Summary
Floresan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) jel elektroforezi kılcal çiftler burada tarif edilen genotipleme tekniği, nükleaz aracılı nakavt klonları yüksek verimli genotipleme için izin verir. Diğer Genotipleme teknikleri karşılaştığı sınırlamaları ortadan ve dizileme yöntemleri maliyet açısından daha etkilidir.
Abstract
Programlanabilir genom düzenleme araçlarının geliştirilmesi spesifik genomik diziler hücreleri ve bütün organizmaların işlev görmesi de rol oynadıklarını anlamak için ters genetik kolaylaştırmıştır. Bu neden müthiş dızı CRISPR'nın yakın zamanda piyasaya sürülmüş araştırmacılar amacıyla, diğer şeylerin yanı sıra, genom ve transkriptom manipüle nakavt, yıkmak veya hedeflenen genlerinde vurmak için izin verir / Cas9 sistem çok yönlü bir araçtır ile yardım görmüştür tavır. bir gen nakavt amacıyla CRISPR / çift iplikli sonları kırılma yerinde nükleotidlerin çerçeve neden olan ekleme veya silme tanıtmak için homolog olmayan uç birleştirme DNA onarım yolağı işe Cas9 aracılı. Ancak, tek bir kılavuz RNA istenmeyen hedef dışı etkilere neden olabilir ve bu ekarte etmek için, çok sayıda kılavuz RNA'ların kullanılması gereklidir. hedeflerin bu çokluğu Klonlardan yüksek hacimli tarama bu da bir ef kullanımını begs olan, gerekli olduğu anlamına gelirnakavt klonları Genotip yüksek verimli tekniği ficient. Güncel genotip teknikleri ya dolayısıyla yüksek verimli amaçlar için uygunsuz render kalıcı sınırlamalar muzdarip veya yüksek ücrete tabidir. Burada, bir şablon olarak ham hücre lizatı, genomik DNA kullanan florasan PCR kullanılarak ve daha sonra, kılcal jel elektroforezi ile PCR parçası çözme ayrıntılarıyla protokolü. Bu teknik, fragmanlar arasında bir baz çift farklılığı ayırmak için yeterince doğru ve dolayısıyla hedeflenen genin kodlama dizisine bir çerçeve kayması varlığını veya yokluğunu gösteren de yeterlidir. Bu kesin bilgi etkin bir şekilde teyit dizisi aşaması için ihtiyaç engellemektedir ve kullanıcıların sürecinde zaman ve maliyetten tasarruf sağlar. Burada ve başka yerlerde gösterildiği gibi Ayrıca bu teknik, bir çok genin karşı kılavuz RNA'lar tarafından hedeflenen çeşitli doku kaynaklarından çeşitli memeli hücrelerini genotipleme içinde çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır.
Introduction
Ters genetik yaklaşımlar bilim adamları hücrede veya bütün organizma üzerinde genomun spesifik değişikliklerle olası etkisini araştırmak için izin vermiş. Örneğin, belirli bir genin ekspresyonu, bu hücrenin veya fonksiyonu üzerinde sahip olduğu etkiyi tespit etmek amacıyla gen yok etme, 1, 2 (kısmi azalma) ya da gen nakavt 3, 4 (tamamen ortadan) zayıflatılmış edilebilir organizmanın gelişimi.
Gen knockout deneyleri, çinko-parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) olarak dizi-spesifik programlanabilir nükleazlar, girmesinden bu yana kolay hale gelmiştir. Ancak, düzenli olarak kısa palindromik tekrarını (CRISPR) serpiştirildiği kümelenmiş nispeten son karakterizasyonu / Cas9 sistemi gen gerçekleştirmek için dünyanın herhangi bir laboratuvar için son derece kolay yapmıştırE nakavt deneyleri. Esas olarak, CRISPR / Cas9 sistemi iki temel bileşenleri-a tanır ve genomunda özel bir diziye baz tamamlayıcılık ile bağlanan tek bir kılavuz RNA (sgRNA), ve Cas9 adı verilen bir endonükleaz oluşur. genomik DNA üzerinde sgRNA-Cas9 kompleksinin spesifik bağlanma ve eylem sonrasında DNA çift iplikli bölünmesidir. Bu da, daha sonra, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homolog rekombinasyon (HR) yolları ile tamir edilir hücre, DNA hasarı yanıt mekanizması devreye girer. NHEJ onarım mekanizması (ancak sıcak mekanizması) çoğu zaman ekleme / silme (indel) mutasyonlar ile sonuçlanan tamir yerinde rasgele yerleştirilmesi veya nükleotidin silinmesi ile sonuçlanmasından dolayı, bir eksonun okuma çerçevesi kaymasına neden olabilir. Bu, daha sonra, bağlı çeviri ve anlamsız aracılı çürüme 5, 6 'nın prematüre terminasyonuna genin nakavt sonuçlanabilir7.
Bir gen nakavt CRISPR / Cas9 sisteminin katılmasıyla elde kolaylık rağmen, hedeflenen hücre klonlarının genotipleme özellikle 8, 9 ayar yüksek throughput, bir tıkanıklık kalır. majör kendine özgü sınırları acı veya mali masraflı, ya Mevcut teknikleri. Örneğin, 10 dupleksleri DNA uyumsuzluklarını bulgulamaktadır enzimatik bir deneyidir bilirkişi veya T7E1 tahlili, vahşi tipli ve homozigoz mutantlar klonlar ayırt etmek mümkün değildir, bu klonlar, alele sahiptir ve dolayısıyla bu yana (olan aleller aynı mutasyona uğratılır klonları), DNA dizisi 11 uyumsuzlukları mevcut değildir. Buna ek olarak, yüksek verimli bir kurulumda, mutant klonları genotipleme altın standart olarak kabul edilir, Sanger sekanslanması, bir kullanımı, yüksek maliyet istenmemektedir. Burada, bir imhaya sunmakDiğer mevcut Genotipleme teknikleri limitlerini aşmak ve nükleaz aracılı nakavt klonlarının bir yüksek verimli bir ekranı yerine getirilmesinde özellikle faydalıdır floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniğinin ailed protokolü. Bu yöntem gerçekleştirmek için teknik olarak basit ve zaman ve maliyet tasarrufu sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CRISPR / Cas9 hedefli tek hücre klonları elde edilmesi
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş antibiyotik içermeyen Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 2 mL içerisinde oyuk başına 500,000 hücre 'ucunda bir 6-yuvalı plaka üzerinde Tohum HEPG2 hücreleri. 37 ° C'de 24 saat% 5 CO2 inkübe edin.
