Summary
Elektrofysiologisk karakterisering af kardiomyocytter afledt af humane pluripotente stamceller (hPSC-CM'er) er afgørende for hjertesygdomsmodellering og til bestemmelse af lægemiddelresponser. Denne protokol tilvejebringer de nødvendige oplysninger til at dissociere og plader hPSC-CM'er på multi-elektrode arrays, måle deres feltpotentiale og en metode til analyse af QT- og RR-intervaller.
Abstract
Kardiomyocytter kan nu udledes med høj effektivitet fra både humane embryonale og humane inducerede-pluripotente stamceller (hPSC). HPSC-afledte cardiomyocytter (hPSC-CM'er) anerkendes i stigende grad som værende af stor værdi for modellering af kardiovaskulære sygdomme hos mennesker, især arytmi-syndromer. De har også vist relevans som in vitro- systemer til forudsigelse af lægemiddelresponser, hvilket gør dem potentielt nyttige til narkotika-screening og -opdagelse, sikkerhedsfarmakologi og måske til sidst for personlig medicin. Dette ville blive lettere ved at udlede hPSC-CM'er fra patienter eller modtagelige individer som hiPSC'er. For alle anvendelser er præcis måling og analyse af hPSC-CM elektriske egenskaber imidlertid afgørende for at identificere ændringer som følge af hjerte ionkanalmutationer og / eller lægemidler, der målretter ionkanaler og kan forårsage pludselig hjertedød. Sammenlignet med manuel patch-klemme, giver multi-electrode array (MEA) enheder fordelene vedTillader optagelse af mellem- til høj gennemløb. Denne protokol beskriver, hvordan man dissocierer 2D cellekulturer af hPSC-CM'er til små aggregater og enkeltceller og plader dem på MEA for at registrere deres spontane elektriske aktivitet som feltpotentiale. Metoder til analyse af de registrerede data til ekstraktion af specifikke parametre, såsom QT og RR intervallerne, er også beskrevet her. Ændringer i disse parametre ville forventes i hPSC-CM'er, der bærer mutationer, der er ansvarlige for hjertearytmi og efterfølgende tilsætning af specifikke lægemidler, hvilket tillader detektion af dem, der bærer en kardiotoksisk risiko.
Introduction
Human Pluripotent Stamceller (hPSC'er) har evnen til selvfornyelse og genererer stort set enhver celletype af menneskekroppen gennem differentiering 1 , 2 . Detaljerede protokoller om, hvordan man differentierer hPSC'er til flere hjertestamninger (ventrikulære, atriale, pacemakerlignende kardiomyocytter) er blevet beskrevet 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyocytter er elektrisk aktive celler, og detaljeret viden om deres elektrofysiologiske aktivitet kan være yderst informativ til forståelse af hjerteudvikling og sygdom 8 . Patientspecifikke hiPSC-afledte cardiomyocytter (hiPSC-CM'er) har med succes været anvendt til at modelere og studere de cellulære, molekylære og elektriske egenskaber ved flere hjertearytmier, herunder Long QT Syndrome(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugada syndrom 14 og kathecolaminerge polymorfe ventrikulære takykardier 15 , 16 . Endvidere er flere lægemidler blevet tilsat til syge hiPSC-CM'er for at rekapitulere terapeutisk indgreb og for at redde de cellulære patologiske fænotyper 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . For nylig er screeningsplatforme baseret på WT hiPSC-CM'er udviklet som reaktion på behovet for humane systemer til de tidlige faser af lægemiddelopdagelse 23 , 24 , 25, da gnaverkardiomyocytter varierer dybt fra huMans i ionkanalekspression og biofysik 26 .
Til dette formål udvikles og implementeres teknologier, der er egnet til medium til høj gennemstrømning. Disse omfatter optiske optagelser af membranpotentiale, Ca 2+ transienter og belastning, impedansmålinger (som en indirekte måling af cellekontraktilitet) og ekstracellulære feltpotentiale (FP) målinger (for gennemgang se ref. 24 ). Multi-electrode Arrays (MEA) enheder tillader optagelse af de elektriske bølgeformsignaler (eller FP'er) der genereres og formes af monolag eller små klynger af cardiomyocytter. FP-konturen korrelerer med det kardiale virkningspotentiale og til en vis grad med elektrokardiogramoptagelserne 27 ; De viser typisk en indledende hurtig opstrækning svarende til Na + tilstrømning og membran depolarisering (R / Q peak), en langsom bølge / plateau fase sandsynligvis svarende til Ca2 + tilstrømning og en repolarisationsfase svarende til en overvejende K + udstrømning (T peak). FTP-bølgeformens forstyrrelse kan korreleres med ændringer i specifikke aktionspotentielle faser 28 .
