Summary
Genotypning teknik som beskrivs här, vilken kopplar fluorescerande polymeraskedjereaktion (PCR) för att kapillär gelelektrofores, möjliggör hög genomströmning genotypning av nukleas-medierad knockout kloner. Det kringgår begränsningar av andra genotypning teknik möter och är mer kostnadseffektiv än sekvenseringsmetoder.
Abstract
Utvecklingen av programmerbara genomet-redigeringsverktyg har underlättat användningen av omvänd genetik för att förstå rollerna specifika genomsekvenser spelar i hur celler och hela organismer. Denna sak har oerhört hjälp av den nyligen införda av CRISPR / Cas9 system ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt för forskare att manipulera genomet och transkriptom för att, bland annat, slå ut, riva eller slå in gener i en riktad sätt. För ändamålet att slå ut en gen, CRISPR / Cas9-förmedlad dubbel-strängbrott rekrytera icke-homolog-ändförening DNA-reparationsvägen för att införa den ramförskjutning som orsakar insättning eller deletion av nukleotider vid brottområdet. Dock kan en enskild styr RNA orsaka oönskade off-target effekter och att utesluta dessa ut, är det nödvändigt att använda flera styr RNA. Denna mångfald av mål innebär också att en hög volym screening av kloner krävs, vilket i sin tur väcker användningen av en efräckligt hög genomströmning teknik för att genotypa knockout kloner. Aktuella genotypning tekniker antingen lider av inneboende begränsningar eller ådra höga kostnader, därmed gör dem olämpliga för hög genomströmning ändamål. Här, vi detalj protokollet för användning av fluorescerande PCR, vilken använder genom-DNA från råa cellysat som en mall, och sedan lösa de PCR-fragmenten via kapillär gelelektrofores. Denna teknik är tillräckligt noggranna för att skilja en baspar skillnad mellan fragment och därmed är tillräcklig i indikerar närvaron eller frånvaron av en läsramsförskjutning i den kodande sekvensen av den målinriktade genen. Denna exakta kunskaper utesluter effektivt behovet av ett bekräftande sekvense steg och tillåter användare att spara tid och kostnader i processen. Dessutom har denna teknik visat sig vara mångsidig i genotypning olika däggdjursceller av olika vävnadsursprung riktade av styr RNA mot ett stort antal gener, såsom visas här och annorstädes.
Introduction
Omvända genetiska tillvägagångssätt har tillåtit forskare att belysa effekterna av specifika förändringar i genomet på cellen eller hela organismen. Till exempel, kan expressionen av en särskild gen dämpas genom gen knockdown 1, 2 (partiell reduktion) eller gen-knockout 3, 4 (fullständig ablation) för att bestämma den effekt som detta har på funktionen hos cellen eller på den utveckling av organismen.
Gen-knockout experiment har blivit lättare sedan införandet av sekvensspecifika programmerbara nukleaser, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) och transkriptionsaktivaliknande effektorceller nukleaser (Talens). Men den relativt nyligen karakterisering av klustrade regelbundet varvas korta palindrom repeat (CRISPR) / Cas9 systemet har gjort det mycket enkelt för laboratorie runt om i världen för att utföra gene knockoutexperiment. I huvudsak består den CRISPR / Cas9 system av två väsentliga komponenter-en enda styr RNA (sgRNA), som känner igen och binder via bas komplementaritet till en specifik sekvens i genomet, och ett endonukleas som kallas Cas9. Följderna av den specifika bindningen och verkan av sgRNA-Cas9 komplex på genomiskt DNA är den dubbelsträngklyvning av DNA. Detta i sin tur, utlöser DNA-skada svarsmekanism i cellen, som därefter repareras via de icke-homologa end-joining (NHEJ) eller homolog rekombination (HR) vägar. Eftersom reparationsmekanism NHEJ (men inte HR mekanism) resulterar ofta i den slumpmässiga insertion eller deletion av nukleotider vid platsen för reparation, vilket resulterar i insertion / deletion (InDel) mutationer, kan det orsaka läsramen för en exon att skifta. Detta kan då resultera i knockout av genen på grund av för tidig terminering av translation och nonsens-medierad sönderfall 5, 6,7.
Trots bekvämligheten som erbjuds genom införandet av CRISPR / Cas9 systemet i att knacka ut en gen, genotypning av kloner av riktade celler förblir en flaskhals, särskilt i en hög genomströmning inställning 8, 9. Existerande tekniker antingen drabbas stora inneboende begränsningar eller är ekonomiskt kostsamt. Till exempel, är inte i stånd att skilja mellan vildtyp kloner och homozygota mutanter lantmätaren eller T7E1 analys, vilket är en enzymatisk analys som detekterar felparningar i DNA-duplex 10, (kloner vars alleler är muterade identiskt), eftersom dessa kloner har identiska alleler och således inte utgör felparningar i deras DNA-sekvens 11. Dessutom är icke önskvärt att använda Sanger-sekvensering, som anses vara den gyllene standarden i genotypning mutanta kloner, i en hög genomströmning inställning på grund av dess höga kostnad. Här presenterar vi en Detailed protokoll av det fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik, som kan kringgå begränsningarna hos andra befintliga genotypning tekniker och är särskilt användbar vid utförande av en hög genomströmning skärm av nukleas-medierad knockout kloner. Denna metod är tekniskt enkelt att utföra och sparar tid och kostnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erhållande CRISPR / Cas9-riktade Encelliga Kloner
- Utsäde HepG2-celler på en 6-brunnsplatta vid 500.000 celler per brunn i 2 ml antibiotikafritt Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Inkubera i 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Transfektera celler med plasmid som samuttrycker Cas9 och specifik sgRNA mot genen av intresse med användning av ett lämpligt transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Till exempel, sgRNA kan klonas in i pSpCas9 (BB) -2A-GFP-vektorn, såsom beskrivits tidigare fyra. - Ersätta odlingsmediet 4 - 16 h efter transfektion med 2 ml färsk antibiotikafritt medium.
