳐 피크 위치를 표시 마크 분석 소프트웨어에 의해 결정 자동 호출 피크 위치에 대응한다. 각 피크의 옆에 제공되는 값 (혈압) 단편의 크기에 대응하여 분석 소프트웨어로부터 얻어진다. 괄호 안의 값은 개별 FRA 간의 크기 차이를 계산 묘사대상 복제 및 야생형 조각에서 gments. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 분석 실험의 결과는 두 개의 클론의 대상 유전자의 넉 아웃을 확인합니다. 지정된 단백질에 대한 항체를 사용하여 (A) 생거 시퀀싱 결과 (B) 웨스턴 블롯 분석. 블루 뉴클레오티드 적색 사람이 protospacer 인접 모티브 (PAM)를 나타내는 상기 sgRNA 표적 서열을 나타내고,있는 것들 갈색 염기 치환 된 뉴클레오티드를 나타내고, 파선은 뉴클레오타이드는 대립 유전자에서 삭제 된 위치를 나타낸다. 다음 개별 클론 이름에 괄호 안의 숫자는 클론의 대립 유전자의 유전자형을 나타내고; ""-1 "-1. 0 "대립 유전자는 각각 하나 열 개 뉴클레오티드의 삭제를 포함하는 것을 의미 웨스턴 블롯에서 검출 단백질의 대략적인 크기는 분석 : ~ 54 NAP1L1에 대한 kDa의와 ~ P84 (로딩 제어) 84 kDa의. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
| 시약 | 한 반응 볼륨 (μL) |
| 키트 특정 솔루션 | 4 |
| 10 배 PCR 버퍼 | 이 |
| 10 μM 정방향 프라이머 (표지) | 1 |
| 10 μM 역방향 프라이머 (표지되지 않은) | 1 |
| 25 mM의 dNTP의 혼합물 | 0.4 |
| 의 Taq DNA 중합 효소 | 0.2 |
| 물 | 8.4 |
| 희석 해물 | 삼 |
| 합계 | (20) |
표 1 : 형광 PCR 반응 시약.
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Discussion
선택의 모델 세포주에서 특정 유전자에서 노크는 유전자가 특정 세포 맥락에서하는 역할을 해명하기위한 일상이되었다. 사실, 여러 게놈 넓은 화면은 게놈 14, 15, 16에 거의 알려진 모든 인간의 유전자를 대상으로 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하는 현재 사용할 수 있습니다. 이러한 대규모의 화면 (또는 관심의 개별 유전자의 대상도 소규모)로, 설계와 같은 유전자의 다른 궤적을 대상으로 sgRNAs을 활용하는 것이 중요하다. 명백하게 유전자의 고갈의 실제 효과 항복 것이 사용되는 다른 sgRNAs 일관된 결과. 이와 같이, 하나 개의 유전자 타겟팅을 정확하게 사용 개별 sgRNA 각각으로부터 다수의 클론 유전자형 고용량 유전자형 단계를 필요로한다. 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술은 그 설명정확하게이 작업을 수행 할 수 있습니다 다시.
기존의 유전자형 방법의 대부분은 높은 처리량을 위해 의무가있는 동안, 그들 각각은 이상적이지를 렌더링 특정의 본질적인 한계에서 겪고있다. 10 이중 가닥 DNA에서 불일치를 검출하는 검사원 또는 T7E1, 분석은 야생형 세포에 의한 두 가지 클론 불일치 11없는 이중 가닥을 생성한다는 사실에 동형 접합 돌연변이 (동일한 두 돌연변이 대립 유전자를 가진 클론)를 구별 할 수 없다. CRISPR 대상 영역 (17) INDEL 돌연변이로 인해 제한 부위의 소실을보고 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석은, 상기 대상 영역 (18)에 적합한 제한 부위의 가용성에 의해 제한된다. 녹는 곡선 (19)에 기초하여 상이한 유전자형을 분별하는 DNA 용융 분석 기술, (20)은 일관성의 부족으로 겪고있다. 또한, 이러한 방법의 세들은 유전 순서의 틀 이동의 발생을보고하지 않는 것이 특히 유익하지 않다. 반면, 생거 시퀀싱 - 현재 가장 인기 유전자형 기술 - 그것은 대상이되는 게놈 영역의 정확한 순서를 제공하기 때문에 매우 유익하다. 그러나,이 기술은 특히 대규모 실험에서, 비용이 많이 드는 것입니다. 그것은 상술 한 다른 기술이 직면 한 모든 제한을 회피 할 수 있기 때문에, 여기에 설명 된 PCR 형광 모세관 전기 영동 기법의 특성은 중요하다.