Selvom patch clamp-optagelser af aktionspotentialer kunne være mere informative, især for parametre som opstødshastighed og hvilemembranpotentiale, er manuelle målinger ikke mulige til eksperimenter ved mellem- og høj gennemstrømningsskala, mens automatiseret patch klemme først er blevet anvendt til hPSC -CMs 29 . Da langvarige optagelser på MEA tillader både akut og kronisk eksponering for forbindelser, der skal undersøges, er det nu muligt at anvende hPSC-CM-platforme til lægemiddel screening, opdagelse 24 , 30 og for sikkerhedsfarmakologi 31 , 32 . Dette holder løftet om fremtidig præcision eller persoNaliseret medicin 33 .
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe de nødvendige oplysninger til dissociating og plating af hPSC-CM'er på MEA-chips og måling af deres FP. I denne procedure er hvert trin optimeret, hvilket sikrer optimal celleoverlevelse og genopretning efter dissociation, optimal cellehæftning til MEA-pladen og standardiseret analyse og kvantificering af parametre. Specielt forklares og eksemplificeres proceduren for ekstracellulær FP-registrering, analyse af QT- og RR-intervaller og evaluering af lægemiddelvirkninger.
Protocol
1. Fremstilling af opløsninger og reagenser
- Forbered hPSC-CM kulturmedium under anvendelse af lavinsulin, bovint serumalbumin, polyvinylalkohol, essentielt lipider (LI-BPEL) medium 34 , 35 , 36 ved at kombinere reagenserne beskrevet i tabel 1 . Filtrer mediet gennem et 0,22 μm porfilter og opbevar ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Forbered human rekombinant fibronectin stamopløsning ved at rekonstituere 1 mg human rekombinant fibronectin i 5 ml sterilt destilleret vand for at nå 200 μg / ml koncentration, alikvot og opbevar ved -80 ° C.
- Forbered 1% (w / v) enzymvaskemiddelopløsning (se tabel over materialer ) for at hjælpe med at fjerne resterende celler fra microarraychipet ved at opløse 1 g enzymopvaskemiddelpulver i 100 ml varm (~ 40-45 ° C) deioniseret vand. Lad opløsningen afkøles og opbevares ved 4 ° C fEller op til et år.
2. Sterilisering af MEA-chips (figur 1A)
BEMÆRK: Flere forskellige konfigurationer af MEA'erne er tilgængelige, med single- eller multi-well-formater. Protokollen beskrevet her bruger single-chamber MEA indeholdende 60 optagelektroder i et 8 x 8 gitterarrangement (se Materialebeskrivelse ). Elektrodediameteren er 30 μm, og afstanden mellem elektroder er 200 μm. En referenceelektrode er også til stede.
- Skyl chippen grundigt med deioniseret vand.
- Sæt MEA-chipsene inde i en glas-petriskål, der kan autoklaveres. Sæt fatet i aluminiumsfolie.
- Steriliser chipsene i en laboratoriepresse i 6 min. Lad diskene afkøle inden åbningen.
BEMÆRK: Alternativt kan chipsene steriliseres ved at nedsænke dem i 1 ml 80% (vol / vol) ethanol ved stuetemperatur i 15-30 minutter. - Placer chipsene i en cellekulturhætte og udsæt denOverflade til UV-lys i ca. 30 min.
3. Coating af MEA-chips (figur 1B og 1C)
- Placer de rene chips i en standard 10 cm Ø plast steril petriskål.
- Tilsæt 8 ml sterilt destilleret vand til petriskålen for at danne et befugtet kammer, hvilket forhindrer det lille volumen af kulturmedium på chippen til at tørre, når det placeres i inkubatoren.
- Brug specialfremstillede polytetrafluorethylen (PTFE) ringe ( Figur 1B ) for at sikre plettering af kardiomyocytterne i midten af chippen, hvor elektrodarrayet er placeret. (PTFE-ringene lagres tidligere i 80% ethanol.) I kogepladeen fjernes ringene fra ethanolet, placeres i en steril petriskål uden låg og lader ringene tørre i emhætten.
- Placer en tørring i en MEA chip ved brug af flamme-steriliserede pincet ( figur 1C ).
BEMÆRK: Brug alternativt 80% ethanol til at vaske pincet og lad tørre iN vævskulturhætten, før du bruger dem. - Optøn en alikvot af humant rekombinant fibronektinlager (200 μg / ml i destilleret vand) og fortyndes i PBS med Ca2 + og Mg2 + for at opnå en arbejdsløsning på 40 μg / ml. Belæg elektroderne ved at tilsætte 50 μl 40 μg / ml fibronectin inde i ringen.
BEMÆRK: Belægning ved hjælp af humant rekombinant fibronectin sikrer optimal hPSC-CM-binding. Imidlertid kan andre typer af coatingproteiner, såsom blandinger af kvægfibronektin eller ekstracellulære matrixproteiner, anvendes. - Luk låget på 10 cm Ø plast-petriskålen, og overfør forsigtigt fadet, der indeholder MEA-chip, ind i inkubatoren. Inkuber ved 37 ° C i mindst 1 time eller ved 4 ° C / N.
