Summary
Den udsatte normale okulære overflade består af hornhinde og bindehinden. Epitelceller, boblerceller og immunceller er til stede i bindehinden. Her beskrives en ikke-invasiv teknik med indtrykcytologi ved anvendelse af en indtrykcytologienhed og flowcytometri til analyse af immunceller i bindehinden.
Abstract
Traditionelt studeres okular overfladecykologi med teknikker som spatelteknologi og børsteknologi. Problemet med disse teknikker er, at de kan fremkalde traumatiske læsioner på overfladen af øjet, som kan udvikle sig til ardannelse, øjenlågsdeformitet, lymfestamme mangel og i nogle tilfælde forårsage stort ubehag for subjektet. For at undgå disse kliniske problemer blev indtrykcytologi (IC) udviklet til diagnosticering af øje med tør øjne og senere neoplasi, atopisk sygdom, vernal keratoconjunctivitis og keratoconjunctivitis sicca. Typisk skærer klinikere manuelt filterpapirene i de krævede former og anvender disse på den okulære overflade. Her beskriver vi, hvordan man udfører IC ved hjælp af en kommercielt tilgængelig medicinsk enhed. Denne teknik forklares her efterfulgt af immunophenotyping ved hjælp af flowcytometri. Denne teknik kræver mindre manuel håndtering og forårsager mindre skade på den okulære overflade.
Introduction
Impression cytology (IC) blev først udført i 1977 af Thatcher et al. 1 . De brugte en plastindtrykskive til at samle konjunktivceller fra patienter i stedet for andre tilgængelige teknikker, som f.eks. Skrabning, swabbing eller pipettering 1 . Den nuværende teknik i IC bruger et absorberende filterpapir 2 til at aftrykke bulbar og palpebral conjunctiva og samle det mest overfladiske lag af konjunktivalceller. Disse celler, der har nået deres sidste trin af differentiering, bliver løbende kaste i tårer 3 . Tre store populationer af celler findes i IC-prøver: epithelceller 4 , boblerceller 3 , 5 og mucosal-associeret lymfoidvæv, viz epithelium-associerede effektor-T-celler eller dendritiske celler 6 . Oculære overfladeceller i IC samPles kan analyseres ved mikroskopi, immunblotting og revers-transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) 7 . Flowcytometri er for nylig blevet anvendt til at analysere immunceller opsamlet ved at skrabe IC-membranen 8 . Interessant nok har IC 6 , 9 været anvendt til at evaluere mange okulære overflade sygdomme, herunder keratoconjunctivitis sicca, vitamin A-mangel, cicatricial pemphigoid, atopisk sygdom, overlegen limbisk keratokonjunctivitis, vernal keratoconjunctivitis og epithelial squamous metaplasi. IC er også blevet brugt til at evaluere virkningen af iført kontaktlinser, detektering af okulære overflademikrober og afprøvning af terapeutisk virkning og tolerance af terapeutiske interventioner i longitudinale studier 10 , 11 , 12 .
Den medicinske enhed (EyePrim) understøttes af en type polyEthersulfon (PES) 0,2 μm membran, som tidligere er valideret for teknikken til okulærtrykscytologi med flowcytometri (OSIC-flow) og åbner mulighed for at anvende langsgående prøveudtagning til at overvåge sygdomsprogression og respons på behandling ( fx den detaljerede Analyse af intraepitheliale leukocytter defineret som formodede sygdomsmarkører for progressiv conjunctival fibrose i slimhindepemphigoid) 13 . Tidlige forskere brugte autoklaverede PES-filtre, der krævede manuel indtryk. Som et resultat var udbyttet variabelt og brugerafhængigt. Fordelen ved denne medicinske enhed er brugervenlighed, standardiseret tryk (Pa eller N / m 2 ) og muliggør repeterbarhed, reproducerbarhed og konsistent cellulær genopretning. Denne teknik er nyttig i en klinisk klinik, fordi den er ikke-kirurgisk, nem at udføre og hurtig. Dette er en medicinsk udstyr i klasse I (steril) i henhold til direktivet 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Det kræver kunS aktuelle anæstesi under proceduren, hvilket sikrer vedligeholdelse af okularoverfladenes integritet. Efter IC kan celler behandles straks for flowcytometri. Desuden er det muligt for ikke-oftalmologi teknikere og sygeplejersker at blive uddannet til at prøve den okulære overflade.