형광 PCR 모세관 전기 영동 기술이 클론에-야생형 존재할 수있는 모든 가능한 유전자형을 구별하는 사용자 수, 동형 접합성 돌연변이 체 (a 야생형 대립 유전자 및 돌연변이 대립 특징) 이형 돌연변이 (두 식별자 특징iCal의 돌연변이 대립 유전자), 및 두 개의 동일하지 않은 돌연변이 대립 특징 화합물 돌연변이 이형 (). 이 유전자형은 electropherogram의 피크 패턴을 쉽게 미분 가능하다. 또한,이 유전자형 기술은 표적 클론의 조각 야생형 앰플 리콘의 크기 및 그 사이의 차이를보고하고 단일 염기쌍에 정확하다. 이 효과적으로 사용자가 그들에게 시간과 비용을 절약 클론의 소수에 자신의 검증을 줄일 수 있도록, 유전자 서열의 틀 이동의 유무를보고합니다. 그 위에,이 기법은 (즉, 그것은 동시에 하나 개의 타겟 이상의 유전자형 수) 표적 유전자의 멀티플렉싱을 가능하게하고, 이는 비정상적인 피크 패턴의 존재 (예를 들어, 앞에서 이종 세포 집단의 검출을 가능하게 이배체 세포의 electropherogram 세 이상의 피크)의. 여기에 이전에 사용 된 12 세포주 이외에 </ SUP> 13 또한 성공적 형광 PCR 모세관 겔 전기 영동 기술을 사용하여, 줄기 세포 및 신경 세포 (미발표 데이타)을 포함하여, 다양한 인간 및 비인간 세포주 유전자형을 가지고, 우리는이 기술을 적용 할 것으로 예상 CRISPR / Cas9 타겟팅 의무가있는 모든 세포에. 이 기술은 셀의 각각의 대립 유전자의 유전자형을보고 이후 또한, 이러한 염색체 또는 유전자 증폭을 암세포와 같은 다중 대립 세포를 유전형에서 매우 유용하다.
프로토콜은 CRISPR / Cas9 표적 클론의 다양하고 재현성있는 유전형에 대해 최적화되어있다 (사용 된 모든 재료를 포함)는 여기에 설명. 그럼에도 불구하고, 수정을 보증 몇몇 부분이있다. 이들은 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 다른 선택 전략의 사용을 필요로 할 수있다 1) 다른 sgRNA 발현 벡터를 사용 (또는 클로닝 전략)(예를 들어, FACS의 대신 클론의 항생제 선택); 2) 형광 PCR 공정에 다른 폴리머의 사용; 3) 다른 형광 라벨의 사용. 또한, 프로토콜에 필수적인 몇 가지 단계가 문제가 될 수 있음을 주목할 필요가있다. 하나의 경우, 형광 PCR 증폭 산물을 아가 로스 겔에서 불특정 electropherogram 대역을 수득되거나, 모세관 겔 electropherogram의 피크 패턴이 될 수있다 "소음." 이는 PCR 프라이머의 하위 최적의 품질에 가능성이 있으므로 이러한 프라이머를 재 설계하여 수리 할 수 있습니다. 우리는 증폭 단계의 일관성, 재현성 및 특이성을 보장하기 위해 형광 표지 사람들을 조달하기 전에 레이블이없는 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 프라이머의 품질을 테스트하는 것이 좋습니다. 주목해야 할 또 다른 중요한 요인은 진정한 긍정적 인 녹아웃 클론을 얻는 속도를 결정할 수 CRISPR 가이드 RNA의 효율성이다. sgRNA 검색 음식물의 아무도 이후현재 사용할 수있는 램은 각 개별 sgRNA의 효능 만 경험적으로 결정될 수, 절대 안전한 있습니다. 따라서, 설계 및 성공적인 녹아웃 클론을 취득하지 가능성을 줄이기 위해 각각의 타겟 유전자 sgRNA 하나 이상의 (바람직하게는 3 개 이상)를 이용하는 것이 중요하다.