- Overfør skålen, der indeholder MEA-chippen, til cellekulturhætten. Før du bruger MEA-chippen, aspirere 50 μL fibronectin ved hjælp af en P200 pipette eller et vakuumsystem i hætten uden at forskyde PTFE-ringen. Brug plaTips til dette trin. Sørg for, at ingen faste genstande (f.eks. Pipettespidser) rører indersiden af parabolen, da det kan beskadige elektroderne.
BEMÆRK: Dette vil forlænge MEA-chipsets levetid. - Tilsæt forsigtigt 950 μL LI-BPEL medium (se Tabel 1 og Tabel af Materialer ) for at sikre, at den er jævnt fordelt, og at ringen ikke flyder. Ret skålen til inkubatoren.
4. HPSC-CMs dissociation og plating (figur 2)
BEMÆRK: Den her beskrevne protokol anvender hPSC-CM'er, som blev differentieret i en monolagskultur under anvendelse af cytokiner 34 ved ~ 18 dage efter start af differentieringen. Det har imidlertid vist sig at være egnet til enhver 2D og 3D hPSC-CM kultur. Ved anvendelse af differentierede kulturer ved tidligere eller senere tidspunkter kan justering af dissociation enzymets inkubationstid (se tabel over materialer ) være necessary. Følgende mængder er beregnet til en enkelt brønd i et 12-brønds pladematform (3,8 cm 2 ).
- Aspirere mediet fra hPSC-CMs kulturbrønd.
- Mens du arbejder under en vævskulturhætte, tilsættes 1-2 ml / brønd af PBS uden Ca 2+ / Mg 2+ for at vaske kulturen. Aspirere PBS.
- Tilsæt 500 μl / brønd af dissociationsenzymet. Inkubér i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 1 ml LI-BPEL / brønd for at fortynde enzymet. Løs forsigtigt monolaget af hPSC-CM'er ved forsigtigt at ridse ved hjælp af en P1000 pipette. Saml cellesuspensionen i et 15 ml rør.
- Skyl brønden med 1 ml LI-BPEL for at samle alle de resterende celler og celleklumper.
- Tilsæt en anden 2-3 ml LI-BPEL for at nå et slutvolumen på 5-6 ml og forsigtigt pipette op og ned 3-5 gange med en 5 ml pipette for at dissociere celleklumper.
BEMÆRK: Dissociation i enkeltceller på dette tidspunkt er ikke nødvendig, da det vil påvirke celleoverlevelse. Tilstedeværelsen af små klynger vilSikre højere celle levedygtighed. - Centrifuger cellerne ved stuetemperatur i 3 minutter ved 300 x g.
- Fjern supernatanten, forsøger at fjerne det meste af overskydende væske, men uden at løsne cellepellet.
- Resuspender cellepellet i 250 μL LI-BPEL (ved anvendelse af en P1000 og pipettering ekstremt forsigtigt).
- Fordel ~ 50 μL cellesuspension pr. MEA (op til 5 MEA'er kan fremstilles fra en brønd i en 12-brønds plade) ved pipettering af cellesuspensionen direkte i midten af PTFE-ringen oven på elektrodarrayet.
BEMÆRK: På dette stadium er cellerne vanskelige at tælle på grund af tilstedeværelsen af celleklynger, og det totale antal celler pr. MEA kan i alt væsentligt variere afhængigt af den anvendte hPSC-CM-kilde. Under plating skal du sørge for, at skyen af dissocierede celler dækker elektrodens areal. - Overfør MEA'erne omhyggeligt til inkubatoren ved 37 ° C og lad cellerne vedhæfte O / N
5. Ringefjernelse og mellemretFriskning (figur 3)
- Ved 1 dag efter plating skal du forsigtigt fjerne ringen i et sterilt miljø ved hjælp af sterile pincet ( Figur 3A-3B ).
- Skyl ringen i 80% (vol / vol) ethanol og opbevar den i et 50 ml rør indeholdende frisk 80% (vol / vol) ethanol.
- Fjern forsigtigt 500 μl medium fra MEA-chippen og tilsæt 500 μL frisk LI-BPEL.
- Overfør MEA'erne til inkubatoren ved 37 ° C.
BEMÆRK: Cellerne skal begynde at slå 1-7 dage efter fjernelse af ring og medieændring ( figur 3C ). - Mål elektrisk aktivitet af hPSC-CM'er på MEA 1-7 dage efter fjernelse af ringen.
6. Kontroller signalkvaliteten (figur 4)
- Tænd for computeren og start softwaren, der er knyttet til MEA-opsætningen: TCX-Control, MC_MEA Select og MC_Rack. Indstil temperaturen til 37 ° C i TCX-Control for at registrere målinger ved fysiologisk temperatur.