På trods af forbedringen af IC over andre teknikker er der stadig flere udfordringer. For eksempel kan der være variation på grund af området for prøveudtagningen og regionale forskelle i bulbens conjunctiva afhængigt af IC'ens position. En anden kilde til variation skyldes anvendelsen af forskellige mængder tryk under IC. Andre metodologiske problemer involverer standardisering af cellebehandling: disse involverer varighed og fastgørelsesmetode og betingelserne for mulig opbevaring, som kan påvirke stabiliteten af det samplede materiale.
Det overordnede mål med denne teknik er at udvikle en metode til isolering af de okulære indtryksprover thaT er let at bruge, ikke-invasiv og kan anvendes til den immunologiske karakterisering af de kliniske prøver.
Protocol
Alle okulære prøver anvendt i dette studie blev samlet fra Dry Eye Clinic på Singapore National Eye Center godkendt af SingHealth Centralized Institutional Review Board og Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapore.
BEMÆRK: Fagene har gennemgået kliniske test for at vurdere omfanget af inflammation og sværhedsgraden af tårefunktion før IC blev udført. Kliniske undersøgelser omfattede ikke-invasiv tårebrudstid (NI-TBUT) 14 og konjunktiv rødme (hyperemi) 15 , 16 vurderet med et diagnostisk instrument, Schirmer's test 17 , Standard Patient Evaluation of Eye Dryness (SPEED) spørgeskema 18 og hornhinde Farvning 19 .
1. Indsamling af okulære prøver af IC
- Efter bestemmelse af den kliniske status bedøvesDeltagerens øjne ved at anvende 1 - 2 dråber topisk anæstesi, proparacainhydrochlorid, til den overlegne bulbar conjunctiva og inferior fornix. Vent i 4 - 5 min. For anæstesiets stikkende fornemmelse at slides af.
- Saml prøver fra både nasal og temporal bulbar conjunctiva med to indtryk cytologi enheder.
BEMÆRK: En enhed bruges til indsamling af to indtryksprover. Her blev to enheder brugt til opsamling af fire indtryksmembraner.- Placer indtrykcytologienheden tangentielt på bindehinden. Tryk let på knappen, og hold den nede i 2 - 3 s.
BEMÆRK: Enheden leveres med membranen. Tryk frigives automatisk, når du har trykket på knappen. Det tager kun få sekunder at frigøre trykket og fjerne enheden.
- Placer indtrykcytologienheden tangentielt på bindehinden. Tryk let på knappen, og hold den nede i 2 - 3 s.
- Frigør membranen i et mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml dyrkningsmedie (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% føtalt bovint serum(FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)) med en skalpel.
- Isolere celler fra anordningens membran ved kontinuerlig skrabning i ca. 1 min med en 10 μl pipettespids.
BEMÆRK: Skrabningen er afsluttet, når membranets overflade bliver ujævn. Celleantal fra hver membran er variabel (100-500 celler / membran). Behandle prøverne inden for 2 - 3 timers samling.
2. Immunofenotyperende celler ved hjælp af flowcytometri
- Centrifuger cellerne ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur for at fjerne medierne. Resuspender cellepellet med 50 μl flowcytometrifarvningsbuffer (phosphatpufret saltvand (PBS) + 0,05% bovint serumalbumin (BSA)).
- Stenceller med et panel af antistoffer ( f.eks . CD3 brilliant violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanin-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE-cyanin 7 (PE- Cy7) -A og levende / dødcellemærke 7-ADD) ved stuetemperatur i 20-30 minutter imørk. Brug antistoffer direkte fra lageret i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: Brug antistofkoncentrationen 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD og 10 μl CCR7-PE. Brug perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) til at titrere de forskellige koncentrationer af antistoffer. Til titrering skal du tage den antistofkoncentration, der er nævnt i producentens protokol, og bruge halv og en fjerdedel af den anbefalede koncentration. Brug den mindste koncentration af antistoffer for at undgå spild til andre fluorokromkanaler. Klare signaler blev observeret med de nævnte koncentrationer af antistoffer. Kompensationen blev udført ved testning af PBMC'er i første omgang ifølge protokollen nævnt i Williams et al . 20 til test blev PBMC'er inkuberet med det samme sæt antistoffer anvendt her og kompenseret ved at sammenligne enkelt- og multiple antistofpletter. - Efter inkubation periOd, tilsæt 1 ml farvningsbuffer til røret, bland godt, og centrifuger ved 450 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellerne i 200 μl farvningsbuffer.