- ile transfekte edilen hücreler, plasmid birlikte ifade, üretici talimatlarına uygun olarak, uygun bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak Cas9 ve ilgi dahilindeki gen karşı özel sgRNA.
Not: daha önce 4 tarif edildiği gibi örneğin, sgRNA, pSpCas9 (BB) -2A-GFP vektörüne klonlanabilir. - Taze antibiyotik içermeyen ortam 2 ml ile transfeksiyondan sonra 16 saat - kültür ortamı 4 değiştirin.
- Transfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra, hücreler tripsinize ile tek bir hücre süspansiyonu toplanır.
- % 0.25 tripsin-EDTA, 0.2 mL hücreleri tripsinize ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. thoroughl ortamın 1 ml ilave edilir ve tekrar süspansiyony.
- Daha önce 12 açıklandığı gibi, GFP pozitif klonlar için hücreleri sıralama ve yaklaşık 3.500 hücreleri toplamak.
- penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamı 8 mL çanak başına 500, 1000 ve 2000 hücre 10 cm'lik kaplar GFP-pozitif kriteri, hücreler plaka. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe hücreleri.
- Da çıplak gözle görülebilecek kadar büyük tek hücreli koloniler halinde büyümeye kadar her beş günde ortamının değiştirilmesiyle, 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri koruyun. En kanser hücre hatlarında, bu kaplama gününden itibaren yaklaşık iki hafta sürer.
- Koloniler, uygun boyutta (çıplak gözle yani görülebilir) olduğu zaman,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM 200 uL ihtiva eden 96 oyuklu bir kültür plakasının kuyularına ayrı ayrı koloniler aktarın.
- orta küçük bir hacimde olan bir 200 uL pipet kullanarak tek hücreli koloniler aspire. iyice hücreler in süspanse edinbirkaç kez ezilip karıştırılarak dividual kuyu.
- % 90 kaynaşmaya - bunlar 50 ulaşana kadar, her beş günde ortamının değiştirilmesiyle, 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri koruyun. 48 saat - en kanser hücre hatlarında, bu yaklaşık 24 sürer.
Doğrudan Liziz Yöntemiyle 2. Sıkma Ham Genomik DNA
- Hücreler 50 ulaştığında -% 90 kaynaşmaya mümkün kullanılarak çok kanallı vakum emme ya da çok kanallı bir pipet gibi kuyu kültür ortamının kadar çıkarın.
- her kuyuya (fenol kırmızısı olmadan)% 0.05 tripsin-EDTA, 25 uL ilave edin ve 7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice tripsinize hücreleri tekrar. onlar plastik yüzeyden ayrılmıştır emin olmak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin.
- bir boş, 96 kuyulu kültür plakasından için tek bir hücre süspansiyonu, yaklaşık 5 uL aktararak bireysel klonların bir sureti oluşturmae. Her bir oyuğa, kültür ortamı 200 uL ekleyin ve pozitif klonlar flöresanlı PCR kapiler jel elektroforezi (aşağıya bakınız) kullanılarak tespit kadar hücreleri korumak. Seri olarak 10 cm'lik kaplar ya da tercih edilen başka bir ölçeğe hücreleri genişletmek (bölüm 7).
- Bir (10 mM Tris pH 8.0, 2.5 mM EDTA, 0.2 M NaCI, 0.15% SDS ve% 0.3 Tween-20) ev yapımı direkt lizis tamponu 10 uL 12 adım 2.3 tek hücre süspansiyonu 5 uL ekleyin 96-PCR plaka ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ile iyice karıştırın. Santrifüj kısa bir süre (kuyu dibine sıvı getirmek için).
- Birlikte adım 2.4 den suret ile, adım 2.3 hücre süspansiyonu geri kalan ~ 15 uL kültür ortamı 200 uL ekleyin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin.
- 3 saat 65 ° C: Tüm hücre lizizi ve genomik DNA bırakılmasını sağlamak için, aşağıdaki ısı çevrimi programa adım 2.5 den lizatları Konu0 s, 30 s için 8 ° C sıcaklıkta 1.5 dk, 1 dakika için 3 dakika boyunca 1 dakika için 3 dakika boyunca 97 ° C, 8 ° C, 65 ° C, 97 ° C, 1 saat 65 ° C, 65 ° C dakika ve 10 dakika boyunca 80 ° C. lizatları kısaca santrifüjleyin.
- nükleaz içermeyen su 40 mcL ekleyerek lizatları seyreltin ve bir vorteks karıştırıcı kullanılarak iyice karıştırın. Santrifüj kısaca. seyreltilmiş lizatlar hemen kullanılabilir veya kalite kaybı olmadan, birkaç ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
CRISPR / Cas9 hedef bölgesini genişletmek üzere Floresan PCR yapılması 3.
- Her bir CRISPR / Cas9 hedef bölgenin tasarım, iki florofor ile işaretlenmiş ileri primerler (her ikisi de 5' ucunda etiketlenmiştir); birbirinden iki ayrı hedef bölgesinde (hedeflenmemiş vahşi tipli kontrol ve CRISPR / Cas9 hedefli klonlar mavi fluoroforla işaretlenmiş primer için, örneğin, yeşil fluoroforla işaretlenmiş primer olarak düşünülmelidir 300 bp'den daha başka siteleri kesilmesi; Materia bakınız Tablo ls).
- Bu ileriye etiketlenmiş primerler ve etiketlenmemiş bir ters primer uygun olarak temin edin. 500 bp long - astarlar seçtikleri bir aracı kullanarak dizayn edilebileceğini ve amplikonlarının 200 olması gerektiğini unutmayın.
- Etiketlenmiş primerler kullanılarak, hedef bölgeleri amplifiye etmek için daha önce tarif edildiği gibi, 12 PCR gerçekleştirin.