- Ca 48 h efter transfektion, samla singel-cellsuspension genom trypsinizing cellerna.
- Trypsinize cellerna i 0,2 ml av 0,25% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C under 5 min. Lägg 1 ml medium och återsuspendera thoroughly.
- Sortera cellerna för GFP-positiva kloner, såsom beskrivits tidigare 12, och samla ca 3500 celler.
- Plätera de GFP-positiva sorterade celler på 10-cm skålar på 500, 1000 och 2000 celler per skål i 8 ml av penicillin / streptomycin-kompletterat odlingsmedium. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Bibehålla cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2, ersätta mediet var femte dag, tills de växer till enkelcellkolonier som är tillräckligt stora för att vara synlig för blotta ögat. För de flesta cancercellinjer, tar denna ungefär två veckor från dagen för plätering.
- När kolonierna är av lämplig storlek (dvs synlig för blotta ögat), överföra individuella kolonier till brunnar i en 96-brunnars odlingsplatta innehållande 200 | il av DMEM kompletterat med 10% FBS.
- Aspirera de encelliga kolonier med användning av en 200-mikroliter pipett med en liten volym av medium. Resuspendera cellerna noggrant i idividual brunnar genom rivning flera gånger.
- Bibehålla cellerna vid 37 ° C och 5% CO 2, ersätta mediet var femte dag, tills de uppgå till 50 - i 90% konfluens. För de flesta cancercellinjer, tar detta ca 24-48 h.
2. Extrahera Rågenomiskt DNA med hjälp av en direkt Lysis Metod
- När cellerna nå 50 - i 90% sammanflytning, ta bort så mycket av odlingsmediet från brunnarna som möjligt med användning av flerkanals vakuumsug eller en flerkanalig pipett.
- Lägga 25 mikroliter av 0,05% trypsin-EDTA (utan fenolrött) i varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 7 min.
- Resuspendera trypsinbehandlade cellerna noggrant genom pipettering upp och ned flera gånger. Kontrollera cellerna under mikroskop för att se till att de är fristående från plastytan.
- Skapa en kopia av de individuella klonema genom att överföra cirka 5 mikroliter av den enkel-cellsuspension till en tom 96-brunnars odlings plate. Tillsätt 200 | il odlingsmedium till varje brunn och upprätthållande av cellerna tills positiva kloner identifieras med användning av fluorescerande PCR-kapillär-gelelektrofores (se nedan). Seriellt expandera cellerna till 10 cm skålar eller andra skala av val (se avsnitt 7).
- Lägga 5 mikroliter av den enkel-cellsuspension från steg 2,3 till 10 yl av hemlagad direkt lyserar buffert (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS och 0,3% Tween-20) 12 i en 96 brunnar PCR-platta och blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger. Centrifug kort (för att få vätskan ner till botten av brunnarna).
- Tillsätt 200 | il av odlingsmediet till den återstående ~ 15 mikroliter av cellsuspension från steg 2,3 och inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2, tillsammans med replikat från steg 2,4.
- Utsätta lysaten från steg 2,5 till följande termisk cykling program för att säkerställa fullständig lys av cellerna och frisättning av genomiskt DNA: 65 ° C under 30 s, 8 ° C under 30 s, 65 ° C under 1,5 min, 97 ° C under 3 min, 8 ° C under 1 min, 65 ° C under 3 min, 97 ° C under 1 min, 65 ° C under en min och 80 ° C under 10 min. Centrifugera kort på lysat.
- Späd lysaten genom tillsats 40 pl nukleasfritt vatten och blanda väl med en vortexblandare. Centrifug kort. De utspädda lysat kan användas omedelbart eller lagras vid -20 ° C under flera månader utan betydande förlust av kvalitet.
3. Utföra Fluorescent PCR för att förstärka CRISPR / Cas9 målregioner
- Konstruktions två fluoroformärkta framåt primrar (både märkt vid 5' änden) för varje CRISPR / Cas9 målregion; skärställen som ligger längre än 300 bp från varandra bör betraktas som två separata målregioner (t.ex. grön fluorofor-märkt primer för oriktade vildtyp kontroll och blå fluorofor-märkt primer för CRISPR / Cas9-målinriktade kloner; se Tabell över Materia ls).
- Procure dessa märkta fram primers och en omärkt omvänd primer därefter. Observera att primers kan utformas med hjälp av något verktyg i valet och att amplikoner ska vara 200-500 bp long.
- Utföra PCR såsom beskrivits tidigare 12 för att amplifiera målregioner med användning av märkta primrar.
