Summary
La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.
Abstract
El desarrollo de herramientas de edición de genoma programables ha facilitado el uso de genética inversa para entender los papeles secuencias genómicas específicas juegan en el funcionamiento de células y organismos enteros. Esta causa ha sido enormemente ayudado por la reciente introducción de la CRISPR / sistema de un Cas9 herramienta versátil que permite a los investigadores manipular el genoma y transcriptoma con el fin de, entre otras cosas, knock out, derribar, o golpeen en los genes de forma focalizada manera. A los efectos de la anulación de un gen, CRISPR / Cas9 mediada por roturas de la doble hebra reclutan la vía de reparación del DNA unión de los extremos no homóloga para introducir la inserción o deleción que causan desplazamiento del marco de los nucleótidos en el sitio de ruptura. Sin embargo, un ARN guía individual puede causar indeseables efectos fuera de objetivo, y para descartar éstos hacia fuera, el uso de múltiples guía RNAs es necesaria. Esta multiplicidad de objetivos también significa que se requiere una selección de alto volumen de clones, que a su vez plantea la utilización de un efciente técnica de alto rendimiento para determinar el genotipo de los clones de final. técnicas de genotipificación actuales o bien sufren de limitaciones inherentes o incurren en altos costos, por lo tanto haciéndolos inadecuados para fines de alto rendimiento. Aquí, nos detalle el protocolo para el uso de fluorescente PCR, que utiliza ADN genómico a partir de lisado celular bruto como una plantilla y, a continuación, la solución de los fragmentos de PCR a través de electroforesis en gel capilar. Esta técnica es lo suficientemente precisa para diferenciar diferencia de un par de bases entre los fragmentos y por lo tanto es adecuada para indicar la presencia o ausencia de un desplazamiento de marco en la secuencia codificadora del gen diana. Este conocimiento preciso impide de hecho la necesidad de una etapa de secuenciación confirmatoria y permite a los usuarios ahorrar tiempo y costes en el proceso. Además, esta técnica ha demostrado ser versátil en el genotipado de diversas células de mamíferos de diversos orígenes tisulares dirigidas por ARN de guía contra numerosos genes, como se muestra aquí y en otros lugares.
Introduction
enfoques de genética inversa han permitido a los científicos para dilucidar los efectos de alteraciones específicas en el genoma de la célula u organismo completo. Por ejemplo, la expresión de un gen particular puede ser atenuada por el gen knockdown 1, 2 (reducción parcial) o knockout del gen 3, 4 (ablación completa) con el fin de determinar el efecto que esto tiene sobre la función de la célula o en el desarrollo del organismo.
experimentos de eliminación de genes se han convertido en más fácil desde la introducción de nucleasas programables específicos de secuencia, tales como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas efectoras del tipo activador de transcripción (Talens). Sin embargo, la relativamente reciente caracterización de la CLUSTERED intercalados regularmente de repetición corta capicúa (CRISPR) / sistema de Cas9 ha hecho que sea extremadamente fácil para cualquier laboratorio en todo el mundo para llevar a cabo Genknockout experimentos e. En esencia, el sistema / Cas9 CRISPR consta de dos componentes esenciales: un guía única de ARN (sgRNA), que reconoce y se une a través de complementariedad de bases a una secuencia específica en el genoma, y una endonucleasa llamada Cas9. Las secuelas de la acción de unión y específica del complejo sgRNA-Cas9 en el ADN genómico es la rotura de la doble cadena de ADN. Esto, a su vez, desencadena el mecanismo de respuesta al daño del ADN en la célula, que se repara posteriormente a través de las vías (HR) de extremos no homólogos de unión (NHEJ) o de la recombinación homóloga. Dado que el mecanismo NHEJ de reparación (pero no el mecanismo HR) a menudo resulta en la inserción aleatoria o deleción de nucleótidos en el sitio de reparación, lo que resulta en la inserción / deleción mutaciones (indel), puede provocar que el marco de lectura de un exón se desplace. Esto puede entonces dar lugar a la knockout del gen debido a la terminación prematura de la traducción y la descomposición mediada por el antisentido 5, 6,7.
A pesar de la conveniencia proporcionada por la introducción del sistema / Cas9 CRISPR en la anulación de un gen, la determinación del genotipo de los clones de células diana sigue siendo un cuello de botella, especialmente en un entorno de 8, 9 de alto rendimiento. Las técnicas existentes o bien sufren importantes limitaciones inherentes o son económicamente costosa. Por ejemplo, el ensayo inspector o T7E1, que es un ensayo enzimático que detecta desajustes en el ADN dúplex 10, no es capaz de distinguir entre los clones de tipo silvestre y mutantes homocigotos (clones cuyos alelos están mutados de forma idéntica), ya que estos clones tienen alelos idénticos y por lo tanto no presentan desajustes en su secuencia de ADN 11. Además, el uso de la secuenciación de Sanger, que se considera el estándar de oro en el genotipo de los clones mutantes, en una configuración de alto rendimiento no es deseable debido a su alto coste. A continuación, presentamos un detprotocolo ailed de la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente, que pueden sustraerse a las limitaciones de las otras técnicas de genotipificación existentes y es particularmente útil en la realización de una pantalla de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Este método es técnicamente sencillo de realizar y permite ahorrar tiempo y costes.
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Protocol
1. La obtención de CRISPR / clones de una sola célula orientados Cas9
- células HepG2 Seed en una placa de 6 pocillos a 500.000 células por pocillo en 2 ml de de antibiótico-libre de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Incubar durante 24 h a 37 ° C y 5% de CO2.
