Summary
يتكون سطح العين الطبيعي المكشوف من القرنية والملتحمة. الخلايا الظهارية، وخلايا الكأس والخلايا المناعية موجودة في الملتحمة. هنا، يتم وصف غير الغازية، وتقنية الخلايا الانطباع باستخدام جهاز علم الانطباع والتدفق الخلوي لتحليل الخلايا المناعية في الملتحمة.
Abstract
تقليديا، يتم دراسة علم الخلايا السطحية العين مع تقنيات مثل تكنولوجيا ملعقة وتقنية الفرشاة. المشكلة مع هذه التقنيات هي أنها قد تحفز آفات صادمة على سطح العين، والتي يمكن أن تتقدم إلى تندب، تشوه الجفن، نقص الخلايا الجذعية الليمفاوية، وفي بعض الحالات، يسبب عدم الراحة الكبيرة للموضوع. لتجنب هذه المشاكل السريرية، تم تطوير علم الخلايا الانطباع (إيك) لتشخيص مرض جفاف العين والأورام في وقت لاحق، ومرض التأتبي، التهاب القرنية والقرنية الربيعي والتهاب القرنية المخروطية سيكا. عادة، يقوم الأطباء بقطع أوراق الترشيح يدويا إلى الأشكال المطلوبة وتطبيقها على سطح العين. هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ إيك باستخدام جهاز طبي متاح تجاريا. يتم شرح هذه التقنية هنا تليها إمونوفينوتيبينغ عن طريق التدفق الخلوي. تتطلب هذه التقنية معالجة يدوية أقل وتسبب إصابة أقل في سطح العين.
Introduction
تم تنفيذ علم الخلايا الانطباع (إيك) لأول مرة في عام 1977 من قبل تاتشر وآخرون 1 . استخدموا قرص انطباع بلاستيكي لجمع خلايا الملتحمة من المرضى بدلا من التقنيات الأخرى المتاحة في ذلك الوقت مثل كشط، مسحة أو بيبتينغ 1 . الأسلوب الحالي من إيك يستخدم ورقة تصفية ماصة 2 لطباعة بصمة والملتحمة الجفن وجمع الطبقة الأكثر سطحية من خلايا الملتحمة. هذه الخلايا، بعد أن وصلت إلى المرحلة النهائية من التمايز، وتسليط باستمرار في البكاء 3 . تم العثور على ثلاث مجموعات رئيسية من الخلايا في عينات إيك: الخلايا الظهارية 4 ، خلايا الكأس 3 ، 5 ، والأنسجة اللمفاوية المرتبطة المخاطية بمعنى ظهارة المرتبطة الخلايا T المستجيب أو الخلايا الجذعية 6 . خلايا سطح العين في إيك سامبليس يمكن تحليلها بواسطة المجهري، المناعية و النشاف و عكس ترانسكريبتاس البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (رت-ير) 7 . وقد استخدمت التدفق الخلوي في الآونة الأخيرة لتحليل الخلايا المناعية التي جمعتها كشط غشاء إيك 8 . ومن المثير للاهتمام، وقد استخدمت إيك 6 ، 9 لتقييم العديد من أمراض السطح العين بما في ذلك التهاب القرنية، التهاب الكبد القرني، ونقص فيتامين (أ)، الفقاع الفقري، مرض التأتبي، متفوقة التهاب القرنية القرنية، التهاب القرنية، التهاب الحلق القرنية الظهاري، والحؤول الحرشفية الظهارية. وقد استخدمت إيك أيضا لتقييم تأثير ارتداء العدسات اللاصقة، والكشف عن الميكروبات سطح العين، واختبار الكفاءة العلاجية والتسامح من التدخلات العلاجية في الدراسات الطولية 10 ، 11 ، 12 .