- 20 pL reaksiyon aşamasında 2.8 seyreltilmiş lizatlarının 3 uL kullanarak ve takip eden termal devir programı (bakınız Tablo 1): 10 dakika boyunca (1 döngü) ile 94 ° C; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 64 ° C, 1 dakika boyunca (4 defa) 68 ° C'de; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 61 ° C, 1 dakika boyunca (4 defa) 68 ° C'de; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 58 ° C, 1 dakika boyunca (4 defa) 68 ° C'de; 10 sn için 94 ° C, 30 sn için 55 ° C ve 1 dakika için 68 ° C (35 döngü).
- boyut ve amplikonlarının nispi miktarı kontrol etmek için bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR amplikonlarının 5 uL çözmess = "xref"> 12.
NOT: Tüm numuneler için bu adımı Sahne teşvik fakat gerekli değildir; Örneklerin belirli sayıda çözülmesi genel olarak, numunelerde amplikonların miktarını tahmin etmek için yeterlidir.
Kapiller jel elektroforezi 4. Numune Hazırlanması
- yaklaşık olarak 2.5 ng / uL nükleaz içermeyen su içinde Vahşi tip (hedefsiz ana hücreler) ve CRISPR / Cas9 hedefli DNA amplikonları seyreltin. (Gerekli olan hedef numune başına seyreltilmiş yabani tip numunenin 0.5 uL az) Her bir hedef DNA örneği ilave edilecek kadar vahşi tipli DNA numunesinin seyreltilmesi için emin olun.
- Eşit oranda seyreltilmiş yabani tür ve hedef DNA örnekleri karıştırın (örneğin, hedef numunesinin 1 uL, vahşi tipli numunesinin 1 uL karıştırıldı).
- Genetik An ile uyumlu olan bir 96 çukurlu PCR plaka deiyonize formamid 8.7 uL, boya etiketli boyut standardı 0.3 uL karışık amplikonların 1 uL ekleyinalyzer.
Not: formamid bir ana karışımı ve boyut standardı kullanımı (diğer bir deyişle, formamit bir ön karışım, bir preparat ve bir 29 boyut standardı: standart miktarlarda sağlamak için önce amplikonların ilavesinden 1 oranında) kullanılması tavsiye edilir. - Sıkıca plaka sızdırmaz ve bir PCR thermocycler 3 dakika süreyle 95 ° C'de numunelerin ısıtın.
- Hemen, ısıtma aşamasından sonra buz üzerinde plaka yerleştirin ve en az 3 dakika süreyle inkübe edin.
5. Bir Genetik Analiz cihazında Kılcal Jel Elektroforez Sahne
- Deney parametreleri, enstrüman protokolü ve genetik analiz bağlı kılcal jel elektroforezi yazılım boyut çağrı protokolü ayarlayın.
NOT: Bu adım sadece ilk elektroforez çalışması için gereklidir; Program ileride kullanmak üzere kaydedilebilir. sonraki işlemler için, 5.2 adıma gidebilirler.- Yazılım gösterge tablosunda "Yeni Plate Oluştur" ikonuna tıklayın.
- r verun bir kukla adı ve aşağıdaki seçenekleri belirleyin: kuyu sayısı, 96; Levha Tipi, parça; Kılcal uzunluğu, 50 cm; Polimer, POP7. "Ata Plaka İçeriği" butonuna tıklayın.
- Altında "Tahliller", "Yeni Testi Oluştur" tıklayın; Yeni bir paneli görünecektir.
- deneyi "FPCR-CGE Tahlili" adlandırın ve "Uygulama Türü" doğru olarak ayarlanmış olduğundan emin olun "Fragment."
- altındaki "Create New" butonuna tıklayarak enstrüman protokolünü kur "Enstrüman Protokolü."
- Set veya uygun alanlarda aşağıdaki seçenekleri ve parametreleri seç: Uygulama Türü, Fragment; Kılcal uzunluğu, 50 cm; Polimer, POP7; Boya Set, G5; Çalışma Modülü, FragmentAnalysis; Protokol Ad, FPCR-CGE Enstrüman Protokolü; Fırın Sıcaklık, 60 ° C; Gerilim çalıştırın 19.5 kV; Ön çalıştırma voltajı, 15 kV; Enjeksiyon voltajı, 1.6 kV; Çalışma Süresi, 1330 s; Ön çalıştırma zaman, 180 s; Enjeksiyon zamanı, 15 s; ve Veri Gecikme, 1 s.
- Cı"Uygula Testiyle" butonuna ve daha sonra "Kaydet Kütüphanesi" butonuna Tran programını kaydetmek için. Devam etmek için paneli kapatın.
- altındaki "Create New" butonuna tıklayarak bir boyut çağıran protokol kur "Sizecalling Protokolü."
- Set veya uygun alanlarda aşağıdaki seçenekleri ve parametreleri belirleyin: Protokol Adı, FPCR-CGE Sizecalling Protokolü; Boyutu, standart, GS500 (-250) Liz; Boyut-Arayan, SizeCaller v1.1.0; Analiz Ayarları -; Analiz Menzil, Tam; Boyutlandırma Menzil, Tam; Yöntem, Yerel Güneyli çağrılması Boyutu; Astar Tepe, Bugünü; Mavi, Yeşil, Turuncu Kanalları, (Kontrol); Asgari Tepe Yüksekliği, tüm kanallar için 175; Yumuşatma, Hiçbiri kullanın; Kullanım baselining (Temel Pencere (PTS)), (kontrol) 51; Minimum pik yarı genişliği, 2; Tepe Pencere Boyutu, 15; Polinom derecesi, 3; Yamaç Eşik Tepe Başlat, 0.0; Yamaç Eşik Tepe Sonu, 0.0; QC Ayarları -; Boyut Kalite, -; Değer ise <0.25 başarısız; Değer ise <0.75 geçirin; 80 0 bp'den Doğrusallık varsayalım0 bp; ve harekete geçirir Çekme üste bayrağı Çekme 0,1 ≤ oranı ve çekme Scan ≤ 1.
- Programı kaydetmek için "Uygula Testiyle" butonuna ve daha sonra "Kaydet Kütüphanesi" butonuna tıklayın. Devam etmek için paneli kapatın.
- tahlil "Kaydet Kütüphanesi" butonuna bir kez daha tıklayarak kaydedilmiş olduğundan emin olun ve "Kapat" düğmesine tıklayarak paneli çıkın.