- Använda 3 mikroliter av de spädda lysaten från steg 2,8 i en 20-mikroliter reaktion (se tabell 1) och följande termisk cykling programmet: 94 ° C under 10 min (1 cykel); 94 ° C under 10 s, 64 ° C under 30 s, 68 ° C under 1 min (4 cykler); 94 ° C under 10 s, 61 ° C under 30 s, 68 ° C under 1 min (4 cykler); 94 ° C under 10 s, 58 ° C under 30 s, 68 ° C under 1 min (4 cykler); 94 ° C under 10 s, 55 ° C under 30 s, och 68 ° C under 1 min (35 cykler).
- Lösa 5 mikroliter av PCR-amplikoner på en 1% agarosgel för att kontrollera storleken och relativa mängden av amplikonerss = "xref"> 12.
OBS: utföra detta steg för alla prover uppmuntras men inte nödvändigt; lösa ett valt antal sampel är tillräcklig för att uppskatta mängden amplikoner som är närvarande i proverna i allmänhet.
4. Förbered Prover för Capillary Gel Electrophoresis
- Späd amplikoner av vildtyp (oriktade moderceller) och CRISPR / Cas9 inriktade DNA i nukleasfritt vatten till approximativt 2,5 ng / | il. Se till att späda ut tillräckligt vildtyp DNA-prov som skall tillsättas till varje målinriktad DNA-prov (minst 0,5 mikroliter av utspädd vildtyp prov per målinriktad prov krävs).
- Blanda den utspädda vildtyp och riktade DNA-prov i lika förhållande (t ex blanda ett mikroliter av vildtyp provet med en mikroliter av riktade prov).
- Lägg 1 mikroliter av de blandade amplikoner till 8,7 mikroliter av avjoniserad formamid och 0,3 mikroliter av färgämnesmärkt storleksstandard i en 96-brunnars PCR-platta som är kompatibel med den genetiska enalyzer.
OBS: Användning av en huvudblandning av formamiden och storleken standard (dvs en beredning av en förblandning av formamiden och storleken standard i en 29: 1-förhållande före tillsatsen av amplikoner för att säkerställa standardiserade mängder) rekommenderas. - Tätt försegla plattan och värma proverna vid 95 ° C under 3 min med användning av en PCR-termocykler.
- Placera plattan på is omedelbart efter upphettningssteget och inkubera under åtminstone 3 min.
5. Utföra Capillary Gel Elektrofores på en Genetic Analyzer
- Inrätta analysparametrar, instrumentprotokoll och storlek-ringer protokoll på kapillär gelelektrofores mjukvara ansluten till en genetisk analysator.
OBS: Detta steg krävs endast för den första elektroforeskörning; Programmet kan sparas för framtida bruk. För efterföljande körningar, gå direkt till steg 5,2.- Klicka på "Skapa nytt Plate" -ikonen på programvaran instrumentbrädan.
- Ge run en dummy namn och välj följande alternativ: Antal brunnar, 96; Plattan Type, Fragment; Kapillär Längd, 50 cm; och Polymer, POP7. Klicka på knappen "Tilldela Plate innehåll".
- Under "Analyser" klicka "Skapa ny Assay"; en ny panel visas.
- Namn analysen "FPCR-CGE analys" och kontrollera att "Application Type" är korrekt inställd som "Fragment".
- Ställ in instrument protokoll genom att klicka på "Skapa ny" -knappen under "Instrument protokoll."
- Ange eller välj följande alternativ och parametrar i lämpliga områden: Application Type, Fragment; Kapillär Längd, 50 cm; Polymer, POP7; Dye Set, G5; Kör Module, FragmentAnalysis; Protokoll Namn, FPCR-CGE Instrument protokollet; Ugn Temperatur, 60 ° C; Köra Spänning, 19,5 kV; Pre-run Voltage, 15 kV; Injektion Voltage, 1,6 kV; Körning, 1.330 s; Pre-körning, 180 s; Injektion Time, 15 s; och Data Fördröjning, 1 s.
- click på "Ansök till analys" och sedan "Spara till Library" för att spara programmet. Stäng panelen för att fortsätta.
- Inrätta en storleks ringer protokoll genom att klicka på "Skapa ny" -knappen under "Sizecalling Protokollet."
- Ange eller välj följande alternativ och parametrar i lämpliga områden: Protokoll Namn, FPCR-CGE Sizecalling protokollet; Storleksstandard, GS500 (-250) LIZ; Storlek-ringer, SizeCaller v1.1.0; Analysinställningar, -; Analys Range, Full; Dimensionering Range, Full; Storlek Ringa Method, Lokala Southern; Primer Peak, närvarande; Blått, grönt, orange-TV, (Kontrollera); Minimum topphöjd, 175 för alla kanaler; Använd Utjämning, None; Användning Versionshantering (Baseline Window (PTS)), (Kontrollera) 51; Minimum Peak Half Bredd, 2; Topp Fönsterstorlek, 15; Polynom Degree, 3; Lutning Tröskel Peak Start, 0,0; Lutning Tröskel Peak End, 0,0; QC Inställningar -; Storlek Kvalitet -; Misslyckas om Värde är <0,25; Passera om Värde är <0,75; Antag Linjäritet från 0 bp till 800 bp; och Manövrera Pull-Up flagga om Pull-Up Ratio ≤ 0,1 och Pull-Up Scan ≤ 1.