ويدعم الجهاز الطبي (إيبريم) من نوع من بوليإيثرسولفون (بيس) 0.2 ميكرون غشاء، والتي تم التحقق من صحة سابقا لتقنية الخلايا الانطباع العين مع التدفق الخلوي (تدفق أوزيك) ويفتح فرصا لاستخدام العينات الطولية لرصد تطور المرض والاستجابة للعلاج (على سبيل المثال ، مفصلة تحليل الكريات البيض داخل الظهاري المعرفة بأنها علامات المرض المفترضة للتليف الملتحمة التدريجي في الغشاء المخاطي الفقاعي الفقاعي) 13 . استخدم الباحثون في وقت مبكر المرشحات بيس تعقيمها التي تتطلب الانطباع اليدوي. ونتيجة لذلك، كان العائد متغير ويعتمد على المستخدم. ميزة هذا الجهاز الطبي هو سهولة الاستخدام، ضغط موحد (باسكال أو N / م 2 )، وتمكين التكرار، استنساخه، واستعادة الخلوية متسقة. هذه التقنية مفيدة في عيادة للمرضى الخارجيين لأنها غير الجراحية، وسهلة لأداء وسريعة. هذا هو الجهاز الطبي من الفئة الأولى (العقيمة) وفقا للتوجيه 93/42 / سي، سي 0499 (سنش). انها تتطلب فقطتخدير موضعي أثناء العملية، مما يضمن الحفاظ على سلامة سطح العين. بعد إيك، يمكن معالجة الخلايا على الفور لتدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لفنيين غير العيون والممرضات لتدريبهم على عينة من سطح العين.
على الرغم من تحسن إيك على تقنيات أخرى، لا تزال هناك العديد من التحديات. على سبيل المثال، قد يكون هناك اختلاف بسبب مجال أخذ العينات والاختلافات الإقليمية في الملتحمة العلوية اعتمادا على موقف إيك. مصدر آخر من الاختلاف يرجع إلى تطبيق كميات مختلفة من الضغط خلال إيك. وتشمل القضايا المنهجية الأخرى توحيد معالجة الخلايا: وهذه تنطوي على مدة وطريقة التثبيت، وظروف التخزين الممكنة، والتي قد تؤثر على استقرار المواد العينة.
الهدف العام من هذه التقنية هو تطوير طريقة عزل عينات الانطباع العين ثار هو سهل الاستخدام، غير الغازية ويمكن تطبيقها على توصيف المناعي للعينات السريرية.
Protocol
تم جمع جميع العينات العين المستخدمة في هذه الدراسة من عيادة العين الجافة في مركز سنغافورة الوطني للعيون التي وافق عليها مجلس مراجعة المؤسسية المؤسسية سينغهيلث ومجلس المراجعة المؤسسية نانيانغ التكنولوجية، سنغافورة.
ملاحظة: خضعت مواضيع الاختبارات السريرية لتقييم مدى الالتهاب وشدة الاختلالات المسيل للدموع قبل تنفيذ إيك. وشملت الاختبارات السريرية الوقت غير الغازية للكسر المسيل للدموع (ني-تبوت) 14 واحمرار الملتحمة (احتقان) 15 ، 16 تقييمها مع أداة تشخيصية، واختبار شيرمر 17 ، وتقييم المريض القياسية من جفاف العين الاستبيان (سبيد) 18 ، والقرنية تلطيخ 19 .
1. مجموعة من عينات العين بواسطة إيك
- بعد تحديد الحالة السريرية، تخديرعيون المشارك عن طريق تطبيق 1 - 2 قطرات من التخدير الموضعي، بروباراكايين هيدروكلوريد، إلى الملتحمة العلوية العلوية والسفلية السفلي. انتظر لمدة 4 - 5 دقائق للإحساس لاذع من مخدر على ارتداء.
- جمع عينات من كل من الأنف والزمني الملتحمة الشظوية مع اثنين من أجهزة علم الانطباع.
ملاحظة: يتم استخدام جهاز واحد لجمع اثنين من عينات الانطباع. هنا، تم استخدام جهازين لجمع أربعة أغشية الانطباع.- وضع جهاز علم الانطباع علميا على الملتحمة. اضغط على زر الضغط برفق واستمر لمدة 2 - 3 ثوان.
ملاحظة: الجهاز يأتي مع الغشاء. يتم تحرير الضغط تلقائيا بعد الضغط على الزر. يستغرق سوى بضع ثوان للافراج عن الضغط وإزالة الجهاز.
- وضع جهاز علم الانطباع علميا على الملتحمة. اضغط على زر الضغط برفق واستمر لمدة 2 - 3 ثوان.
- الافراج عن الغشاء في أنبوب ميكروسنتريفوج تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام والثقافة (روزويل بارك المعهد التذكاري المتوسطة (رمي) + 10٪ مصل البقري الجنين(فبس) + 1٪ البنسلين الستربتومايسين (القلم بكتيريا)) من قبل مشرط.