- transfectar células con el plásmido co-expresión de Cas9 y sgRNA específica contra el gen de interés usando un reactivo de transfección apropiado según las instrucciones del fabricante.
NOTA: Por ejemplo, sgRNA se puede clonar en el 2A-GFP vector pSpCas9 (BB), como se describió previamente 4. - Reemplazar el medio de cultivo 4 - 16 h después de la transfección con 2 ml de medio fresco libre de antibióticos.
- Aproximadamente 48 h después de la transfección, recogen suspensión de una sola célula por tripsinización de las células.
- Se tripsinizan las células en 0,2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Añadir 1 ml de medio y volver a suspender thoroughly.
- Clasificar las células para clones GFP-positivas, como se ha descrito previamente 12, y recoger alrededor de 3.500 células.
- Placa de las células clasificadas GFP-positivas en placas de 10 cm a 500, 1.000 y 2.000 células por placa en 8 ml de penicilina medio de cultivo / estreptomicina suplementado. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2.
- Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2, reemplazando el medio cada cinco días, hasta que crecen en colonias de una sola célula lo suficientemente grandes como para ser visibles a simple vista. Para la mayoría de las líneas celulares de cáncer, esto toma alrededor de dos semanas desde el primer día de la siembra.
- Cuando las colonias son del tamaño apropiado (es decir, visible al ojo desnudo), la transferencia de las colonias individuales a pocillos de una placa de cultivo de 96 pocillos que contenía 200 l de DMEM suplementado con 10% de FBS.
- Aspirar las colonias de una sola célula usando una pipeta de 200 l con un pequeño volumen de medio. Resuspender las células a fondo en enpozos dividual por trituración varias veces.
- Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2, reemplazando el medio cada cinco días, hasta que alcanzan el 50 - 90% de confluencia. Para la mayoría de líneas celulares de cáncer, esto toma aproximadamente 24 - 48 h.
2. El ADN genómico de extracción en bruto usando un método de lisis directa
- Cuando las células alcanzan el 50 - 90% de confluencia, eliminar la mayor cantidad del medio de cultivo de los pocillos como sea posible utilizando succión de vacío de múltiples canales o una pipeta multicanal.
- Añadir 25 l de 0,05% de tripsina-EDTA (sin rojo fenol) en cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 7 min.
- Resuspender las células tratadas con tripsina minuciosamente pipeteando arriba y abajo varias veces. Compruebe las células bajo un microscopio para asegurarse de que se separan de la superficie de plástico.
- Crear una réplica de los clones individuales mediante la transferencia de aproximadamente 5 l de la suspensión de una sola célula a un vacío de 96 pocillos plat culturami. Añadir 200? L de medio de cultivo a cada pocillo y mantener las células hasta que los clones positivos se identifican mediante electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente (véase a continuación). En serie expandir las células a placas de 10 cm o cualquier otra escala de elección (véase la sección 7).
- Añadir 5 l de la suspensión de una sola célula de Paso 2.3 a 10 l de tampón-lyse directa casera (10 mM Tris pH 8,0, EDTA 2,5 mM, 0,2 M de NaCl, 0,15% de SDS, y 20 Tween-0,3%) 12 en una placa de 96 pocillos PCR y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. brevemente Centrífuga (a llevar el líquido hasta la parte inferior de los pocillos).
- Añadir 200? L de medio de cultivo para los restantes ~ 15! L de suspensión de células de la etapa 2.3 y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2, junto con la réplica de la etapa 2.4.
- Someter los lisados de la etapa 2.5 para el siguiente programa de ciclo térmico para asegurar la lisis completa de las células y la liberación de ADN genómico: 65 ° C durante 30 s, 8 ° C durante 30 s, 65 ° C durante 1,5 min, 97 ° C durante 3 min, 8 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 3 min, 97 ° C durante 1 min, 65 ° C durante 1 min, y 80 ° C durante 10 min. Centrifugar los lisados brevemente.
- Diluir los lisados mediante la adición de 40 l de agua libre de nucleasa y se mezcla a fondo utilizando un mezclador de vórtice. centrifugar brevemente. Los lisados diluidas se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a -20 ° C durante varios meses sin pérdida significativa de calidad.
3. Realización de fluorescente de PCR para amplificar CRISPR / Regiones Cas9 objetivo
- Diseño dos cebadores marcados con fluoróforo hacia adelante (tanto marcado en el extremo 5' ) para cada región diana CRISPR / Cas9; sitios que están más allá de 300 pb entre sí deben ser considerados como dos regiones diana separada (por ejemplo, verde cebador marcado con fluoróforo para el control de tipo salvaje no directo y azul cebador marcado con fluoróforo para CRISPR / clones orientados Cas9 corte; ver la Tabla de Materia ls).
- Adquirir estos etiquetados cebadores directos y un cebador inverso no marcado en consecuencia. Tenga en cuenta que los cebadores pueden diseñarse utilizando cualquier herramienta de elección y que los amplicones deben ser de 200 - 500 bp long.
- Realizar PCR como se describió anteriormente 12 para amplificar las regiones de destino utilizando los cebadores marcados.
- Utilice 3 l de los lisados diluidas de la etapa 2.8 en una reacción de 20-l (véase la Tabla 1) y el siguiente programa de ciclo térmico: 94 ° C durante 10 min (1 ciclo); 94 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min (4 ciclos); 94 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min (4 ciclos); 94 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 1 min (4 ciclos); 94 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s, y 68 ° C durante 1 min (35 ciclos).