- Klicka på "Apply till analys" och sedan "Spara till Library" för att spara programmet. Stäng panelen för att fortsätta.
- Se till att analysen sparas genom att klicka på "Spara till biblioteket" knappen en gång till och avsluta panelen genom att klicka på knappen "Stäng".
- Tillbaka på "Tilldela Plate Innehåll" sida, klicka på länken "Skapa nytt filnamn konventionen" under "Filnamn konventioner."
- Namnge programmet "FPCR-CGE filnamn."
- Under "Tillgängliga attribut," välja önskade egenskaper som kommer att visas i filnamnet (till exempel "Datum Run", "Time of Run", "Ja Position" och "Sample Name"). Välj önskad plats fil där resultaten av körningen kommer att lagras.
- Klicka på knappen "Ansök till analys" och sedan"Spara till Library" för att spara programmet. Stäng panelen för att fortsätta.
- Tillbaka på "Tilldela Plate Innehåll" sida, klicka på "Skapa nya resultat Group" länken under "Resultat Groups."
- Namnge programmet "FPCR-CGE Resultat grupper."
- Under "Tillgängliga attribut," välja önskade egenskaper som kommer att visas i filnamnet (till exempel "Assay Name"). Välj önskad plats fil där resultaten av körningen kommer att lagras.
- Klicka på "Apply till analys" och sedan "Spara till Library" för att spara programmet. Stäng panelen för att fortsätta.
- Ställ in programmet för en elektrofores körs genom att följa stegen nedan.
- Gå till instrumentpanelen och klicka på "Skapa ny platta" -ikonen.
- Namnge körningen såsom önskas (för enkel referens, inkludera datum, cellinjen, och gen namn). Välj följande alternativ: Antal brunnar, 96; Plattan Type, Fragment; Kapillär Längd, 50 cm; och Polymer, POP7. Klicka på knappen "Tilldela Plate innehåll".
- Märka varje brunn av provet som önskas (t.ex., ett prov kan namnges "NC" för att indikera att brunnen är en negativ kontroll).
- Under "Assays", "Filnamn konventioner" och "Resultat grupper" lådor, klicka på "länken Lägg från Library" och välj de program som skapats i steg 5.1.3 till 5.1.17.
- Markera alla brunnar som ska analyseras och välj de relevanta programmen under "Assays", "Filnamn konventioner" och "Resultat grupper" genom att markera rutorna bredvid dem.
- Före laddning plattan på brickan av den genetiska analysatorn, applicera gummitätningen på 96-brunnsplatta och sätta den förseglade plattan i plasthöljet som kommer med den genetiska analysatorn.
- Tryck på "Tray" -knappen på framsidan av den genetiska analysatorn och när brickan revärk framsidan av utrustningen, öppna dörren och ladda inkapslad plattan på facket. Se till att plattan är låst på plats och stäng sedan luckan.
- Klicka på "länkplattan för Run" -knappen.
- I "Load Plattor för Kör" sida, gör en sista kontroll för att säkerställa att alla reagens och betingelser är korrekta och i ordning.
- Klicka på "Start Run" -knappen. Varje körning av 24 prover (de första 3x8 brunnar av 96-brunnar) tar mindre än 55 minuter att slutföra.
6. Analys av elektroferogram att Bestäm baspar Skillnader
- När kapillär gelelektrofores run är klar öppnar analysprogram att analysera resultaten.
- Klicka på "Lägg Samples att projektet" ikonen och söka efter den mapp som innehåller köra filer. Minns från steg 5.1.12 den tilldelade platsen för resultatfiler.
- Välj alla resultaten filer av varje injektion i den färdiga körningen och click på knappen "Lägg till i lista"; namnen på dessa filer börjar med "Inj" och innehåller uppgifter om körningen.
- Klicka på "Lägg till och Analyze" för att fortsätta med analysen.
- Välj alla proverna i körningen genom att klicka på det första provet och dra markören ner till det sista provet och sedan klicka på ikonen "Display Tomter".
- För att kontrollera kvaliteten på storlek standard, öppnar den orange kanalen av resultaten genom att kontrollera orange ikon och avmarkera resten av färgade ikoner; Detta är viktigt att se till att storleken calling är korrekt och tillförlitlig.
- Att se de toppar som motsvarar de fragment härledda från den oriktade kontroll och de målinriktade kloner, ta de blå och gröna ikoner för att öppna avläsningar från dessa kanaler.
- Placera markören över den horisontella axeln av de första resultaten tomten och högerklicka för att välja "full storlek." Rulla nedåt för att visa alla resultat i korthet att fastställaom det finns några större problem med körningen. Om du vill zooma in på ett visst intervall av värden, högerklicka med musen på relevant axel tomten, välj "Zoom till ..." och knappa in de värden av intresse.
OBS: Ett potentiellt stort problem är att alla prover ger låga intensitetstoppar. Detta beror vanligtvis på att den långvariga lagringen av fluoroformärkta amplikoner innan läkemedlet kapillärelektrofores kör eller överutspädning av amplikoner, som lätt kan åtgärdas genom att upprepa PCR-steget eller genom att späda amplikonema med användning av en lägre utspädningsfaktor, respektive. - För att spara resultatet genom att följa stegen som beskrivs nedan.
- Se till att de blå och gröna kanaler väljs och klicka på "Dimensionering Table" -ikonen.