- Geri "Ata Plaka İçindekiler" sayfasında, altında "Yeni Dosya Adı Konvansiyonu oluştur" linkine tıklayın "Dosya adı Sözleşmeleri."
- Programı Ad "FPCR-CGE Dosya Adı".
- Altında "Kullanılabilir Öznitelikler," (örneğin, "Run tarihi", "Run Time," "Eh Konumu", ve "Örnek Adı" gibi) dosya adında görünür istenen özelliği seçin. seferin sonuçları saklanır istenen dosya konumu seçin.
- Daha sonra "Uygula Testiyle" butonuna tıklayın ve"Kaydet Kütüphanesi" tuşuna basarak programı kaydedin. Devam etmek için paneli kapatın.
- Geri "Plaka İçeriğini atama" sayfasında, altında "Yeni Sonuçlar Grup Oluştur" bağlantısını tıklayarak "Sonuçlar Gruplar."
- Programı Ad "FPCR-CGE Gruplar sonuç."
- Altında "Kullanılabilir Öznitelikler," (örneğin, "Tahlili Adı" olarak) dosyası adında görünür istenen özelliği seçin. seferin sonuçları saklanır istenen dosya konumu seçin.
- Programı kaydetmek için "Uygula Testiyle" butonuna ve daha sonra "Kaydet Kütüphanesi" butonuna tıklayın. Devam etmek için paneli kapatın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek çalıştırın bir elektroforez için programı kurun.
- paneline git ve "Yeni Plate oluştur" simgesine tıklayın.
- (Kolay referans tarihi, hücre çizgisi ve gen adını içerir) istenen şekilde çalıştırmak adı. Aşağıdaki seçenekleri belirleyin: kuyuların sayısı96; Levha Tipi, parça; Kılcal uzunluğu, 50 cm; Polimer, POP7. "Ata Plaka İçeriği" butonuna tıklayın.
- Arzu edildiği gibi örneğin her kuyu etiketleyin (örneğin, bir örnek de, bir negatif kontrol olduğunu belirtmek için "NC" adlandırılabilir).
- "Tahliller", "Dosya Adı Sözleşmeleri" ve "Sonuçlar Gruplar Altında Ekle Kütüphanesi'nden" bağlantı "kutuları, click" ve 5.1.17 adım 5.1.3 oluşturulan programları seçin.
- Analiz edilecek tüm kuyuları vurgulayın ve altında ilgili programları seçin "Tahliller", "Dosya Adı Sözleşmeleri" ve "yanlarındaki kutuları işaretleyerek Sonuçları Gruplar".
- Genetik analiz tepsinin üzerine plaka yüklemeden önce, 96 oyuklu bir plaka üzerinde kauçuk conta uygulamak ve genetik analiz ile birlikte plastik durumda kapalı bir tabak koydu.
- Genetik analizör önünde "Tepsi" düğmesine basın ve ne zaman tepsi yenidenKapıyı açıp tepsiye kaplı plaka yük, ekipmanın ön ağrıyor. Plaka yerine kilitli olduğundan emin olun ve ardından kapıyı kapatın.
- düğmesinin "Çalıştır için bağlantı Plate" seçeneğini tıklayın.
- "Yük Tabaklar Run için" sayfasında, tüm reaktifler ve koşullar doğru ve sırayla olmasını sağlamak için son bir kontrol yapmak.
- "Başlat Çalıştır" butonuna tıklayın. 24 örnek (96 oyuklu plakanın birinci 3x8 kuyu) her biri, çalışma tamamlamak için en az 55 dakika sürer.
Elektroferogramıyla 6. analizi baz-çifti Farklar belirlemek için
- kapiler jel elektroforez işlemi tamamlandığında, sonuçlarını analiz etmek için analiz yazılımı açın.
- simgesi "Proje ekle Örnekler" ve çalıştırma dosyaları içeren klasör aramak tıklayın. adım 5.1.12 sonuç dosyalarının atanan konum dan hatırlayın.
- tamamlanan koşu ve cl her enjeksiyonun tüm sonuçlar dosyaları seçin"Listeye Ekle" butonuna Tran; Bu dosyaların isimleri "INJ" ile başlayan ve çalışmasının ayrıntılarını içermektedir.
- analizi ile devam etmek için "ekleyin ve Analiz" düğmesine tıklayın.
- İlk örnekteki tıklayıp son numuneye kadar aşağı imleci sürükleyerek vadede bütün örneklerini seçin ve ardından "Görüntü Entrikalar" simgesine tıklayın.
- Turuncu simgesini kontrol ve renkli simgeler kalanını işaretini kaldırarak sonuçların portakal kanal açmak, boyut standardı kalitesini kontrol etmek; Bu boyut çağıran doğru ve güvenilir olmasını sağlamak için önemlidir.
- hedeflenmemiş kontrol türetilen fragmanları ve hedeflenen klonlarına karşılık gelen tepe noktaları görüntülemek için, bu kanallardan okumaları açık mavi ve yeşil ikonlar kontrol edin.
- İlk sonuçlar arsa ve seçmek için sağ tıklayıp yatay eksen üzerinde imlecini "Tam Görünüm." belirlemek için bir bakışta tüm sonuçlarını görüntülemek için aşağı kaydırınrun ile herhangi bir büyük sorun varsa. arsa ilgili ekseninde fareyi sağ tıklatın değerlerin belirli bir aralıkta yakınlaştırmak için, "Zoom To ...," seçim ve ilgi değerler aralığında anahtar.
NOT: Bir potansiyel büyük sorun bütün numuneler düşük yoğunluklu zirveleri vermeniz. Bu, kapiler elektroforez ya da kolayca PCR işlemini tekrarlama ile ya da sırasıyla, bir düşük seyreltme faktörü kullanılarak amplıkonları seyreltilmesi ile giderilebilir amplikonların aşırı seyreltme öncesinde fluoroforla işaretlenmiş amplikonların uzun süreli depolama için genellikle. - Sonuçları kaydetmek için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
- mavi ve yeşil kanalları seçilmiş olduğundan emin olun ve "Boyutlandırma Tablosu" simgesine tıklayın.
- "Dosya" açıp seçerek sekme ayrılmış metin (.txt) biçiminde değerleri tablosuna Kaydet "İhracat Masa." buna göre Dosyayı adlandırın ve seçtikleri dosya konumu seçin.