형광 PCR-모세관 전기 영동 기술은, 정보 민감하고 사용하기 쉬운 반면, 그것은 몇 가지주의와 함께 제공됩니다. 첫째,이 기술은 쉽게 사용할 수 없습니다 유전 분석기의 사용을 필요로한다. 이 목적을 위해 사용되는 유전자 분석기가 생거 시퀀싱 실험에 사용 된 것과 같은 하나이기 때문에, 모세관 전기 영동 프로토콜은 기존의 생거 시퀀싱 서비스 제공 업체에 아웃소싱 할 수있다. 사실, 우리는 이전에 사내 할 경우에 비해 비용 모세관 전기 영동 프로토콜을 수행 할 수있는 우리의 시퀀싱 서비스 제공 업체에 배치했다. techniq의 둘째, 정확성INDEL 변이가 이상 30 BP가 관련되는 경우 단말은 저하 될 수 있습니다. 경험상, 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술은 큰 삽입이나 삭제 (> 30 BP)이 관찰 될 때 삽입이나 삭제의 사이즈를 과소 평가하는 경향이있다. 그러나 우리의 경험에서, 돌연변이의 대부분은 (대부분의 미만 5 BP 있습니다) 매우 짧은 INDEL 변이 길이를 표시. 그럼에도 불구하고,이 사용 된 CRISPR 대상 사이트 및 세포주에 크게 의존한다. 셋째, 형광 PCR-모세관 전기 영동 기술은 CRISPR / Cas9 컷 사이트에서 NHEJ 수리시 기본 대체를 감지 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고,이 이중 가닥 휴식의 NHEJ 수리의 결과로 염기 치환이 드문 이벤트 (21)이라고보고되고있다, 그들은 해로운 유전자의 독서 프레임을 변경하지 않습니다. 넷째,이 기법은 (유전 적 변화를 ou 모든 오프 - 타겟 수차를보고하지 않고 따라서 형광 PCR 공정에서 증폭 된 대상 영역의 변화를 검출하고,) 증폭 영역 tside. 개별 CRISPR의 sgRNA의 오프 대상 효과 등 종합적인 조사가 필요한 경우, 우리는 정확하게 표적 클론의 게놈에 어떤 변화를 감지하는 전체 게놈 시퀀싱을 권장합니다. 전술 한 바와 같이 하나 이상의 sgRNA가 표적 유전자 당 사용되는 경우에는, 오히려 비용이 실험은 필요하지 않다. 마지막으로, 여기에 설명 된 PCR 형광 모세관 전기 영동 기술은 600 염기쌍의 단편 크기 한계를 갖는다. 타겟 영역이 반복되는 시퀀스로 구성 또는 PCR 증폭 효율 및 특이성에 영향을 미칠 수있는 매우 높은 구아닌 - 시토신 (GC) 콘텐츠를 갖는 경우에 문제를 제기 할 수있다. 이 쉽게 예방 문제는 대상 지역의 적절한 증폭에 대한 적절한 고려가 포함되어야합니다주의 sgRNA 대상 디자인의 중요성을 강조하고있다. 따라서, 강도 및 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술주의, 유전자형이 용이 한 방법을 고려이 일에 병목 현상 남아 녹아웃 클론의 대량 유전자형의 부담을 완화 할 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 모세관 전기 영동 실험을 도와 양 탄시 민, 미스 헬렌 옹, 박사 자오 이순신에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 / 2,011분의 1,314 NMRC 및 환경부 AcRF 계층이 기금 보조금 MOE2011-T2-1-051을 부여 NMRC / IRG에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
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