- Spara tabellen med värden i tabbavgränsad text (.txt) format genom att öppna "File" och välja "Exportera tabell." Döp filen detta och välj filen platsen för val.
- För att spara tomtens av körningen i PDF-format, gå till "File" och klicka på "Skriv ut" alternativet. Välj relevant PDF författare och tryck på "Skriv ut." Döp filen detta och välj filen platsen för val.
- Att beräkna skillnaden i storleken hos de fragment härledda från oriktade vildtyp kontrollen och de CRISPR / Cas9-målinriktade kloner, följa de steg som beskrivs nedan.
- Öppna fliken avgränsad text (.txt) från steg 6.9.2 med ett kalkylprogram. Tabellen bör innehålla dessa fyra viktiga kolumner: "Dye / Prov Peak" (som indikerar en blå eller grön kanal), "Prov filnamn" (de första tecknen indikerar brunnen eller provnamn), "Storlek" (som indikerar storleken på den fragment kallas), och "Längd" (som anger fluorescensintensiteten av toppen).
- Att peka ut relevanta toppar, utesluter dem som inte är i det förväntade storleksintervallet.
OBS: Vanligtvis InDel mutationer sällan resulterar i merän en 100-bp-skillnad i storlek; således är toppar vars storlek skiljer sig med mer än 100 bp från vildtyp kontrolltoppen (dominerande topp i den gröna kanalen) uteslutas. Detta kan enkelt göras med hjälp av "mellan" alternativ under "Villkorsstyrd formatering" -funktionen i kalkylbladet. - För att avlägsna icke-specifika toppar, som är omöjlig att skilja från bakgrundsnivån, använd "mindre än" alternativ under "Villkorsstyrd formatering" funktion i kalkylprogram för att utesluta toppar vars höjder är lägre än 2.000 enheter. Detta gränsvärde har empiriskt bestämts och kan därför anpassas när det ansågs lämpligt.
- Beräkna skillnaden i fragmentstorleken mellan var och en av de resulterande topparna i den blå kanalen (CRISPR / Cas9-målinriktade kloner) och den enda toppen i den gröna kanalen (oriktade vildtyp kontroll) genom att subtrahera den senare från den förra.
OBS: Det är viktigt att använda värden som tillskrivs varje kapillär ElectrophorESIS prov, eftersom det kan finnas interprov skillnader i fragmentstorleken av vildtyps kontroll. - Avrunda värden till närmaste heltal för att bestämma antalet av baspar som har infogats in i eller tas bort från, om någon, den genomiska sekvensen i fråga. När slå ut en gen är av intresse att välja kloner vars Indel mutationer inte av multiplar av 3 bp se till att det finns ramförskjutning i kodningssekvensen.
7. Kontroll av Knockout Status av kloner
- Expandera individuella knockout kloner från den 96-brunnars platta (från steg 2.4 och 2,6) till en 24-brunnsplatta genom trypsinizing cellerna med användning av 25 mikroliter av 0,25% trypsin-EDTA och inkubering vid 37 ° C under 5 min.
- Lägga 125 mikroliter av medium (DMEM kompletterat med 10% FBS) till de trypsinerade cellerna och återsuspendera grundligt.
- Överföra cellsuspensionen till en 15-ml rör och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort så mycket av mediet som möjligt med användning av vakuumsug eller en pipett, resuspendera cellpelleten i 500 mikroliter av mediet, och överför cellsuspensionen till en brunn i en 24-brunnsplatta. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 tills cellerna når 80-90% konfluens.
- Expandera de individuella kloner seriellt från 24-brunnar till en 6-brunnsplatta och från 6-brunnsplatta till en 10-cm skål när de nå 80 - i 90% sammanflytning genom att upprepa stegen 7,1 till 7,4, med användning av följande volymer: 50 | il av 0,25% trypsin-EDTA och 150 ul av medium (för expansion från 24-brunnar till 6-brunnsplatta) och 200 mikroliter av 0,25% trypsin-EDTA och 1 ml medium (för expansion från 6- väl plattan till 10-cm skål).
- Skörda kloner när de nå 80 - i 90% sammanflytning genom trypsinizing cellerna med användning av 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
- Lägga 5 ml medium (DMEM kompletterat med 10% FBS) till de trypsinbehandlade cellerna och resuspend noggrant.
- Överföra cellsuspensionen lika i två 15-ml rör, centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur, och avlägsna mediet så mycket som möjligt. En portion av cellerna är för genomisk DNA-extraktion och den andra är för totalt protein extraktion.
- För verifiering via Sanger-sekvensering genom att följa stegen som beskrivs nedan.
- Extrahera genomiskt DNA från klonema såsom beskrivits tidigare 12.
- Utföra PCR-amplifiering av regionen som spänner över CRISPR / Cas9 målstället, såsom beskrivs i avsnitt 3,2, men använda omärkta primrar. Använd inte märkta primers för detta steg, eftersom fluorescens från taggen kommer att störa den efterföljande Sanger-sekvense steg.
- Rena de amplikoner med användning av en PCR clean-up kit, såsom beskrivits tidigare 12.
- Sekvensera de renade amplikoner med användning av PCR-primrar som används i steg 7.9.2 för att bestämma genotypen av klonerna, såsom beskrivs previously 12.