- arsa kaydetmek içinPDF formatındaki çalışmasının lar, "Dosya" gidin ve "Yazdır" seçeneğine tıklayın. İlgili PDF yazar ve basın seç "Yazdır". buna göre Dosyayı adlandırın ve seçtikleri dosya konumu seçin.
- hedeflenmemiş vahşi tipli kontrol ve CRISPR / Cas9 hedefli klonlarından türetilen parçalarının büyüklüğü farkı hesaplamak için, aşağıda açıklandığı gibi yapılmalıdır.
- Bir elektronik tablo programı ile adım 6.9.2 sekme ayrılmış metin (.txt) dosyasını açın. tablo bu dört önemli sütunları içermelidir: "Boya / Numune Zirvesi" (mavi veya yeşil kanalı belirten), "Örnek Dosya Adı", "Boyut" (ilk karakter kuyu veya örnek adını belirtiniz) (boyutunu gösteren fragmanı olarak adlandırılır) ve tepe floresans yoğunluğunu gösteren "yüksekliği" ().
- İlgili zirveleri tek tek için beklenen boyut aralığı içinde olmayanlar da dahil değildir.
NOT: Genellikle, indel mutasyonlar nadiren daha sonuçlanabilirboyutunda bir 100-bp farkından; Bu şekilde, boyutu (yeşil kanaldaki hakim zirve), vahşi tipli kontrol zirveden fazla 100 bp farklılık tepe hariçtir. Bu kolayca elektronik tabloda "Koşullu Biçimlendirme" fonksiyonu altında seçenek "Arasında" kullanılarak yapılabilir. - taban seviyesinden ayırt edilemeyen spesifik olmayan zirveleri, kaldırmak için, kimin yükseklikleri 2.000 birimlerinin daha düşük doruklarına dışlamak için tablo programında "Koşullu Biçimlendirme" fonksiyonu altında "daha az" seçeneğini kullanın. Bu kesme değeri, deneysel olarak tespit edilmiş ve uyum gördüğü durumlarda, bu nedenle ayarlanabilir.
- Birinciden ikinci çıkarılarak mavi kanal (CRISPR / Cas9 hedefli klon) ve yeşil kanalı (hedeflenmemiş vahşi tipli kontrol) tek tepe sonuçlanan tepe her biri arasında, fragman büyüklüğündeki farkı hesaplanır.
NOT: Her kılcal Elektrofore atfedilen değerleri kullanmak önemlidirESIS örnek olarak doğal suş kontrol parçası boyutu arası örnek farklılıklar olabilir. - en yakın tamsayıya değerleri kapalı yuvarlak içine veya söz konusu genomik sekans varsa, silinmiş baz çifti sayısının belirlenmesi için. bir gen nakavt ilgi olduğunda, kimin indel mutasyonlar değil 3 bp katları olan seçme klonları kodlama sekansında çerçeve kayması olmamasını sağlamak için.
Klonların Nakavt Durumu 7. Doğrulama
- % 0.25 tripsin-EDTA, 25 uL kullanılarak hücrelerin tripsinize ve 5 dakika için 37 ° C'da kuluçkalama ile 24 oyuklu plakaya (adım 2.4 ve 2.6 ile), 96 oyuklu plakadan tek nakavt klonlar Expand.
- trisinize edilmiş hücrelerin orta ila 125 uL (% 10 FBS ile takviye edilmiş) ilave edilir ve iyice yeniden süspanse edin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın.
- Mümkün kullanılarak vakum emme ya da pipet gibi ortam kadar çıkarın ortamının 500 uL hücre pelletini, ve 24-çukurlu plaka iyi hücre süspansiyonu aktarın. Hücreler% 80-90 ulaşana kadar 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe edin.
- 24 gözlü levhadan 6 kuyulu bir plakaya ve 6 oyuklu plaka bu 80 ulaşmak 10 cm'lik bir tabak için seri olarak tek tek klonlar genişletme - aşağıdaki miktarlar kullanılarak tekrar adım 7.1 ve 7.4,% 90 kaynaşmaya: % 0.25 50 uL tripsin-EDTA ve (6-çukurlu plaka 24 gözlü levhadan genişletilmesi için) ortamın 150 uL ve% 0.25 200 uL tripsin-EDTA ve ortamın 1 ml (6- genişletilmesi için oyuk) 10 cm'lik bir tabak için plaka.
- % 0.25 tripsin-EDTA 1 mL kullanılarak ve 5 dakika için 37 ° C'de inkübe hücrelerin tripsinize% 90 kaynaşmaya - bunlar 80 ulaştığında klonlar hasat.
- trisinize edilmiş hücrelerin ve resuspe orta ila 5 mL (% 10 FBS ile takviye edilmiş) ilaveİyice nd.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de iki adet 15 ml tüpler, santrifüj içine eşit hücre süspansiyonu aktarın ve mümkün olduğu kadar orta kaldırmak. hücrelerin bir kısmı, genomik DNA izolasyonu için ve diğer toplam protein ekstre içindir.
- Sanger dizileme yoluyla doğrulama için aşağıda açıklanan adımları uygulayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi, 12 klon, genomik DNA ekstrakte edilir.
- Bölüm 3.2 de tarif edildiği gibi, CRISPR / Cas9 hedef bölgenin kapsayan bölgenin PCR amplifikasyonu gerçekleştirmek ancak işaretlenmemiş primerler kullanılır. etiketten floresan müteakip Sanger sıralama adımı engel olacak şekilde, bu adım için işaretli primerler kullanmayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi 12, bir PCR temizleme kiti kullanılarak amplikonları arındırın.
- tarif previousl olarak klonların genotipini belirlemek için aşama 7.9.2 kullanılan PCR primerleri kullanılarak saflaştırılmış amplikonları, Diziy 12.
- Daha önce, 12 anlatıldığı gibi Batı benek analizi ile doğrulaması için, vahşi tipli hücreler ve hedef klonlardan total protein ekstrakte edilir.