- Resolver 5 l de los amplicones de PCR en un gel de agarosa al 1% para comprobar el tamaño y la cantidad relativa de ampliconesss = "xref"> 12.
NOTA: La ejecución de este paso para todas las muestras se recomienda pero no es necesario; la resolución de un número seleccionado de muestras es suficiente para estimar la cantidad de amplicones presentes en las muestras en general.
4. Las muestras se preparan para electroforesis en gel capilar
- Diluir amplicones de tipo salvaje (células parentales no orientados) y / DNA-dirigida de Cas9 CRISPR en agua libre de nucleasa a aproximadamente 2,5 ng / mL. Asegúrese de diluir suficiente muestra de ADN de tipo salvaje para ser añadido a cada muestra de ADN objetivo (un mínimo de 0,5 l de muestra de tipo salvaje diluida por muestra dirigida es necesario).
- Mezclar el tipo salvaje diluido y muestras de ADN dirigidas en la misma proporción (por ejemplo, mezclar 1 l de muestra de tipo salvaje con 1 l de muestra objetivo).
- Añadir 1 l de los amplicones mixtos a 8,7 l de formamida desionizada y 0,3 l de estándar de tamaño marcado con colorante en una placa de 96 pocillos de PCR que es compatible con el de una genéticaalyzer.
NOTA: El uso de una mezcla maestra de la formamida y el estándar de tamaño (es decir, una preparación de una premezcla de la formamida y el estándar de tamaño en un 29: 1 proporción antes de la adición de los amplicones para asegurar cantidades estandarizadas) se recomienda. - Estrechamente sellar la placa y calentar las muestras a 95 ° C durante 3 min usando un termociclador PCR.
- Colocar la placa en hielo inmediatamente después de la etapa de calentamiento y se incuba durante al menos 3 min.
5. Realización de electroforesis en gel capilar en un analizador genético
- Configurar parámetros de ensayo, el protocolo de instrumentos, y el protocolo de tamaño de llamada en el software de la electroforesis en gel capilar conectado a un analizador genético.
NOTA: Este paso sólo es necesario para la primera carrera de electroforesis; el programa se puede guardar para uso futuro. Para las ejecuciones posteriores, vaya directamente al paso 5.2.- Haga clic en el icono "Crear nueva placa" en el tablero de instrumentos de software.
- Dar la rONU un nombre falso y seleccione las siguientes opciones: Número de pozos, 96; Tipo de placa, Fragmento; Longitud del capilar, a 50 cm; y Polymer, POP7. Haga clic en el botón "Asignar Placa contenido".
- En "Ensayos", haga clic en "Crear nuevo ensayo"; aparecerá un nuevo panel.
- Nombrar el ensayo "FPCR-CGE Ensayo" y comprobar que "Tipo de aplicación" está ajustado correctamente como "Fragmento".
- Configurar el protocolo instrumento haciendo clic en el botón "Crear nuevo" bajo "Protocolo de instrumentos."
- Ajustar o elegir entre las siguientes opciones y parámetros en las áreas apropiadas: Tipo de aplicación, Fragmento; Longitud del capilar, a 50 cm; Polymer, POP7; Conjunto de colorantes, G5; Ejecutar módulo, FragmentAnalysis; Nombre de protocolo, FPCR-CGE Protocolo Instrumento; Temperatura del horno, 60 ° C; Ejecutar voltaje, 19,5 kV; Previa al funcionamiento de tensión, 15 kV; Inyección de voltaje, 1,6 kV; Tiempo de ejecución, 1.330 s; Tiempo de Pre-run, 180 s; Tiempo de inyección, 15 s; y el retardo de datos, 1 s.
- Click en el botón "Aplicar a ensayo" y luego el botón "Guardar en la biblioteca" para guardar el programa. Cierre el panel para continuar.
- Establecer un protocolo de tamaño llamar haciendo clic en el botón "Crear nuevo" bajo "Protocolo Sizecalling."
- Ajustar o elegir entre las siguientes opciones y parámetros en las áreas apropiadas: Nombre de protocolo, FPCR-CGE Protocolo Sizecalling; tamaño estándar, GS500 (-250) LIZ; Tamaño-persona que llama, SizeCaller v1.1.0; Configuración de análisis, -; Análisis Rango, completa; Rango de tamaño, completa; Tamaño llamando al método, el sur de local; Pico Primer, Present; Azul, verde, naranja Canales, (cheque); Altura de pico mínimo, 175 para todos los canales; Utilizar el suavizado, ninguno; Uso Línea de base (Base Ventana (PTS)), (Check) 51; La mitad del ancho de pico mínimo, 2; Tamaño de la ventana Peak, 15; Polinomio Universitario, 3; Umbral de pendiente Punta de arranque, 0.0; Slope Umbral pico End, 0,0; Ajustes de control de calidad, -; Calidad tamaño, -; Fallar si el valor es <0,25; Pasar si el valor es <0,75; Supongamos Linealidad de 0 pb a 800 pb; y accionador Pull-Up bandera si Ratio Pull-Up ≤ 0,1 y Pull-Up Scan ≤ 1.
- Haga clic en el botón "Aplicar a ensayo" y luego el botón "Guardar en la biblioteca" para guardar el programa. Cierre el panel para continuar.