- Fjern skålen med MEA chip fRom inkubatoren. Åbn låget, tag MEA-chipet ud, og læg det på et væv for at absorbere resterende vand.
- Tør forsigtigt de eksterne kontakter på pladen med et væv og rengør dem ved hjælp af en vatpind fugtet med 100% (volumen / volumen) ethanol for at fjerne eventuelt resterende vand eller affald, hvilket kan forårsage signalstøj.
- Overfør MEA-pladen til det opvarmede (37 ° C) optagelseshovedstad for at opdage spontan aktivitet ( f.eks. Hardware: se Materialebord ; software: MC_Rack).
- Åbn MC_Rack: Klik på 'Rediger' → 'Tilføj MC_Card' for at oprette en ny protokol. Brug rullemenuen 'Rediger' for at tilføje forskellige optager og displayvinduer til protokollen.
BEMÆRK: Der anbefales en prøvefrekvens på mindst 10 kHz. Den protokol, vi bruger, indeholder et langvarigt displayværktøj med et komplet layout af hele MEA-chip og en Spike Sorter, der er afgørende for indfangning af narkotikaeffekt iN realtid. Spike Cutout er indstillet med en 'Pre Trigger' på 20 ms, en 'Post Trigger' på 800 ms og en 'Dead Time' på 2 ms. Protokollen kan gemmes som '.rck' -fil og genindlæses, før eksperimenterne startes.
- Åbn MC_Rack: Klik på 'Rediger' → 'Tilføj MC_Card' for at oprette en ny protokol. Brug rullemenuen 'Rediger' for at tilføje forskellige optager og displayvinduer til protokollen.
- Start protokollen i afspilningstilstand ved at klikke på 'play' knappen.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det muligt at genindlæse protokollen gemt i trin 6.5. I MC_Rack skal du indlæse protokollen (.rck filudvidelse) ved at klikke på 'Fil' → 'Åbn'. - Hvis signalerne udviser klart synlige R-toppe og T-tinder, vent 10-15 minutter for at afslutte tilpasningsfasen. Eksempler på gode og dårlige kvalitetsspor er vist i figur 4 .
BEMÆRK: Hvis ingen T-top kan detekteres i nogen af elektroderne, fortsæt ikke med eksperimentet. Normalt er dette resultatet af dårlig elektrisk aktivitet af hPSC-CM'erne eller dårlig fastgørelse af cellerne til elektroderne.
7. Start EksPeriment og optagelse
- Klik på 'record' og derefter 'play' og erhverver data i 10 minutter under baseline betingelser for at bestemme stabil tilstand. Angiv de elektroder, der har det bedste signal, så de let kan identificeres og eksporteres senere til analysen.
- Til vurdering af narkotika-respons tilføjes stigende koncentrationer af lægemiddel hver 10. minut. F.eks. Tilføj hERG-blockereren E4031 ved en slutkoncentration på 1 μM. Til dette fjern 100 μl medium og tilsæt det samme volumen 10 μM E4031 opløst i mediet.
BEMÆRK: Som tidligere vist af Cavero og kollegaer 31 er et klogt valg af mængden, hvor lægemidlet er opløst, vigtigt, da det dybt kan ændre lægemiddelresponsskurven. - Gentag trin 7.2 for alle andre lægemiddelkoncentrationer af interesse.
- Klik på 'stop' for at afslutte optagelserne i slutningen af protokollen.
8.MEA Rengøring til genanvendelse
- Når forsøgsoptagelsen er færdig, skal du forsigtigt fjerne mediet med en P1000 pipette. Undgå at røre indersiden af parabolen, da det kan beskadige elektroderne. Kassér i henhold til lokale sikkerhedsregler.
- Skyl MEA-chipsene med deioniseret vand ved brug af en vaskeflaske, og gentag vaskesteget 3-4x.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det ikke nødvendigt, at cellerne er helt adskilt fra chippen. - Tilsæt 1 ml enzymopløsningsmiddelopløsning 1% (volumen / volumen) i hver brønd og inkuber O / N ved 4 ° C for at tillade celledeposition og fjernelse af celler.
- En dag senere skylles MEA-chipsene grundigt med deioniseret vand for at fjerne enzymopløsningsmiddelopløsning og resterende celler og tilsæt 1 ml deioniseret vand. Clean MEA chips kan opbevares nedsænket i deioniseret vand ved 4 ° C.
9. Data Eksport
- Åbn MC_Data Tool-softwaren, der er knyttet til MEA-opsætningen.
- Klik på 'Fil' → 'Åbn MCD'.
- Klik på 'Værktøjer' → 'Konverter MCD til ABF' .
- Vælg elektroderne med de bedste optagesignaler, der skal eksporteres til analysen. Vælg den mappe, hvor de eksporterede filer skal gemmes, og klik på 'Gem'. Eksportproceduren kan tage flere minutter afhængigt af antallet af elektroder, der eksporteres og den samlede størrelse af optagelsesfilerne.