- Kør prøver på en flowcytometri maskine.
- Før kalibreringen af dataene kalibreres flowcytometerkanalspændingerne med cytometeropsætning og -sporing (CS & T) perler for at normalisere dataindsamlingen på forskellige dage som producentens anvisninger.
- Åbn flow-cytometry-dataopsamlingssoftwaren, klik på "Indstil & QC" -knappen, vælg det rigtige CS & T-perlepartinummer, læs perlerne, og klik derefter på knappen "Start".
- Resuspender celler ved forsigtigt at trykke på røret, før du lægger prøver på maskinen. Åbn dataindsamlingssoftwaren og klik på "Preview". Når tærskelværdien er stabil, klik på "Acquire". Overvåg prøveniveauet og klik på "Stop", når prøverne løber ud.
BEMÆRK: Få 10.000 begivenheder pr. Prøve. Efter at have erhvervet 10.000 begivenheder, generere et SSC-A og FSC-A prik plot i regnearket.- Klik på "Polygon Gate" knappen og tegne en gate (dette er P1) over alle begivenheder med en FSC-A værdi> 5 x 10 4 for at udelukke snavs. Klik på "Opret prik plot" knappen for at generere et nyt prik plot, højreklik på prikken blot, vælg "Egenskaber" for at åbne vinduet "Plot Editor", og vælg derefter "P1". Klik på FSC-A på x-aksen i P1 punktplot, skift den til CD3-BV510. Tegn en '' Polygon Gate '' for at vælge CD3 + befolkningen og navngiv den '' P2 ''.
- Klik på "Opret prik plot" knappen for at generere en ny prik plot, højreklik på dot blot, vælg "Properties" for at åbne vinduet "Plot Editor". Klik på FSC-A på x-aksen i P2 punktplot og skift den til 7-AAD. Tegn en '' Polygon Gate '' for 7-AAD - population og vælg '' P3 ''. P3 her er CD3 +Levende celler.
- Klik på "Opret prik plot" knappen for at generere en ny prik plot, højreklik på dot blot, vælg "Properties" for at åbne vinduet "Plot Editor". Klik på CD3-BV510 på x-akse og CD4-APCH7 på y-aksen på P3 punktplottet. Tegn rektangelporte på kvadrantens øvre og nedre sider og vælg henholdsvis '' P4 '' og '' P5 ''. P4 er live CD3 + CD4 + og P5 er levende CD3 + CD4 - T-celler.
- Klik på "Opret prik plot" knappen for at generere en ny prik plot, højreklik på dot blot, vælg "Properties" for at åbne vinduet "Plot Editor". Klik på CD45RO PE-Cy7 på x-aksen og CCR7-PE på y-aksen for både P4 og P5-plotterne. Tegn '' Quad Gate '' på denne prik plot.
BEMÆRK: Øverste venstre side, øverste højre side, nederste højre side og nedre venstre kvadranter her er naiv, central hukommelse (T CM ), eFfector-hukommelse (T EM ), henholdsvis terminalt differentieret effektorhukommelse (T EMRA ) T-celler.
- Før kalibreringen af dataene kalibreres flowcytometerkanalspændingerne med cytometeropsætning og -sporing (CS & T) perler for at normalisere dataindsamlingen på forskellige dage som producentens anvisninger.
Representative Results
IC ved denne kliniske enhed tillod os at isolere okulære overfladeimmunceller, samtidig med at den okulære overflade holdes intakt. Figur 1 beskriver, hvordan IC'en blev udført. De forskellige steder i øjet, hvorfra prøverne blev samlet, er markeret. Figur 2 viser repræsentativt resultat af flowcytometri indsamlet fra 10 sunde kontroller. Til gating skal du bruge SSC og 7-AAD til at skelne mellem levende og døde celler. 7-AAD - celler identificeres som levende celler. Disse levende celler karakteriseres yderligere af CD3 + og CD4 + markører. Desuden blev CD4 + og CD4 - populationerne yderligere karakteriseret som Naïve, T EM , T CM og T EMRA med markerne CCR7 og CD45RO. Blandt CD3 + T-celler dominerer effektorhukommelses-T-celler i den menneskelige okulære overflade. I tidligere eXperimenter, er det også blevet vist, at CD8 + -hukommelsesceller er de største populationer i konjunktivalepithelial-T-celler blandt de raske individer 20 . Figur 3 viser, at CD4 + og CD8 + effektorhukommelse T-celler (T EM og T EMRA ) er den væsentligste delmængde i den menneskelige okulære overflade i 10 sunde kontrollerede undersøgelser. Hver population nævnt i figuren er anmeldt med deres markørfænotype og navne (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Tallene i rødt angiver procentdelen af befolkningen. Dataene i denne figur er repræsenteret som middelværdi ± SEM
Figur 1: Indsamling af IC-prøver fra den okulære overflade af Impression Cytology Device. Prøver blev samlet fra den tidlige pæreAr region som vist.