- Asegúrese de que el ensayo se guarda haciendo clic en el botón "Guardar a la biblioteca" una vez más y salir del panel haciendo clic en el botón "Cerrar".
- De vuelta a la página "Asignar Plate Contenido", haga clic en el enlace "Crear nuevo archivo Convención Nombre" en "convenios de nombre de archivo."
- Nombre del programa "FPCR-CGE Nombre de archivo."
- En "Atributos disponibles", seleccione los atributos deseados que van a aparecer en el nombre del archivo (por ejemplo, "Fecha de Ejecución", "Tiempo de Ejecución", "Bien Posición" y "Nombre de la muestra"). Elija la ubicación del archivo deseado en el que se almacenan los resultados de la ejecución.
- Haga clic en el botón "Aplicar a ensayo" y luegoel botón "Guardar en la biblioteca" para guardar el programa. Cierre el panel para continuar.
- De vuelta a la página "Asignar contenido de la placa", haga clic en el enlace "Crear nuevo Resultados Grupo" bajo "Resultados Grupos".
- Nombre del programa "FPCR-CGE Resultados Grupos".
- En "Atributos disponibles", seleccione los atributos deseados que van a aparecer en el nombre del archivo (por ejemplo, "Nombre de Ensayo"). Elija la ubicación del archivo deseado en el que se almacenan los resultados de la ejecución.
- Haga clic en el botón "Aplicar a ensayo" y luego el botón "Guardar en la biblioteca" para guardar el programa. Cierre el panel para continuar.
- Configurar el programa para ejecutar una electroforesis siguiendo los pasos a continuación.
- Ir al panel de control y haga clic en el icono "Crear nueva placa".
- Nombre de la carrera como se desee (para una fácil referencia, incluir la fecha, la línea celular, y el nombre de gen). Seleccione las siguientes opciones: Número de pozos, 96; Tipo de placa, Fragmento; Longitud del capilar, a 50 cm; y Polymer, POP7. Haga clic en el botón "Asignar Placa contenido".
- Etiqueta de cada pocillo de la muestra, tal como se desea (por ejemplo, una muestra puede ser nombrado "NC" para indicar que el bien es un control negativo).
- En virtud de los convenios "Ensayos", "Nombre de archivo", y "Resultados" cajas Grupos, haga clic en el "enlace Añadir a la biblioteca" y seleccione los programas creados en el paso 5.1.3 a 5.1.17.
- Resaltar todos los pozos para analizar y seleccionar los programas pertinentes en "Ensayos", "Convenciones de nombre de archivo" y "Resultados Grupos" marcando las casillas junto a ellos.
- Antes de cargar la placa de la bandeja del analizador genético, aplicar la junta de goma en la placa de 96 pocillos y poner la placa de sellado en la caja de plástico que viene con el analizador genético.
- Pulse el botón "bandeja" en la parte delantera del analizador genético, y cuando la bandeja de redolores de la parte frontal del equipo, abrir la puerta y cargar la placa revestida en la bandeja. Asegúrese de que la placa esté en su sitio y cierre la puerta.
- Haga clic en el "Enlace Placa para Ejecutar" botón.
- En la página "Cargar placas para Ejecutar", hacer una comprobación final para asegurarse de que todos los reactivos y las condiciones son correctas y en orden.
- Haga clic en el botón "Ejecutar". Cada ejecución de 24 muestras (los primeros pozos 3x8 de la placa de 96 pocillos) tarda menos de 55 min para completar.
6. Análisis de la electroferograma para determinar las diferencias de pares de bases
- Cuando el capilar de electroforesis en gel de ejecución es completa, abra el software de análisis para analizar los resultados.
- Haga clic en "Añadir muestras al proyecto" icono y buscar la carpeta que contiene los archivos de ejecución. Recordemos de paso 5.1.12 la ubicación asignada de los archivos de resultados.
- Seleccionar todos los archivos de resultados de cada inyección en la carrera completado y click en el botón "Añadir a la lista"; los nombres de estos archivos comienzan con "Iny" y contienen los detalles de la carrera.
- Haga clic en el botón "Añadir y analizar" para continuar con el análisis.
- Seleccionar todas las muestras en la carrera haciendo clic en la primera muestra y arrastrando el cursor hacia abajo hasta la última muestra y haga clic en el icono "Display Solares".
- Para comprobar la calidad de la norma tamaño, abrir el canal de color naranja de los resultados marcando el icono naranja y desactivando el resto de los iconos de colores; esto es importante para asegurar que el tamaño de los insultos es precisa y fiable.
- Para ver los picos correspondientes a los fragmentos derivados de la de control no directo y los clones específicos, compruebe los iconos azules y verdes para abrir las lecturas de estos canales.
- Coloque el cursor sobre el eje horizontal de la primera parcela resultados y haga clic derecho para seleccionar "Vista completa". Desplazarse hacia abajo para ver todos los resultados de un vistazo para determinarsi hay algún problema importante con la carrera. Para hacer zoom en un rango específico de valores, haga clic con el ratón sobre el eje correspondiente de la trama, seleccione "Zoom a ...", e introduzca el rango de valores de interés.
NOTA: Un problema potencial es importante que todas las muestras dan picos de baja intensidad. Esto es generalmente debido al almacenamiento prolongado de amplicones marcados con fluoróforo antes de la serie de electroforesis capilar o la sobre-dilución de amplicones, que puede ser fácilmente corregido mediante la repetición de la etapa de PCR o mediante la dilución de los amplicones utilizando un factor de dilución inferior, respectivamente. - Para guardar los resultados, siga los pasos que se describen a continuación.