- Daha önce tarif edildiği gibi, 12, hedef genin proteine karşı uygun antikorlar kullanılarak Western blot analizi gerçekleştirir; gerçek bir nakavt klonu protein ekspresyonu yoksundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniği yabancı DNA teslim için uygun olan hemen hemen herhangi bir hücre hattında genomunda hedeflenebilir bölgesi için geçerli olması beklenmektedir. Daha önce, bir kolorektal kanser hücresi hattı 12 üç geni hedef alan ile uygulanmasına göstermişlerdir. Burada, bir dızı CRISPR'nın hedeflenen bir hepatoselüler karsinom hücre hattı, HepG2, genotipleme kendi etkinlik / Cas9 1 (NAP1L1) geni gibi nükleozom kurulumu Protein 1'e karşı yapı göstermektedir. Aslında, başarılı bir çok diğer genler 12 hedefleyen insan olmayan memeli hücre hatları, 13 dahil olmak üzere diğer çeşitli hücrelere, genotip için flöresanlı PCR kılcal jel elektroforez tekniği kullanmışlardır.
Deney-bazlı, floresan PCR kılcal jel elektroforezi technique kolay ve gerçekleştirmek için hızlı. Cas9 ve sgRNA ekspresyonunun hücre ve pozitif klonların seçilmesi konstraktlarının sonra, ayrı ayrı klonlar, ev yapımı lizis tamponu, Direk lizis tamponu 12 kullanılarak 96 oyuklu bir kültür plakasına şirketinden parçalanır. Deneyimlerimize göre, elde edilen lizatlar, genomik DNA, kalite kaybı olmadan, birkaç ay boyunca -20 ° ya da daha düşük bir sıcaklıkta muhafaza edilebilir. Bu parçalama aşaması, CRISPR hedef bölgeyi kapsayan florofor etiketli amplikonların üretimini içine PCR amplifikasyon aşaması takip eder. Resim floresan PCR protokolü, bu amaç için optimize edilmiştir ve tutarlı bir şekilde bağımsız olarak bölgenin amplifiye edilen, bol PCR ürünleri üretti. Şekil 1, bir tek CRISPR / Cas9 hedefli klon tekabül eden her bir şerit ve değerden uygun çeşitli gruplarla, floresan PCR adımında elde edilen amplikonların çözünürlük temsili bir sonuç göstermektedirklonlar tek tek allellerin amplifiye bölgelere onding. Deneyimlerimize göre, diğer polimerazlar ve bunlara eşlik eden protokollerin kullanımı daha düşük bir amplikon verimi ile sonuçlanmıştır. bu kolayca kılcal jel elektroforezi için numune hazırlama sırasında seyreltme faktörü ayarlayarak düzeltilmesi, ancak daha düşük verim amplikonlar kullanıldığı zaman, çevre ya da gürültü seviyesi dolayısıyla daha yüksek olabilir. PCR adımından sonra, amplikonlar seyreltilir ve vahşi tipli numunenin bu hedeflenen klonlar bir kılcal jel üzerinde de deiyonize formamid tamponu, bir boyut standardı, denatüre eklenmeden önce eşit oranda karıştırılır ve çözülür.
kılcal jel elektroforezi tamamlandıktan sonra genotipleme sonuçlan analiz edilmeye hazırdır. sonuçlar iki önemli setleri elektroforez çalışmasından gereklidir: tepe noktaları olan elektroferogramlar bireysel floresan sinyalleri ve th tekabülhesaplama için gerekli olan bütün değerleri içeren e sonucu tablo. Şekil 2, HepG2 hücrelerinde NAP1L1 gene karşı sgRNA hedeflenen iki klonun genotipleme için sonuçları göstermektedir. Mavi tepe CRISPR / Cas9 hedefli klonların indel mutasyonu içeren alel amplikonlarının uygun iken, yeşil zirveleri, ebeveyn HepG2 hücrelerinde hedeflenmeyen vahşi tipli alel amplikonlarının karşılık gelmektedir. açık bir şekilde gösterildiği gibi, iki klon her iki alelde üzerinde bir ila on nükleotidin silinmesi ile homozigot mutantlar (aynı şekilde mutasyona uğramış aleller olan mutantlar) vardır. Tepe değerleri yabani tip hücrelerin hedeflenen klonların amplikon ve arasında temel çift farkların sayısı belirlemede önemlidir ise elektroferogramlar, sadece görüntüleme amacıyla kullanılır dikkat etmek önemlidir.
nakavt durumunun gerçekliğini doğrulamak için, performans tavsiyeSanger sekanslama ve Western blot analizi hücrelerinde gen ifadesinin kaldırılması teyit etmek için. Yukarıda tanımlanan klon flöresanlı PCR kılcal jel elektroforezi sonuçları (Şekil 3A) ile tutarlı Sanger dizileme sonuçları vermiştir. Nakavt klonların beklendiği gibi Ayrıca, NAP1L1 protein ekspresyonu tamamen ablasyon (Şekil 3B) gösterilir.
Şekil 1: NAP1L1 Gene Yönelik CRISPR / Cas9 Hedeflenen HEPG2 Klonların PCR Amplikonlar. Floresan PCR adımında amplikonlan iki ayrı agaroz jelleri (üst ve alt) üzerinde çözülmüştür ve her bir şerit, ayrı bir hedef klonuna karşılık gelir. L: DNA merdiveni (tek tek bantların boyutları aşağıdaki şemaya verilmiştir). Onu tıklayınE bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 2: Kapiler jel elektroforez ile Çözülmüş İki Samples floresan sinyalleri çizimleri. Yatay eksen fragmanı boyutunu temsil eder ve dikey eksen floresans sinyali yoğunluğunu temsil etmektedir. Yeşil tepe yabani tip hücrelerden türetilen fragmanlara karşılık ise mavi tepe CRISPR / Cas9 aracılı hedefli klonlarından türetilen fragmanlarına karşılık gelir. Macenta hatları sürekli örnekleri arasında pikleri gösteren konum işaretleri analiz yazılımı ile belirlenen otomatik tepe çağrı pozisyonlarına karşılık gelmektedir. Tek tek zirvelerin yanında verilen değerler (bp olarak) parçalarının boyutları ile ilgilidir ve analiz yazılımı ile elde edilir. Parantez içindeki değerler tek tek fra boyutları arasında hesaplanan fark tasvirhedeflenen bir klon ve yabani fragmanından gments. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Deneyler sonuçları iki klon içinde hedef genin Knockout durumundadırlar. Belirtilen proteine karşı antikorlar kullanılarak (A), Sanger sekanslama sonuçları ve (B) 'Western blot analizi. mavi nükleotitler kırmızı olanlar protospacer bitişik motifi (PAM), temsil eder, sgRNA hedef diziyi temsil eder, olanlar kahverengi baz-ikame edilmiş nükleotidleri temsil eder, ve çizgi nükleotid allelinde silinir pozisyonları temsil eder. Bir sonraki bireysel klon adlarına parantez içinde değerler klonu allellerin genotipi temsil eder; " "-1" -1. 0" aleller sırasıyla bir ve on bir nükleotid delesyonu içerdiği anlamına gelir Western blot tespit proteinlerin yaklaşık büyüklüğü analiz: ~ 54 NAP1L1 için kDa ~ P84 (yükleme kontrolü) 84 kDa. Bir görüntülemek için lütfen Bu rakamın daha büyük versiyonu.