Figur 2: Dotplotgraf ved brug af flowcytometri. Live 7-AAD - celler blev valgt. CD3 + -cellerne blev først gated, og derefter blev denne population gated ind i CD4 + og CD4 - undergrupper. Proportionerne af naive (CCR7 + CD45RO - ), centralhukommelse (CCR7 + CD45RO + ) og effektorhukommelse (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO-) delmængder blev bestemt ved hjælp af CCR7- og CD45RO-markører. Klik her for at se en større version af denne figur.
FIgure 3: Immunkelle-undertyper i CD4 + og CD8 + T-celler af sund menneskelig okulær overflade. Fordeling af konjunktival CD4 + og CD8 + naiv, centralminne (T CM ) og effektorhukommelse (T EM og T EMRA ) undergrupper i sunde menneskelige kontroller; Hvert datapunkt repræsenterer et separat individuel middel ± SEM vist. Andelen af befolkningen er markeret som rød under navnet på hver af befolkningerne. Den samlede procentdel af befolkningen er 98%, fordi CD4 + T EMRA- populationen ikke var medtaget i den nævnte scatterplot (modificeret fra Bose et al. 21 ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Dette er en nem, hurtig og mindre invasiv teknik, der kan bruges i klinikkerne til ekstremt hurtig immunprofilering i modsætning til de konventionelle teknikker som skrabning, sugning, pipettering eller absorberende filterpapir 1 , 2 . En variant af denne teknik anvendes allerede i forskningsindstillinger 22 . Den fremtidige anvendelse af den foreslåede metode er for patientstratifikation i kliniske forsøg med okulære sygdomme, især dem der kræver immunfenotyping.
En stor udfordring med denne teknik er de relativt få immunceller, der hentes efter indtryk indsamling og skrabning. Det samlede antal CD3 + T-celler genvundet fra fire visninger pr. Individ varierede fra ~ 500-1000 celler. De okulære prøver blev vasket før flowcytometrianalysen i et minimalt antal gange for at undgå yderligere tab af celles. Kritiske trin og udfordringer, der forbliver inden for protokollen, er effektiv samling af okulære prøver og korrekt skrabning af membranen for at opnå højere celleantal. Ikke desto mindre er denne begrænsning usandsynligt, at den forstyrrer nogen specifik immunfænotype. Fejlfinding udført her for at maksimere udbyttet af celler var at reducere antallet af vaske trin efter og før inkubation af antistoffer.
Der er andre begrænsninger for at bruge IC. Hos patienter med alvorligt keratiniseret eller fibroseret okulær overflade, såsom i Steven Johnsons syndrom, kan det cellulære udbytte være endnu mindre end det i denne undersøgelse. Andelen af immunceller kan ændres, hvis prøverne opbevares i stedet for analyseret samme dag. Det er svært at forudsige, om visse celletyper er mere modstandsdygtige over for opbevaring end andre. Tidligere undersøgelser har rapporteret forhøjede niveauer af HLA-DR-ekspression i conjunctivalepithelcellerne 23 , så det ville være interEstimerer korrelationen mellem HLA-DR og niveauer af specifikke immunceller. Immunkeller kan også være forbundet med ekspressionsniveauet af kemokiner. Disse spørgsmål bør behandles i fremtidige undersøgelser.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Nandini Nallappan og Sharon Yeo for at hjælpe med de tekniske trin. Undersøgelsen blev finansieret af en Start-Up Grant til KGC fra Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University og af en Senior Clinician Scientist Award fra Singapore's Ministry of Health's National Medical Research Council (NMRC) til LT (NMRC / CSA / 045/2012) og ved et tilskud fra NMRC og administreret af National Health Innovation Center til KGC og LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