- Asegúrese de que los canales azul y verde son seleccionados y haga clic en el icono "Tabla Dimensionar".
- Guarde la tabla de valores en formato de texto (.txt) delimitado por tabuladores con la apertura de "Archivo" y seleccionando "Exportar tabla". El nombre del archivo en consecuencia y seleccione la ubicación del archivo de su elección.
- Para guardar la tramas de la carrera en formato PDF, vaya a "Archivo" y haga clic en la opción "Imprimir". Elija el escritor PDF correspondiente y pulsar "Imprimir". El nombre del archivo en consecuencia y seleccione la ubicación del archivo de su elección.
- Para calcular la diferencia en el tamaño de los fragmentos derivados de control de tipo salvaje no directo y los CRISPR / clones orientados Cas9, siga los pasos descritos a continuación.
- Abra el archivo de texto delimitado pestaña (.txt) de la etapa 6.9.2 con un programa de hoja de cálculo. La tabla debe incluir estas cuatro columnas importantes: "Tinte Pico / muestra" (que indica un canal azul o verde), "Muestra de nombre de archivo" (los primeros caracteres indican el pozo o nombre de la muestra), "Tamaño" (que indica el tamaño de la fragmento de llamada), y "Altura" (que indica la intensidad de fluorescencia del pico).
- Para destacar picos relevantes, excluir a aquellos que no están en el rango de tamaño esperado.
NOTA: Por lo general, las mutaciones indel rara vez producen másque una diferencia de 100 pb de tamaño; Por lo tanto, se excluyen los picos cuyo tamaño difiere en más de 100 pb a partir del pico de control de tipo salvaje (pico dominante en el canal verde). Esto puede hacerse fácilmente mediante el uso del "entre" opción en la función "Formato condicional" en la hoja de cálculo. - Para eliminar los picos no específicos, que son indistinguibles de nivel de fondo, utilice el "menor que" opción en la función "Formato condicional" en el programa de hoja de cálculo para excluir picos cuyas alturas son inferiores a 2.000 unidades. Este valor de corte se ha determinado empíricamente y por lo tanto se puede ajustar cuando se considere conveniente.
- Calcular la diferencia de tamaño de los fragmentos entre cada uno de los picos resultantes en el canal azul (CRISPR / clones orientados Cas9) y el único pico en el canal verde (control de tipo salvaje no directo) restando el último de los primeros.
NOTA: Es importante usar valores atribuidos a cada capilar electrophormuestra ESIS, ya que puede haber diferencias entre la muestra en el tamaño del fragmento del control de tipo salvaje. - Redondear los valores al entero más cercano para determinar el número de pares de bases que han sido insertados en o eliminados desde, en su caso, la secuencia genómica en cuestión. Cuando la anulación de un gen es de interés, seleccione clones cuyas mutaciones indel no son de múltiplos de 3 pb para asegurar que no hay desplazamiento de marco en la secuencia codificante.
7. Verificación de la Situación de los clones Knockout
- Expandir clones knockout individuales de la placa de 96 pocillos (de pasos 2.4 y 2.6) a una placa de 24 pocillos por tripsinización las células utilizando 25 l de 0,25% de tripsina-EDTA y la incubación a 37 ° C durante 5 min.
- Añadir 125! L de medio (DMEM suplementado con 10% de FBS) a las células tratadas con tripsina y resuspender a fondo.
- Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Eliminar la mayor cantidad del medio como sea posible utilizando succión de vacío o una pipeta, resuspender el sedimento celular en 500 l de medio, y transferir la suspensión celular a un pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que las células alcanzan 80-90% de confluencia.
- Ampliar los clones individuales en serie desde la placa de 24 pocillos a una placa de 6 pocillos y de la placa de 6 pocillos a una placa de 10 cm cuando se alcanzan los 80 - 90% de confluencia por repetición de las etapas 7.1 a 7.4, utilizando los siguientes volúmenes: 50? l de 0,25% de tripsina-EDTA y 150 l de medio (para la expansión de la placa de 24 pocillos a la placa de 6 pocillos) y 200 l de 0,25% de tripsina-EDTA y 1 ml de medio (para la expansión de la 6- así placa a la placa de 10 cm).
- Cosecha de los clones cuando se alcanzan los 80 - 90% de confluencia por tripsinización las células usando 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
- Añadir 5 ml de medio (DMEM suplementado con 10% de FBS) a las células tratadas con tripsina y resuspend a fondo.
- Transferir la suspensión celular por igual en dos tubos de 15 ml, centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y eliminar el medio de tanto como sea posible. Una porción de las células es para la extracción de ADN genómico y el otro es para la extracción de proteína total.
- Para la verificación a través de la secuenciación de Sanger, siga los pasos descritos a continuación.
- Extraer el ADN genómico de los clones como se ha descrito previamente 12.
- Realizar la amplificación por PCR de la región que abarca el sitio diana CRISPR / Cas9, como se describe en la sección 3.2, pero el uso de cebadores no marcados. No use cebadores marcados para este paso, como la fluorescencia de la etiqueta va a interferir con la posterior etapa de secuenciación de Sanger.
- Purificar los amplicones utilizando un kit de limpieza de PCR, como se describió anteriormente 12.
- Secuenciar los amplicones purificados utilizando los cebadores de PCR usados en la etapa 7.9.2 para determinar el genotipo de los clones, como previousl descritoy 12.