- عزل الخلايا من غشاء الجهاز عن طريق كشط المستمر لمدة 1 دقيقة مع 10 ميكرولتر ماصة طرف.
ملاحظة: اكتمال اكتمال عندما يصبح سطح الغشاء متفاوتة. أرقام الخلايا من كل غشاء متغير (100 - 500 خلية / غشاء). معالجة العينات في غضون 2 - 3 ساعة من جمع.
2. الخلايا المناعية من قبل التدفق الخلوي
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة وسائل الإعلام. ريسوسبيند الخلية بيليه مع 50 ميكرولتر من التدفق الخلوي تلطيخ العازلة (الفوسفات مخزنة المالحة (بس) + 0.05٪ ألبومين المصل البقري (بسا)).
- الخلايا اللطخة مع لوحة من الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، CD3 البنفسجي الرائعة (بف) 510 (UCHT1)، CD4 ألوفيكوسيانين-H7 (أبك-H7) (SK3)، CCR7 فيكويريثرين (بي) -A، CD45RO بي سيانين 7 (PE- Cy7) -A، ويعيش / ميت علامة الخلية 7-أد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة فيداكن. استخدام الأجسام المضادة مباشرة من الأسهم وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: لتركيز الأجسام المضادة، واستخدام 2.5 ميكرولتر من CD3-BV510، 1.25 ميكرولتر من CD4-أبك-H7، CD45RO-بي-Cy7، 7-آد و 10 ميكرولتر من CCR7-بي. استخدام خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (بمكس) لمعايرة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة. للمعايرة، واتخاذ تركيز الأجسام المضادة المذكورة في بروتوكول الشركة المصنعة واستخدام نصف وربع التركيز الموصى بها. استخدام الحد الأدنى من تركيز الأجسام المضادة لتجنب تسرب إلى قنوات فلوريكروم أخرى. وقد لوحظت إشارات واضحة مع تركيزات المذكورة من الأجسام المضادة. تم إجراء التعويض عن طريق اختبار بمكس في البداية وفقا للبروتوكول المذكور في ويليامز وآخرون . 20 للاختبار، وحضنت بمكس مع نفس مجموعة من الأجسام المضادة المستخدمة هنا وتعويضها بمقارنة البقع الأجسام المضادة مفردة ومتعددة. - بعد الحاضنة بيريأود، إضافة 1 مل من تلطيخ العازلة إلى الأنبوب، وتخلط جيدا، وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكرولتر من تلطيخ العازلة.
- تشغيل العينات على جهاز التدفق الخلوي.
- قبل الحصول على البيانات، ومعايرة تدفق قناة الجهد الكهروضوئي مع إعداد عداد الكريات وتتبع (كس & T) الخرز لتطبيع اكتساب البيانات في أيام مختلفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- فتح التدفق الخلوي جمع البيانات البرمجيات، انقر فوق "إعداد و مراقبة الجودة" زر، واختيار الصحيح كس & T حبة الكثير عدد، تحميل الخرز، ثم انقر فوق زر "ابدأ".
- ريسوسبيند الخلايا عن طريق التنصت بلطف أنبوب قبل تحميل العينات إلى الجهاز. افتح برنامج جمع البيانات وانقر على "معاينة". عندما يكون معدل العتبة مستقرا، انقر على "اكتساب". مراقبة مستوى العينة وانقر على "إيقاف" عند نفاد العينات.
ملاحظة: الحصول على 10،000 الأحداث لكل عينة. بعد الحصول على 10،000 الأحداث، إنشاء سك-A و فسك-A مؤامرة نقطة في ورقة العمل.- انقر فوق زر "بوابة المضلع" ورسم بوابة (وهذا هو P1) على جميع الأحداث مع قيمة فسك-A> 5 × 10 4 لاستبعاد الحطام. انقر فوق "إنشاء نقطة مؤامرة" زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، واختيار "خصائص" لفتح نافذة "محرر المؤامرة"، ثم اختر "P1". انقر فوق فسك-A على المحور س من P1 نقطة مؤامرة، تغييره إلى CD3-BV510. ارسم '' بوابة مضلع '' لاختيار سكان CD3 + واسمها '' P2 ''.