10. Dataanalyse
- Download og installer et elektrofysiologisk dataopsamlings- og analyseprogram ( fx pClamp). Når du er færdig, skal du starte analysesoftwaren ( f.eks. Clampfit).
- RR Interval beregning (Figur 5).
- Placer to lodrette markører for at definere regionen af interesse på sporet. Vælg 'Hændelsesdetektion' → 'Tærskel søgning'. Den vandrette markør skal krydse alle de hændelser, der skal kvantificeres, som vist i figur 5A .
- Klik &# 39; OK 'og derefter' Acceptér hele kategorien '. Softwaren vil derefter søge gennem sporet for alle de passende arrangementer. Blå mærker vil blive placeret over begivenhederne.
- Juster følsomheden for det automatiske valg ved at indstille parametrene i hovedhændelsesdetekteringsvinduet.
- Når alle begivenhederne er blevet identificeret automatisk, skal du gå til resultatvinduet (Vindue → Resultater) og kopiere kolonnen "Intervent Interval", som indeholder frekvensdataene ( Figur 5B ).
- QT Interval beregning (Figur 6-9):
- Placer en markør lige før og en efter en enkelt FP i steady state tilstand. Vælg 'Hændelsesdetektion' → 'Opret skabelon' ( Figur 6 ) .
- Kontroller, at FP'en er korrekt identificeret, og klik på 'Tilføj'. Skabelonen flyttes til bundpanelet.
- Gem skabelonen som en '.atf'fil. På denne måde er der skabt et skabelonspor, som vil blive søgt af softwaren gennem hele optagelsen ( figur 7 ). Opret en skabelon for hver tilstand, da en lægemiddelvirkning kan ændre formen på FP'en. Hvis det er nødvendigt, filtrer sporet lidt for at medtage maksimalt 10.000 point inden for de to markører.
- Når skabelonen er gemt med '.atf' udvidelsen, skal du vælge 'Event Detection' → 'Template Search' og indlæse skabelonen.
- Juster "Template match threshold" for at identificere alle FP korrekt i det valgte interval.
- Når alle begivenhederne er blevet identificeret korrekt, gem dem i en ny ".abf" -fil.
- Åbn filen med analyseprogram og beregner automatisk 'Time of Peak' for både Q / R og T-toppe ( figur 8, 9 ). Hvis spor er meget støjende, skal du anvende et filter. Beregn QT-intervallet ved at subtrahereQ / R-værdi fra T-værdien i en valgfri regnearkredaktør.
Representative Results
En dag efter dissociation og plating vil laget af hPSC-CM'er være synligt som en tæt og hvid film, der dækker midten af MEA-kammeret ( Figur 3A ). Efter fjernelse af ringen ( figur 3B ) Laget skal forblive på plads, og inspektion på et lysmikroskop viser MEA-elektroderne, der er dækket af hPSC-CM-laget (kontraherende) ( figur 3C ). På grund af fysisk og elektrisk kobling af cellerne vil kun en elektrode (gylden elektrode) blive anvendt til analyse.
Alternativt kan de, når de arbejder med 3D-strukturer, såsom embryoidlegemer eller mikrotisser, udplades således, at de er fysisk og elektrisk ukoblet. Visuel inspektion ved mikroskopet kunne ikke bekræfte nogen fysisk forbindelse mellem klyngerne og usynkroniserede R-bølger ved MEA'er, bekræfter ingen elektrisk kobling. I denne cAse, kan flere uafhængige elektroder analyseres.
Typiske optagelser af FP-spor er vist i figur 4 . Specielt kan et sporing af god kvalitet defineres ved tilstedeværelsen af en klar top svarende til Na + tilstrømning og membran depolarisering (R / Q peak), en klar repolarisationsfase svarende til K + efflux (T peak) og en høj Signal til støjforhold ( figur 4A , venstre: note y-akse skala og figur 4B ). Spor af dårlig kvalitet ( Figur 4A , midten) kan være et resultat af, at hPSC-CM'erne ikke er tilsluttet til MEA-pladen eller af svag hPSC-CM-elektrisk aktivitet. Venter 1-3 dage for bedre vedhæftning kan forbedre signalet; Men hvis ingen signalforbedring er synlig, anbefales det at udelukke dette MEA fra eksperimenter. Støjende spor ( Figur 4A , højre) kan analyseres efter filtrering.
Figur 5A, 5B ). Inden for det tidsinterval, der er defineret af de lodrette markører, skal der være blå mærker svarende til hver top. Hvis programmet ikke identificerer en eller flere toppe, skal du forsøge at flytte den vandrette markør og køre analysen igen eller justere registreringsindstillingerne. Tilsvarende kan en vellykket analyse af QT-interval identificeres ved visuel inspektion af skærmen, der viser FP-detektion ( Figur 7 ). Inden for det tidsinterval, der er defineret af de lodrette markører, skal der være blå mærker svarende til hver FP-detektion. Hvis programmet ikke identificerer en eller flere FP'er, skal du forsøge at omdefinere FP-skabelonen ( Figur 6 ) eller justere registreringsindstillingerne og køre analysen igen.