- För verifiering via Western blot-analys, extrahera totalt protein från naturliga celler och riktade kloner, såsom beskrivits tidigare 12.
- Utföra Western blot-analys med användning av lämpliga antikroppar mot proteinet av målgenen, såsom beskrivits tidigare 12; en sann knockout klon saknar expression av proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik som beskrivs här förväntas vara tillämpbar på varje inriktningsbar region i genomet i praktiskt taget vilken cellinje som är mottaglig för främmande DNA leverans. Vi har tidigare visat sin ansökan genom att rikta tre gener i en kolorektal cancer cellinje 12. Här visar vi dess effekt i genotypning av en hepatocellulär karcinom cellinje, HEPG2, riktad med en CRISPR / Cas9 konstruera mot nukleosomen Assembly Protein 1 Gillar 1 (NAP1L1) genen. I själva verket har vi framgångsrikt utnyttjas den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik för att genotypa olika andra celler, inkluderande icke-humana däggdjurscellinjer, riktade till ett stort antal andra gener 12, 13.
Experiment-vis, det fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores technique är enkel och snabb att utföra. Efter införandet av Cas9 och sgRNA uttryckskonstruktioner in i cellerna och selektion av positiva kloner, är de individuella klonerna lyserades direkt från 96-brunnars odlingsplatta med hjälp av vår hemlagad lysbuffert, Direkt-Lyse Buffert 12. Enligt vår erfarenhet kan de resulterande lysaten lagras vid -20 ° C eller lägre under flera månader utan signifikant förlust av genomiskt DNA-kvalitet. Lyssteget följs av PCR-amplifieringssteg, vilket innebär produktion av fluoroforen-märkta amplikon som spänner över CRISPR målregionen. Den fluorescerande PCR-protokoll förutsatt har optimerats för detta ändamål och har konsekvent producerat riklig PCR-produkter, oberoende av regionen som amplifieras. Figur 1 visar ett representativt resultat av upplösningen av de amplikoner härledda från den fluorescerande PCR-steget, med varje bana motsvarar en individuell CRISPR / Cas9 inriktade klonen och de olika banden CORRESPonding de förstärkta regionerna i enskilda alleler i klonerna. I vår erfarenhet, användning av andra polymeraser och deras åtföljande protokoll resulterade i en lägre amplikon avkastning. Även om detta kan lätt åtgärdas genom justering av utspädningsfaktorn under provberedning för kapillär gelelektrofores, kan bakgrunden eller brusnivån följaktligen vara högre när amplikoner av lägre utbyte används. Efter PCR-steget, är amplikonema utspädda, och de av vildtyp provet och de målinriktade kloner blandas i lika tal före de tillsätts till avjoniserat formamid buffert och en storlek standard, denaturerade, och upplöstes på en kapillär gel.
Efter slutförandet av den kapillära gelelektrofores, de genotypningsförfaranden resultaten är redo att analyseras. Två viktiga uppsättningar resultat krävs från elektroforeskörning: elektroferogrammen innehållande topparna motsvarande individuella fluorescenssignaler och the resultattabellen innehåller alla nödvändiga värden som krävs för beräkning. Figur 2 visar resultaten för genotypning av två kloner som omfattas av sgRNA mot NAP1L1 genen i HepG2-celler. De gröna topparna motsvarar de amplikoner av oriktade vildtyp allelen i de parentala HepG2-celler, medan de blå topparna motsvarar amplikoner av InDel mutationsinnehållande alleler av de CRISPR / Cas9-målinriktade kloner. Såsom klart visas, de två klonerna är homozygota mutanter (mutanter med identiskt muterade alleler), med deletion av en och tio nukleotider på båda allelerna. Det är viktigt att notera att elektroferogram används för visualisering syfte, medan toppvärden är viktiga för att bestämma antalet basparskillnader mellan amplicon av de riktade kloner och att de naturliga celler.
För att validera äktheten av knockout status rekommenderar vi utförSanger-sekvensering och Western blot-analys för att bekräfta avskaffandet av genexpression i cellerna. De två klonerna som identifierats ovan gav Sanger sekvenseringsresultaten överensstämmande med de fluorescerande PCR-kapillär gel elektroforesresultat (Figur 3A). De uppvisade också fullständig ablation av NAP1L1 proteinuttryck (figur 3B), som väntat av knockout-kloner.