- Para la verificación a través de análisis de transferencia Western, extracto de proteína total a partir de las células de tipo salvaje y clones específicos, como se ha descrito previamente 12.
- Realizar análisis de transferencia de Western usando anticuerpos apropiados contra la proteína del gen diana, como se ha descrito previamente 12; un verdadero clon knockout está desprovista de la expresión de la proteína.
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Representative Results
La técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente descrito aquí se anticipa que sea aplicable a cualquier región objeto de orientación en el genoma en prácticamente cualquier línea celular que es susceptible de suministro de ADN extraño. Hemos demostrado anteriormente su aplicación por la orientación tres genes en una línea celular de cáncer colorrectal 12. Aquí, se muestra su eficacia en el genotipado de una línea celular de carcinoma hepatocelular, HepG2, dirigida con un CRISPR / Cas9 construir frente a la proteína 1 Asamblea Nucleosoma Al igual que 1 gen (NAP1L1). De hecho, hemos utilizado con éxito la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente para determinar el genotipo de diversas otras células, incluyendo las líneas de mamíferos no humanos de células, dirigidos a otros numerosos genes 12, 13.
Experimento-sabia, el fluorescente techniq electroforesis en gel de PCR-capilarue es fácil y rápido de realizar. Después de la introducción de la expresión Cas9 y sgRNA construye en las células y la selección de los clones positivos, los clones individuales se lisan directamente desde la placa de cultivo de 96 pocillos usando nuestra tampón de lisis casera, Direct-Lyse Buffer 12. En nuestra experiencia, los lisados resultantes se pueden almacenar a -20 ° C o menos durante varios meses sin pérdida significativa de la calidad del ADN genómico. La etapa de lisis es seguida por la etapa de amplificación PCR, que implica la producción de amplicones fluoróforo de etiquetado que abarcan la región diana CRISPR. El protocolo de PCR fluorescente proporcionada ha sido optimizado para este propósito y ha producido consistentemente amplias productos de PCR, independientemente de la región que está siendo amplificado. La Figura 1 muestra un resultado representativo de la resolución de los amplicones derivados de la etapa de PCR fluorescente, con cada carril correspondiente a un CRISPR individuo / clon-dirigida de Cas9 y las diversas bandas corresponding a las regiones amplificadas de alelos individuales en los clones. En nuestra experiencia, el uso de otras polimerasas y sus protocolos concomitantes dio lugar a un rendimiento menor amplicón. Aunque esto puede ser fácilmente corregido mediante el ajuste del factor de dilución durante la preparación de la muestra para electroforesis en gel capilar, el fondo o el nivel de ruido pueden en consecuencia ser mayor cuando se utilizan los amplicones de menor rendimiento. Después de la etapa de PCR, los amplicones se diluyen, y las de la muestra de tipo salvaje y los clones específicos se mezclan en igual proporción antes de que se añaden a tampón de formamida desionizada y un estándar de tamaño, desnaturalizado, y se resolvieron en un gel capilar.
Después de la finalización de la electroforesis en gel capilar, los resultados de genotipado están listas para ser analizada. Se requieren dos importantes conjuntos de resultados de la carrera de electroforesis: los electroferogramas que contienen los picos correspondientes a las señales de fluorescencia individuales y THtabla de resultados e que contiene todos los valores necesarios para el cálculo. La Figura 2 muestra los resultados para el genotipado de dos clones dirigidos por sgRNA contra el gen NAP1L1 en las células HepG2. Los picos verdes corresponden a los amplicones del alelo de tipo salvaje no directo en las células HepG2 parentales, mientras que los picos azules corresponden a los amplicones de los alelos que contiene la mutación indel de los CRISPR / clones orientados Cas9. Como se muestra claramente, los dos clones son mutantes homocigotos (mutantes con alelos mutados de forma idéntica), con la deleción de uno y diez nucleótidos en ambos alelos. Es importante señalar que los electroferogramas se utilizan sólo con fines de visualización, mientras que los valores de pico son importantes para determinar el número de diferencias de pares de bases entre el amplicón de los clones específicos y la de las células de tipo salvaje.
Para validar la autenticidad de la situación nocaut, es recomendable que completesecuenciación de Sanger y análisis de transferencia Western para confirmar la supresión de la expresión génica en las células. Los dos clones identificados anteriormente dieron Sanger resultados de la secuenciación en consonancia con los resultados de la electroforesis en gel de la PCR-capilar fluorescentes (Figura 3A). También muestran la ablación completa de la expresión de proteínas NAP1L1 (Figura 3B), como se esperaba de clones de final.