Ekstraherede individuelle FP-spor eller deres gennemsnit ( FigurE 8) kan bruges til at opnå QT-intervalværdier med specifikke indstillinger som i figur 9 . Analyse af QT-RR forholdet er tilrådeligt og er meningsfuldt i syge og WT hPSC linjer ( Figur 10A ) og for at vurdere behovet og / eller effekten af QT-interval korrektioner ( Figur 10B-10D ). HPSC-CM'er, der bærer LQTS-forårsagende mutationer, har forlængede QT-intervaller sammenlignet med WT-kontroller ( Figur 11A ). Behandling af hPSC-CM'er med en hERG-blokering resulterer i forlængelse af QT-interval ( Figur 11B ); Omvendt resulterer behandling med en hERG-aktivator i forkortelse af QT-intervallet ( figur 11C ). Endelig bør behandling med lægemidler, der påvirker hPSC-CM'ernes slagfrekvens, være synlig som en ændring i RR-intervallet ( Figur 11D , RR-intervalforkortelse).
/>
Figur 1: Sterilisering og belægning af MEA Chips. ( A ) Skema, der repræsenterer steriliseringsprocessen, herunder at placere MEA-brikken i en autoklaverbar glas-petriskål, indpakning i aluminiumsfolie, dampning i 6 minutter og udsættelse for UV i 30 minutter. ( B ) Øverste (venstre panel) og side (mellempanel) visninger af brugerdefineret PTFE ring; Ringen har en ydre diameter på 1,2 cm, herunder 4 klapper, der tillader dets positionering i midten af MEA chipen og den indre diameter er 0,4 cm (højre panel). ( C ) Skematisk repræsenterende fremstilling af MEA-chipet, herunder at placere chippen i en standard plastisk petriskål, idet der tilføjes 8 ml deioniseret vand uden for MEA-kammeret, placerer PTFE-ringen i midten af kammeret og belæger elektrodarrayet med fibronektin . Efter inkubationstid fjernes fibronectin og erstattes med dyrkningsmedium.T = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dissociation og Plating af hPSC-CM'er. Skematisk repræsenterer processerne af hPSC-CMs enzymatisk dissociation, centrifugering, resuspension og plating i midten af MEA kammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: MEA-chips med hPSC-CM-lag. ( A ) Topvisninger af MEA-chip indeholdende ringen og laget af hPSC-CM'er. ( B ) sidebillede af MEA chip efter ringfjernelse. ( C ) Bright field billede af hPSC-CMs lag belagt på mikro-Elektrode array; 4X forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: MEA Optagelse af hPSC-CM'er. ( A ) Repræsentative spor registreret med MEA, der viser et godt kvalitetsspor med R / Q og T-spidser tydeligt synlige med højt signal / støjforhold (til venstre), et dårligt kvalitetsspor uden klart synlige R / Q og T toppe (midten) Og et støjende spor med R / Q og T topper tydeligt synligt, men med lavt signal til støjforhold (højre). ( B ) Repræsentative eksempler på FP-spor af god kvalitet med forskellige morfologier, som kan registreres under MEA-eksperimenter ved anvendelse af hPSC-CM'er. Det skyggede område repræsenterer QT-intervallet målt under analysen. Da FP på MEA ligner den første derivatE af handlingspotentialet 28 , har vi beregnet integralet af FP-sporet, vist som rød prikket linje, som teoretisk demonstration af et T-vågevalg tæt på en fuldstændig aktionspotentiale-repolarisation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: RR Interval Beregning. ( A ) Eksempel på RR interval analyse med automatisk top detektion (top) og dataudvinding (bund) ved hjælp af analysesoftwaren (se Materialebeskrivelse). Lodrette markører identificerer tidsintervallet for interesse, og den vandrette markør krydser alle de hændelser, der registreres og identificeres med blå mærker. ( B ) Den forstørrede kolonne viser de ekstraherede data, der anvendes til at beregne RR-intervallet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Oprettelse af FP-skabelon. Eksempel på skabelonvalg ved hjælp af lodrette markører placeret før og efter en enkelt FP. Denne skabelon bruges til automatisk identifikation af FP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Automatisk identifikation af FP-skabelon. Eksempel på skabelon søgning gennem et interval defineret af to lodrette markører. Alle de registrerede hændelser er identificeret med blå mærker og er automaticallY overlejret i indsatsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Kvantificering af FP-parametre. Analyse af de gemte hændelser, med R-spidsen manuelt identificeret inden for de to første markører og T-spidsen manuelt identificeret inden for de sidste to markører. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Analysevindue. Parametre, der bruges i statistikvinduet til at detektere R peak. Til detektion af T-spidsen, skift cursorer og (hvis nødvendigt) porigtighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: QT-RR-forhold. ( A ) Eksempel på forskelligt forhold mellem QT og RR intervaller mellem WT (LQT1 corr ) og Long QT syndrom type 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CM'er. Skyggelagte områder viser, at det samme forskydning i RR-interval genererer et større skift i QT-intervallet for den syge linie LQT1, hvilket sandsynligvis øger arytmi-følsomheden. ( B ) Forholdet mellem ukorrigeret QT og RR intervaller målt ved MEA i CM'er fra 7 forskellige hPSC linjer. Virkningen af QT-korrektion for Bazett's ( C ) eller Fridericia's ( D ) formler er vist og synlig som ændring i QT-RRs hældning i Terval forhold. Tal tilpasset fra reference 30 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Disease- eller Drug-inducerede QT- og RR-intervalvariationer. ( A ) Eksempel på forlængelse af QT-intervallet i hPSC-CM afledt fra en patient, der bærer en long-QT syndrom (LQTS) -mutation i sammenligning med dens isogene WT-kontrol. ( B ) Eksempel på forlængelse af QT-interval i hPSC-CM efter farmakologisk hERG-blok. ( C ) QT-interval forkortes ved behandling med stigende doser af hERG-aktivator. Pil angiver retningen af forkortningen. ( D ) Eksempel på lægemiddelinduceret RR-intervalforkortelse. Panel (C) blev tilpasset fra reference> 30. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Lavinsulin, BSA, polyvinylalkohol, essentielle lipider (LI-BPEL) Medium | |||
| Komponent | Mængde til 100 ml | ||
| IMDM | 43 ml | ||
| F12 | 43 ml | ||
| Ascorbinsyre 2-phosphat (5 mg / ml i destilleret vand) | 1 ml | ||
| Cellekulturtilskud (direkte erstatning for L-glutamin) | 1 ml | ||
| Penicillin / streptomycin | 0,5ml | ||
| Phenol Red | 1 mg | ||
| Proteinfri Hybridom Medium-II (PFHMII) | 5 ml | ||
| BSA (10% vægt / volumen i IMDM) | 2,5 ml | ||
| PVA (5% vægt / volumen i destilleret vand) | 2,5 ml | ||
| Kemisk defineret lipidkoncentrat (CDLC) | 1 ml | ||
| Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITS-X) 100X | 0,1 ml | ||
| A-monothioglycerol (13 μl i 1 ml IMDM) | 0,3 ml | ||
| Kombiner reagenserne, filtrer med et 0,22 μm porfilter og opbevar mediet ved 4 ° C i op til 2 uger. | |||
Tabel 1: Li-BPEL-middelsammensætning.
Discussion
Denne protokol viser, hvordan man dissocierer og forbereder hPSC-CM'er til måling af deres FP ved hjælp af MEA'er. HPSC-CM'er viser sædvanligvis spontan elektrisk aktivitet, som kan måles som FP og kan give meningsfulde data med hensyn til slagfrekvens, QT-intervalvarighed og arytmiske hændelser.
Dissociering af 2D-hjerte-differentierede kulturer er nødvendig for at genskabe et slaglag på MEA, og det repræsenterer et kritisk trin. Mekanisk stress ved gentagen pipettering og / eller aggressiv dissociation enzymbehandling kan resultere i høj celledødelighed, manglende vedhæftning til MEA-pladen og mangel på spontan elektrisk aktivitet. Denne protokol er blevet optimeret til monolagskulturer. Imidlertid kan en lignende fremgangsmåde anvendes til tredimensionale (3D) kulturer ( fx embryoidlegemer eller EB'er) med mindre modifikationer, såsom indsamling af EB'er efterfulgt af PBS-vask og længere inkubationstid med dissocierende enzym. ImportereAntly, i både 2D og 3D differentierede kulturer, kunne de ældre de differentierede celler, den længere inkubationstid, der kræves, være at frigøre cellerne på grund af forøget ekstracellulær matrixaflejring.
Protokollen beskrevet her for kvantificering af FP parametre kan anvendes til at generere dosis-respons kurver for cardioaktive lægemidler. Som for nylig beskrevet af Cavero et al. 31 , kan udgangskoncentrationen af et lægemiddel dybt påvirke resultatet af en MEA-måling. Derfor foreslår vi følgende for at forbedre nøjagtigheden og pålideligheden af resultaterne: 1) i tilfælde af irreversible aktivatorer / blokkere, brug relativt store volumener medium indeholdende det lægemiddel, der skal testes. Fjern mere detaljeret 10-50% af mellemvolumenet fra MEA-chippen og tilsæt et lige stort antal medier, hvor stoffet tidligere var opløst ved den passende koncentration. I dette tilfælde er det afgørende for at beregne den endelige lægemiddelkoncentrationEr ændringen i koncentration efter medium fjernelse. 2) I tilfælde af reversible aktivatorer / blokkere tilsættes 10 μL af hver lægemiddeldosis fra en 100X stamopløsning.