- انقر فوق "إنشاء نقطة مؤامرة" زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، اختيار "خصائص" لفتح نافذة "محرر المؤامرة". انقر فوق فسك-A على المحور س من مؤامرة نقطة P2 وتغييره إلى 7-آد. رسم "بوابة مضلع '' لمدة 7-آد - السكان واختيار '' P3 ''. P3 هنا هو CD3 +الخلايا الحية.
- انقر فوق "إنشاء نقطة مؤامرة" زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، اختيار "خصائص" لفتح نافذة "محرر المؤامرة". انقر فوق CD3-BV510 على المحور س و CD4-APCH7 على المحور ص من مؤامرة النقطة P3. رسم مستطيل البوابات على الجانبين العلوي والسفلي من الربع واختيار '' P4 '' و '' P5 ''، على التوالي. P4 يعيش CD3 + CD4 + و P5 يعيش CD3 + CD4 - خلايا T.
- انقر فوق "إنشاء نقطة مؤامرة" زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، اختيار "خصائص" لفتح نافذة "محرر المؤامرة". انقر فوق CD45RO بي-Cy7 على المحور السيني و CCR7-بي على المحور الصادي لكل من P4 و P5 المؤامرات. رسم '' بوابة رباعية '' على هذه المؤامرة نقطة.
ملاحظة: الجانب الأيسر العلوي، الجانب الأيمن العلوي، الجانب الأيسر السفلي والأرباع الجانب الأيسر السفلي هنا هي السذاجة، والذاكرة المركزية (T سم )، ه(T إم )، ذاكرة متباينة مؤقتا المستجيب (T إمرا ) الخلايا التائية، على التوالي.
- قبل الحصول على البيانات، ومعايرة تدفق قناة الجهد الكهروضوئي مع إعداد عداد الكريات وتتبع (كس & T) الخرز لتطبيع اكتساب البيانات في أيام مختلفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
Representative Results
إيك من قبل هذا الجهاز السريري سمح لنا لعزل الخلايا المناعية سطح العين مع الحفاظ على سطح العين سليمة. ويصف الشكل 1 كيفية تنفيذ إيك. تم وضع علامة على المواقع المختلفة للعين من حيث تم جمع العينات. ويبين الشكل 2 نتيجة ممثل التدفق الخلوي التي تم جمعها من 10 الضوابط الصحية. للتباعد، واستخدام سك و 7-آد للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. 7-آد - يتم تحديد الخلايا كخلايا حية. وتتميز هذه الخلايا الحية أيضا من قبل CD3 + و CD4 + علامات. وعلاوة على ذلك، تم وصف كل من CD4 + و CD4 - السكان كما مزيد من السذاجة، T إم ، T سم و T إمرا مع علامات CCR7 و CD45RO. بين الخلايا CD3 + T، الخلايا المستجيب الذاكرة T تهيمن على سطح العين البشرية. في وقت سابق هزبيريمنتس، وقد تبين أيضا أن خلايا الذاكرة CD8 + هي السكان الرئيسيين في الخلايا التائية الظهارية الملتحمة بين الأفراد الأصحاء 20 . ويبين الشكل 3 أن CD4 + و CD8 + المستجيب خلايا T الذاكرة (T إم و T إمرا ) هي المجموعة الفرعية الرئيسية في سطح العين البشرية في 10 ضوابط صحية درس. يتم إخطار كل السكان المذكورة في الشكل مع النمط الظاهري علامة وأسماء (نايف، T سم ، T إم ، T إمرا ). الأرقام باللون الأحمر تدل على النسبة المئوية للسكان. يتم تمثيل البيانات في هذا الرقم كما يعني ± سيم
الشكل 1: جمع عينات إيك من سطح العين من قبل جهاز علم الانطباع. تم جمع العينات من اللمبة الزمنيةأر كما هو مبين.