| reaktif | Bir reaksiyon için hacim (ml) |
| Kit özgü çözüm | 4 |
| 10x PCR Tampon | 2 |
| 10 uM ileri primer (etiketli) | 1 |
| 10 uM ters primer (etiketsiz) | 1 |
| 25 mM dNTP karışımı | 0.4 |
| Taq DNA Polimeraz | 0.2 |
| Su | 8.4 |
| seyreltik lizat | 3 |
| Genel Toplam | 20 |
Tablo 1: Floresan PCR reaksiyonu için ayıraçlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
seçim modeli hücre hattında spesifik bir genin nakavt geni söz konusu hücresel bağlamda oynadığı rol ortaya çıkması için rutin hale gelmiştir. Aslında, çeşitli, genom çapında taramalarla genom 14, 15, 16, hemen hemen tüm bilinen insan dizilerini hedef CRISPR / Cas9 sistemi kullanmak şu anda mevcuttur. Bu büyük ölçekli ekranlar (veya ilgili tek tek genlerin hedeflenmesi daha küçük ölçekli) ile tasarlanması ve aynı genin farklı lokusları hedefleme sgRNAlardır kullanılması önemlidir. açık bir biçimde genin tükenmesi gerçek etkisini capitulate ediyorum kullanılan farklı sgRNA'lann genelinde tutarlı sonuçlar. Bu şekilde, tek bir genin hedeflenmesi doğru kullanılan tek tek sgRNA her birinden gelen klonların bir çok genotip için yüksek hacimli genotipleme aşamasını gerektirir. flöresanlı PCR kılcal jel elektroforezi tekniği diye tarif edilentam da bu görevi gerçekleştirebilir yeniden.
mevcut genotipleme yöntemlerin çoğu, yüksek verimli amaçları için uygun ise de, her biri yere daha az hale getiren bazı belli kısıtlamalardan etkilenir. 10 dupleksleri DNA uyumsuzluklarını bulgulamaktadır SURVEYOR veya T7E1, deney, vahşi tipli hücreleri ve bağlı her iki klon uyumsuzlukları 11 yoksun dupleksleri elde gerçeğine homozigoz mutantları (iki aynı mutasyona uğramış aleller ile klon) arasında ayırt etmek mümkün değildir. CRISPR hedef bölgede 17 indel mutasyonlara bağlı kısıtlama sitelerinin yok olduğunu rapor restriksiyon parça uzunluk polimorfizm (RFLP) analizi, hedef bölge 18, uygun restriksiyon siteleri mevcudiyetine ile sınırlıdır. Erime eğrilerinin 19 göre farklı genotipleri ayıran DNA erime analizi tekniği, 20, tutarlılık eksikliğinden muzdariptir. Buna ek olarak, bu yöntemler her üç genetik sekansında bir çerçeve kayması meydana gelmesini bildirmez bu özellikle bilgi değildir. Bunun aksine, Sanger sekanslanması, - halen en popüler genotipleme tekniktir - bu, hedeflenen genomik bölgenin tam sırası temin ettiği için, son derece açıklayıcıdır. Bununla birlikte, bu teknik, özellikle büyük ölçekli deneylerde, maliyetlidir. bu, yukarıda tarif edilen diğer teknikler ile karşı karşıya tüm sınırlamalar aşmak çünkü bu durumda, burada tarif edilen floresan PCR kapiler jel elektroforezi tekniği karakterizasyonu hayati önem taşımaktadır.
flöresanlı PCR kılcal jel elektroforezi tekniği bir klon içinde vahşi tip ana kadar olan tüm olası genotipler arasında ayrım yapmak için, kullanıcıya, homozigoz mutant (doğal tipte alel ve bir mutant alel ile karakterize edilir) heterozigot mutant (iki ident ile karakterizeik mutant alel), ve iki özdeş olmayan mutant alelleri ile karakterize edilen bileşik heterozigot mutant (). Bu genotip elektroferogramdaki tepe desenleri ile kolayca türevlenebilir. Bundan başka, bu genotipleme tekniği hedeflenen klonların fragmanı doğal tipte amplikonun boyutu ve bu arasındaki farkı rapor eder ve tek bir baz çifti doğrudur. Bu etkin kullanıcıların bu kez zaman ve maliyet tasarrufu, klonlar sadece bir avuç kendi doğrulama azaltmak için izin genetik sekansında bir çerçeve kayması varlığını veya yokluğunu bildirir. Bunun üzerine, bu teknik, aynı zamanda (yani, aynı anda tek bir hedefi daha genotip olabilir) hedef genin çok yönlü olarak detaylandırılmasına olanak verir, ve bu anormal tepe desen mevcudiyetinde (örneğin, varlığı bir heterojen hücre popülasyonu saptanmasını sağlar diploid hücrelerde elektroferogramı üç veya daha fazla tepe) arasında. Burada ve daha önce 12 kullanılan hücre hatlarına ek olarak </ sup>, 13, aynı zamanda başarılı bir şekilde flöresanlı PCR kapiler jel elektroforez tekniği kullanılarak, kök hücre ve nöronal hücreler (yayınlanmamış veriler) de dahil olmak üzere, çeşitli başka insan ve insan olmayan hücre çizgileri genotiplendi ve biz bu teknik uygulanabilir olduğunu tahmin CRISPR / Cas9 hedeflemeye yatkın olan herhangi hücrelere. Bu teknik, hücre içinde ayrı ayrı allel genotipi rapor Dahası, bu tür anöploidinin veya genetik amplifikasyonlar sahip kanser hücreleri gibi çok alelik hücreleri, genotipleme olarak son derece yararlıdır.