Størstedelen af de kardiale differentieringsprotokoller resulterer i en variabel blandet population af nodallignende, atriumlignende og ventrikulære lignende kardiomyocytter, hvor ventrikulærtypen er den mest repræsenterede. Dette kan udgøre en begrænsning ved modellering af hjertesygdomme, som påvirker en specifik kardiomyocyt-subtype eller lægemidler, der virker på hjerte-subtypespecifikke ionkanaler. Selvom flere undersøgelser har optimeret betingelser for at styre mere kontrolleret specifikation under hjertedifferentiering 3 , 5 , 37 , 38 , er deres bredere anvendelighed stadig under undersøgelse.
Endvidere varierer effektiviteten af differentiering (i forskellige forsøg og i diFferent hPSC linjer) kan observeres 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Kardiomyocytberigende strategier baseret på overfladeproteinekspression 35 , 45 (ved hjælp af florescensassisteret cellesortering eller ved magnetisk beadsudvælgelse 46 , 47 ) og metabolisk udvælgelse 44 , 48 kan repræsentere gyldige strategier, som kan anvendes til enhver (genetisk modificeret eller Umodificeret) hPSC-line forudgående plating af hPSC-CM'erne for at forbedre det elektriske signal.
Selvom hPSC-CM'er er notorisk umodne sammenlignet med humane voksne cardiomyocytter 4 , 49 , har de vist sig at være værdifulde i rEcapitulering og identifikation af specifikke sygdomsrelaterede ændringer ( f.eks . I kanalopati) 19 , 20 , 50 og lægemiddelinducerede responser ( fx hjerte ionkanalblokkere) 4 , 51 . Endvidere er umodne celler lettere at dissociere og genvinde bedre end voksne kardiomyocytter efter dissociation og plating 44 Derfor kan hPSC-CM umodenhed belønnes som en fordel i denne henseende. Men for at kunne rekapitulere f.eks . Sygdomme med forsinket hjertesygdomme og trofast reproducere lægemiddelresponser af voksne kardiomyocytter, bør der opnås en mere moden mekanisk, metabolisk og elektrisk hPSC-CM-tilstand. Metoder til at modne disse celler indbefatter langvarig tid i kultur 52 , mekanisk stamme 53 , elektrisk stimulering 54 , tilsætning af småMolekyler 55 , 3D-kultur 56 , samkultur med andre celletyper 57 og endog en kombination af disse fremgangsmåder 58 ; Hidtil har ingen af disse tilgange ført til en voksenlignende fænotype.
Som en del af ufuldstændighedsegenskaberne viser hPSC-CM'er elektrisk automatik. Her gives der detaljer om, hvordan man præcist kvantificerer QT og RR intervaller. En begrænsning af måling af spontan elektrisk aktivitet er, at sammenligning af QT-intervaller kan være vanskelig, når hPSC-CM'er udviser forskellige slagfrekvenser. I dette tilfælde kan Bazett eller Fridericia's formler bruges til at korrigere QT-intervallet for frekvensen. Som tidligere rapporteret 30 anbefaler vi dog stærkt at udføre Major-Axis regressionsanalyse ved at udforme QT interval versus RR interval for både rå og korrigeret data for at udelukke enhver mulig forspænding som følge af selve korrektionsmetoden.
Protokollen, der præsenteres her sammen med tidligere beskrevne fremgangsmåder 59 , 60 hjælper standardiseringen af procedurerne og analysen af hPSC-CM FP'er, forbedrer data reproducerbarhed og muliggør en bedre sammenligning af interlaboratorieresultater.
Disclosures
CLM er medstifter og rådgiver for Pluriomics bv. En del af publikationsomkostningerne blev dækket af Multi Channel Systems.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af følgende stipendier: CVON (HUSTCARE): Det Hollandske Hjertestiftelsesforbund (Holländsk Hjertestiftelse, Hollænderforbundet for Universitetsmedicinske Centre, Den Hollandske Organisation for Sundhedsforskning og Udvikling og Det Kongelige Videnskabsakademi) Det Europæiske Forskningsråd (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Vi takker E. Giacomelli (LUMC) for hjælp med hPSC hjerte differentiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
| CO2 cell-culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) | Gilson International | ||
| Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
| Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
| Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
| Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
| Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
| Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for LI-BPEL medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
| F12 nutrient mixture (Ham) | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
| Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
| α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
| TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
| MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
| MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
| Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
- Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
- Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
- Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
- Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
- Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
- Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease - what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
- Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
- Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
- Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
- Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
- Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse--a reasonable model for probing mechanisms? Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
- Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
- Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
- Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
- Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
- Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come? Br J Pharmacol. , (2016).
- Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
- Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
- Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596 (2015).
- Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem? Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
- Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
- Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
- Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
- Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).