الشكل 2: نقطة مؤامرة الرسم البياني باستخدام التدفق الخلوي. ليف 7-آد - تم اختيار الخلايا. وكانت الخلايا CD3 + أول بوابات، وبعد ذلك كانت هذه البوابة السكان إلى CD4 + و CD4 - مجموعات فرعية. تم تحديد نسب السذاجة (CCR7 + CD45RO - ) والذاكرة المركزية (CCR7 + CD45RO + ) والذاكرة المستجيبة (CCR7 - CD45RO + ؛ CCR7 - CD45RO - ) بمساعدة علامات CCR7 و CD45RO. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Fإيغور 3: الخلايا المناعية أنواع فرعية في CD4 + و CD8 + خلايا T من صحة الإنسان سطح العين. توزيع الملتحمة CD4 + و CD8 + السذاجة، والذاكرة المركزية (T سم )، والذاكرة المستجيب (T إم و T إمرا ) مجموعات فرعية في ضوابط الإنسان صحية؛ كل نقطة بيانات تمثل متوسط فردي منفصل ± سيم يظهر. وتظهر النسبة المئوية للسكان على أنها حمراء تحت اسم كل من السكان. وتبلغ النسبة الإجمالية للسكان 98 في المائة، لأن سكان CD4 + T إمرا لم يدرجوا في مخطط الانتثار المذكور (المعدل من بوس وآخرون 21 ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هذه هي تقنية سهلة وسريعة وأقل الغازية التي يمكن استخدامها في العيادات الخارجية لتنميط المناعة نسبيا نسبيا على النقيض من التقنيات التقليدية مثل كشط، مسحة، بيبتينغ أو ورقة تصفية ماصة 1 ، 2 . وهناك نوع آخر من هذه التقنية يستخدم بالفعل في إعدادات البحث 22 . التطبيق المستقبلي للمنهجية المقترحة هو لطبقية المرضى في التجارب السريرية مع أمراض العين، وخاصة تلك التي تتطلب المناعي.
التحدي الرئيسي مع هذه التقنية هو عدد قليل نسبيا من الخلايا المناعية استرجاعها بعد جمع الانطباع وكشط. وتراوح العدد الكلي للخلايا CD3 + T المستعادة من أربعة انطباعات لكل فرد من 500 ~ 1000 خلية. تم غسل عينات العين قبل تحليل التدفق الخلوي لعدد ضئيل من المرات لتجنب المزيد من فقدان الخليةالصورة. الخطوات والتحديات الحاسمة التي لا تزال داخل البروتوكول هي جمع كفاءة عينات العين والكشط الصحيح من الغشاء لتحقيق أرقام الخلايا أعلى. ومع ذلك، فإن هذا القيد من غير المرجح أن التحيز تجاه أي النمط الظاهري المناعي محددة. كان استكشاف الأخطاء وإصلاحها أجريت هنا لتحقيق أقصى قدر من العائد من الخلايا للحد من عدد من الخطوات الغسيل بعد وقبل حضانة الأجسام المضادة.
هناك قيود أخرى لاستخدام إيك. في المرضى الذين يعانون من سطح العين شديدة الكيراتين أو فيبروزد مثل في متلازمة ستيفن جونسون، قد يكون العائد الخلوي أقل من ذلك في هذه الدراسة. قد تتغير نسبة الخلايا المناعية إذا تم تخزين العينات بدلا من تحليلها في نفس اليوم. ومن الصعب التنبؤ بما إذا كانت أنواع معينة من الخلايا أكثر مقاومة للتخزين من غيرها. وقد ذكرت الدراسات السابقة مستويات مرتفعة من التعبير هلا-در في الخلايا الظهارية الملتحمة 23 ، لذلك سيكون من بينتقييم لتقييم العلاقة بين هلا-در ومستويات الخلايا المناعية المحددة. ويمكن أيضا أن ترتبط الخلايا المناعية مع مستوى التعبير من تشيموكينس. وينبغي معالجة هذه المسائل في الدراسات المقبلة.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا نانديني نالابان وشارون يو للمساعدة في الخطوات التقنية. وقد تم تمويل الدراسة من قبل منحة البدء ل كغ من مدرسة لي كونغ شيان للطب، جامعة نانيانغ التكنولوجية، ومن قبل جائزة عالم السريرية العليا من المجلس الوطني للبحوث الطبية وزارة الصحة في سنغافورة (نمرك) ل لوت (نمرك / سسا / 045/2012 م) ومنحة مقدمة من المركز الوطني لمكافحة الجراد الصحراوي (نمرك) وتدار من قبل المركز الوطني للابتكار الصحي إلى كك و لوت (نهيك-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