Protokol CRISPR / Cas9 hedefli klonların yönlü ve yeniden üretilebilir bir genotip için optimize edilmiştir (kullanılan tüm malzeme de dahil olmak üzere) burada açıklanan. Bununla birlikte, modifikasyon garanti bazı bölümleri vardır. Bunlar arasında, ancak bunlarla sınırlı değildir: farklı bir seçim strateji kullanılmasını gerektirebilir 1) farklı bir sgRNA ekspresyon vektörünün kullanımı (veya klonlama stratejisi),(Örneğin, yerine FACS klonlarının antibiyotik seçimi); 2) floresan PCR adımında için farklı bir polimeraz kullanılması; ve 3) farklı floresan etiketler kullanımı. Ayrıca, protokolde temel birkaç adım sorunlu kanıtlamak dikkati çekiyor. İlk olarak, floresan PCR amplikonları agaroz jel elektroferogramdaki spesifik olmayan bantlar verebilir veya kapiler jel elektroferogramdaki tepe model olabilir "gürültülü." Bunun nedeni, PCR primerleri alt en iyi kalitede olasıdır ve bu nedenle, bu primerler yeniden tasarlanması ile giderilebilir. Bu amplifikasyon adımı tutarlılığı, yeniden üretilebilirlik ve özgüllük sağlamak için fluoroforla işaretlenmiş olanlar tedarik önce etiketlenmemiş oligonükleotid primerler kullanılarak kalitesini test önerilir. dikkat etmek diğer önemli bir doğru pozitif nakavt klonlar elde oranını belirleyebilir CRISPR kılavuz RNA verimidir. sgRNA arama prog hiçbiri bu yanaŞu anda mevcut ram her sgRNA etkinliği sadece ampirik olarak saptanabilir, kusursuz bulunmaktadır. Bu nedenle, tasarım ve başarılı bir nakavt klon elde olup şansını azaltmak için her bir hedef gen için birden fazla sgRNA (tercihen üç veya daha fazla) kullanılması önemlidir.
flöresanlı PCR kılcal jel elektroforezi tekniği, bilgilendirici, duyarlı ve kullanımı kolay iken, bazı uyarılar ile gelir. İlk olarak, bu teknik, mevcut olmayabilir genetik analiz, kullanımını gerektirir. Bu amaç için kullanılan bir genetik analiz Sanger dizileme deneyler için kullanılan aynı olduğu, ancak, kılcal jel elektroforezi protokol, mevcut Sanger dizileme servis sağlayıcılar için dış kaynaklı olabilir. Aslında, daha önce de içi yapılan zaman karşılaştırılabilir bir maliyetle kılcal jel elektroforezi protokol gerçekleştirmek için dizilim servis sağlayıcı ile düzenlenmiştir. techniq İkinci, doğrulukindel mutasyonlar uzun 30 bp işin içine girdiğinde ue uğrayabileceği. Deneyimlerimize göre, floresan PCR kılcal jel elektroforezi teknik, büyük indeller (> 30 bp), gözlemlenen zaman indeller büyüklüğü göz ardı etme eğilimindedir. Ancak, bizim deneyim, mutantların bir büyük çoğunluğu (en az 5 bp) çok kısa indel mutasyon uzunlukları görüntülenir. Bununla birlikte, bu kullanılan CRISPR hedef site ve hücre hattında son derece bağlıdır. Üçüncü olarak, floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniği CRISPR / Cas9 kesme sahasında NHEJ onarım üzerine taban ikameleri tespit etmek mümkün değildir. Bununla birlikte, çift iplikli molaları NHEJ onarım sonucunda baz ikame nadir bir olay 21 olduğu rapor edilmiştir ve bunlar zararlı genin okuma çerçevesini değiştirmez. Dördüncü olarak, bu teknik, sadece (genetik değişiklikler ou herhangi bir hedef dışı sapmaları rapor yoktur ve böylece flöresanlı PCR aşamasında çoğaltılan hedef bölge değişiklikleri tespit eder ve) Genişletilmiş bölgenin tside. Bireysel CRISPR sgRNA off-hedef etkilerinin böyle kapsamlı bir anket gerekiyorsa, biz doğru hedeflenmiş klon genomunda herhangi bir değişiklik tespit etmek için tüm genom sıralamasını öneriyoruz. Yukarıda ele alındığı gibi, birden fazla sgRNA, hedeflenen gen başına kullanıldığı takdirde, bu oldukça pahalı bir deney gerekli değildir. Son burada tarif edilen floresan PCR kılcal jel elektroforezi tekniği 600 bp'lik bir fragmanı boyutunda olabilir. Hedef bölge tekrarlanan diziler oluşur ya da PCR amplifikasyonu verimliliği ve özgüllüğünü etkileyebilir derece yüksek guanin-sitosin (GC) içeriği, varsa, bu bir sorun teşkil edebilir. Bu kolayca önlenebilir sorun hedeflenen bölgenin uygun yükseltilmesi için göz önüne alınması içermelidir dikkatli sgRNA hedef tasarımın önemini vurgulamaktadır. Bu durumda, güçlü ve flöresanlı PCR kapiler jel elektroforezi tekniği uyarılar, genotipleme bu basit yöntemi dikkateBu güne kadar bir darboğaz kalır nakavt klonlarının yüksek hacimli genotiplenmesi yükünü azaltabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar kılcal jel elektroforezi deneyleri ile yardımcı olmak için Bayan Tan Shi Min, Bayan Helen Ong ve Dr Zhao Yi teşekkür etmek istiyorum. Bu iş / 1314/2011 NMRC ve Çevre Bakanlığı AcRF Tier 2 Fon hibe MOE2011-T2-1-051 hibe NMRC / IRG'de tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid | Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| HyClone Water, Molecular Biology Grade | GE Healthcare | SH30538.02 | |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3' |
| CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense) | AITbiotech | None | Sequence: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unlabeled PCR amplification forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| HEX-labeled fluorescent PCR forward primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unlabeled PCR reverse primer | AITbiotech | None | Sequence: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3' |
| Taq PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Series 2 program | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 program | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antibody (N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
References
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312 (2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
- Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587 (2015).
- Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
- Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632 (2014).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157 (2014).