Figura 1: PCR amplicones de HEPG2 Clones dirigidas por CRISPR / Cas9 Contra el NAP1L1 génica. Los amplicones de la etapa de PCR fluorescente se resolvieron en dos geles de agarosa separados (superior e inferior), y cada carril corresponde a un clon objetivo individual. L: escalera de ADN (los tamaños de las bandas individuales se dan al lado del diagrama). Por favor, haga clic en ellae para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Parcelas de señales de fluorescencia de dos muestras resueltos mediante electroforesis en gel capilar. El eje horizontal representa el tamaño del fragmento y el eje vertical representa la intensidad de la señal de fluorescencia. Los picos azules corresponden a fragmentos derivados de CRISPR / clones dirigidos mediadas por Cas9, mientras que los picos verdes corresponden a fragmentos derivados de las células de tipo salvaje. líneas magenta corresponden a posiciones de los picos-llamada automática determinados por el software de análisis, que marca las posiciones que muestran consistentemente picos través de muestras. Los valores proporcionados junto a picos individuales corresponden a los tamaños de los fragmentos (en pb) y se obtienen desde el software de análisis. Los valores en paréntesis representan la diferencia calculada en tamaño entre fra individuogments partir de un clon dirigido y el fragmento de tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: los resultados de ensayos para confirmar la Knockout del gen diana en dos clones. Resultados (A) Sanger de secuenciación y (B) Análisis de transferencia de Western usando anticuerpos contra la proteína indicada. Los nucleótidos en azul representan la secuencia diana sgRNA, los que están en rojo representan el motivo adyacente protospacer (PAM), los que están en marrón representan nucleótidos de base-sustituido, y los guiones representan las posiciones en las que el nucleótido se han eliminado en el alelo. Los valores en paréntesis junto a los nombres de clones individuales representan el genotipo de los alelos del clon; "-1" y "-10" significa que los alelos contienen una deleción de uno y diez nucleótidos, respectivamente tamaño aproximado de proteínas detectadas en el análisis de Western blot:. ~ 54 kDa para NAP1L1 y ~ 84 kDa para p84 (control de carga). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | De volumen durante un reacción (l) |
| solución específica kit | 4 |
| 10x PCR Buffer | 2 |
| 10? M de cebador directo (marcado) | 1 |
| 10? M de cebador inverso (sin etiqueta) | 1 |
| mezcla de dNTP 25 mM | 0.4 |
| Taq ADN polimerasa | 0.2 |
| Agua | 8.4 |
| lisado diluido | 3 |
| Total | 20 |
Tabla 1: Reactivos para la reacción de fluorescencia de la PCR.
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Discussion
La anulación de un gen específico en una línea celular modelo de elección se ha convertido en rutina para dilucidar el papel que desempeña el gen en ese contexto celular particular. De hecho, varias pantallas de todo el genoma están actualmente disponibles que utilizan el sistema CRISPR / Cas9 para apuntar genes humanos prácticamente todos los conocidos en el genoma de 14, 15, 16. Con estas pantallas de gran escala (o incluso a pequeña escala focalización de los genes individuales de interés), es importante para diseñar y utilizar sgRNAs dirigidos a diferentes loci del mismo gen. Resultados consistentes a través de los diferentes sgRNAs utilizados capitularía sin ambigüedad el verdadero efecto del agotamiento del gen. Como tal, la orientación de un solo gen requeriría un paso de genotipado de alto volumen para el genotipo con precisión una multitud de clones a partir de cada uno de los sgRNA individual utilizado. La técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente describe élre puede realizar precisamente esta tarea.
Mientras que la mayoría de los métodos de genotipificación existentes son susceptibles de efectos de alto rendimiento, cada uno de ellos adolece de ciertas limitaciones inherentes que las hacen menos que ideal. El topógrafo, o T7E1, ensayo, que detecta desajustes en el ADN dúplex 10, no es capaz de diferenciar entre las células de tipo salvaje y mutantes homocigotos (clones con dos alelos idénticamente mutado) debido al hecho de que estos dos clones producen dúplex desprovistos de desajustes 11. El ensayo de longitud de fragmentos de restricción polimórficos (RFLP), que informa de la desaparición de los sitios de restricción debido a mutaciones indel en la región diana CRISPR 17, está limitada por la disponibilidad de los sitios de restricción adecuados en la región diana 18. La técnica de análisis de fusión del ADN, que discierne los diferentes genotipos en base a sus curvas de fusión 19, 20, sufre de una falta de consistencia. Además, los tres de estos métodos no son particularmente informativo en cuanto a que no informan de la aparición de un desplazamiento de marco en la secuencia genética. En contraste, Sanger de secuenciación - que es actualmente la técnica de genotipado más popular - es extremadamente informativa, ya que proporciona la secuencia exacta de la región genómica como objetivo. Sin embargo, esta técnica es costosa, especialmente en experimentos a gran escala. Por lo tanto, la caracterización de la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente descrito aquí es de vital importancia, ya que puede eludir todas las limitaciones que enfrentan las otras técnicas descritas anteriormente.
La técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente permite a los usuarios distinguir entre todos los genotipos posibles un clon pueden existir en-tipo salvaje, mutante heterocigótico (caracterizado por un alelo de tipo salvaje y un alelo mutante), mutante homocigótico (caracterizado por dos identalelos mutantes iCal) y mutante heterocigoto compuesto (caracterizado por dos alelos mutantes no idénticos). Estos genotipos son fácilmente diferenciables por los modelos de picos del electroferograma. Además, esta técnica de genotipificación informa de la diferencia entre el tamaño del fragmento del amplicón de tipo salvaje y el de los clones específicos y tiene una precisión de un único par de bases. Este informa efectivamente la presencia o ausencia de un marco de lectura en la secuencia genética, que permite a los usuarios reducir su validación a sólo un puñado de clones, ahorrando tiempo y costes. Además de eso, esta técnica también permite la multiplexación de la orientación de genes (es decir, concurrentemente puede determinar el genotipo de más de un objetivo), y que permite la detección de una población celular heterogénea de la presencia de patrones de picos aberrantes (por ejemplo, la presencia de tres o más picos en el electroferograma de células diploides). Además de las líneas celulares utilizadas aquí y anteriormente 12 </ sup>, 13, también hemos genotipo con éxito diversas otras líneas celulares humanas y no humanas, incluyendo las células madre y células neuronales (datos no publicados), utilizando la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente, y anticipamos que esta técnica es aplicable a cualesquiera células que son susceptibles de CRISPR / Cas9 focalización. Además, dado que esta técnica informa el genotipo de los alelos individuales en la célula, es extremadamente útil en la genotipificación de células multi-alélicas, tales como células cancerosas que tienen la aneuploidía o amplificaciones genéticas.