Figur 1: PCR Amplikoner av HEPG2 Kloner Riktade genom CRISPR / Cas9 Mot NAP1L1 Gene. Amplikoner av den fluorescerande PCR-steget separerades på två separata agarosgeler (topp och botten), och varje bana motsvarar en individuell riktad klon. L: DNA-stege (storlekarna hos individuella band ges bredvid diagrammet). Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Diagram över Fluorescence Signaler från Två Prov Lösta via Capillary Gel Electrophoresis. Den horisontella axeln representerar fragmentstorleken och den vertikala axeln representerar fluorescenssignalintensitet. De blå topparna motsvarar fragment härledda från CRISPR / Cas9-medierade målinriktade kloner, medan de gröna topparna motsvarar fragment härledda från naturliga celler. Magenta linjerna motsvarar automatiska topp-ringer positioner som bestäms av analysmjukvara, som markerar positioner som konsekvent visar toppar över prover. De värden som tillhandahålls intill enskilda toppar motsvarar storlekarna på fragmenten (i bp) och erhålls från analysprogram. Värdena inom parentes visar den beräknade skillnaden i storlek mellan enskilda fragments från en riktad klon och vildtyp fragmentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Resultaten av Analyser för att Bekräfta Knockout av den målinriktade genen i två kloner. (A) Sanger-sekvenseringsresultat och (B) Western blot-analys med användning av antikroppar mot det indikerade proteinet. Nukleotider i blåa representerar sgRNA målsekvensen, de i rött representerar protospacer intilliggande motivet (PAM), de i brunt representerar bas-substituerade nukleotider, och strecken representerar de positioner där nukleotiden är deleterade i allelen. Värdena inom parentes bredvid de enskilda klon namnen representerar genotypen av alleler av klon; "-1" och "-10" betyder att allelerna innehåller en deletion av en och tio nukleotider, respektive Ungefärlig storlek av proteiner som detekteras i Western blot-analyser:. ~ 54 kDa för NAP1L1 och ~ 84 kDa för P84 (laddningskontroll). Klicka här för en större version av denna figur.
| Reagens | Volymen för en reaktion (il) |
| Kit specifik lösning | 4 |
| 10x PCR-buffert | 2 |
| 10 | iM framåtriktad primer (märkt) | 1 |
| 10 | iM bakåtriktad primer (omärkt) | 1 |
| 25 mM dNTP-blandning | 0,4 |
| Taq DNA-polymeras | 0,2 |
| Vatten | 8,4 |
| utspädd lysat | 3 |
| Total | 20 |
Tabell 1: Reagenser för fluorescerande PCR-reaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den slår ut av en specifik gen i en modell cellinje val har blivit rutin för att belysa den roll som genen spelar i det särskilda cellulära sammanhang. I själva verket flera genomvida skärmar är för närvarande tillgängliga som använder CRISPR / Cas9 system för att rikta praktiskt taget alla kända humana gener i genomet 14, 15, 16. Med dessa stora skärmar (eller till och med småskalig inriktning av enskilda gener av intresse), är det viktigt att utforma och använda sgRNAs inriktade på olika loci av samma gen. Konsekventa resultat i de olika sgRNAs används skulle entydigt kapitulera den verkliga effekten av utarmningen av genen. Som sådan skulle målsökning av en enda gen kräver en hög-volym genotypning steg för att noggrant genotypa en mångfald av kloner från var och en av de individuella sgRNA används. Den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores beskrivna tekniken hanre kan exakt utföra denna uppgift.
Medan de flesta av de befintliga genotypningsförfaranden är mottagliga för hög genomströmning ändamål, lider var och en av dem från vissa inneboende begränsningar som gör dem mindre än idealisk. Lantmätaren, eller T7E1, analys, som detekterar felparningar i DNA-duplex 10, inte är i stånd att skilja mellan vildtyp-celler och homozygota mutanter (kloner med två identiskt muterade alleler) på grund av det faktum att båda dessa kloner gav duplex som saknar felparningar 11. Restriktionsfragmentlängd-polymorfism (RFLP) -analys, som rapporterar försvinnandet av restriktionsställen på grund av InDel mutationer i CRISPR målregionen 17, är begränsad genom tillgängligheten av lämpliga restriktionsställen vid målregionen 18. Den DNA-smältning analysteknik, som urskiljer de olika genotyperna baserat på deras smältkurvor 19, 20, lider av en brist på konsekvens. Dessutom är alla tre av dessa metoder är inte särskilt informativt att de inte rapporterar förekomsten av en ramförskjutning i den genetiska sekvensen. Däremot Sanger-sekvensering - är mycket informativ, eftersom det ger den exakta sekvensen av den genomiska regionen blir måltavla - som för närvarande är det mest populära genotypning teknik. Emellertid är denna teknik kostsam, särskilt i storskaliga experiment. Sålunda, är karakteriseringen av den fluorescerande PCR-kapillär-gelelektrofores teknik som beskrivs här mycket viktigt eftersom det kan kringgå alla begränsningar genom de andra tekniker som beskrivits ovan står inför.
Den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik möjliggör för användare att skilja mellan alla möjliga genotyper en klon kan finnas i-vildtyp, heterozygot mutant (kännetecknad av en vildtyps-allel och en muterad allel), homozygot mutant (som kännetecknas av två identical mutanta alleler), och förening heterozygot mutant (kännetecknas av två icke-identiska mutanta alleler). Dessa genotyper är lätt differentierbar av toppmönstren i elektrofores. Vidare rapporterar detta genotypning teknik skillnaden mellan fragmentstorlek av vildtyps amplikon och att av de riktade kloner och är korrekt att ett enda baspar. Detta rapporterar effektivt närvaron eller frånvaron av en ramförskjutning i den genetiska sekvensen, så att användarna kan minska sin validering till endast en handfull av kloner, vilket sparar dem tid och kostnad. På toppen av det, denna teknik medger även för multiplexering av genmålsökning (dvs., det kan samtidigt genotypa mer än ett mål), och det möjliggör detektering av en heterogen cellpopulation från närvaron av avvikande toppmönster (t ex, närvaron av tre eller flera toppar i elektroforesdiagram av diploida celler). Förutom de cellinjer som används här och tidigare 12 </ sup>, 13, har vi också framgångsrikt genotypas olika andra humana och icke-humana cellinjer, inklusive stamceller och neuronala celler (opublicerade data), med användning av den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik, och vi räknar med att denna teknik är tillämpbar till alla celler som är mottagliga för CRISPR / Cas9 inriktning. Eftersom denna teknik rapporterar genotypen av individuella alleler i cellen, är det extremt användbart vid genotypning fler alleliska celler, såsom cancerceller som har aneuploidi eller genetiska amplifieringar.