El protocolo descrito aquí (incluyendo todo el material utilizado) se ha optimizado para la determinación del genotipo versátil y reproducible de CRISPR / clones orientados Cas9. Sin embargo, hay algunas partes que requieren modificación. Ellos incluyen, pero no se limitan a: 1) el uso de un vector de expresión sgRNA diferente (o estrategia de clonación), que puede necesitar el uso de una estrategia de selección diferente(Por ejemplo, la selección de antibióticos de clones en lugar de FACS); 2) el uso de una polimerasa diferente para la etapa de PCR fluorescente; y 3) el uso de diferentes marcadores fluorescentes. Por otra parte, es de destacar que un par de pasos esenciales en el protocolo puede resultar problemática. Por un lado, los amplicones de PCR fluorescentes pueden producen bandas inespecíficas en el electroferograma en gel de agarosa, o el patrón de pico en el electroferograma en gel capilar pueden ser "ruidoso". Esto es probablemente debido a la calidad sub-óptima de los cebadores de PCR y por lo tanto puede ser rectificada por re-diseño de estos cebadores. Se recomienda probar la calidad de los cebadores usando los oligonucleótidos no marcados antes de la adquisición de los marcados con fluoróforo para garantizar la coherencia, la reproducibilidad, y la especificidad de la etapa de amplificación. El otro factor importante a tener en cuenta es la eficiencia de la guía de ARN CRISPR, que puede determinar la tasa de obtención de verdaderos clones knockout positivos. Dado que ninguno de la búsqueda prog sgRNAcarneros que están actualmente disponibles son infalibles, la eficacia de cada sgRNA individual sólo puede ser determinada empíricamente. Por lo tanto, es importante para diseñar y utilizar más de un sgRNA (preferiblemente tres o más) para cada gen diana para reducir la posibilidad de no obtener un clon knockout éxito.
Mientras que la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente es informativo, sensible y fácil de usar, se trata con algunas advertencias. En primer lugar, esta técnica requiere el uso de un analizador genético, que puede no estar fácilmente disponible. Sin embargo, desde el analizador genético utilizado para este propósito es el mismo utilizado para los experimentos de secuenciación de Sanger, el protocolo de electroforesis en gel capilar puede ser subcontratado a proveedores de servicios de secuenciación existentes Sanger. De hecho, hemos dispuesto previamente con nuestro proveedor de servicio de secuenciación para llevar a cabo el protocolo de electroforesis capilar en gel a un coste comparable a cuando se hace en-casa. En segundo lugar, la exactitud de la techniqUE puede sufrir cuando indel mutaciones más de 30 pares de bases están involucrados. En nuestra experiencia, la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente tiende a subestimar el tamaño de los indeles cuando se observan grandes indeles (> 30 pb). Sin embargo, en nuestra experiencia, una gran mayoría de los mutantes muestra longitudes de mutación muy corto indel (la mayoría son de menos de 5 pb). No obstante, esto depende del lugar diana CRISPR y la línea celular utilizada altamente. En tercer lugar, la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente no es capaz de detectar sustituciones base sobre la reparación NHEJ en el sitio de corte CRISPR / Cas9. Sin embargo, se ha informado de que la sustitución de base como resultado de la reparación NHEJ de roturas de doble cadena es un evento raro 21, y no lo hacen de forma perjudicial alterar el marco de lectura del gen. En cuarto lugar, esta técnica sólo detecta los cambios en la región diana amplificado en la etapa de PCR fluorescente y por lo tanto no informar de cualquier aberraciones fuera de objetivo (cambios genéticos outside la región amplificada). Si se requiere una encuesta tan completa de los efectos fuera del objetivo de sgRNA CRISPR individual, se recomienda secuenciación del genoma completo para detectar con precisión los cambios en el genoma de los clones específicos. Sin embargo, este experimento bastante costoso no es necesario si más de un sgRNA se utiliza por gen diana, como se discutió anteriormente. Por último, la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente descrito aquí tiene un límite de tamaño de fragmento de 600 pb. Esto puede suponer un problema si la región diana se compone de secuencias repetidas o tiene contenido excepcionalmente alto de guanina-citosina (GC), que puede afectar a la eficiencia de amplificación PCR y especificidad. Este problema se puede prevenir fácilmente subraya la importancia del diseño de destino sgRNA cuidado, que debe incluir la consideración adecuada para la amplificación apropiada de la región en estudio. Por lo tanto, teniendo en cuenta los puntos fuertes y advertencias de la técnica de electroforesis en gel de PCR-capilar fluorescente, este método fácil de genotipadopuede aliviar la carga de genotipado de alto volumen de clones de final, que sigue siendo un cuello de botella para el día de hoy.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Sra. Tan Shi Min, Sra. Helen Ong, y el Dr. Zhao Yi para ayudar con los experimentos de electroforesis capilar en gel. Este trabajo fue apoyado por NMRC / IRG conceder NMRC / 1314/2011 y el Ministerio de Educación ACRF Nivel 2 subvención del Fondo MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
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