Det protokoll som beskrivs här (inklusive allt material som används) har optimerats för den mångsidiga och reproducerbar genotypning av CRISPR / Cas9-målinriktade kloner. Det finns dock vissa delar som kräver modifiering. De innefattar, men är inte begränsade till: 1) användning av en annan sgRNA expressionsvektorn (eller kloningsstrategi), vilket kan kräva användning av ett annat urval strategi(T.ex. det antibiotiska selektion av kloner i stället för FACS); 2) användning av ett annorlunda polymeras för den fluorescerande PCR-steget; och 3) användningen av olika fluorescerande märkningar. Dessutom är det värt att notera att ett par viktiga steg i protokollet kan visa sig vara problematiskt. För en, kan de fluorescerande PCR-amplikoner ge ospecifika band i agarosgelen elektroferogram, eller toppmönstret i kapillären gelén elektroferogram kan vara "bullriga." Detta beror sannolikt på att suboptimal kvalitet av PCR-primers och kan därför åtgärdas genom att åter konstruera dessa primers. Vi rekommenderar att testa kvaliteten av primrarna med användning av omärkta oligonukleotider före anskaffning de fluoroformärkta ettor för att säkerställa konsekvens, reproducerbarhet och specificitet av amplifieringssteget. Den andra viktiga faktorn att notera är effektiviteten hos CRISPR styr RNA, vilket kan bestämma hastigheten för erhållande av sant positiva knockout kloner. Eftersom ingen av sgRNA Sök progbaggar som för närvarande är tillgängliga är idiotsäker, effekten av varje individuell sgRNA kan endast bestämmas empiriskt. Sålunda är det viktigt att utforma och använda mer än en sgRNA (företrädesvis tre eller flera) för varje målgen för att minska risken för att inte erhålla en lyckad knockout klon.
Medan den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik är informativ, känslig, och lätt att använda, det kommer med några varningar. Först kräver denna teknik användningen av en genetisk analysator, som kanske inte är lätt tillgänglig. Emellertid, eftersom den genetiska analysatorn används för detta ändamål är den samma som används för Sanger-sekvenseringsexperiment, kapillär gelelektrofores protokoll kan läggas ut på befintliga Sanger-sekvensetjänsteleverantörer. I själva verket har vi tidigare ordnat med vår sekvensetjänsteleverantören att utföra kapillär gelelektrofores protokoll till en kostnad som är jämförbar med när det görs in-house. För det andra, noggrannhet technique kan drabbas när InDel mutationer längre än 30 bp är inblandade. I vår erfarenhet, tenderar den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik för att underskatta storleken på InDels när stora InDels (> 30 bp) observeras. Men i vår erfarenhet, en stor majoritet av mutanterna visade mycket kort InDel mutationslängder (de flesta är mindre än 5 bp). Detta är dock starkt beroende av CRISPR målplatsen och cellinje som användes. Tredje, är den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores tekniken inte kan detektera bassubstitutioner upon NHEJ reparation vid CRISPR / Cas9 cut site. Ändå har det rapporterats att basen substitution till följd av NHEJ reparation av dubbelsträngade pauser är en sällsynt händelse 21, och att de inte skadligt förändra läsramen av genen. För det fjärde, denna teknik identifierar endast förändringar i målområdet förstärks i fluorescerande PCR-steget och därmed inte rapportera eventuella off-target avvikelser (genetiska förändringar outside den amplifierade regionen). Om det krävs en så omfattande undersökning av off-mål effekterna av enskilda CRISPR sgRNA rekommenderar vi hela genom sekvensering för att noggrant upptäcka eventuella förändringar i genomet hos de riktade kloner. Emellertid är detta ganska kostsam experiment inte nödvändigt om mer än en sgRNA används per målinriktad gen, såsom diskuterats ovan. Sista, den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik som beskrivs här har ett fragment storleksgräns på 600 bp. Detta kan innebära ett problem om målet region består av upprepade sekvenser eller har exceptionellt hög guanin-cytosin (GC) innehåll, vilket kan påverka PCR-amplifiering effektivitet och specificitet. Detta lätt kan förebyggas problem betonar vikten av noggrann sgRNA mål design, som måste innehålla vederbörlig hänsyn till lämplig förstärkning av målområdet. Sålunda, med tanke på de starka och varningar av den fluorescerande PCR-kapillär gelelektrofores teknik, denna enkel metod för genotypningkan lindra bördan av stora volymer genotypning av knockout-kloner, som fortfarande är en flaskhals i dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ms Tan Shi Min, Ms Helen Ong och Dr. Zhao Yi för att hjälpa med kapillärgelelektrofores experiment. Detta arbete stöddes av NMRC / IRG bevilja NMRC / 1314/2011 och MOE ACRF Tier 2 Fund bidrag MOE2011-T2-1-051.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
